Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунофенотип и функциональная активность лимфоцитов, выделенных из печени, пораженной опухолевым процессом

На правах рукописи

Кузовлев Евгений Николаевич

Иммунофенотип и функциональная активность лимфоцитов, выделенных из

ъ

печени, пораженной опухолевым процессом

14 00 36 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

11111111111

ООЗ166154

ч______ ___^

Москва-2008 г.

Работа выполнена в ГУ Российский онкологический научный центр им Н Н БлохинаРАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Киселевский Михаил Валентинович

Доненко Федор Витальевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Калюжин Олег Витальевич

доктор медицинских наук

Блюменберг Анна Генриховна

Ведущая организация:

ММА им И М Сеченова

Защита состоится « 19-» АПРЕЛЯ 2008 года в часов на заседани диссертационного совета Д 001 035 01 в ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН по адресу 105064, г Москва, Малый Казенный пер Д 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им И И Мечникова РАМН

Автореферат разослан « » марта 2008 г

Ученый секретарь Яковлева

диссертационного совета кандидат биологических наук

"У Ирина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Заболеваемость злокачественными новообразования в последние десятилетия в России постоянно возрастает и, как показывают расчеты, прирост числа онкологических больных в XXI веке будет постоянно увеличиваться На современном этапе, несмотря на развитие медицины, по-прежнему основными методами лечения рака остается хирургический и химиотерапевтический При основных локализациях неоплазий показатель резектабельности по отношению к числу заболевших не превышает 20%, а около 50% оперированных больных умирают в первые два года от прогрессирования заболевания После радикальных и условно-радикальных операций больные умирают не столько от рецидива опухоли, сколько от отдаленных метастазов, что свидетельствует о необходимости проведения системного лечения даже при местно-распространенных формах злокачественных новообразований Современные схемы химиотерапии оказываются недостаточно эффективными, прежде всего, при так называемых иммуночувствительных формах неоплазий (меланома, рак почки) и ряде относительно химиорезистентных форм рака (немелкоклеточный рак легкого, рак желудка, метастатические поражения печени и т п) Поэтому поиск методов, направленных на стимуляцию противоопухолевого иммунитета и повышение распознаваемости опухолевых антигенов, представляется перспективным [Давыдов М И с соавт , 2000]

Опухолевое поражение печени может быть как самостоятельным заболеванием, так и метастатическим, и отмечается при многих онкологических заболеваниях Но и в том и в другом случае развитие как первичного, так и метастатического узла в печени указывает на резкое ухудшение прогноза в течении заболевания Такое ухудшение прогноза связывают с тем, что развитие онкологического процесса в печени может наблюдаться на фоне практически полного истощения иммунной системы организма и, в частности, иммунной системы этого органа

Иммунная система печени включает в себя большинство компонентов врожденной иммунной системы (натуральные киллеры (НК), натуральные киллеры-Т-клетки (НКТ-клетки), дендритные клетки, макрофаги и др) и небольшую часть эффекторов специфического иммунитета (Т-клетки) [Beaudoin L et al, 2002] Взаимосвязь между этими двумя звеньями иммунной защиты печени до конца не изучена О роли специфического иммунного ответа известно достаточно много, гораздо меньше сведений посвящено другим субклассам мононуклеарных клеток печени, особенно об их участии в инициации иммунного ответа

НКТ-клетки печени составляют основную часть Т-клеточной популяции этого органа Информация о популяции НКТ-клеток в печени человека весьма малочисленна и противоречива Практически все сведения об их внутрипеченочной активации и взаимодействии с другими звеньями иммунной системы печени были получены в эксперименте на мышах Однако участие НКТ-клеток печени в противоопухолевом иммунитете остается мало изученным [Berzins S Р et al, 2004]

Очевидным является то, что НКТ-клетки охватывают более гетерогенную популяцию Т-лимфоцитов, чем считалось изначально [Fuji N et al, 2000] Дальнейший анализ функций НКТ-клеток печени и исследование их иммунофенотипа является крайне важным в оценке роли НКТ-клеток в противоопухолевом иммунитете

Цель исследования

Изучение иммунофенотипа и функциональной активности мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из печени онкологических больных, пораженной опухолевым процессом

Задачи исследования

1 Изучить содержание лимфоцитов в пораженных метастазами и интактных участках печени

2 Исследовать морфологические особенности лимфоцитов печени, пораженной опухолевым процессом

3 Оценить цитотоксическую активность лимфоцитов из паратуморальной области и периферической крови онкологических больных

