Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Изучение функциональной активности фагоцитарных клеток у больных атопическим дерматитом и пиодермией

4856807

ЦЫВКИНА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

Изучение функциональной активности фагоцитарных клеток у больных атопическим дерматитом и пиодермией

Специальность: 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

1 3 ОКТ 2011

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2011 г.

4856807

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Феденко Е.С. доктор медицинских наук, профессор Пинегин Б.В.

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук Сетдикова Н.Х. доктор медицинских наук Пампура А.Н.

Ведущая организация: Российский государственный медицинский

университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита диссертации состоится ЦШЛ 2011 года в 14 часов на

заседании диссертационного совета Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корпус 2. Факс: (499) 617-10-27.

? т>')

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Автореферат разослан « 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, — '

JI.C. Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время атопический дерматит (АтД) является важной медико-социальной проблемой, значимость которой определяется его широким распространением: по данным разных авторов 15-24%, а в некоторых экологически неблагоприятных регионах около 50% населения, страдает этим заболеванием. В последние годы отмечается интенсивный рост заболеваемости АтД, наблюдается тенденция к развитию более тяжёлых, непрерывно рецидивирующих форм заболевания, сопровождающихся изнурительным кожным зудом, торпидных к традиционной терапии, протекающих с явлениями присоединения микробных осложнений. Вторичное инфицирование кожи является серьезной проблемой у большинства больных АтД. Микроорганизмы, живущие на поверхности кожи больных АтД, могут быть одним из ведущих патогенетических факторов, которые вызывают и поддерживают аллергическое воспаление. По данным различных авторов у 80-95% больных АтД Staphylococcus aureus {S. aureus) является доминирующим микроорганизмом, определяемым на пораженных участках кожи в высокой плотности [Lever R. 1988; Noble W.C. 1998].

S, aureus также является одной из важных этиологических причин пиодермий. В экономически развитых странах больные пиодермией составляют 1/3 среди пациентов, страдающих инфекционными заболеваниями. В детском возрасте заболеваемость выше, чем у взрослых, и составляет 25-60% от общего числа больных дерматозами в этом возрасте. [Масюкова СЛ., Гладько В.В., Устинов М.В. и др. 2004; Новосёлов B.C., Плиева Л.Р. 2004].

Данные заболевания имеют высокую социальную значимость, так как влияют на повседневную жизнь и работоспособность пациентов.

Известно, что в патогенезе этих заболеваний на фоне персистирующего влияния aureus, ведущую роль играют факторы врожденного иммунитета. Врожденный иммунитет - это наследственно закрепленная система защиты многоклеточных организмов от любых патогенов. Он обеспечивает распознавание и элиминацию микроорганизмов в первые часы после их вторжения и выработку сигналов, обусловливающих формирование специфического иммунного ответа [Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. 2002]. Одним из важных компонентов системы врожденного иммунитета являются антимикробные пептиды

(АМП). Защита эпителиальных поверхностей при АтД и пиодермии от патогенных микроорганизмов зависит от экспрессии АМП. Это положение основано на исследованиях, проверенных на моделях животных и человека. Уменьшение или отсутствие продукции, а также изменение активности АМП ведет к повышению чувствительности макроорганизма к микроорганизмам и к развитию заболевания. Так, например, при АтД отмечается снижение уровня таких АМП, как HBD-2, LL -37, что может предрасполагать к колонизации S. aureus и других микроорганизмов на коже у данных пациентов и способствовать частым реккурентным бактериальным инфекциям [Howell M.D., Boguniewicz М., Pastore S., et al. 2006; Ong PY„ Ohtake Т., Brandt C. et al. 2002; Siegbert Rieg, Heiko Steffen, Silke Seeber et al. 2004].

В настоящее время показано непосредственное участие АМП, как основного фактора естественной защиты против патогенных микроорганизмов, уровень которых значительно снижен при АтД, а при пиодермии и вовсе не изучен.

Принимая во внимание выше приведенные данные об иммунологических механизмах развития АтД и пиодермии, а также влияния S. aureus на патогенез данных заболеваний, необходима разработка новых методов обследования и усовершенствование уже имеющихся методов для получения наиболее полной картины о патологическом процессе, о динамике течения заболеваний и оценке эффективности проводимой терапии.

Изучение функциональной активности фагоцитарных клеток, в том числе антимикробных пептидов, возможно, позволит определить маркер системной активации нейтрофилов, который можно будет использовать при мониторинге инфекционных и воспалительных заболеваний, в частности осложненных форм атопического дерматита и пиодермии, а также в качестве лабораторного критерия проводимого иммунотропного лечения.

Цель работы: Изучить факторы врожденного иммунитета (функциональную активность фагоцитарных клеток, уровень а-дефензинов в нейтрофилах периферической крови, ß- дефензинов в кератиноцитах) у больных атопическим дерматитом и пиодермией, оценить их клиническую роль в развитии заболеваний и влияние иммунотропной терапии ликопидом.

Задачи исследования:

1. Дать клинико-аллергологическую характеристику больных АтД и пиодермией.

2. Изучить некоторые показатели иммунитета у больных исследуемых групп: субпопуляции лимфоцитов, IgA, IgG, IgM, IgE, аффинность антител.

3. Изучить особенности фагоцитоза у больных исследуемых групп.

4. Изучить содержание антимикробных пептидов в лейкоцитах периферической крови у больных атопическим дерматитом и пиодермией по сравнению со здоровыми донорами.

5. Изучить содержание антимикробных пептидов в биоптатах кожи у больных атопическим дерматитом по сравнению со здоровыми донорами.

6. Дать качественную и количественную характеристику микробиоценоза кожи у больных исследуемых групп и сопоставить с активностью антимикробных пептидов в лейкоцитах периферической крови.

7. Изучить влияние иммунотропной терапии с использованием глюкозаминилмурамилдипептида (ликопида) на клиническое течение пиодермии, на показатели иммунитета и на содержание а-дефензинов в нейтрофилах периферической крови.

Научная новизна: Впервые изучена активность а-дефензинов в лейкоцитах периферической крови и fj-дефензинов в коже у больных АтД, осложненным пиодермией, неосложненным АтД, у больных пиодермией, в сравнении с группой контроля и определено их потенциальное значение в патогенезе данных заболеваний. Впервые проведен сравнительный анализ показателей фагоцитарной активности у больных исследуемых групп. Впервые изучена взаимосвязь между активностью антимикробных пептидов в лейкоцитах периферической крови и количественным уровнем S. aureus в коже человека. Впервые оценено влияние иммунотропной терапии ликопидом на перечисленные показатели и ее клиническая эффективность в исследуемых группах.

Практическая значимость работы: Обоснована возможность использования для практического здравоохранения комплексного метода обследования фагоцитарного звена иммунитета и определения уровня а-дефензинов в лейкоцитах периферической крови, р-дефензинов в биоптатах кожи у больных с АтД и пиодермией. Усовершенствован алгоритм обследования и индивидуального подбора иммунотерапии у больных пиодермией. Обосновано

определение уровня а-дефензинов в лейкоцитах периферической крови в качестве критерия эффективности проводимой иммунотропной терапии у больных пиодермией.

Апробация работы: По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ в материалах отечественных конгрессов и в центральной научной печати. Результаты исследований были представлены на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ), Казань, Россия, 2009.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Библиографический указатель включает 138 источников, в том числе 59 отечественных и 79 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами, 28 рисунками, 2 фото.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

За период с 2007 по 2010 гг. в клинике Института иммунологии на базе отделения «Аллергии и иммунопатологии кожи» обследованы 58 пациентов, из них 27 с АтД, 31 с пиодермией. В качестве групп сравнения выбраны здоровые доноры, не страдающие аллергическими заболеваниями и гнойничковыми заболеваниями кожи: из них 17 здоровых доноров для исследования внутриклеточных а-дефензинов в периферической крови и 10 здоровых доноров для исследования р-дефензинов в биоптатах кожи.

