Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение нейротропной активности производных пиразоло[C]пиридина и родственных соединений

На правах рукописи

иа3058В75

МЕЛЕТОВА ОЛЬГА КОНСТАНТИНОВНА

ИЗУЧЕНИЕ НЕЙРОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ПИРАЗОЛО[С]ПИРИДИНА И РОДСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2007 г

003058675

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии имени В В Захусова РАМН, ММА имени И М Сеченова

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук

Аляутднн Ренат Николаевич Молодавкин Геннадий Матвеевич

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Ковалев Георгий Иванович

доктор биологических наук, профессор Тушмалова Нина Александровна

Ведущая организация

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава

Защита диссертации состоится_« »_2007 г в «_» час на

заседании диссертационного совета Д 001 024 01 при ГУ НИИ фармакологии имени В В Закусова РАМН по адресу 125315, Москва, ул Балтийская, д 8

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части ГУ НИИ фармакологии имени В В Закусова РАМН

Автореферат разослан « » _ г

Учёный секретарь диссертационного совета дмн

ЕА Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность Тревожно-депрессивные расстройства - одна из наиболее распространенных форм психической патологии По данным Всемирной организации здравоохранения, заболеваемость дегресс,«|ми на сегодняшний день приближаете? к 3 %, то есть ежегодно около 180 миллионов жителей нашей планеты обнаруживают признаки депрессии и нуждаются в адекватной медицинской помощи Однако депрессия служит поводом к обращению за медицинской помощью не чаще, чем в 35-50 % случаев Около 40% всех депрессий протекает со стертыми проявлениями, причем 60-80 % больных лечатся у врачей общей практики Тревожно-фобические расстройства среди населения составляют 5%, а в общемедицинской сети показатель их распространенности достигает 11,9 % При сочетании (коморбидности) тревожных и депрессивных расстройств отмечается уменьшение эффективности лечения, ухудшение прогноза заболевания (Brundtland GH, 2000)

Среди соматически больных (сердечно-сосудистые, онкологические заболевания, диабет и др ) частота депрессий составляет 22-33 % Депрессии могут ухудшать течение соматического заболевания, провоцировать соматическое заболевание (например, гипертоническую болезнь, заболевания кожи и т д), и быть реакцией на него (Дороженок И Ю , 2003) Наблюдающееся во многих слу"аях затяжное течение либо частые рецидивы депрессии повышают риск самоубийств Депрессия серьезно влияет на качество жизни и адаптационные возможности пациента, поскольку может привести к снижению профессионального статуса с вынужденной сменой работы, распаду семьи и, наконец, полной инвалидизации (Дороженок И Ю , 2003)

Широкая распространенность депрессивных состояний, увеличение числа рецидивов и недостаточная эффективность терапии - все это определяет актуальность и научно-практическую значимость разработки новых антидепрессивных лекарственных средств Необходимым условием для решения указанных проблем является комплексное исследование патогенетических и фармакологических закономерностей депрессивных состояний

Исследованию патогенетических механизмов, лежащих в основе эндогенных депрессий, посвящено много работ Это и моделирование патологических состояний, и изучение биохимического метаболизма, и исследование гормонов, нейропептцдов и т д Многочисленные исследования посвящены изучению обмена катехоламинов и индоламинов, которые, как считается, играют важную роль в механизмах действия антидепрессантов Однако многолетние интенсивные биохимические исследования, проведенные в разных странах, не смогли подтвердить или опровергнуть гипотезу о недостаточности моноаминовой нейромедиации как основной причине депрессивных проявлений (Коган Б М, Дроздов А 3 , 1998)

Внедрение в клиническую практику большого количества различных антидепрессантов не привело к существенному повышению эффективности терапии эндогенных депрессий До настоящего времени остаются неясными причины недостаточной эффективности современных

антидепрессантов Исходя из этого, повышение эффективности ангидепрессивной терапии является одной из наиболее актуальных задач современной психиатрии (Мосолов СН, 1995, Смулевич А Б, 2000)

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение нейротропной активности ряда соединении -производных пиразоло[с]пиридина и родственных соединений

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи

1 Оценить антидепрессивную активность производных пиразоло[с]пиридина по сравнению с классическими и современными антидепрессантами в экспериментах на животных

2 Оценить анксиолитический эффект производных пиразоло[с]пиридина по сравнению с классическими анксиолитиками в экспериментах на животных

3 Оценить выраженность побочных миорелаксантного и седативного эффектов по сравнению с классическими анксиолитиками, определить широту терапевтического действия наиболее эффективного соединения

4 Оценить общую тревожность животных и сохранение анксиолитического эффекта наиболее эффективного соединения после его хронического введения

5 Оценить острую токсичность соединений, определить Ц)5о для наиболее эффективного соединения

6 Оценить с помощью электрофизиологических методик влияние наиболее эффективного соединения, а также классических и современных антидепрессантов, на амплитуду транскаллозального ответа

7 Провести биохимический анализ содержания основных моноаминов и их метаболитов в структурах мозга после введения наиболее эффек^чвчсо соединения в сравнении с современным антидепрессантом флуоксетином

Научная новизна исследования В данной работе впервые обнаружен антидепрессивный эффект у производных пиразоло[с]пирвдина При этом выраженность антидепрессивного эффекта наиболее эффективного соединения превышает эффект современных антиденрессантов флуоксетина и тианептина и сопоставима с силой антидепрессивного эффекта классического трициклического антидепрессанта амитриптилина. Эти исследования демонстрируют высокую активность новых соединений

Всесторонне исследован анксиолитический эффект наиболее эффективного соединения, превышающий эффект диазепама. В отличие от бензодиазепиновых производных у производных пиразоло[с]пиридина отсутствуют такие побочные эффекты, как миорелаксантный и седативный

Изученные соединения обладают низкой токсичностью

Таким образом, обнаружены низкотоксичные соединения, сочетающие выраженный антидепрессивный и анксиолитнческий эффекты, что особенно актуально при лечении тревожно-депрессивных расстройств

Научно-практическая значимость работы Полученные в работе данные представляют интерес для психофармакологии с точки зрения разработки нового антидепрессанта, оказывающего также анксиолитическое действие

Апробация работы Основные положения работы представлены на 2-м Съезде Российского Научного Общества фармакологов, Москва, 2003 г, на 10-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2003 г , на 8-й Международной конференции ECNP, Москва, 2005

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в десяти печатных работах Список работ приведен в конце реферата

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы из 217 наименований (из них 125 на английском языке), изложена на 158 страницах, содержит 23 таблицы и иллюстрирована 41 рисунком

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследование проводили на 938 беспородных белых крысах-самцах, а также на 24 крысах-самцах линии Вистар, массой 200-250 г Животные содержались в условиях вивария ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН при свободном доступе к воде и брикетированному корму при стандартном освещении, при комнатной температуре окружающей среды

Исследования проводились в соответствии с методическими указаниями, опубликованными в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Издание второе, переработанное и дополненное /Гл ред Р У Хабриев -М 2005)

В работе исследовалась нейротропная активность новых соединений - производных пиразоло[с]пиридина и родственных соединений под шифром ГИЖ, синтезированных в лаборатории химии гетероциклических соединений ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН к х н Глозманом О M и к х н Жмуренко JI А

В качестве препаратов сравнения были использованы амитриптилин, раствор для инъекций 10 мг/мл, ФГУП Московской Эндокринный Завод, Россия, диазепам, раствор для внутривенного и внутримышечного введения 5 мг/мл, Alkaloid, Республика Македония, прозак (МНН -флуоксетин), капсулы 20 мг, Eli Lilly & Company Limited, Великобритания, коаксил (МНН -тианептин), таблетки покрытые оболочкой 12,5 мг, Les Laboratoires Semer Industrie, Франция

Оценка антидепрессивиого эффекта

Антидепрессивный эффект оценивался с использованием теста вынужденного плавания -теста отчаяния (Андреева Н И, 2005) по модифицированной методике S Nomura в сосуде с водой и свободно вращающимися колесами (Nomura S et al, 1982) Достоинствами метода являются его объективность при оценке результатов, автоматизированная многоканальная регистрация и прямой ввод данных в компьютер, отсутствие предварительной подготовки животных (фармакологической, хирургической, поведенческой) Использовалась четьгрехканапьная установка для исследования эффекта препаратов на крысах, разработанная в лаборатории психофармакологии ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН (Молодавкин Г М , Воронина Т А, Мдзинаришвили АЛ, 1995) При обработке результатов оценивалось число оборотов колеса, произведенных животными за 10 мин