4 Провести сравнительный иммунофенотипический анализ мононуклеарных лейкоцитов паратуморальной области и интактных участков печени

5 Исследовать особенности иммунофенотипа и киллерных свойств лимфокин-активированных киллеров, генерированных из мононуклеарных лейкоцитов паратуморальной области, интактного участка печени и периферической крови

Основные положения, выносимые на защиту

1 На фоне развития опухолевого процесса в печени формируются лимфоидные инфильтраты, локализующиеся главным образом в паратуморальной области Лимфоциты, инфильтрирующие печень, представлены тремя основными популяциями клеток Т-клетками (СОЗ+), НК (СЬ16+, СБ56+, СБ57+) и НКТ (СОЗ+/СЭ56+)

2 Лимфоциты, выделенные из паратуморальной области, характеризуются более высоким уровнем НК-активности и цитотоксическим потенциалом по отношению к аутологичным опухолевым клеткам, по сравнению с лимфоцитами периферической крови онкологических больных

3 Лимфоциты, выделенные из пораженной опухолевым процессом печени, могут рассматриваться в качестве источника для получения лимфокин активированных киллеров (ЛАК) и их последующего использования для адоптивной иммунотерапии

Научная новизна

Впервые в сравнительном аспекте исследованы морфологические

иммунофенотипические и функциональные свойства лимфоцитов, выделенных

из параметастатического, интактного участков печени и периферической крови

онкологических больных

Установлено, что особенностью иммунного процесса при онкологических заболеваниях печени является формирование лимфоидных инфильтратов в паратуморальной области

Впервые установлено, что лимфоциты параметастатической области печени обладают высокой спонтанной цитотоксической и НК активностью, сопоставимой с таковой для ЛАК Впервые показана возможность получения из лимфоцитов печени онкологических больных ЛАК, способных эффективно лизировать аутологичные опухолевые клетки

Впервые установлено, что в области опухолевых узлов образуются лимфоидные инфильтраты, состоящие из Т-лимфоцитов, НК и НКТ, характеризующихся высоким уровнем экспрессии молекул адгезии и маркера пролиферации К167 Исследованы имунофенотипические и функциональные свойства ЛАК, генерированных из лимфоцитов, инфильтрирующих печень

Получены новые данные о соотношении субпопуляции лимфоцитов в различных участках печени на фоне опухолевой прогрессии

Научно-практическая значимость

Полученные в работе данные расширяют представления о механизмах местного противоопухолевого иммунитета В ходе исследования отработан алгоритм экстракорпоральной генерации из лимфоцитов, выделенных из пораженной опухолевым процессом печени, ЛАК с высоким уровнем киллерной активности по отношению к аутологичным клеткам ЛАК, генерированные из лимфоцитов печени, могут быть использованы для локорегиональной адоптивной иммунотерапии радикально и условно-радикально оперированных больных с целью профилактики рецидивов метастазирования в печени

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на совместном заседании кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией ММА им И М Сеченова и лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН (Москва 2007г )

Основные положения диссертации доложены на II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитации (Москва, 2005 г ) и на VII Российской конференции «Новые отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2007 г )

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 9 научных публикациях Из них две в журналах, рекомендованных ВАК

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, материалов и методов исследования, двух глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и указателя литературы, иллюстрирована 16 таблицами и 17 рисунками Объем диссертации - 109 страниц машинописного текста, было использовано 198 источников литературы из них 7 отечественых и 191 зарубежных

Материалы и методы исследования

Исследование проведены на мышах 20 образцах резецированной во время операции печени онкологических больных

Экспериментальные животные

В работе использовано 100 мышей линии DBA/2

Модели опухолей и методика их перевивки В качестве моделей опухолей использовали опухолевые клетки рака яичников мышей СаО-1 и НК-чувствительные линии К-562 и YAC-1 Клетки линии Сао-1

имплантировали мышам под капсулу печени в концентрации 500 тыс кл /мышь

Выделение мононуклеаров периферической крови (МНПК) МНПК выделяли из стабилизированной гепарином (25 Ед /мл) периферической крови на градиенте фиколла («Pharmacia», плотностью 1 077 г/смЗ)

Выделение мононуклеарных лейкоцитов (MHJI) из интактной и паратуморальной областей печени Из фрагментов печени, полученных после резекции этого органа, была получена клеточная суспензия Гепатоциты отделяли от МНЛ путем центрифугирования при 50 g в течение 5 минут МНЛ выделяли с помощью центирифугирования в градиенте фиколла («Pharmacia», плотностью 1 077 г/смЗ)