Больные пиодермией были подразделены на 2 подгруппы: 12 человек с фурункулезом и 19 - с остиофолликулитом, среди которых 7 человек с легкой степенью тяжести, 12 - со средней степенью тяжести пиодермии и 12 человек с тяжелой пиодермией. У 7 пациентов пиодермия была в стадии ремиссии, у 24 - в стадии обострения.

Из 27 больных АтД у 12 отмечено среднетяжёлое течение, у 15 больных -тяжелое течение АтД, осложненного вторичной инфекцией.

Всем пациентам было проведено комплексное клинико-лабораторное, аллергологическое и иммунологическое обследование. Иммунологическое обследование включало определение субпопуляций лимфоцитов, уровня

сывороточных иммуноглобулинов класса А, М, G, аффинности антител, общего IgE, определение фенотипа нейтрофилов: CD16+, CDllb+, CD18+, CD32+, CD35+. Пациентам проводилось расширенное исследование фагоцитарного звена иммунитета, включавшее исследование хемилюминесценции фагоцитов (спонтанной и индуцированной зимозаном), определение поглотительной активности лейкоцитов (нейтрофилов и моноцитов) с определением фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа в отношении стафилококка с помощью проточной цитометрии, бактерицидной активности лейкоцитов периферической крови, переваривания захваченных микроорганизмов (индекса завершенности фагоцитоза). Также исследовали уровень внутриклеточных а-дефензинов в периферической крови методом проточной лазерной цитометрии с использованием мышиных моноклональных анти HNP-антител «Ну Cult biotechnology». У 11 пациентов АтД исследованы биоптаты кожи из очага поражения с целью определения Р-дефензинов методом ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR).

13 пациентов с вялотекущим течением пиодермии, торпидной к проводимому лечению, нуждались в проведении иммунотропной терапии по клиническим показаниям. Учитывая преимущественные изменения фагоцитарного звена в патогенезе хронической рецидивирующей пиодермии, в качестве иммуномодулирующего препарата использовали глюкозаминилмурамилдипептид (ликопид). Исследование проведено в 3 этапа: на первом этапе проведено комплексное обследование всех больных, на втором этапе - проведено иммунотропное лечение 13 больным: ликопид 10 мг по 1 таблетке 1 раз в день в течение 10 дней на фоне антибактериальной терапии. И на третьем этапе проводили иммунологическое обследование через 7-10 дней и через месяц после лечения, а также катамнестическое наблюдение через 12 месяцев. Эффективность проведенной терапии оценивали по следующим критериям:

• Изменение степени тяжести и распространенности пиодермии

• Частота рецидивов пиодермии

• Изменение потребности в медикаментах (системных и местных антибактериальных препаратах)

• Динамика уровня внутриклеточных а-дефензинов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При сборе аллергологического анамнеза установлено, что большинство пациентов страдало АтД с раннего детского возраста. Только у 1 пациента симптомы АтД впервые появились в возрасте 16 лет. У обследованных нами больных частота обострений АтД варьировала от непрерывно-рецидивирующего течения до 1 обострения в год (рис. 1).

до 3 обострении до 6 обостренийдо 10 обострений непрерывно-

рецидивирующее течение(более 10 обострений)

1 Среднетяжелый АтД ■ Тяжелый АтД 1

Рис. 1. Распределение пациентов со средне-тяжелым и тяжелым АтД по частоте рецидивов.

Средняя частота рецидивов АтД в год у пациентов со среднетяжелым течением составила 5,1±2,5 обострений в год, у пациентов с тяжелым течением АтД -7,8±3,3 обострений в год. Длительность обострений колебалась от 5 до 20 дней. Вторичная пиодермия у больных с тяжелым АтД встречалась в 100% случаев, у пациентов со среднетяжелым течением АтД у 11,1%. Таким образом, частота обострений АтД и осложнение вторичной инфекцией у пациентов с тяжелым течением была достоверно выше, чем у пациентов со средне-тяжелым АтД.

Давность заболевания больных хронической рецидивирующей пиодермией составила от 0,5 года до 18 лет (в среднем 5,5 лет). Частота рецидивирования пиодермии варьировала в широких границах от 1 раза в год до непрерывно-рецидивирующего течения (рис.2).

частота обострений (в год)

Рис. 2. Распределение больных пиодермией по частоте обострений в год в зависимости от клинических проявлений пиодермии.

Всем пациентам с АтД и пиодермией была проведена оценка спектра

сенсибилизации. Трем пациентам с АтД аллергологического обследования не проводили, в силу выраженного обострения кожного процесса и длительного приема антигистаминных препаратов. У большинства обследованных больных выявлена сенсибилизация к бытовым аллергенам - у 22 человек (91,6%) из 24 обследуемых, к эпидермальным аллергенам - у 7 человек (29,1%). Сенсибилизация к аллергенам пыльцы деревьев выявлена у 12 человек (50%), к пыльце злаковых трав у 9 человек (37,5%), к пыльце сорных трав у 7 человек (29,1%), поливалентный спектр сенсибилизации наблюдался у 17 человек (70,8%). Зафиксирована латентная сенсибилизация к аллергенам пыльцы деревьев, злаковых трав и сорных трав, соответственно в 25%, 16,6% и 25% случаев. Интересно отметить, что у 2 пациентов (8%) сенсибилизации к тем или иным аллергенам не выявлено (рис.3). При оценке клинических проявлений сенсибилизации у большинства пациентов АтД (19 человек - 79,1%) выявлены респираторные проявления аллергии. Круглогодичный аллергический риноконъюнктивит установлен у 19 человек (79,1%), сезонный ринит - у 16 человек (66,6%), и атопическая бронхиальная астма - у 4 человек (16,6%). У 6 (22,2%) пациентов респираторных проявлений аллергии не отмечено, как в момент включения в исследование, так и при оценке анамнестических данных. Среднее значение уровня общего ^Е у больных АтД составляло 1216,14±820,22 МЕ/мл.

При аллергологическом обследовании у большинства пациентов с пиодермией (24 человека - 77,4%) сенсибилизации не выявлено. Лишь у 22,5%

пациентов выявлена сенсибилизация к ингаляционным аллергенам. Из них у 12,9% больных - сенсибилизация носила латентный характер. При верификации атопии в 19,3% случаев установлена сенсибилизация к бытовым аллергенам, в 9,6% к аллергенам пыльцы деревьев, в 16,1% к аллергенам пыльцы злаковых трав и в 12,9% к аллергенам пыльцы сорных трав (Рис.3), с клиническими проявлениями в виде круглогодичного аллергического риноконъюнктивита (19%), сезонного аллергического риноконъюнктивита (12,9%) и бронхиальной астмы (3,2%). В большинстве случаев у обследованных пациентов с пиодермией показатель уровня общего ^Е в сыворотке крови не превышал нормальных значений (130 МЕ/мл) и составил 81,7±69,6 МЕ/мл; у 3 пациентов отмечалось повышение данного показателя от 138 МЕ/мл до 156 МЕ/мл. Таким образом, при оценке сенсибилизации к ингаляционным аллергенам в исследуемых группах каких- либо особенностей и закономерностей между течением пиодермии и сенсибилизацией выявлено не было. Данное исследование носило скрининговый характер для выявления возможной сопутствующей патологии в данной группе пациентов и впервые выявило сенсибилизацию к ингаляционным аллергенам у 7 (22,5%) пациентов с пиодермией.

Рис. 3. Спектр сенсибилизации у больных Атд (п=27) и пиодермией (п= 31).

У 18 человек из исследуемой группы пациентов с АтД и у 27 пациентов с пиодермией проводилось бактериологическое исследование материала, взятого с пораженных участков кожи с целью идентификации возбудителя. В развитии инфекционных поражений при пиодермии и поддержании воспаления при АтД преобладающим этиологическим фактором являлась условно-патогенная флора: 5.