Оценка антидепрессивного эффекта проводилась также методом вынужденного плавания по Порсолту (Андреева Н И, 2005, Porsolt R D et al, 1978) Суть метода состоит в том, что крысы после помещения их в сосуд с водой стараются из него выбраться и проявляют бурную двигательную активность, направленную на поиск выхода из аверсивной (неприятной) ситуации Убедившись в тщетности своих попыток, крысы зависают в воде в характерной позе, оставаясь неподвижными или совершая незначительные движения, необходимые для поддержания морды над поверхностью воды Показателем выраженности депрессивноподобного состояния является длительность иммобилизации Вещества с антидепрессивной активностью облегчают это состояние, уменьшая длительность иммобилизации Оценка анксиолитического эффекта

Оценка анксиолитического действия препаратов проводились по методике конфликтной ситуации (Vogel et al, 1971), основанной на столкновении питьевой и оборонительной мотивации (Воронина Т А, Середенин С Б, 2005) Принцип методики заключается в подавлении болевым электрическим раздражителем питьевого рефлекса у крыс при потреблении ими воды из трубк1»-поилки Для исследований использовалась четырехкамерная установка, разработанная в лаборатории психофармакологии ГУ НИИ фармакологии им В В Закусова РАМН (Молодавкин Г М, Воронина Т А , 1995)

Другим способом изучения анксиолитического действия веществ является метод приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ), в котором отсутствуют такие сильные стрессоры, как лишение воды шш пищи и эдектроргздражение (Воронина Т А, Середенин С Б , 2005) В силу этого он считается более адекватным для поиска мягких, анксиоселективньгх транквилизаторов Методика основана на предпочтении грызунами темных нор, естественного страха нахождения на открытых площадках и падения с высоты (Lister R G, 1987)

Ввод и регистрация основных параметров экспериментальной методики проводились с использованием компьютерной программы (Молодавкин Г М, Воронина Т А, 2005) Согласно

данной программе каждому поведенческому акту соответствует нажатие экспериментатором определенной клавиши на клавиатуре компьютера с последующим вычислением средних значений регистрируемых параметров и их стандартных отклонений, которые в виде таблиц могут быть выведены на экран монитора В эксперименте регистрировались следующие параметры число входов в открытые и закрытые рукава лабиринта, длительность пребывания животных в открытых и закрытых рукавах, число свешиваний животных за края открытых рукавов лабиринта во время пребывания на них

Контрольные интактные животные предпочитают бочьшую часть времени проводить в закрытых, темных рукавах Анксиолитический эффект препарата оценивается по увеличению числа заходов в светлые рукава и времени нахождения в них без увеличения общего числа заходов

Оценка миорелаксантного н седатнвного эффектов

Миорелаксантный эффект (нарушение координации движений, походки и равновесия у крыс) оценивался по тесту вращающегося стержня, а также по нарушению рефлекса подтягивания задних конечностей крыс при помещении передних на горизонтально натянутую проволоку диаметром 3 мм (Воронина Т А, Середенин С Б, 2005) Дня оценки широты терапевтического действия наиболее эффективного препарата определялась ED50 для миорелаксантного эффекта - доза, при которой побочный эффект проявляется у 50 % животных

Оценка седативного эффекта проводилась по измерению интенсивности горизонтальной двигательной активности крыс (Воронина Т А, Середенин С Б, 2005) Горизонтальную двигательную активность регистрировали с помощью актометра марки «Opto Varimex» Columbia instruments USA, стенки камеры которой снабжены инфракрасными датчиками При пересечении крысой луча осуществляется автоматическая регистрация движения, результаты которой выводятся на пишущую ленту актометра.

Оценка эффектов ГИЖ-72 после хронического введения

Оценку уровня тревожности крыс после хронического введения ГИЖ-72 оценивали на беспородных белых крысах-самцах в тесте открытого поля (Воронина Т А, Середенин С Б, 2005) Регистрацию активности животных производили с помощью специальной компьютерной программы, в которой каждому визуально отмечаемому виду активности соответствовало нажатие на определенную клавишу (Молоцавкин Г М, Воронина Т А, 2005) Программа автоматически вычисляла средние и стандартные отклонения, которые в дальнейшем использовались для определения достоверности различий между группами животных с помощью дисперсионного анализа

В качестве препарата сравнения использовался диазепам Вещества и дистиллированную воду (в контрольной группе) вводили ежедневно интрагастрально в течение 1 месяца

Оценка сохранения анксиолитического эффекта ГИЖ-72 после хронического введения препарата проводилась по тесту конфликтной ситуации Изучение острой токсичиости

Острая токсичность определялась в опытах на крысах при постоянной температуре окружающей среды (20-21°С) (Арзамасцев ЕВ , Гуськова ТА, Березовская ИВ и др, 2005, Воронина Т А, Середенин С Б , 2005) Исследуемый препарат вводили внутрибрюшинно в дозах 300,400, 500, 600, 800 и 900 мг/кг Регистрацию гибели животных осуществляли через 24 ч после введения вещества

Регистрация транскаллозального ответа у крыс

Транскаллозальные ответы у беспородных белых крыс регистрировали по методике Молодавкина ГМ (1998) Вызванные потенциалы регистрировали от поверхности сенсомоторной коры ненаркотизированного обездвиженного животного, оперированного под эфирным наркозом, при искусственной вентиляции легких

Регистрацию и обработку транскаллозальных ответов осуществляли с помощью электрофизиологического комплекса на основе осциллографа PCS500 (фирма «Velleman Instruments», Голландия) через 2 ч после операции чтобы гарантировать, что ТКО не искажен в результате операционных манипуляций и воздействия эфира Влияние исследуемых веществ на транскаллозальные ответы оценивали по вызванным ответам, усредненным по результатам 25 предъявлений стимула. Усредненный вызванный потенциал регистрировали 2-3 раза до введения вещества (для проверки стабильности фона) и через каждые 30 мин в течение 2 часов после введения Подсчитывали средние значения и их стандартные отклонения для каждой группы Определение содержания моноамниов и их метаболитов в структурах мозга крыс Определение содержания мопоамлнов и их метаболитов в структурах мозга крыс проводилось на крысах-самцах массой 200-250 г линии Вистар Водные суспензии ГИЖ-72 и флуоксетина готовили непосредственно перед внутрибрюшинным введением в дозах 20 мг/кг за 60 мин до забоя Во избежание влияния суточных ритмов на ферментативную активность и уровни нейропередатчиков животных забивали путем декапитации в период между 9 и 14 часами при температуре лабораторного помещения 22 ± 1 °С (Wan-en et al,1984) На льду быстро извлекали мозг и выделяли фронтальную кору, прилежащее ядро, гипоталамус, стриатум и гиппокамп (Glowmski, Iversen, 1966) Содержание моноаминов и их метаболитов определялось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на хроматографе LC-304T (В AS, West Lafayette, США) с инжектором Rheodyne 7125 с петлёй на 20 мкл для нанесения образцов Данные нейрохимических опытов были статистически обработаны с помощью методов параметрической статистики - критерия Стьюдента и отношения дисперсии Фишера (Glowinski, Iversen, 1966) Методы статистической обработки результатов

При обработке результатов для каждой группы вычисляли средние значения и доверительные интервалы при Р< 0,05 Достоверность различий между группами определяли с помощью дисперсионного анализа (Боровиков ВП, Боровиков ИП, 1997) Случаи использования нестандартной обработки оговорены в тексте особо

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В диссертационной работе описан поиск наиболее активного соединения среди производных пиразоло[с]пиридина, проведен сравнительный анализ нейротропной активности наиболее активного производного пиразоло[с]пиридина с эффектами классического трициклического антидепрессанта амитриптилина, селективного ингибитора обратного захвата серотонина флуоксетина, стимулятора обратного захвата серотонина тианептина и классического бензодиазепинового анксиолитика диазепама.