Получение опухолевых клеток из опухолевого узла печени Из метастатического узла получали суспензию опухолевых клеток, которую затем дважды отмывали в растворе Хенкса и ресуспендировали в полной культуральной среде

Цитологическое исследование Из взвеси МНЛ, полученных из различных участков пораженной опухолью печени, готовили мазки, которые фиксировали метиловым спиртом и окрашивали эозином азуром-2 по Романовскому-Гимза, метиловым зеленым пиронином по Браше на РНК с контрольной обработкой РНК-азой Фотографирование меченых клеток и окрашенных мазков производили с использованием системы АхюVision 4 (Carl Zeiss, Германия)

Цитотоксический тест НК-активность определяли на линии К-562, клетки которой культивировали в полной культуральной среде при 37°С в атмосфере 4% С02 Для определения противоопухолевой активности (цитотоксичности) МНЛ печени использовали аутологические опухолевые клетки Опухолевые клетки (1x104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с МНЛ (в соотношении 1 5) в плоскодонных 96-луночных микропланшетах (Costar, Франция) 18 часов Затем в лунки добавлялся витальный краситель МТТ (Sigma, США) и по оптической плотности, измеряемой на мультискане МСС-340 (Labsystem, Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых

клеток -цитотоксический индекс (ЦИ) ЦИ(%)=[1-(ОПЭ+М - ОПэ )/ОПМ]хЮО

Где ОПЭ+М — значение оптической плотности в опытных сериях, ОПэ - значение оптической плотности в лунках с эффекторами, ОПМ - значение оптической плотности в лунках с мишенями

Проточная цитометрия (FACS-анализ) Определение экспрессии поверхностных маркеров MHJI проводили при помощи моноклональных антител против соответствующих антигенов (Caltag Laboratories, США), результаты учитывали методом проточной цитофлюорометрии на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, США) На MHJ1 исследовали уровни экспрессии дифференцировочных антигенов CD3, CD4, CD8, CD 16, активационных антигенов CD25, CD38, HLA-DR, молекул адгезии CD57, CD58 Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток При учете результатов подсчитывали 10 ООО клеток в гейте

Иммуноцитохгшическое исследование Иммуноцитохимическое выявление микрометастазов проводили с помощью реактивов фирмы «ДАКО» (DAKO LSAB System, США)

Статистические методы Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента при помощи стандартного пакета статистических программ Windows 2000 (StatSoft 6), Excel и WmMdi

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологическая характеристика моионуклеарных лейкоцитов инфильтрирующих опухоли печени у мышей

Мышам линии DBA/2 посредством чрезкожной пункции в паренхиму печени вводи взвесь опухолевых клеток рака яичников СаО-1 На 14 сутки после имплантации опухолевых клеток в печени обнаруживались опухолевые узлы овальной формы от 3 до 15 мм в диаметре, прорастающие окружающие

ткани

При гистологическом исследовании паратуморальных участков печени было установлено, что опухолевые узлы окружены массивным инфильтрационным валом По своему клеточному составу инфильтраты могут быть отнесены лимоиндно-гистиоцитарным, и представлены преимущественно лимфоидными клетками и моноцитами-макрофагами Лимфоидная инфильтрация у различных особей может иметь как диффузный, так и локальный характер, однако во всех случаях мононуклеарные лейкоциты локализуются преимущественно вокруг опухолевых узлов и в значительно меньшей степени инфильтрируют ткань опухоли

Таким образом, на фоне формирования опухолевых узлов в печени мышей определяются инфильтраты из мононуклеарных лейкоцитов, расположенные главным образом в паратуморальной области

Изучение иммунофенотипа мононуклеарных лимфоцитов печени мышей пораженной опухолевым процессом

Для оценки субпопуляционного состава клеточных инфильтратов в печени у мышей с инплантированной опухолью рака яичников СаО-1 были проведены исследования поверностных маркеров МНЛ с использованием моноклональных антител На первом этапе учитывая имеющиеся данные о преобладании в печени мышей, пораженной опухолью, особой субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране маркеры Т-лимфоцитов и НК, на криосрезах паратуморальных участков печени методом прямой иммунофлюоресценции были определены скопления СБЗ+ лимфоцитов НК (№1 1+)

Проведение иммунофлюоресцентного анализа показало, что МНЛ, выделенные из пораженной опухолью печени, экспрессируют на своей мембране антигены Т-лимфоцитов (СРЗ) и маркеры НК (рис 1) В популяции МНЛ селезенки в отличие от печени выявлялись только СОЗ+ Т-лимфоциты и практически отсутствовали НК+-клетки Как следует из данных

представленных на рис. 1, лимфоциты, выделенные из пораженной опухолью печени, образуют две субпопуляции, в одной из которых обнаруживаются практически только Т-лимфоциты (35%), а в другой - НК (18%). Содержание НКТ, несущих одновременно маркеры Т-клеток и НК, в обеих исследованных субпопуляциях колеблется от 1 до 5%. Лимфоциты селезенки интатктых и зараженных опухолью мышей, экспрессируют на своей поверхности только СБЗ+лимфоциты, а содержание НК не превышает 2,5 % (рис. 1).