■ Пиодермии Атопический дерматит

aureus, S. epidermidis. Рост S. aureus был обнаружен у 77,7% пациентов с АтД и у 33% пациентов с пиодермией. Плотность контаминации составила 103-105 KOE/Icm3. Рост S. aureus определяли как в монокультуре, так и в сочетании с другими микроорганизмами (табл. 1). У 2 пациентов с тяжелым АтД с явлениями вторичной инфекции и у 4 пациентов с пиодермией посев с очага поражения роста микрофлоры не дал, что, по-видимому, связано с длительным лечением местными и системными антибактериальными препаратами.

Таблица 1. Результаты бактериологического исследования мазков с кожи больных АтД (п=18) и пиодермией (п=27).

Флора, высеваемая с кожи Больные АтД (абс/%) Больные пиодермией (абс/%)

5. aureus (10-10 КОЕЛсмЗ) 14 (77,7) 9(33,3)

S. epidermidis 4 (22,2) 13 (48)

С. albicans 5 (27,7) 1 (3,7)

S. saprophytics 1 (5,5) 2(7,4)

S. aureus + S. epidermidis 1 (5,5) 3(11)

S. epidermidis+ C. albicans - 2 (7,4)

S. aureus + C. albicans 2(11,1) -

St. Intermedius - 1 (3,7)

B. cereus - 1 (3,7)

Нет роста 2(11,1) 4(14,8)

Особый интерес представляло выявление со слизистых оболочек возбудителя S. aureus. Кроме бактериологического исследования микрофлоры кожи, проводили бактериологическое исследование кала и мазков с ротоглотки. У 14 пациентов (51,8%) с АтД выявлен дисбактериоз кишечника. Причем в группе пациентов с тяжелыми проявлениями дерматита дисбактериоз диагностировали чаще. Преобладающими микроорганизмами при дисбактериозе кишечника были: S.aureus в 35,7% случаев, Candida albicans в 28,5% и гемолитический энтерококк в 28,5%. Также отмечен рост лактозонегативной кишечной палочки в 21,4% случаев (табл. 2).

При бактериологическом исследовании кала у 22 больных (71%) пиодермией выявлен дисбактериоз кишечника. Преобладающими микроорганизмами при дисбактериозе кишечника были: S.aureus в 16% случаев, лактозонегативная кишечная палочка в 16% случаев, обращало на себя внимание выраженное

снижение числа бифидобактерий у 7 пациентов (22,58%) и общего количества эшерихий у 5 пациентов (16%), а также повышение допустимого количества сульфитредуцирующих клостридий у 4 пациентов (12,9%). Рост Candida glabrata отмечен в 6,4% случаев. Выраженные явления дисбиоза кишечника у больных пиодермией, возможно, являются следствием неоднократных и длительных курсов системной антибактериальной терапии (табл. 2).

Таблица 2. Результаты бактериологического исследования фекалий на дисбактериоз у больных АтД (п=27) и пиодермией (п=31)._

Высеваемая флора Больные АтД (абс/%) Больные пиодермией (абс/%)

Дисбактериоз (всего пациентов) 14(51,8) 22 (71)

Дисбактериоз 1ст 2(7,4) 7(22,5)

Дисбактериоз 2 ст 9 (33,3) 10 (32,2)

Дисбактериоз 3 ст 3(11,1) 5(16,1)

S. aureus 9 (35,7) 5(16)

С. albicans 7 (28,5) -

С. glabrata - (6,4)

гемолитический энтерококк 7(28,5) -

лактозонегативная кишечная палочка 5 (21,4) (16)

20 пациентам с пиодермией проводили также бактериологическое исследование материала с ротоглотки. Преимущественно выделяли Candida albicans у 35% больных и S. aureus у 25%.

Таким образом, для обследованной группы больных пиодермией и АтД, как осложненным пиодермией, так и не осложненным, характерной чертой является колонизация кожи грамположительными кокками: S. aureus и S. epidermidis на фоне высокого процента контаминации слизистых этиологически-значимым возбудителем S. aureus, что подтверждает данные о существенной роли этого микроорганизма в развитии и поддержании воспаления при АтД и рецидивировании гнойных инфекций кожи.

На основании результатов общеклинического обследования у всех пациентов как с АтД, так и с пиодермией, выявлена различная сопутствующая патология, в основном органов желудочно-кишечного тракта, проводилась коррекция выявленных нарушений фармацевтическими средствами.

С целью определения всех возможных нарушений в различных звеньях иммунитета всем больным было проведено иммунологическое исследование. В иммунограмме пациентов, как с АтД, так и с пиодермией преобладали нарушения фагоцитарного звена (в 88,8% при АтД и в 100% случаев при пиодермии), гуморального звена (в 70%, как при АтД, так и при пиодермии). Изменения гуморального звена у пациентов с АтД проявлялись в основном повышением общего 1§Е, а при пиодермии повышением 1§А. У 51 % пациентов с АтД и у 42 % пациентов с пиодермией выявлены изменения субпопуляционного состава лимфоцитов (рис. 4).

Рис. 4. Частота встречаемости иммунологических нарушений при АтД и пиодермии.

Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов носили разнонаправленный характер. У 18,5% пациентов с АтД и у 29% пациентов с пиодермией выявлен как абсолютный, так и относительный лимфоцитоз. Преимущественное повышение показателей лимфоцитов может свидетельствовать об активном воспалительном процессе у обследуемых пациентов.

Снижение аффинности иммуноглобулинов до 730 уел.ед отмечено у 1 пациента с тяжелой пиодермией. Однако, существенных отклонений средних значений от нормы при оценке субпопуляций лимфоцитов, иммуноглобулинов классов в, А, М и аффинности не выявлено.

Наиболее выраженные изменения выявлены в фагоцитарном звене иммунитета.

У пациентов как с пиодермией, так и с АтД, выявлено повышение уровня спонтанной и индуцированной хемилюминесценции (у 33% пациентов с АтД и у

45% пациентов с пиодермией), а также индекса стимуляции (у 29,6% пациентов с АтД и у 54,8% пациентов с пиодермией). Данные изменения свидетельствуют о высоких резервных способностях кислородзависимой активности нейтрофилов.

При оценке фенотипа нейтрофилов как при пиодермии, так и при АтД преобладающими было повышение показателей CD32+ и снижение уровня CD11Ь+. Уровень CD16+ незначительно повышался при пиодермии, в отличие от АтД.

При исследовании бактерицидной активности сыворотки крови больных, как пиодермией, так и АтД отмечалась тенденция к ее повышению через 1 час инкубации, которая составила 35,7±5,1% у пациентов с пиодермией и 35,84±5,5% у пациентов с АтД. Повышение бактерицидное™ через 1 час инкубации до 42% выявлено у 12 пациентов с пиодермией, что составило 38,7% и, до 48% у 11 пациентов с АтД, что составило 40,7%. Повышение бактерицидности, по сравнению со здоровыми донорами, свидетельствует о наличии воспалительного процесса у этих групп пациентов. Снижение бактерицидности сыворотки крови через 1 час и 3 часа инкубации у данных пациентов свидетельствует об истощении защитных функций нейтрофилов. Снижение бактерицидности через 1 час инкубации выявлено у 2 пациентов (6,4%) с пиодермией и у 2 пациентов (7,4%) АтД. Снижение бактерицидности через 3 часа инкубации выявлено у 8 пациентов (25,8%) с пиодермией и у 6 пациентов (22,2%) с АтД.

При оценке фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов обращает на себя внимание снижение фагоцитарного числа нейтрофилов у обследуемых групп пациентов вне зависимости от степени тяжести заболевания. Так, средний уровень фагоцитарного числа нейтрофилов у пациентов с АтД составил 7,05±2,94 усл.ед., и у пациентов с пиодермией 8,06±1,9 усл.ед (при нормальных значениях 9,3±2,0 усл.ед.).