В результате сравнительной оценки антидепрессивной активности производных пиразоло[с]пиридина в тесте вынужденного плавания крыс в сосуде со свободно вращающимися колесами показано, что соединения ГИЖ-72, ГИЖ-68, ГИЖ-141 и ГИЖ-200 в дозе 20 мг/кг достоверно увеличивают число оборотов колес по сравнению с контролем (Рисунок 1) Таким образом, можно предположить наличие антидепрессивной активности у некоторых производных пиразоло[с]пиридина. ГИЖ-72, обладающий максимальной активностью, был отобран для дальнейших исследований

При сравнительном анализе антидепрессивного эффекта ГИЖ-72 (5,10,20 и 40 мг/кг, в/б) с эффектом классического трициклического антидепрессанта амитриптилина (10 мг/кг, в/б) в тесте вынужденного плавания у крыс обнаружено, что в дозе 20 мг/кг ГИЖ-72 проявляет максимальную активность, которая сопоставима с активностью амитриптилина, вводимого в изученной дозе

Поскольку применение современных антидепрессантов в настоящее время заметно возрастает, возникает необходимость проведения сравнительной оценки антидепрессивной активности ГИЖ-72 не только с эффектом классического антидепрессанта, но и с наиболее популярными и используемыми сейчас антидепрессантами

5 150 -

Контроль ГИЖ-72 20 ГИЖ-68 20 ГИЖ-128 ГИЖ-141, ГИЖ-189, ГИЖ-200 мг/кг мг/кг 20 мг/кг 20 мг/кг 20 мг/кг 20 мг/кг

Рисунок 1 Влияние соединений ряда пнразоло[с] пиридина на число оборотов колес в тесте вынужденного плавания у крыс

* - Р < 0,05 в сравнении с контролем

С этой целью использованы флуоксетин и тианептин, в тесте вынужденного плавания у крыс определены их терапевтические дозы 12,5 мг/кг - для тианептина и 20 мг/кг - для флуоксетина. Следует отметить, что эффект тианептина, вводимого в своей терапевтической дозе, значительно превышает таковой флуоксетина

При сравнении антидепрессивного действия ГИЖ-72 (5, 10,15 и 20 мг/кг, в/б) с эффектами тианептина в дозе 12,5 мг/кг (в/б) и флуоксетина в дозе 20 мг/кг (в/б) установлено, что ГИЖ-72 при введении в дозе 20 мг/кг недостоверно повышает число оборотов колес по сравнению с современными антидепрессантами в их терапевтических дозах (Рисунок 2)

8060 -40 -

Контроль Прозак, 20 Коаксил, ГИЖ-72, 5 ГИЖ-72,10 ГИЖ-72 15 ГИЖ-72, 20 мг/кг 12,5 мг/кг мг/кг мг/кг мг/кг мг/кг

Рисунок 2. Влияние ГИЖ-72 на число оборотов колес в тесте вынужденного плавания у крыс в сравнении с флуоксетином н тианептином

* - Р < 0,05 в сравнении с контролем

Для выявления возможного механизма антидепрессивного действия ГИЖ-72 оценивалось влияние анализаторов бикукуллина, кетансерина, 5-ОТФ и Ь-ДОФА на активность ГИЖ-72 в тесте вынужденного плавания у крыс в сосуде со свободно вращающимися колесами Бикукуллин, антагонист ГАМКА-рецепторов, использовался для оценки участия ГАМК-ергической системы в реализации антидепрессивного эффекта ГИЖ-72, кетансерин, антагонист 5-НТ2-рецепторов, и 5-ОТФ, предшественник серотонина, - серотонинергической системы, Ь-ДОФА, предшественник дофамина, - дофаминергической системы

В результате исследования обнаружено, что кетансерин и бикукуллин при совместном введении с ГИЖ-72 недостоверно увеличивают число оборотов колес у животных по сравнению с эффектом ГИЖ-72, 5-ОТФ практически не изменяет этот показатель, а Ь-ДОФА достоверно значимо увеличивает число оборотов колес по сравнению с эффектом ГИЖ-72 (Рисунок 3) При анализе влияния кетансерина на эффекты тианептина, флуоксетина и амитриптилина обнаружено, что кетансерин недостоверно увеличивает число оборотов колес у животных по сравнению с эффектами тианептина и флуоксетина и, наоборот, уменьшает - по сравнению с эффектом амитриптилина

Таким образом, обнаружено, что серотонин-, дофамин- и ГАМК-ергические системы участвуют в реализации антидепрессивного эффекта ГИЖ-72 Также выявлено общее стимулирующее влияние антагониста 5-НТ2-рецепторов кетансерина на эффекты ГИЖ-72, флуоксетина и тианептина в тесте вынужденного плавания у крыс

Рисунок 3. Изучение влияния анализаторов на эффект ГИЖ-72 в тесте вынужденного тг^авлкнн у крыс,

* - Р < 0,05 в сравнении с контролем.

Поскольку депрессии часто сопровождаются тревожностью, особую актуальность приобретают лекарственные препараты, сочетающие е спектре своего действия антидепрессивньш и анксиолнтический эффекты. В литературе описаны соединения, сходные по структуре с пиразоло[с]пиридином, которые обладают анкснолитической активностью (Allen M S., Skolmck Р., Cook J.M., 1992, Selleri S. ei а!., 2002, Costagli C. etal, 2003). Поэтому в данной работе ставилась цель оценить наличие и выраженность ajгеополитического эффекта у производных пиразоло[с|пиридина.

Анхсиолитическая активность производных гшразоло[ с] пиридина 1ИЖ-72, ГИЖ-200, ГИЖ-128, ГИЖ-141, ГИЖ-189, ГИЖ-68 изучалась в тесте конфликтной ситуации с использованием тока силой 0,5 мА, который позволяет обнаружить анксиолитики средней силы. Среди изученных производных ГИЖ-72 показал максимальную анксиояитическую активность. При сравнении анксиолитической активности ГИЖ-72 (10 и 20 мг/кг, в/б) с аффектом классического бензодиазепинового анксиолитика диазепама (5 мг/кг, в/6) в тесте конфликтной ситуации обнаружено, что эффект ГИЖ-72 превышает таковой диазепама. Установлено, что при ингра! астральном введении ГИЖ-72 сохраняет анксиолнтический эффект, что перспективно с точки зрения использования нового препарата в условиях амбулаторного приема

В результате оценки анксиолитического эффекта ГИЖ-72 в приподнятом крестообразном лабиринте обнаружено, что ГИЖ-72 (10 мг/кг, в/б) увеличивает время пребывания животных в

открытых рукавах лабиринта по сравнению и с контролем, и с диазепамом, что подтверждает наличие у ГИЖ-72 анксиолитического эффекта, превышающего эффект диазепама.

Поскольку ГИЖ-72 наряду с антидепрессивным сочетает анксиолитический эффект, необходимо было оценить влияние современных антидепрессантов сравнения флуоксетина и тианептина на тревожность в тесте конфликтной ситуации На основе литературных данных (Supavilai Р, Karobath М, 1981, Ticku М К, Davis W С, 1982) было предположено, что ГИЖ-72 связывается с ГАМКд-БД рецепторным комплексом Поэтому изучалось влияние бикукуллина (1 мг/кг, в/б), антагониста ГАМКа-рецепторов, на анксиолитический эффект ГИЖ-72 Для оценки участия ГАМК-ергической системы в действии на тревожность прозака и коаксила также использовался бикукуллин

В результате исследования обнаружено, что флуоксегин увеличивает тревожность у крыс, то есть проявляет анкиогенное действие, а тианептин недостоверно уменьшает тревожность Следовательно, дополнительным преимуществом ЩЖ-72 перед современными антидепрессантами флуоксетином и тианептином является выраженный анксиолитический эффект

Также установлено, что бикукуллин увеличивает число наказуемых взятий воды у животных, которым вводились тианептин и флуоксетин, наиболее значительно усиливая эффект тианептина, благодаря чему увеличение числа наказуемых взятий воды под его влиянием становится достоверным (Рисунок 4)

Из результатов исследования следует, что ГАМК-ергическая система принимает участие в опосредовании влияния антидепрессантов на тревожность, по-видимому, через нейрональную сеть в мозге, в которой высвобождение серотонина из нейронов регулируется тормозными ГАМК-ергическими интернейронами (Clements S, Schreck С В, 2004, Labnd С, Mocaer Е, Kamoun А, 1992) Блокада ГАМК-рецепторов бикукуллином приводит к снижению тормозного влияния ГАМК на высвобождение серотонина и, соответственно, к его повышенному выбросу

В связи с вышеизложенным, можно полагать, что именно усиленное высвобождение серотонина за счет блокирования ГАМК-рецепторов биккуллином лежит в основе достоверного анксиолитического эффекта в тесте конфликтной ситуации, наблюдающегося при сочетании тианептина с бикукуллином

В отличие от стимулирующего влияния на эффекты флуоксетина и тианептина, бикукуллин достоверно уменьшает число наказуемых взятий воды, увеличенное под влиянием ГИЖ-72, то есть уменьшает его анксиолитическое действие (Рисунок 4), что подтверждает наше предположение об участии ГАМК-ергической системы в опосредовании анксиолитического эффекта ГИЖ-72 путем связывания с ГАМКл-бензодиазепиновым рецепторным комплексом

КЪктршъ Коакеил12 5 Коаксип12 5 ГТроэак 20 мгУкг Прозах 20 мгУкг ГИЖ72 20 rVDK-72 20 БикукулгкН

мг/кг мг/и" + +Бикукуллин 1 Мг/W МГ/КГ+ М filer

Бикухуптн 1 мг/кг Бикукуплин 1

мг/кг мг/кг

Рисунок 4 Сравнительное изучение влияния ГИЖ-72, флуоксетина и тианептина на поведение крыс в конфликтной ситуации