10" 10 10г 103 10' И.1-Н

ф ж.

Рис. 1. Цитофлюрограммы, характеризующие экспрессию поверхностных молекул СОЗ (Б1ТС) и ЫК (РЕ) мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из печени (а-в) и селезенки (г-д) мышей с опухолевым поражением печени, а - распределение МНЛ печени; 6 - распределение МНЛ печени при двойном прижизненном окрашивании (СОЗ/ЫК) в регионе Я2; в - распределение МНЛ печени (СШ/ЫК) при двойном прижизненном окрашивании в регионе Ш; г - распределение МНЛ селезенки; д -распределение МНЛ селезенки при двойном прижизненном окрашивании (СОЗ/ЫК) в регионе.

Иммуногистохимическое исследование позволило выявить, что в окружающей опухолевые узлы ткани печени мышей в основном определяются Т-лимфоциты, на которых эекспрессируется высокий уровень маркера пролиферации клеток Кл 67. В области лимфоидных инфильтратов также обнаруживаются единичные кластеры В-клеток (СБ20+) (рис. 2).

Рис. 2. Микрофото гистологических препаратов параметастатической области и метастазов печени мышей, заражённых опухолью СаО-1, меченных моноклональными антителами к соответствующим поверхностным антигенам, а - СО 20+ клетки. Ок. 10, об. 90; б - Кл 67+ клетки. Ок. 10, об. 90.

Следовательно, у мышей с имплантированной в паренхиму печени опухолью рака яичников СаО-1 в паратуморальной области формируются инфильтраты из МНЛ. По своему иммунофенотипу большинство МНЛ представлено Т-клетками. В популяции лимфоцитов инфильтрирующих печень обнаруживается около 20% НК и не более 5% НКТ. Экспрессия на лимфоцитах печени, пораженной опухолевым процессом маркера К! 67 свидетельствует о пролиферации лимфоцитов.

Цитотоксическая активность лимфоцитов, выделенных из печени

Представлялось целесообразным оценить функциональную активность лимфоцитов, выделенных из пораженной печени, в сравнении с лимфоцитами

селезенок этих же особей Учитывая наличие в популяции МНЛ НК и Т-клеток была оценена НК активность МНЛ на НК-чувчствительной лейкозной линии мышей УАС-1 и цитотоксическая активность на аутологичных клетках рака яичников СаО-1 (табл 1)

Таблица 1 НК-активность и цитотоксичность МНК печени и селезенки мышей (%)

Клетки-эффекторы Клетки-мишени

УАС-1 аутологичные опухолевые клетки

МНК печени 61±14* 43±11*

МНК селезенки 37±10 18±8

* - достоверные различия по сравнению с МНК селезенки (р<0,05)

Таким образом, образование опухолевого узла в печени у мышей вызывает инфильтрацию паренхимы МНЛ Они обладают не только значительным уровнем спонтанной НК-активности при испытании на Нечувствительной линии УАС-1, но и более высоким цитотоксическим потенциалом по отношению к аутологичным опухолевым клеткам, чем лимфоциты селезенки Проведенные исследования свидетельствуют о том, что инфильтрация паренхимы печени лимфоцитами на фоне опухолевого роста является реакцией местного иммунитета на злокачественно трансформированные клетки Согласно данным, полученные в настоящей работе печень-ассоциированные лимфоциты представлены двумя субпопуляциями, каждая из которых преимущественно содержит НК или Т-клетки и лишь небольшое количество лимфоцитов может быть отнесено к НКТ Таким образом, печень-ассоциированные лимфоциты, характеризуются особенностями иммунофенотипа и функциональной активности и, очевидно, играют важную роль в формировании местного противоопухолевого иммунитета

Особенности инфильтрации моноиуклеарными лейкоцитами метатстатических узлов печени онкологических больных