Переваривание захваченных микроорганизмов, в первую очередь, S.aureus, оценивают с помощью индекса переваривающей способности. У обследуемых групп пациентов вне зависимости от степени тяжести заболевания выявлено значимое снижение индекса переваривающей способности S.aureus у большинства пациентов обследуемых групп: 55,5% пациентов с АтД и у 67,7% пациентов с пиодермией. Так, средний уровень индекса переваривающей способности у пациентов с АтД составил 65,12±13,7 %, а у пациентов с пиодермией - 66,5±10,1%

(при нормальных значениях 78,1±7,б%). Данные изменения приводят к незавершенному фагоцитозу и к развитию кожной инфекции и длительной персистенции S.aureus на коже данных пациентов с высокой вероятностью хронизации процесса.

Известно, что дефензины обеспечивают антибактериальную защиту против широкого спектра бактерий. Высокое содержание антимикробных пептидов в циркулирующей крови уменьшает число обострений тяжелой бактериальной инфекций и обеспечивает более легкое течение заболевания. Это предположение основано на результатах ранее проведенных работ Zhang и его сотрудников [Zhang L., Yu W., Не Т. at al. 2002]. Уменьшение содержания дефензинов в фагоцитарных клетках может привести к недостаточной бактерицидное™ нейтрофилов и, как следствие, - к возникновению инфекции, в том числе, бактериальной [Cole А. М. 2005].

Нормативные показатели уровня а- и Р-дефензинов определяли у здоровых доноров. Уровень внутриклеточных а-дефензинов оценивали по средней геометрической интенсивности свечения клеток (средняя интенсивность флюоресценции). При обследовании группы доноров определили нормативные значения средней интенсивности флюоресценции внутриклеточных а-дефензинов в лейкоцитах периферической крови, которая составила 1190 (1096; 1857) усл.ед. В контрольную группу здоровых доноров вошли 17 человек без признаков пиодермии или иных воспалительных заболеваний. Среди них 12 женщин и 5 мужчин, в возрасте от 23 до 50 лет.

Р-дефензины определяли в кератиноцитах методом ПЦР. При изучении генов р-дефензинов: 1, 103, 4, 104 - оценивали уровень флуоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации. В контрольную группу здоровых доноров вошли 10 человек, не страдающие АтД и без признаков пиодермии или иных воспалительных заболеваний. Среди них 5 женщин и 5 мужчин, в возрасте от 26 до 35 лет. По генам для каждого из пациентов и доноров были получены индивидуальные значения уровня экспрессии. При исследовании содержания DEFB в биоптатах кожи определяли циклы амплификации, которые нормировали относительно RNC. Индивидуальным значением уровня экспрессии гена принято считать параметр Ct (пороговый уровень), определяющийся с помощью программного обеспечения

прибора. Для определения статистически достоверных различий уровня экспрессии между выборками здоровых и больных по каждому гену использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.

При исследовании а-дефензинов в крови у больных АтД было выявлено достоверное снижение уровня дефензинов по сравнению со здоровыми донорами на 22%. Средняя интенсивность флюоресценции внутриклеточных а-дефензинов в данной группе пациентов составила 927(653;1162) усл.ед. при норме 1190 усл.ед. (р=0,002). В зависимости от степени тяжести АтД отмечается изменение данного показателя. Как видно из рисунка 5 средняя интенсивность флюоресценции внутриклеточных дефензинов у пациентов с тяжелым АтД, осложненным вторичной инфекцией, составила 740 (533,5; 934,2) усл.ед., что на 38 % ниже по сравнению с контрольной группой (р=0,004). Снижение уровня дефензинов у пациентов с АтД может свидетельствовать о наличии воспалительного процесса на коже и о персистенции S. aureus, что является патогномоничным признаком АтД. Воспаление приводит к активации и дегрануляции нейтрофилов, при этом происходит выброс дефензинов во внеклеточное пространство, что ведет к уменьшению количества внутриклеточных дефензинов в нейтрофилах.

1190

■ здоровые доноры ВАтД В ереднетяжелый АтД а тяжелый АтД

Рис. 5. Определение уровня внутриклеточных дефензинов у пациентов с различной степенью тяжести АтД по сравнению со здоровыми донорами. *, **- р <0,05 достоверное отличие уровня дефензинов больных АтД по сравнению со здоровыми донорами.

При исследовании дефензинов у больных АтД с явлениями вторичной пиодермии было выявлено достоверное снижение уровня дефензинов по сравнению со здоровыми донорами на 22%. Для больных АтД, не осложненным

вторичной пиодермией, не характерны данные изменения. У пациентов данной группы средняя интенсивность флюоресценции внутриклеточных а-дефензинов

(

I

Рис. 6. Определение уровня внутриклеточных дефензинов больных АтД в зависимости от наличия вторичного инфицирования кожи (п=18).

* - р <0,05 достоверное отличие уровня дефензинов больных по сравнению со здоровыми донорами.

На примере пациентов с различными проявлениями пиодермии (фурункулез, остиофолликулит) нами показано, что уровень внутриклеточных а-дефензинов в нейтрофилах периферической крови снижен на 30,2 % (р=0,0001) по сравнению с показателями здоровых доноров. Средняя интенсивность флюоресценции дефензинов у данной группы больных составила 830,5 (682,75; 1130,3) усл.ед. Обращает внимание достоверное различие уровня дефензинов в зависимости от формы и степени тяжести пиодермии (рис. 7). Во всех группах пациентов с пиодермией выявлено снижение уровня а-дефензинов, причем наибольшее снижение данного показателя отмечено в группе с тяжелым течением заболевания, а также у больных с проявлениями в виде остиофолликулита.

составила 1275 {1010,5; 1596,5) усл. ед. (рис.6).

С

§ 1

§ I

ё |

Ф 2Г

Р- и

1 I

г §

I с

ч -е-

ф

1400 1200 1000 -800 -600 400 Н 200 О

1190

1275

ы

1 —

ь ц

р Е

Ц!

Г

Й

В Здоровые доноры

и АтД

В АтД с явлениями пиодермии

и АтД без явлений пиодермии

я здоровые доноры

в пиодермия

иа легкая пиодермия

■ среди етяжелая

пиодермия ш тяжелая пиодермия

ил фурункулез

<ЙЗ остиофолликулит

Рис. 7. Определение уровня внутриклеточных а-дефензинов у пациентов с разной степенью тяжести и различными формами пиодермии по сравнению со здоровыми донорами.

* - достоверное отличие уровня дефензинов больных по сравнению со здоровыми донорами (р <0,05 критерий Манна - Уитни).

Таким образом, достоверное снижение уровня а-дефензинов в нейтрофилах у больных с тяжелым течением пиодермии может служить объективным лабораторным признаком хронического бактериального воспаления, обусловленного колонизацией кожи St. aureus.

При исследовании биопсийного материала для определения содержания генов DEFB4 и DEFB - 103 у пациентов с обострением АтД с пораженного участка кожи отмечалось появление флюоресцентного сигнала (С,) DEFB4 в 8-10 циклах амплификации, и DEFB103 в 8-9 циклах амплификации, по сравнению со здоровыми донорами. В процессе исследования было обнаружено, что экспрессия гена DEFB-104 в коже больных АтД отсутствовала. Уровень достоверности различий экспрессии в коже больных атопическим дерматитом и здоровых доноров по гену DEFB - 1 оказался низким, т.к. превышал границы статистической значимости р<0,05. По генам DEFB - 103 и DEFB-4 уровень достоверности различий экспрессии больных и здоровых оказался высокозначимым и составил р<0,05 и р<0,005 соответственно (рис.8).