* - Р < 0,05 в сравнении с контролем

Поскольку для бензодиазепиновых анксиолитиков характерны миорелаксантный и седативный побочные эффекты (Dundee J W, 1992), необходимо было оценить ГИЖ-72 с точки зрения их выраженности Обнаружено, что ГИЖ-72 не оказывает миорелаксантного действия даже в дозах, превышающих терапевтические При этом ED30 для миорелаксантного эффекта составляет 243,6 мг/кг при доверительном интервале [202,9-292,4] Следовательно, при терапевтической дозе 20 мг/кг терапевтический индекс миорелаксантного эффекта ГИЖ-72 составляет 12,18 Диазепам вызывал выраженную миорелаксацию, характерную для бензодиазепиновых транквилизаторов

При исследовании седативного эффекта установлено, что ГИЖ-72 (20 мг/кг, в/б) недостоверно увеличивает двигательную активность у крыс по сравнению с контролем, то есть можно утверждать, что ГИЖ-72 не оказывает седативного действия При этом диазепам (5 мг/кг, в/б) достоверно снижает двигательную активность у крыс по сравнению с контролем, что подтверждает наличие у него седативного эффекта, характерного для бензодиазепиновых транквилизаторов (Dundee JW, 1992) Следовательно, преимуществом ГИЖ-72 перед классическими бензодиазепиновыми транквилизаторами является отсутствие миорелаксантного и седативного эффектов

Из литературных данных известно, что для бензодиазепиновых анксиолитиков характерно снижение анксиолитического эффекта в результате длительного применения, развитие привыкания, зависимости (Lader М, 1994, Malcolm R J, 2003)

Для оценки подобных свойств ГИЖ-72 изучены эффекты препарата после его хронического введения животным (ежедневно в течение 1 месяца)

При исследовании сохранения анксиолитического эффекта ГИЖ-72 (20 мг/кг, и/га) после хронического введения был использован тест конфликтной ситуации Анксиолитическая активность ГИЖ-72 после хронического введения оценивается по числу наказуемых взятий воды в тесте конфликтной ситуации по сравнению с диазепамом ГИЖ-72 достоверно повышает число наказуемых взятий воды у крыс и после хронического введения по сравнению с контрольными животными, что свидетельствует о сохранении анксиолитического эффекта соединения В отличие от него диазепам не увеличивает число наказуемых взятий воды у крыс относительно контроля, те в результате хронического введения снижается анксиолитическая активность препарата

Оценка уровня тревожности животных после хронического введения ГИЖ-72 (20 мг/кг, и/га) по сравнению с диазепамом (5 мг/кг, и/га) проводилась по выраженности горизонтальной и вертикальной активности у крыс в тесте открытого поля Обнаружено, что ГИЖ-72 достоверно уменьшает вертикальную активность животных по сравнению с контрольными, что свидетельствует о снижении уровня тревожности у крыс после хронического введения ГИЖ-72

В «абстинентных группах» (животным этих групп за день до эксперимента не вводили ГИЖ-72 или диазепам) наблюдается тенденция к увеличению вертикальной и горизонтальной активности у крыс по сравнению с крысами после хронического непрерывного введения препаратов, однако эти данные недостоверны Следовательно, мы не можем утверждать, что ГИЖ-72 вызывает абстинентный синдром

В результате ежедневной регистрации массы тела животных во время хронического введения веществ было обнаружено, что ГИЖ-72 (20 мг/кг, и/га) достоверно увеличивает массу тела крыс по сравнению с контрольной группой и крысами, получавшими диазепам (Рисунок 5) В литературе описан эффект снижения массы тела у крыс с депрессией по сравнению с контрольными крысами (Крупина НА, 2000), поэтому можно предположить сохранение аитидепрессивного эффекта ГИЖ-72 после хронического введения препарата

С точки зрения дальнейшего изучения препарата и возможного внедрения его на фармацевтический рынок необходимо определить острую токсичность ГИЖ 72

LD50 вещества составила 825,3 мг/кг при доверительном интервале [704,95-966,10] Таким образом, при терапевтической дозе ГИЖ-72 20 мг/кг терапевтический индекс препарата составляет 41,3, что говорит о низкой токсичности ГИЖ-72

390 -г

§

*

*

270

1-й день 5-й день 10-й день 15-й день 20-й день 25-й день 30-й ден* 32 день

Время, дни

I—*— ГИЖ-7220 мг/иг —□—Диазепам 5 мг/кг

Рисунок 5 Влияние ГИЖ-72, диазепама н дистиллированной воды (контроль), вводимых хронически, на массу животных.

* - Р < 0,05 в сравнении с контролем

В свете новых представлений об участии нейропластичности в патогенезе депрессий особенный интерес представляет изучение влияния ГИЖ-72, амитриптилина, флуоксетина и тианептина на процессы межполушарной передачи с помощью электрофизиологических методик При снижении нейропластичности происходят нарушение проведения возбуждения, изменение восстановления процессов в синаптической щели (длительное потенцирование или длительная депрессия), изменение числа синаптических связей (связано с изменением нейротрофических факторов), снижение нейроналъной реконфигурации Эти изменения влияют на процессы обучения и памяти, формирования эмоций (Speddmg M, Lestage Р, 2005)

Мы оценивали влияние исследуемых препаратов на амплитуду транскашюзального ответа (ГКО) В результате исследования обнаружено, что амитриптилин практически не влияет на амплитуду ТКО, то есть препарат не изменяет процесс межполушарной передачи В отличие от амитриптилина флуоксетин снижает амплитуду ТКО у крыс, то есть ослабляет процесс межполушарной передачи Можно предположить, что он оказывает негативное влияние на память, что коррелириует с данными некоторых исследователей, обнаруживших отрицательное влияние флуоксетина на память и процессы обучения (Joss et al, 2003, Huang et al, 2004) (Рисунок 6, Рисунок 8)

1700 1600 1500 1400 1300 1200

1100 1000

А В

1600 i

1600 1400 -j _ ~~ ' .J

А/" " 1200

1Mft 1 f

800

600 600 !

400 -

200

Рисунок 6 Влияние амитриптилина и флуоксетина на амплитуду ТКО у крыс

А ТКО сенсомоторной коры крысы после введения дистиллированной воды (контроль) перед введением амитриптилина В Влияние амитриптилина на амплитуду ТКО через 30 мин после введения С. ТКО сенсомоторной коры крысы после введения дистиллированной воды (контроль) перед введением флуоксетина О Влияние флуоксетина на амплитуду ТКО через 30 мин после введения

Ось ординат - амплитуда, мкВ Ось абсцисс - время, мс

Тианептин значительно увеличивает амплитуду ТКО у крыс по сравнению с контролем (Рисунок 7, Рисунок 8) Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат положительно влияет на мексполушарную передачу, и позволяют предположить его позитивное влияние на процессы памяти Положительное влияние тианептина на память и обучение также находит отражение в работах ряда исследователей (Diamond et al, 2004, Meneses, 2002)

Известно, что тианептин, помимо усиления обратного захвата серотонина, обладает нейропротективным действием (McEwen, 2004, Spedding М, Lestage Р, 2005) Способность тианетина улучшать нейропластичность и образование нейротрофических факторов может во многом объяснить его положительное влияние на амплитуду ТКО по сравнению с другими препаратами

Предполагается, что эндогенный серотонин, влияя на обратный захват и 5-НТ(1-7) рецепторы, модулирует процессы обучения и играет существенную роль в процессах памяти (А Meneses, 2002) Полученные нами данные подтверждают это предположение и позволяют полагать, что в реализации эффектов изученных антидепрессантов на ТКО принимает участие серотонинергическзя система

А

Рисунок 7 Влияние тнанептина и ГИЖ-72 на амплитуду ТКО у крыс

А ТКО сенсомоторной коры крысы после введения дистиллированной воды (контроль) перед введением тианептина В Влияние тианептина на амплитуду ТКО через 30 мин после введения С. ТКО сенсомоторной коры крысы после введения дистиллированной воды (контроль) перед введением ГИЖ-72 О Влияние ГИЖ-72 на амплитуду ТКО через 30 мин после введения Ось ординат - амплитуда, мкВ Ось абсцисс - время, мс

Флуоксетин - селективный ингибитор обратного захвата серотонина, повышает содержание серотонина в синаптической щели, уменьшает амплитуду ТКО и ухудшает память Тианептин -стимулятор обратного захвата серотонина, снижает содержание серотонина в синаптической щели, повышает амплитуду ТКО и улучшает обучение и память Таким образом, можно полагать, что эндогенный серотонин способствует ухудшению проведения возбуждения и отрицательно влияет на процессы обучения и памяти

ГИЖ-72 увеличивает амплитуду ТКО по сравнению с контролем, однако его эффект уступает эффекту тианептина (Рисунок 7, Рисунок 8) Наличие нейпротективного механизма действия у ГИЖ-72 в настоящий момент не изучено, тем не менее, положительное влияние соединения на амплитуду ТКО позволяет предположить наличие у него способности улучшать нейропластичность, а возможно, и память Исследование данного эффекта может стать темой для последующих работ

Для получения данных о механизме действия ГИЖ 72 в данной диссертационной работе проведено исследование его влияния на содержание моноаминов и их метаболитов в мозге по сравнению с современным антидепрессантом - селективным ингибитором обратного захвата серотонина флуоксетином Эксперимент проводился на 24 крысах линии Вистар

Время мин

Рисунок 1 Сравнительное изучение влияния ГИЖ-72, ачитриптилина, флуоксетина и тианептина на амплитуду ТКО у крыс

* - Р < 0 05 в сравнении с контролем, ** - Р < 0,01 в сравнении с контротсм, *** . р <0,001 в сравнении с контролем

Содержание моноаминов и их метаболитов определялось в следующих структурах мозга фронтачьная кора, прилежащее ядро, гипоталамус, стриатум, гиппокамп В резутьтаге исследования обнаружено, что ГИЖ-72 достоверно снижает содержание предшественников серотонина 5-ОИУК и 5-ОТ в тканях прилежащего ядра (Рисунок 9), а также 5-ОИУК - в тканях гипоталамуса (Рисунок 10), то есть можно утверждать, что в данных структурах ГИЖ-72 увеличивает содержание серотонина в синатическои щели

Во фронтальной коре концежрации основных моноаминов и их метаболитов посте введения ГИЖ-72 и флуоксетина очень близки, за исключением содержания дофамина

В тканях прилежащею ядра по изменению соотношений ДОФУК/ДА, ГВК/ДА и 5-ОИУК/5-ОТ ГИЖ-72 напоминает флуоксетин, также как и по тенденции к снижению содержания норадреналина

« Контроль —о— Флуоксетин 20 мт/к' —*1—ГИЖ-72 20 мг/кг НА

Рисунок 2 Влияние ГИЖ-72 п флуоксетнна на содержание моноаминов и их метаболитов в прилежащем ядре мозга крыс линям Вистар

* - Р < 0,05 в сравнении с контролем

В гипоталамусе концентрации дофамиьа и ДОФУК после введения ГИЖ-72 и флуоксетмт сходны, причем наблюдается тенденция к увечичению содержания дофамина и его метаболита по сравнению с контролем Соотношения концентраций ДОФУК/ДА и концентрации норадреналина также сходны после введения обоих препаратов

В стриатуме после введения ГИЖ-72 наб подается тендеция к увепичеииго содержания норадреналина и ГВК, чем препарат напоминает антидепрессант флуоксетин ГИЖ-72 также сходен с флуоксетином по содержанию ДОФУК и 5-ОИУК

В гиппокампе выявлена сходная с флуоксетином тенденция к снижению содержания дофамина, ДОФУК и ГВК, также как и тенденция к снижению соотношения 5-ОИУК/5-ОТ

Таким образом, ГИЖ-72 демонстрирует значительное сходство с известным антчдепрессанюм флуоксетином по содержанию многих моноаминов и их метаболитов во всех изученных структурах мозга, что, однако, не дает возможности сделать однозначных выводов относительно механизма антидепрессивного действия ГИЖ-72 Возможно, дальнейшие исследования с использованием других методов (например, радиоактивного связывания) смогут помочь в решении этой задачи

Подводя ИЮ1И всему вышесказанному, можно заключить, что изученное в данной работе соединение - производное пиразото[с]пиридина под шифром ГИЖ-72, обладает активностью, сходной с таковой изученных антидепрессантов - препаратов сравнения Характер влияния ГИЖ-72 на амтитуду ТКО позволяет предпопожить, что ГИЖ-72 как и тианептин может улучшать нейрогпастичность и, возможно, память

—»—Контроль —О—Фчуоксетин 20мг/кг —й—ГИЖ 72 20 мг/кг КЛ

Рисунок 3 Влияние ГИЖ-72 и флуоксетина на содержание мопоамииов и их метаболитов в гипота там) се мозга крыс линии Вистар

* -Р < 0,05 в сравнении с контролем

Содержание моноачинов и их метабопитов в структурах гоповного «оз^а посте введения ГИЖ-72 и современного антидепрессанта флуоксетина очень бчизко Таким образом, ГИЖ-72 можно отнести к классу антидепрсссантов Низкая токсичность, анксиолитический эффект, отсутствие миоретаксантного и седативного побочных эффектов и другие ранее изложенные преимущества дспают ГИЖ-72 перспективным соединением для дальнейшего изучения с целью внедрения на фармацевтический рынок

ВЫВОДЫ

! Среди изученных производных пиразоло[с]пиридина наиболее высокую фармакотогическую активность проявпяет соединение под шифром ГИЖ-72

2 ГИЖ-72 обчадает сочетанными антидепрессивным и анксиолитическим свойствами

3 Антидепрессивный эффект ГИЖ-72 сопоставим с эффектом амитриптилина и превышает эффекты современных антидепрессантов флуоксетина и тианептина По силе анксиотитического эффекта, опосредованного ГАМК-ергичсской системой, ГИЖ-72 превосходит диазепам

4 ГИЖ-72 малотоксичен В отчичис от диазепама ГИЖ-72 не оказывает миорелаксантного и седативнсо деРстви°, не вызывает эффекта привыкания и сохраняет анксиопитическую активность после хронического введения

5 ГИЖ-72 увечичивает амплитуду транскаллозального ответа и усиливает межполушарную передачу, это позволяет предположить, что механизм действия ГИЖ-72 связан с улучшением нейропластичности

6 ГИЖ-72 увеличивает содержание серотонина в прилежащем ядре и гипоталамусе, чем напоминает механизм действия антидепрессанта флуоксетина

Список научных трудов, опубтнкованных по теме диссертации

1 Мелетова О К , Молодавкин Г М , Воронина Т А , Глозман О М , Жг'уренко JI А

Изучение нейротропной активности производного пиразоло[с]пиридина - ГИЖ-72// Фундаментальные проблемы фармакологии, часть II, С 21 Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов, 21-25 апреля 2003 года, г Москва

2 Молодавкин Г М , Воронина Т А , Алдармаа Ж , Мелетова О К Влияние стресса различной этиологии на основные эффекты транквилизаторов - антиконфчиктный, антиагрессивный, миорелаксантный// Фундаментальные проблемы фармакотогии, часть II, С 32 Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакочогов, 21-25 апреля 2003 года, г Москва

3 Мелетова О К , Молодавкин Г М , Воронина Т А , Глозман О М , Жмуренко JI М

Изучение нейротропной активности производного 4-амино-2,6-дичетичникотиновой кислоты// Тезисы X Российского национального конгресса «Четовек и лекарство», Москва, март 2003 г , С 73

4 Молодавкин Г М , Воронина Т А, Алдармаа Ж , Мелетова О К Изменение антиагрессивного действия анксиолитиков под влиянием стресса// Экспериментальная и клиническая фармакология, 2004, т 67, № 4, С 3-6

5 Молодавкин Г М , Воронина Т А , Садикова Д У, Мелетова О К, Пчелкина М И , Ларенцова JI И , Ганышша Т С., Мирзоян Р С Вчияние анксиолитиков на поведение и электрофизиологические показатечи крыс при сосудистой паточогии мозга// Экспериментальная и клиническая фармакология, 2004, т 67, № 6, С 16-20

6 Молодавкин Г М, Воронина Т А, Мететова О К Сравнительное изучение антидепрессивной и противотрсвожной активности флуоксетина и тианептина// Эксперимента чьная и клиническая фармакология, 2005, г 68, № 3, С 10-12

7 Meletova О К. Comparative study of pharmacological activity of antidepressants fluoxetine and tianeptme//Abstracts of the 8"1 ECNP Regional Meeting, Moscow, April 14-16,2005, S 105

8 Молодавкин Г M , Воронина Т А , Незнамов Г Г., Мелетова О К , Елиава Н В Анализ участия ГАМК-бензодиазепинового рецепторного компчекса в механизме анксиолитического эффекта пирацетама// Экспериментачьная и клиническая фармакология 2006, т 69, №3, С 7-9

9 Молочавкии Г \1, Воронина ТА, Мелетовд О К Сравнительное изучение влияния амитриптилина, флуоксетина и тианептина на амплитуду лранска повального ответа у крыс// Экспериментальная и клиническая фармакология, 2007, т 70, № 1, С 3-5