р<0,005 р<0,05

Рис. 8 Достоверность различий уровня экспрессии (ДО) генов БЕРВ - 1, 103 и 4 в коже больных АтД (п=11) и здоровых доноров по методу Манна-Уигни.

Таким образом, с высокой степенью достоверности можно сказать, что в очаге поражения при АтД уровень экспрессии БЕРВ - 103 (р<0,05) и БЕРВ4 (р<0,005) выше по сравнению с донорами, что свидетельствует об активном воспалительном процессе в очаге поражения при обострении АтД.

Учитывая преимущественные изменения фагоцитарного звена в патогенезе хронической рецидивирующей пиодермии, группе пациентов из 13 человек (8 пациентов с фурункулезом и 5 пациентов с остиофолликулитом) проведено иммунотропное лечение с использованием ликопида (Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН) на фоне антибактериальной терапии. У 3 пациентов применение ликопида вызвало

обострение пиодермии, однако носило умеренный характер и не требовало отмены иммунотропного лечения. При этом наступала быстрая регрессия фурункулов. Стойкая ремиссия более 1 года наблюдалась в 50% случаев, из них в 75% случаев у пациентов с фурункулезом и в 33,3 % случаев у пациентов с остиофолликулитом (рис. 9). В среднем длительность ремиссии составила 12,73±8,4 месяца, при этом сроки ремиссии у пациентов с хроническим фурункулезом были более длительные и составили 15,6±7,9 месяца, а у пациентов с остиофолликулитом 5,83±5,34 месяца. Интересно отметить, что уменьшилась не только частота рецидивов пиодермии, но и тяжесть ее течения. У 2 пациентов эффекта от проведенного лечения не было, что потребовало повторных курсов иммунотропной, антибактериальной терапии и проведения хирургического лечения. У одной пациентки с остиофолликулитом удалось добиться относительной ремиссии с уменьшением интенсивности и количества элементов пиодермии.

Г" 1 1

г ^ _ 1

1 !

.ЛЯщ 1 1_щ и Г 1 1 1 1 '¿Ш 1 в

нет эффекта 1-3 мес 3-6 мес 6-12 мес 12-20 мес более 20

мес

0 пациенты с остиофолликулитом ■ пациенты с фурункулезом

Рис. 9. Длительность ремиссии у пациентов с пиодермией (п=13) после проведенной иммунотерапии.

Анализ динамики иммунологических показателей у больных пиодермией до и после лечения отражен в таблице 3.

Табл. 3. Динамика иммунологических показателей в процессе лечения больных пиодермией (п=13).____

Норма До лечения Через 7-10 дней после лечения Через 1 мес. после лечения

Клеточное звено иммунитета

Лимфоциты, абс 1200-3000 2374,5±275,6 2408,5±708,1 2232,2±779,3

Лимфоциты, % 19-37 30,6±7,6 36±8,9 30,7±6,7

Лейкоциты 4000-9000 8200±1886,7 6600±1178,9 6923±1839,9

СБЗ+, абс 800-2200 1640,7±472,7 1835,3±563,9 1726,3±717,6

СОЗ\ % 55-80 75,6±5,8 75,9±6,5 75,2±7

СБ4+, абс 600-1600 980±204,5 1007,1±366,9 904,4±491,2

СБ4+, % 31-51 42±7,2 41,4±8,8 41,1±7,1

С08+, абс 300-800 823,8±154,9 814,3±275,6 840,8±286,7

С138+, % 19-40 34±6,6 33,8±5,2 36,1±5

Индекс СБ4+/С08+ 1,0-2,5 1,3±0,41 1,27±0,39 1,17±0,32

С019+,абс 100-500 189,7±57,8 184,7±66,6 168±97,9

С019+,% 5-19 7,46±1,9 7,76±2,2 7±2,2

Гуморальное звено иммунитета

10-350 237±148,6 207,9±113,9 247,6±115,1

ДО 900-1800 1301±168,3 1261,2±176,6 1259,2±186,2

1вМ 80-250 162,2±83 166,1±73 142,2±51,9

Аффинность Более 1000 1693±436 1701±471 1593±508

Фагоцитарное звено иммунитета

Спонтанная хемилюминесценция 10-30 23,1±6 24,56±5,6 22,3±7,8

Индуцированная хемилюминесценция 100-350 362,9±124,1 331,9±118,9 316,3±110,9

Индекс стимуляции 10-60 65,4±16,9 61,1±13,8 58,3±12,8

Бактерицидная активность (1 час) 32,5±4,9 36±5,8 33,7±3,5 34,6±6,39

Бактерицидная активность (3 часа) 62,5±7,2 57,1±8,6 56,8±5,7 60,6±6,5

Индекс переваривания 78,1±7,6 68,46±7,2 67,46±6 68,69±7,9

Фагоцитарный индекс (моноциты) 60-85 74,9±9,4 76,8±10,8 78,8±8,5

Фагоцитарный индекс(нейтрофилы) 70-95 91±5,8 89±7,5 89,2±8,9

Фагоцитарное число 3,3±1,192,6±0,4 (моноциты)

2,8±0,4

2,6±0,7

Фагоцитарное число 9,3±2 7,9±0,7

(нейтрофилы)

8,2±0,7

8,3±0,8

CD16+

977,5±177,1 1355,3±507,5 1417,15±272,5 1734,8±672,3

CDllb'

220,8±64,9 197,3±66,1 221,2±64,8 233,6±90,8

CD18+

47,4±17,5 44,2±10 43,3±8,1 50±13,3

CD32+

153,3±30,7 163,3±70,9 145,8±34,4 193,1±84

CD35+

46,3±10,7 48,9±11,1 46,4±8,3 40,3±12,6

После проведенного иммунотропного и антибактериального лечения уменьшалась воспалительная реакция, проявляющаяся в нормализации уровня лейкоцитов периферической крови. При оценке субпопуляционного состава лимфоцитов выявлено, что абсолютное число зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) и уровень экспрессии цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) увеличивался, а уровень В-лимфоцитов (CD19+) снижался после проведенного лечения. При повторном обследовании гуморального звена иммунитета была выявлена тенденция к повышению среднего уровня IgA, а также к снижению IgG и IgM. При этом средние значения данных показателей находились в пределах нормы. Функциональная активность фагоцитарного звена иммунитета после проведенного лечения характеризовалась достоверным снижением уровня индуцированной хемилюминесценции и индекса стимуляции. Через 1 месяц после иммунотропного лечения данные показатели нормализовались. Отмечалась тенденция к снижению бактерицидное™ после проведенного лечения. Способность нейтрофилов и моноцитов фагоцитировать St. aureus повышалась по сравнению с данными показателями до лечения и проявлялась в повышении фагоцитарного индекса (моноцитов) и фагоцитарного числа (нейтрофилов).

При обследовании пациентов с пиодермией через 1 месяц после проведения иммунотропной терапии ликопидом было отмечено значимое повышение средней интенсивности флюоресценции а-дефензинов до 1374 (992; 1859) усл.ед. (р<0,001). Через 7-10 дней после окончания проведения иммунотропной терапии отмечалась умеренная тенденция к повышению уровня а-дефензинов на данной стадии исследования - 934 (815; 1222) усл.ед. (рис.10).

уровень а-дефснзинов у здоровых доноров

■ уровень а-дсфензинов у больных пиодермией до лечении

ы уровень а-дефензннов через 7-10 дней после лечения

■ уровень а-дефензинов через 1 месяц после лечения

Рис. 10. Определение уровня внутриклеточных а-дефензинов у пациентов пиодермией до и после лечения.

* - достоверное отличие уровня дефензинов больных по сравнению со здоровыми донорами (р <0,05, критерий Манна - Уитни).