10 Молодавкин Г М , Воронина Т А , Ларенцова Л И , Пчелкина М И , Мелетова О К Изучение комбинированного действия мексидола и ненаркотических анальгетиков на поведение в условиях эмоционального стресса и на болевые пороги// Экспериментальная и клиническая фармакология, принято в печать

Подписано в печать 09 04 2007 г

Отпечатано в ЗАО «Оперативное тиражирование»,

ИНН 7710243829,

ул Бол Новодмитровская, д 28

Бумага офсетная, тираж 100 экз , зак № 104/09

Актуальность темы

Тревожно-депрессивные расстройства - одна из наиболее распространенных форм психической патологии. По данным Всемирной организации здравоохранения, заболеваемость депрессиями на сегодняшний день приближается к 3 %, то есть ежегодно около 180 миллионов жителей нашей планеты обнаруживают признаки депрессии и нуждаются в адекватной медицинской помощи. Однако депрессия служит поводом к обращению за медицинской помощью не чаще, чем в 35-50 % случаев. Около 40 % всех депрессий протекает со стертыми проявлениями, причем 60-80 % больных лечатся у врачей общей практики. Тревожно-фобические расстройства среди населения составляют 5 %, а в общемедицинской сети показатель их распространенности достигает 11,9 %. При сочетании (коморбидности) тревожных и депрессивных расстройств отмечается уменьшение эффективности лечения, ухудшение прогноза заболевания (Brundtland G.H., 2000).

Среди соматически больных (сердечно-сосудистые, онкологические заболевания, диабет и др.) частота депрессий составляет 22-33 %. Депрессии ухудшают течение соматического заболевания, могут провоцировать соматическое заболевание (особенно это относится к реактивным депрессиям, нередко способствующим развитию гипертонической болезни, заболеваний кожи и т.д.), и быть реакцией на него, а также не зависеть от соматической болезни (Дороженок И.Ю., 2003). Но во всех случаях депрессия усиливает проявления, усугубляет течение телесного недуга и усложняет его лечение. Депрессия влечет за собой ряд неблагоприятных последствий как медицинского, так и социального порядка. Наблюдающееся во многих случаях затяжное течение либо частые рецидивы депрессии повышают риск самоубийств. Особенно велика опасность суицида при сочетании депрессии с хроническим соматическим или неврологическим заболеванием. Депрессия серьезно влияет на качество жизни и адаптационные возможности пациента, поскольку может привести к снижению профессионального статуса с вынужденной сменой работы, распаду семьи и, наконец, полной инвалидизации (Дороженок И.Ю., 2003).

Широкая распространенность депрессивных состояний, увеличение числа рецидивов и количества затяжных и скрытых форм, недостаточная эффективность терапии - все это определяет актуальность и научно-практическую значимость разработки новых антидепрессантов. Необходимым условием для решения указанных проблем является комплексное исследование патогенетических и фармакологических закономерностей депрессивных состояний.

Исследованию патогенетических механизмов, лежащих в основе эндогенных депрессий, посвящено много работ. Это и моделирование патологических состояний, и изучение биохимического метаболизма, и исследование гормонов, нейропептидов и т.д. Многочисленные исследования посвящены изучению обмена катехоламинов и индоламинов, которые, по современным представлениям, играют важную роль в механизмах действия антидепрессантов. Однако многолетние интенсивные биохимические исследования, проведенные в разных странах, не смогли подтвердить или опровергнуть гипотезу о недостаточности моноаминовой нейромедиации как основной причине депрессивных проявлений (Коган Б.М., Дроздов А.З., 1998).

Внедрение в клиническую практику большого количества различных антидепрессантов не привело к существенному повышению эффективности терапии эндогенных депрессий. До настоящего времени остаются неясными причины недостаточной эффективности современных антидепрессантов. Исходя из этого, повышение эффективности антидепрессивной терапии является одной из наиболее актуальных задач современной психиатрии (Мосолов С.Н., 1995; Смулевич А.Б., 2000).

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось изучение нейротропной активности ряда соединений - производных пиразоло[С]пиридина и родственных соединений.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Оценить антидепрессивную активность производных пиразоло[С]пиридина и родственных соединений по сравнению с классическими и современными антидепрессантами в экспериментах на животных.

2. Оценить анксиолитический эффект производных пиразоло[С]пиридина и родственных соединений по сравнению с классическими анксиолитиками в экспериментах на животных.

3. Оценить выраженность побочных миорелаксантного и седативного эффектов по сравнению с классическими анксиолитиками, определить широту терапевтического действия наиболее эффективного соединения.

4. Оценить уровень тревожности и сохранение анксиолитического эффекта после хронического введения наиболее эффективного соединения по сравнению с классическими анксиолитиками.

5. Оценить острую токсичность соединений, определить LD50 для наиболее эффективного соединения.

6. Оценить с помощью электрофизиологических методик влияние наиболее эффективного соединения, а также классических и современных антидепрессантов, на амплитуду транскаллозального ответа.

7. Провести биохимический анализ содержания основных моноаминов и их метаболитов в структурах мозга после введения наиболее эффективного соединения в сравнении с контролем и современным антидепрессантом флуоксетином.

Научная новизна исследований. В данной работе впервые обнаружен антидепрессивный эффект у производных пиразоло [С] пиридина и родственных соединений. При этом выраженность антидепрессивного эффекта наиболее эффективного соединения превышает эффект современных антидепрессантов флуоксетина и тианептина и сопоставима с силой антидепрессивного эффекта классического трициклического антидепрессанта амитриптилина. Эти исследования демонстрируют высокую активность новых соединений.

Обнаружен анксиолитический эффект у производных пиразоло[С] пиридина и родственных соединений, превышающий эффект диазепама. В отличие от бензодиазепиновых производных у исследуемых соединений отсутствуют такие побочные эффекты, как миорелаксантный и седативный.

Изученные соединения обладают низкой токсичностью.

Таким образом, обнаружены низкотоксичные соединения, сочетающие выраженный антидепрессивный и анксиолитический эффекты, что особенно актуально при лечении тревожно-депрессивных расстройств.

Научно-практическое значение работы. Полученные в работе данные представляют интерес для психофармакологии с точки зрения разработки нового антидепрессанта, оказывающего также анксиолитическое действие.

Апробация работы

Основные положения работы представлены на 2-м Съезде Российского Научного Общества фармакологов, Москва, 2003 г.; на 10-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2003 г.; на 8-й Международной конференции ECNP, Москва, 2005.

Публикации

По материалу диссертации опубликовано 10 работ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Среди изученных производных пиразоло[С]пиридина и родственных соединений наиболее высокую фармакологическую активность проявляет соединение под шифром ГИЖ-72.

2. ГИЖ-72 обладает сочетанными антидепрессивным и анксиолитическим свойствами.

3. Антидепрессивный эффект ГИЖ-72 сопоставим с эффектом амитриптилина и превышает эффекты современных антидепрессантов флуоксетина и тианептина. По силе анксиолитического эффекта, опосредованного ГАМК-ергической системой, ГИЖ-72 превосходит диазепам.

4. ГИЖ-72 малотоксичен. В отличие от диазепама ГИЖ-72 не оказывает миорелаксантного и седативного действия, не вызывает эффекта привыкания и сохраняет анксиолитическую активность после хронического введения.

5. ГИЖ-72 увеличивает амплитуду транскаллозального ответа и усиливает межполушарную передачу; это позволяет предположить, что механизм действия ГИЖ-72 связан с улучшением нейропластичности.

6. ГИЖ-72 увеличивает содержание серотонина в прилежащем ядре и гипоталамусе, чем по механизму действия напоминает а нтидепрессант флуоксетин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа посвящена изучению поведенческих, нейрохимических и электрофизиологических механизмов, лежащих в основе антдепрессивного, анксиолитического и других эффектов производных пиразоло[С]пиридина и родственных соединений, в частности, соединения под шифром ГИЖ-72, по сравнению с классическим трициклическим антидепрессантом амитриптилином и бензодиазепиновым анксиолитиком диазепамом и современными антидепрессантами флуоксетином - селективным ингибитором обратного захвата серотонина, и тианептином - стимулятором обратного захвата серотонина.

В первых разделах исследования на поведенческих моделях у животных изучалось наличие и выраженность антидепрессивного эффекта у производных пиразоло[С]пиридина и родственных соединений. В результате сравнительной оценки антидепрессивной активности производных пиразоло[С]пиридина и родственных соединений методом вынужденного плавания у крыс в сосуде со свободно вращающимися колесами (Андреева Н.И., 2000; Nomura S. et al., 1982; Молодавкин Г.М., 1998) максимальный антидепрессивный эффект среди изученных производных обнаружен у соединения под шифром ГИЖ-72. ГИЖ-72 был отобран для дальнейших исследований как наиболее перспективное соединение.

Антидепрессивный эффект ГИЖ-72 сравнивался с эффектами классического трициклического антидепрессанта амитриптилина и современных антидепрессантов флуоксетина и тианептина. Сравнение проводилось на модели вынужденного плавания у крыс в сосуде со свободно вращающимися колесами и на модели Порсолта (Porsolt R.D. et al., 1978). В результате данных исследований обнаружено, что ГИЖ-72 проявляет антидепрессивный эффект, превышающий эффект флуоксетина и тианептина и сравнимый с действием амитриптилина. Таким образом, обнаружено соединение, обладающее выраженной антидепрессивной активностью, при этом принципиально отличающееся по химической структуре от всех известных антидепрессантов.

Для выявления возможного механизма антидепрессивного действия ГИЖ-72 оценивалось влияние анализаторов бикукуллина, кетансерина, 5-ОТФ и L-ДОФА на активность ГИЖ-72 в вынужденном плавании у крыс в сосуде со свободно вращающимися колесами. Бикукуллин, антагонист ГАМКд-рецепторов, использовался для оценки участия ГАМК-ергической системы в реализации антидепрессивного эффекта ГИЖ-72, кетансерин, антагонист 5-ШУрецепторов, и 5-ОТФ, предшественник серотонина, - для серотонинергической системы, L-ДОФА, предшественник дофамина, - для дофаминергической системы. В качестве препаратов сравнения использованы амитриптилин (10 мг/кг), флуоксетин (20 мг/кг) и тианептин (12,5 мг/кг).

Обнаружено, что у кетансерина и бикукуллина при совместном введении с ГИЖ-72 наблюдается тенденция к увеличению числа оборотов колес животными по сравнению с эффектом ГИЖ-72; 5-ОТФ, практически не изменяет этот показатель, а L-ДОФА достоверно значимо увеличивает число оборотов колес по сравнению с эффектом ГИЖ-72. Следовательно, серотонин-, дофамин- и ГАМК-ергические системы участвуют в реализации антидепрессивного эффекта ГИЖ-72.

При анализе влияния кетансерина на эффекты тианептина, флуоксетина и амитриптилина у кетансерина обнаружена тенденция к увеличению числа оборотов колес животными по сравнению с эффектами тианептина и флуоксетина и, наоборот, к уменьшению по сравнению с эффектом амитриптилина. Таким образом, выявлен общий стимулирующий эффект антагониста 5-НТ2-рецепторов кетансерина на эффекты ГИЖ-72, флуоксетина и тианептина в тесте вынужденного плавания у крыс.

Поскольку в научной литературе описаны соединения, сходные по структуре с пиразоло[С]пиридином, обладающие анксиолитической активностью (Allen M.S., Skolnick P., Cook J.M., 1992; Melani F. et al., 1986; Francis J.E., Bennett D.A., 1991; Selleri S. et al., 2002; Costagli C. et al., 2003), мы решили оценить анксиолитический эффект исследуемых производных пиразоло [С] пиридина и родственных соединений. Обнаружено, что среди изученных соединений ГИЖ-72 проявляет максимальную анксиолитическую активность в тесте конфликтной ситуации. При сравнении анксиолитической активности ГИЖ-72 с действием диазепама в тесте конфликтной ситуации обнаружено, что эффект ГИЖ-72 превышает эффект диазепама. Таким образом, ГИЖ-72 обладает более выраженным по сравнению с действием диазепама анкиолитическим эффектом. Установлено, что при интрагастральном введении ГИЖ-72 сохраняет анксиолитический эффект, что перспективно с точки зрения использования нового препарата в условиях амбулаторного приема.

В результате оценки анксиолитического эффекта ГИЖ-72 в приподнятом крестообразном лабиринте обнаружено, что ГИЖ-72 повышает время пребывания животных в открытых рукавах лабиринта по сравнению с контролем и диазепамом, что подтверждает наличие у ГИЖ-72 выраженного анксиолитического эффекта.

Для оценки влияния флуоксетина и тианептина на тревожность и сравнения их эффектов с анксиолитическим эффектом ГИЖ-72 изучено поведение крыс в конфликтной ситуации после введения препаратов. Одновременно ставилась цель обнаружить рецепторы, через которые, по-видимому, реализует анксиолитический эффект ГИЖ-72, а также оценить участие ГАМК-ергической системы в действии на тревожность флуоксетина и тианептина.

На основе литературных данных (Supavilai P., Karobath М., 1981; Placheta Р, Singer Е., 1980; Ticku М.К., Davis W.C., 1982) мы предположили, что ГИЖ-72 связывается с БДР, которые находятся в комплексе с ГАМКА-рецепторами. Вследствие этого, эффект препарата изучался в антагонизме с бикукуллином -антагонистом ГАМКд-рецепторов.

В отличие от ГИЖ-72, обладающего анксиолитическим эффектом, установлено, что флуоксетин достоверно повышает тревожность у крыс. У тианептина обнаружена тенденция к повышению числа наказуемых взятий воды по сравнению с контролем.

Обнаружено, что бикукуллин увеличивает число наказуемых взятий воды у животных, которым вводили тианептин и флуоксетин. При этом бикукуллин наиболее значительно усиливает эффект тианептина, благодаря чему увеличение числа наказуемых взятий воды под его влиянием становится достоверным. Из данных эксперимента можно предположить, что ГАМК-ергическая система принимает участие в действии антидепрессантов на тревожность. Для объяснения полученных результатов можно использовать представление о существовании нейрональной сети в мозге, в которой высвобождение серотонина из нейронов регулируется тормозными ГАМК-ергическими интернейронами (Clements S., Schreck С.В., 2004; Labrid С., Мосаег Е., Kamoun А., 1992; Suranyi-Cadotte В.Е., Bodnoff S.R., Welner S.A., 1990). Таким образом, можно предположить, что блокирование ГАМК-рецепторов бикукуллином приводит к снижению тормозного влияния ГАМК на высвобождение серотонина и, соответственно, повышенному выбросу серотонина. В связи с вышесказанным, можно полагать, что именно повышенный выброс серотонина за счет блокирования ГАМК-рецепторов биккуллином лежит в основе достоверного анксиолитического эффекта в тесте конфликтной ситуации, наблюдающегося при сочетании тианептина с бикукуллином.

В отличие от стимулирующего эффекта на флуоксетин и тианептин, бикукуллин достоверно снижает число наказуемых взятий воды, увеличенное под влиянием ГИЖ-72, то есть уменьшает его анксиолитическое действие. Полученные результаты подтверждают наше предположение об участии ГАМК-ергической системы в реализации анксиолитического действия ГИЖ-72.

Таким образом, ГИЖ-72 сочетает выраженные антидепрессивный и анксиолитический эффекты, что характеризует его как перспективное соединение с точки зрения лечения тревожно-депрессивных расстройств.

Поскольку для бензодиазепиновых анксиолитиков характерны миорелаксантный и седативный побочные эффекты (Dundee J.W., 1992), необходимо было оценить ГИЖ-72 с точки зрения выраженности этих эффектов. Обнаружено, что ГИЖ-72 не обладает миорелаксантным эффектом даже в дозах, превышающих терапевтические. При этом ED5o для миорелаксантного эффекта составляет 243,6 мг/кг при доверительном интервале [202,9-г292,4]. Следовательно, при терапевтической дозе 20 мг/кг терапевтический индекс миорелаксантного эффекта ГИЖ-72 составляет 12,18. Диазепам вызывает выраженную миорелаксацию, что характерно для бензодиазепиновых транквилизаторов.

При исследовании седативного эффекта установлено, что ГИЖ-72 недостоверно увеличивает двигательную активность у крыс по сравнению с контролем, то есть можно утверждать, что ГИЖ-72 не обладает седативным эффектом. При этом диазепам достоверно снижает двигательную активность у крыс по сравнению с контролем, что подтверждает наличие у него седативного эффекта, характерного для бензодиазепиновых транквилизаторов (Dundee J.W., 1992). Следовательно, преимуществом ГИЖ-72 перед классическими бензодиазепиновыми транквилизаторами является отсутствие у него миорелаксантного и седативного эффектов.

Известно, что для бензодиазепиновых анксиолитиков характерно снижение анксиолитического эффекта в результате длительного применения, развитие привыкания, зависимости (Lader М., 1994; Malcolm R.J., 2003).

Для оценки подобных свойств ГИЖ-72 изучены эффекты препарата после его хронического введения животным (ежедневно в течение 1 месяца).