С целью оценки эффективности иммунотропного лечения мы провели корреляционный анализ. Метод иммунотропного лечения ликопидом показал высокую корреляцию между повышением уровня внутриклеточных а-дефензинов и клинической эффективностью в виде уменьшения частоты рецидивов (коэффициент корреляции г = 0,54 при значимости р=0,05).

Таким образом, иммунотропная терапия больных пиодермией ликопидом в дозе 10 мг по 1 таб 1 раз в сутки обеспечивает повышение уровня а- дефензинов в лейкоцитах периферической крови, что может рассматриваться как критерий эффективности лечения в совокупности с выраженным клиническим эффектом, проявляющимся в уменьшении симптомов пиодермии, удлинении сроков ремиссии, в уменьшении потребности в антибактериальной терапии и в отсутствии необходимости хирургического лечения.

При этом побочных эффектов при лечении иммуномодулятором ликопидом не отмечалось.

ВЫВОДЫ:

1. У больных АтД сенсибилизация к бытовым аллергенам выявлена в 91,6% случаев, у больных пиодермией в 19,3% случаев установлена сенсибилизация к бытовым аллергенам. Вторичная пиодермия у больных тяжелым АтД

встречалась в 100% случаев, у больных со среднетяжелым течением АтД в 11,1% случаев.

2. Средние значения субпопуляционного состава лимфоцитов были в пределах допустимых значений. Достоверное повышение IgE (р<0,05) выявлено у больных АтД, в то время как при пиодермии повышения IgE не отмечено (среднее значение данного показателя составил 81,7±69,6 МЕ/мл).

3. У 100% больных пиодермией и у 88,8% больных АтД выявлены изменения фагоцитарного звена: достоверное снижение индекса бактерицидной активности (у больных пиодермией и АтД) и фагоцитарного числа нейтрофилов (у больных АтД), изменение уровня спонтанной и индуцированной хемилюминесценции у 45% больных пиодермией и у 37% больных АтД а также индекса стимуляции у 54,8% больных пиодермией и 25,9% больных АтД.

4. У всех больных, как АтД, так и пиодермией выявлено достоверное снижение (р<0,05) уровня внутриклеточных а- дефензинов в периферической крови по сравнению со здоровыми донорами.

5. При обострении АтД отмечено достоверное повышение экспрессии ß-дефензинов (DEFB4 и DEFB - 103 ) в пораженных участках кожи по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05 ).

6. Для больных пиодермией и АтД, как осложненным, так и не осложненным вторичной инфекцией, характерна контаминация S.aureus кожи и слизистых оболочек в высокой степени плотности.

7. Длительность ремиссии пиодермии более 1 года после иммунотропного лечения ликопидом отмечалась у 50% пациентов, что сопровождалось достоверным повышением средней интенсивности флюоресценции а-дефензинов периферической крови до 1374 (992; 1859) усл. ед. (коэффициент корреляции г = 0,54 при значимости р=0,05). Таким образом, уровень а-дефензинов может служить критерием эффективности иммунотропной терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации: 1. Цывкина Е.А., Феденко Е.С., Будихина A.C. Изучение антимикробных пептидов в лейкоцитах периферической крови у больных пиодермией. Российский иммунологический журнал, 2008, том2 (11), № 2-3, стр. 185.

2. Цывкина Е.А., Феденко Е.С. Изучение антимикробных пептидов в лейкоцитах периферической крови у больных с атопическим дерматитом и пиодермией. Российский аллергологический журнал. 2009, № 3, вып. 1, стр. 126.

3. Цывкина Е.А., Феденко Е.С., Пииегин Б.В. Изучение функциональной активности фагоцитарных клеток у больных атопическим дерматитом и пиодермией. Всероссийская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы дерматологии и урогенитальной патологии», 5-6 ноября, 2009г, стр. 50-51.

4. Цывкина Е.А., Феденко Е.С., Пинегин Б.В. Антимикробные пептиды (а-дефензины) у больных атопическим дерматитом и пиодермией. Российский аллергологический журнал, 2010, №1, вып.1., стр. 203.

5. Цывкина Е.А., Феденко Е.С., Пинегин Б.В. Антимикробные пептиды - факторы противомикробной защиты при атопическом дерматите и пиодермии. Российский аллергологический журнал, 2010, №3, стр. 3-8.

6. Цывкина Е.А., Феденко Е.С., Пинегин Б.В., Будихина A.C. Оценка уровня антимикробных пептидов (а-дефензинов) в лейкоцитах периферической крови больных атопическим дерматитом и пиодермией. Российский аллергологический журнал, 2010, №5, стр. 43-47.

7. Цывкина Е.А., Феденко Е.С., Пинегин Б.В. Влияние глюкозаминилмурамилдипептида (ликопида) на уровень а-дефензинов в периферической крови у больных пиодермией. Российский аллергологический журнал, 2010, №5, вып.1„ стр. 328-329.

8. Цывкина Е.А., Феденко Е.С., Пинегин Б.В., Будихина A.C. Влияние иммунотропной терапии на уровень а-дефензинов у больных пиодермией. Российский аллергологический журнал, 2010, №6, стр. 25-30.

9. Цывкина Е.А., Феденко Е.С., Пинегин Б.В. Сравнительная клинико-иммунологическая характеристика больных атопическим дерматитом и пиодермией на фоне персистирующей колонизации кожи S. aureus. Российский аллергологический журнал, 2011, №4, вып.1., стр. 416-418.

Подписано в печать 14.07.11 . Формат 60x84/16. Бумага офисная «ЗуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ № 693 Отпечатано на УМТ РОЩ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Показатели уровня а- дефензинов у здоровых доноров.85

Показатели уровня р- дефензинов у здоровых доноров.86

Заключение.89

Клиническая, аллергологическая и иммунологическая характеристика группы больных пиодермией.90

Общая характеристика группы.90

Результаты аллергологического обследования.92

Характеристика микробиоценоза кожи и слизистых.94

Результаты общеклинического обследования.96

Результаты иммунологического исследования.99

Исследование уровня а-дефензинов у пациентов с пиодермией.104

Характеристика группы пациентов до и после иммунотропной терапии.106

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.122

ВЫВОДЫ.132

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.134

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Аг - аллерген

АМП- антимикробный пептид Ат- антитело

АтД- атопический дерматит

БСА -бычий сывороточный альбумин

ГКС- глюкокортикостероиды

ГМДП -глюкозаминилмурамилдипептид

ЖВП - желчевыводящие пути

ЖКТ- желудочно-кишечный тракт

ИМП - иммуномодуляторы микробного происхождения

ИРИ- иммунорегуляторный индекс

ИС- индекс стимуляции

ЛПС- липополисахарид

МДП -мурамилдипептид

НАДФН- никотинамидадениндинуклеотид фосфат восстановленный

ПЦР — полимеразно-цепная реакция

РНК- рибонуклеиновая кислота

ФСБ- фосфатно-солевой буфер

XJI- хемилюминесценция

ХРП -хроническая рецидивирующая пиодермия

ХРФ- хронический рецидивирующий фурункулез

CD- cluster differentiation - поверхностный лейкоцитарный антиген соответствующего дифференцировочного кластера Dot Plot - точечный рисунок в системе координат х/у FACS- флюоресцентно активированный клеточный сортировщик hCapl8/LL37 - кателицидин

HBD (Human beta defensins)- бета дефензины человека

HNP (Human neutrophils peptides)- пептиды нейтрофилов человека

HP- Helicobacter pylori

GeoMean -средняя геометрическая интенсивность флюоресценции клеток ICAM (intercellular adhesion molecule) - молекулы межклеточной адгезии Ig- иммуноглобулин NK клетки -нормальные киллеры

РАМР (patogen-associated molecular patterns) - ПАМП (патоген-ассоциированные молекулярные паттерны) Real-Time PCR -полимеразно -цепная реакция в реальном времени SCORAD (Scoring of Atopic Dermatitis) — шкала для оценки степени тяжести

АтД Th- Т-хелпер

Список сокращений статистических показателей М среднее значение медиана

Me

Qi Q3

SD стандартное отклонение нижний квартиль верхний квартиль

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы диссертации.