Оценка уровня тревожности у животных после хронического введения ГИЖ-72 (20 мг/кг, и/га) по сравнению с диазепамом (5 мг/кг, и/га) проводилась по выраженности горизонтальной и вертикальной активности у крыс в тесте открытого поля. Обнаружено, что ГИЖ-72 достоверно уменьшает вертикальную активность животных по сравнению с контрольными, что свидетельствует о снижении уровня тревожности у крыс после хронического введения ГИЖ-72.

В «абстинентных группах» (животным этих групп за день до эксперимента не вводили ГИЖ-72 или диазепам) наблюдается тенденция к увеличению вертикальной и горизонтальной активности у крыс по сравнению с крысами после хронического непрерывного введения препаратов, однако эти данные недостоверны. Следовательно, мы не можем утверждать, что ГИЖ-72 вызывает абстинентный синдром.

Для оценки сохранения анксиолитического эффекта ГИЖ-72 после хронического введения по сравнению с диазепамом и дистиллированной водой (контроль) был использован тест конфликтной ситуации. Анксиолитическая активность ГИЖ-72 и диазепама после хронического введения оценивалась по числу наказуемых взятий воды в конфликтной ситуации. Обнаружено, что диазепам недостоверно повышает этот показатель у крыс по сравнению с контрольными животными, следовательно, в результате хронического введения снижается анксиолитическая активность диазепама. В отличие от него ГИЖ-72 достоверно повышает число наказуемых взятий воды у крыс по сравнению с контрольными животными, что свидетельствует о сохранении ГИЖ-72 анксиолитического эффекта после хронического введения.

В результате ежедневной регистрации массы тела животных во время хронического введения препаратов обнаружено, что ГИЖ-72 достоверно увеличивает массу тела крыс по сравнению с контролем. Поскольку в научной литературе описан эффект снижения массы тела у крыс с депрессией по сравнению с контрольными крысами (Крупина Н.А., 2000), можно предположить сохранение антидепрессивного эффекта ГИЖ-72 после хронического введения препарата.

С точки зрения дальнейшего изучения препарата и возможного внедрения его на фармацевтический рынок необходимо было определить острую токсичность ГИЖ 72.

LD50 вещества составляет 825,3 мг/кг при доверительном интервале [704,95+966,10]. Таким образом, при терапевтической дозе ГИЖ-72 20 мг/кг терапевтический индекс препарата составляет 41,3, что говорит о низкой токсичности ГИЖ-72.

В свете новых представлений об участии нейропластичности в патогенезе депрессий особенный интерес представляет изучение влияния ГИЖ-72, амитриптилина, флуоксетина и тианептина на процессы межполушарной передачи с помощью электрофизиологических методик. При снижении нейропластичности происходят нарушение проведения возбуждения, изменение восстановления процессов в синаптической щели (длительное потенцирование или длительная депрессия), изменение числа синаптических связей (связано с изменением нейротрофических факторов), снижение нейрональной реконфигурации. Эти изменения влияют на процессы обучения и памяти, формирования эмоций (Spedding М., Lestage Р., 2005).

Мы оценивали влияние исследуемых препаратов на амплитуду транскаллозального ответа (ТКО). В результате исследования обнаружено, что амитриптилин практически не влияет на амплитуду ТКО, то есть препарат не изменяет процесс межполушарной передачи. В отличие от амитриптилина флуоксетин снижает амплитуду ТКО у крыс, то есть ослабляет процесс межполушарной передачи, и можно предположить, что оказывает негативное влияние на память, что коррелириует с данными некоторых исследователей, обнаруживших отрицательное влияние флуоксетина на память и процессы обучения (Joss et al., 2003; Huang et al., 2004).

Тианептин значительно увеличивает амплитуду ТКО у крыс по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствуют о том, что препарат положительно влияет на межполушарную передачу, и позволяют предположить его позитивное влияние на процессы памяти. Положительное влияние тианептина на память и обучение также находит отражение в работах ряда исследователей (Diamond et al., 2004; Meneses, 2002).

Известно, что тианептин, помимо усиления обратного захвата серотонина, обладает нейропротективным действием (McEwen, 2004; Spedding М., Lestage P., 2005). Способность тианетина улучшать нейропластичность и образование нейротрофических факторов может во многом объяснить его положительное влияние на амплитуду ТКО по сравнению с другими препаратами.

Предполагается, что эндогенный серотонин, влияя на обратный захват и 5-НТ(1-7) рецепторы, модулирует процессы обучения и играет существенную роль в процессах памяти (A. Meneses, 2002). Полученные нами данные подтверждают это предположение и позволяют полагать, что в реализации эффектов изученных антидепрессантов на ТКО принимает участие серотонинергическая система.

Флуоксетин - селективный ингибитор обратного захвата серотонина, повышает содержание серотонина в синаптической щели, уменьшает амплитуду ТКО и ухудшает память. Тианептин - стимулятор обратного захвата серотонина, снижает содержание серотонина в синаптической щели, повышает амплитуду ТКО и улучшает обучение и память. Таким образом, можно полагать, что эндогенный серотонин способствует ухудшению проведения возбуждения и отрицательно влияет на процессы обучения и памяти.

ГИЖ-72 увеличивает амплитуду ТКО по сравнению с контролем, однако его эффект уступает эффекту тианептина. Наличие нейпротективного механизма действия у ГИЖ-72 в настоящий момент не изучено, тем не менее, положительное влияние препарата на амплитуду ТКО позволяет предположить способность ГИЖ-72 улучшать нейропластичность, а возможно, и память. Исследование данного эффекта может стать темой для будущих работ.

Для получения данных о механизме действия ГИЖ 72 в данной работе проведено исследование его влияния на содержание моноаминов и их метаболитов в мозге по сравнению с современным антидепрессантом флуоксетином. Эксперимент проводился на 24 крысах линии Вистар.

Содержание моноаминов и их метаболитов определялось в следующих структурах мозга: фронтальная кора, прилежащее ядро, гипоталамус, стриатум, гиппокамп. В результате исследования обнаружено, что ГИЖ-72 достоверно снижает содержание метаболитов серотонина 5-ОИУК и 5-ОТ в тканях прилежащего ядра, а также 5-ОИУК - в тканях гипоталамуса, то есть можно утверждать, что в данных структурах ГИЖ-72 увеличивает содержание серотонина в синаптической щели.

Во фронтальной коре концентрации основных моноаминов и их метаболитов после введения ГИЖ-72 и флуоксетина очень близки, за исключением содержания дофамина.

В тканях прилежащего ядра по изменению соотношений ДОФУК/ДА, ГВК/ДА и 5-ОИУК/5-ОТ ГИЖ-72 напоминает флуоксетин, также как и по тенденции к снижению содержания норадреналина.

В гипоталамусе концентрации дофамина и ДОФУК после введения ГИЖ-72 и флуоксетина близки, причем наблюдается тенденция к увеличению содержания дофамина и его метаболита по сравнению с контролем. Соотношения концентраций ДОФУК/ДА и концентрации норадреналина также сходны после введения обоих препаратов.

В стриатуме после введения ГИЖ-72 наблюдается тендеция к увеличению содержания норадреналина и ГВК, чем препарат напоминает антидепрессант флуоксетин. ГИЖ-72 также сходен с флуоксетином по содержанию ДОФУК и 5-ОИУК.

В гиппокампе выявлена сходная с флуоксетином тенденция к снижению содержания дофамина, ДОФУК и ГВК, соотношения 5-ОИУК/5-ОТ.

Таким образом, ГИЖ-72 демонстрирует значительное сходство с флуоксетином по содержанию многих моноаминов и их метаболитов во всех изученных структурах мозга, что, однако, не дает возможности сделать однозначных выводов относительно механизма антидепрессивного действия ГИЖ-72. Возможно, дальнейшие исследования с использованием других методов (например, радиоактивного связывания) смогут помочь в решении этой задачи.

Подводя итоги всему вышесказанному, можно заключить, что изученное в данной работе соединение под шифром ГИЖ-72 обладает активностью, сходной с активностью изученных антидепрессантов - препаратов сравнения. Характер влияния ГИЖ-72 на амплитуду ТКО позволяет предположить, что ГИЖ-72, как тианептин, может улучшать нейропластичность и, возможно, память. Содержание моноаминов и их метаболитов в структурах головного мозга после введения ГИЖ-72 и современного антидепрессанта флуоксетина очень близко. Таким образом, ГИЖ-72 можно отнести к классу антидепрессантов. Низкая токсичность, анксиолитический эффект, отсутствие миорелаксантного и седативного побочных эффектов и другие ранее изложенные преимущества делают ГИЖ-72 перспективным соединением для дальнейшего изучения с целью внедрения на фармацевтический рынок.