В настоящее время атопический дерматит (АтД) является важной медико-социальной проблемой, значимость которой определяется его широким распространением: по данным разных авторов 15-24%, а в некоторых экологически неблагоприятных регионах около 50% детского населения страдает этим заболеванием. В последние годы отмечается интенсивный рост заболеваемости АтД, наблюдается тенденция к развитию более тяжёлых, непрерывно рецидивирующих форм заболевания, сопровождающихся изнурительным кожным зудом, торпидных к традиционной терапии, протекающих с явлениями присоединения микробных осложнений. Тяжесть заболевания, особенно при наличии вторичного инфицирования, влияет на социальную деятельность и работоспособность пациентов с АтД. Наличие вторичного инфицирования кожи является серьезной проблемой у большинства больных АтД. Микроорганизмы, живущие на поверхности кожи больных АтД,. могут быть одним из важнейших, а у некоторых пациентов ведущим патогенетическим фактором, который вызывает и поддерживает аллергическое воспаление. По данным различных авторов у 80-95% больных АтД Staphylococcus aureus (S. aureus) является доминирующим микроорганизмом, определяемым на пораженных участках кожи в высокой плотности [105, 110].

S. aureus также является одной из важных этиологических причин пиодермий — острых и хронических, поверхностных и глубоких воспалительных заболеваний кожи, вызываемых гноеродными микроорганизмами. В экономически развитых странах больные пиодермией составляют 1/3 среди пациентов, страдающих инфекционными заболеваниями, и составляет с среднем от 17 до 43%. В детском возрасте заболеваемость выше, чем у взрослых, и составляет 25-60% от общего числа заболеваний дерматозами в этом возрасте [30, 35]. С данной группой 7 заболеваний встречаются врачи практически всех специальностей. Довольно часто обострение пиодермии приводит к временной потере трудоспособности пациентов, что обуславливает социальную значимость этой патологии.

Известно, что в патогенезе данных заболеваний на фоне персистирующего влияния S. aureus, ведущую роль играют факторы врожденного иммунитета. Врожденный иммунитет — это наследственно закрепленная система защиты многоклеточных организмов от любых патогенов. Он обеспечивает распознавание и элиминацию микроорганизмов в первые часы после их вторжения и выработку сигналов, обусловливающих формирование специфического иммунного ответа [52]. Одним из важных компонентов системы врожденного иммунитета являются антимикробные пептиды (АМП).

Защита эпителиальных поверхностей при АтД и пиодермии от патогенных микроорганизмов зависит от экспрессии АМП. Это положение основано на исследованиях, проверенных на моделях животных и человека. Уменьшение или отсутствие продукции, а также изменение активности АМП ведет к повышению чувствительности макроорганизма к микроорганизмам и к развитию заболевания. Так, например, при АтД отмечается снижение уровня таких АМП, как HBD-2, LL -37, что может предрасполагать к колонизации S. aureus и других микроорганизмов1 на коже у данных пациентов и. способствовать частым реккурентным бактериальным инфекциям [92, 114, 124]. Другие заболевания редко сопровождаются повышенной колонизацией S. aureus и пиодермией, что, возможно, связано с нормальным содержанием АМП, как например, при псориазе, дисгидротической экземе.

В настоящее время показано непосредственное участие АМП, как основного фактора естественной защиты против патогенных микроорганизмов, уровень которых значительно снижен в кератиноцитах кожи при АтД, а при пиодермии и вовсе не изучен. Причем исследование АМП только в кератиноцитах вряд ли покажет истинную картину заболевания, поэтому целесообразно проводить определение уровня АМП в лейкоцитах периферической крови.

Принимая во внимание выше приведенные данные об иммунологических механизмах развития АтД и пиодермии, а также о влиянии S. aureus на патогенез данных заболеваний, необходима разработка новых методов исследования и усовершенствование уже имеющихся методов для получения наиболее полной картины о патологическом процессе, о динамике течения заболеваний и оценке эффективности проводимой.терапии.

Изучение функциональной активности фагоцитарных клеток, в том числе антимикробных пептидов, возможно, позволит определить маркер системной активации нейтрофилов, который можно будет использовать при мониторинге инфекционных и воспалительных заболеваний, в частности осложненных форм атопического дерматита и пиодермии, а также в качестве лабораторного критерия проводимого иммунотропного лечения. Цель исследования.

Изучить факторы врожденного иммунитета (функциональную активность фагоцитарных клеток, уровень а-дефензинов в нейтрофилах периферической крови, Р- дефензинов в кератиноцитах) у больных атопическим дерматитом и пиодермией, оценить их клиническую роль в развитии заболеваний и влияние иммунотропной терапии ликопидом. Для решения поставленной цели определены следующие задачи:

1. Дать клинико-аллергологическую характеристику больных АтД и пиодермией.

2. Изучить некоторые показатели иммунитета у больных исследуемых групп: субпопуляции лимфоцитов, IgA, IgG, IgM, IgE, аффинность антител.

3. Изучить особенности фагоцитоза у больных исследуемых групп.

4. Изучить содержание антимикробных пептидов в лейкоцитах периферической крови у больных атопическим дерматитом и пиодермией по сравнению со здоровыми донорами.

5. Изучить содержание антимикробных пептидов в биоптатах кожи у больных атопическим дерматитом по сравнению со здоровыми донорами.

6. Дать качественную и количественную характеристику микробиоценоза кожи у больных исследуемых групп и сопоставить с активностью антимикробных пептидов лейкоцитов периферической крови.

7. Изучить влияние иммунотропной терапии с использованием глюкозаминилмурамилдипептида (ликопида) на клиническое течение пиодермии, на показатели иммунитета и на содержание а-дефензинов в нейтрофилах периферической крови.

Научная новизна.

Впервые изучена активность а-дефензинов в лейкоцитах периферической крови у больных атопическим дерматитом, осложненным пиодермией, неосложненным АтД, у больных пиодермией, в. сравнении с группой контроля и определено их потенциальное значение в патогенезе данных заболеваний. Впервые проведен сравнительный анализ показателей фагоцитарной активности у больных исследуемых групп. Впервые изучена взаимосвязь между активностью антимикробных пептидов в лейкоцитах периферической крови и количественным уровнем S. aureus в коже человека. Впервые оценено влияние иммунотропной терапии ликопидом на перечисленные показатели и ее клиническая эффективность в исследуемых группах.

Практическая значимость работы

Обоснована возможность использования для практического здравоохранения комплексного метода обследования фагоцитарного звена иммунитета и определения уровня а-дефензинов в лейкоцитах

10 периферической крови, (3-дефензинов в биоптатах кожи у больных с АтД и пиодермией. Усовершенствован алгоритм обследования и индивидуального подбора иммунотерапии у больных пиодермией. Обосновано определение уровня а-дефензинов в лейкоцитах периферической крови в качестве критерия эффективности проводимой имунотропной терапии у больных с пиодермией.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ в материалах отечественных и международных конгрессов и в центральной научной печати. Результаты исследований были представлены на X Национальном конгрессе Российской Ассоциации Аллергологов и Клинических Иммунологов (РААКИ), Казань, Россия, 2009. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов. Библиографический указатель включает 138 источников, в том числе 59 отечественных и 79 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами, 28 рисунками, 2 фото.

выводы

1. У больных АтД сенсибилизация к бытовым аллергенам выявлена в 91,6% случаев, у больных пиодермией в 19,3% случаев установлена сенсибилизация к бытовым аллергенам. Вторичная пиодермия у больных тяжелым АтД встречалась в 100% случаев, у больных со среднетяжелым течением АтД в 11,1% случаев.

2. Средние значения субпопуляционного состава лимфоцитов были в пределах допустимых значений. Достоверное повышение IgE (р<0,05) выявлено у больных АтД, в то время как при пиодермии повышения IgE не отмечено (среднее значение данного показателя составил 81,7±69,6 МЕ/мл).

3. У 100% больных пиодермией и у 88,8% больных АтД выявлены изменения фагоцитарного .звена: достоверное снижение индекса бактерицидной активности (у больных пиодермией и АтД) и фагоцитарного числа нейтрофилов (у больных АтД), изменение уровня спонтанной и индуцированной хемилюминесценции у 45% больных пиодермией и у 37% больных АтД а также индекса стимуляции у 54,8% больных пиодермией и 25,9% больных АтД.

4. У всех больных, как АтД, так и пиодермией выявлено достоверное снижение (р<0,05) уровня внутриклеточных а- дефензинов в периферической крови по сравнению со здоровыми донорами.

5. При обострении АтД отмечено достоверное повышение экспрессии (3-дефензинов (DEFB4 и DEFB - 103 ) в пораженных участках кожи по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05 ).

6. Для больных пиодермией и АтД, как осложненным, так и не осложненным вторичной инфекцией, характерна контаминация S. aureus кожи и слизистых оболочек в высокой степени плотности.

7. Длительность ремиссии пиодермии более 1 года после иммунотропного лечения ликопидом отмечалась у 50% пациентов, что сопровождалось

132 достоверным повышением средней интенсивности флюоресценции а-дефензинов периферической крови до 1374 (992; 1859) усл. ед. (коэффициент корреляции г = 0,54 при значимости р=0,05). Таким образом, уровень а-дефензинов может служить критерием эффективности иммунотропной терапии.

Заключение.

Таким образом, их 27 обследованных больных АтД в возрасте 29,92±9,02 лет у 15 человек (55,6%) отмечено тяжелое течение АтД, осложненного вторичной инфекцией и у 12 человек (44,4%) - средняя степень тяжести заболевания. При аллергообследовании наиболее часто встречающимися аллергенами являются бытовые аллергены у 22 человек (91,6%) из 24 обследуемых, а уровень общего IgE у больных АтД составил 1216,14±820,22 МЕ/мл.

Исследование микробиоценоза кожи показало, что в подавляющем большинстве случаев у больных АтД, как осложненным вторичной инфекцией, так и не осложненным АтД, высеваются грамположительные кокки. Рост S. aureus был обнаружен у 14 пациентов (77,7%). Рост S. epidermidis был обнаружен у 4 пациентов (22,2%). На основании результатов общеклинического обследования в 100% случаев выявлена различная сопутствующая патология, в основном органов желудочно-кишечного тракта, в том числе дисбактериоз кишечника, который в 35,7% случаев был ассоциирован со S. aureus. При иммунологическом обследовании преобладали нарушения фагоцитарного звена (в 88,8%), гуморального звена (в 70%), проявлявшиеся, в основном, в повышении общего IgE. У 51 % пациентов выявлены изменения клеточного звена иммунитета. При исследовании дефензинов у больных АтД было выявлено достоверное снижение их уровня по сравнению со здоровыми донорами на 22%, особенно у пациентов с тяжелым АтД, осложненным вторичной инфекцией - на 38 % ниже по сравнению с контрольной группой. На основании данных ПНР исследования можно сделать заключение о том, что у пациентов с обострением АтД в пораженном участке кожи, по сравнению со здоровыми донорами, отмечается достоверное увеличение уровня следующих иммунологических параметров: DEFB4, DEFB103. При этом DEFB104 отсутствует в коже как здоровых доноров, так и пациентов с АтД.

Клиническая, аллергологическая и иммунологическая характеристика группы больных пиодермией.

Общая характеристика группы.

В течение 2007 - 2010 годов в клинике Института иммунологии на базе отделения «Аллергии и иммунопатологии кожи» обследован 31 пациент с пиодермией, из них 17 женщин (55%), 14 мужчин (45%). Возраст больных варьировал в диапазоне от 18 до 45 лет, средний возраст составил -27,25±7,38 года, у женщин от 20 до 45 лет, средний возраст - 29,47±7,93 лет, и у мужчин от 18 до 41 года, средний возраст - 25,07±6,33 лет (рис. 19). до 20 20-29 30-39 старше

ПЛОПОЛФ 40

Рис. 19. Распределение больных пиодермией по полу и возрасту. По оси абсцисс - возраст мужчин и женщин. По оси ординат - число больных.

Таким образом, пациенты с пиодермией - молодые люди трудоспособного возраста, что показывает социальную значимость этого заболевания.

Пациенты находились на лечении и обследовании с диагнозом «Хроническая рецидивирующая пиодермия» с клиническими проявлениями в виде фурункулеза (12 человек) и остиофолликулита (19 человек). Степень тяжести пиодермии определялась в соответствии с классификацией Савицкой Л.Н (1987г) [42].

Тяжелая степень тяжести — диссеминированные, множественные, непрерывно-рецидивирующие очаги пиодермии, сопровождающиеся симптомами общей интоксикации (слабость, головная боль, снижение работоспособности, повышение температуры тела, потливость).

Средняя степень тяжести- одиночные или множественные элементы пиодермии, с рецидивами от 1 до Зраз в год. Иногда обострения сопровождаются увеличением регионарных лимфатических узлов, незначительными признаками интоксикации.

Легкая степень тяжести — одиночные гнойные элементы, сопровождающиеся умеренной воспалительной реакцией, с рецидивами 1-2 раза в год, без явлений интоксикации.

Среди обследованных больных было 7 человек (22,6%) с легкой степенью тяжести, на долю пациентов со средней степенью тяжести пиодермии и с тяжелой пиодермией приходилось по 12 человек (38,7%). У 7 пациентов пиодермия была в стадии ремиссии, у 24 - в стадии обострения. У 5 больных (16,1%) с обострением хронического фурункулеза отмечались симптомы общей интоксикации: повышение температуры тела до субфебрильных значений, слабость, головная боль, потливость, лейкоцитоз до 17*109/л, ускорение СОЭ до 40 мм/ч.

Давность заболевания больных хронической рецидивирующей пиодермией составила от 0,5 года до 18 лет (в среднем 5,67 ± 0,72 года). Частота рецидивирования пиодермии варьировала в широких границах от 1 раза в год до непрерывно-рецидивирующего течения (рис. 20).

1-2 раза до 5 раз до 10 раз более 10 раз частота обострений (в год)

Рис. 20. Распределение больных пиодермией по частоте обострений в год в зависимости от клинических проявлений пиодермии.

По оси абсцисс - частота обострений в год. По оси ординат - число пациентов.

Результаты аллергологического обследования.

При аллергологическом обследовании у большинства пациентов (24 человека, что составило 77,4%) сенсибилизации не выявлено. Лишь у 7 (22,5%) пациентов выявлена сенсибилизация к ингаляционным аллергенам, из них в 19,3% случаев установлена сенсибилизация к бытовым аллергенам, в 9,6% к аллергенам пыльцы деревьев, в 16,1% к аллергенам пыльцы злаковых трав и в 12,9% к аллергенам пыльцы сорных трав, с клиническими проявлениями в виде круглогодичного аллергического риноконъюнктивита (19%), сезонного аллергического риноконъюнктивита (12,9%) и бронхиальной астмы (3,2%). У 12,9% больных - сенсибилизация носила латентный характер (Таб.10). В большинстве случаев у обследованных пациентов с пиодермией показатель уровня общего 1§Е в сыворотке крови не превышал нормальных значений (130 МЕ/мл) и составил 81,7±69,6 МЕ/мл; у

3 пациентов отмечалось повышение данного показателя от 138 МЕ/мл до 156 МЕ/мл.