У первичных больных без предварительно проводимой в предоперационном периоде химио- и лучевой терапии удалось выделить 5— 6x106 МНЛ из 1 см3 печени При этом в паратуморальной области количество клеток в 1,5—2 раза превышало их число в интактных участках печени У пациентов, получивших в предоперационном периоде курс химио- и лучевой терапии, количество МНЛ печени составляло не более 1х10б МНЛ на 1 см3 У больной раком молочной железы с метастазами в печень, предварительно получившей 4 курса химиотерапии (по схеме САР + лучевая терапия), не удалось выделить МНЛ из печени В то время как у пациента, больного раком почки, получавшим перед операцией 1 курс иммунотерапии (Интрон А), количество выделенных из печени МНЛ составляло 10х106МНЛ на 1 см

Как правило, в интактном участке печени обнаруживаются небольшие зоны инфильтрации, локализующиеся, как правило, в области триад и крупных сосудов В параметастатических участках обнаруживаются сливные зоны инфильтраций, захватывающие значительные области паренхимы расположенной в непосредственной близости к опухолевому узлу

Морфо-гистохимические исследования МНЛ, полученных из различных участков печени, показали, что данные клетки имеют характерные морфологические особенности Пораженная опухолевым процессом печень инфильтририрована лимфоидными клетками типа пролимфоцитов и иммунобластов (наиболее многочисленных в параметастатических областях), которые взаимодействуют с макрофагами и дендритными клетками Среди мононуклеаров выявляется значительное количество лимфоцитов, имеющих яркую пиронинофильную окраску цитоплазмы и ядрышек, исчезающую после обработки РНК-азой, что свидетельствует о повышенном содержании РНК в клетках, и, следовательно, их синтетической активности Пиронинофильные лимфоциты обнаруживаются как в параметастической области, так и в ткани метастатического узла Пролимфоциты и иммунобласты, согласно данным

цитологического анализа, составляют 24,7% МНЛ интактных участков печени, при этом количество пиронифильных лимфоцитов достигает 15,7% В параметастатической области абсолютное большинство мононуклеарных клеток (91,3%) представлено активированными клетками лимфоидного ряда пролимфоцитами, иммунобластами и пиронинофильными лимфоцитами

В работе также были изучены образцы печени человека, полученные в результате хирургических вмешательств при травмах брюшной полости, сопровождающихся резекцией данного органа Гистологические исследования свидетельствуют о том, что в паренхиме интактной печени обнаруживаются лишь единичные лимфоидные элементы, представленные в основном, зрелыми формами

Таким образом, характерной особенностью иммунного процесса, выявленного у онкологических больных, является наличие в паренхиме печени, прилегающей к метастазам, клеточных инфильтратов, представленных преимущественно лимфоцитами В параметастатических участках эти инфильтраты содержат значительное количество бластных форм и клеток типа пролимфоцитов с высоким уровнем пиронинофильности

Киллерная активность лимфоцитов, выделенных из параметастаических и интактных участков печени онкологических больных

В настоящем разделе работы исследована НК-активность и цитотоксичность по отношению к аутологичным опухолевым клеткам лимфоцитов, выделенных из параметастатических и интактных участков печени, удаленных во время гемигепатэктомии, а также МНПК этих же больных

Сравнительное исследование цитотоксической активности МНЛ, выделенных из интактного и паратуморального участков печени, выявило, что при тестировании на НК-чувствительной линии К-562 они не имеют достоверных отличий В то же время по отношению к аутологичным

опухолевым клеткам киллерная активность МНК из паратуморальной области достоверно выше дитотоксической активности МНК интактного участка печени (62 и 25%, соответственно)

МНПК больных характеризуются достоверно меньшим уровнем НК-активности по сравнению с МНК печени и соответствуют степени цитотоксической активности мононуклеаров периферической крови здоровых доноров МНПК больных практически не обладают киллерной способностью по отношению к аутологичным опухолевым клеткам (их активность составляет в среднем 11%)

Следовательно, наибольшую цитотоксическую активность по отношению к аллогенным и аутологичным опухолевым клеткам демонстрируют мононуклеары, выделенные из паратуморальных участков печени больных

Изучение имунофенотипа монуклеарных лейкоцитов печени онкологических больных

Сравнительное исследование иммунофенотипа мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из двух различных областей печени онкологических больных показало, что процентное содержание клеток, экспрессирующих на своей поверхности дифференцировочный антиген CD4, примерно одинаково в интактном и паратуморальном участках (9,1 и 10,4%) То же самое можно сказать и об уровне экспрессии дифференцировочных антигенов CD8 (42,2 и 50,9%), CD3 (60,5 и 79,9%), CD16 (10,4 и 12,2%) Однако следует отметить, что степень активности данных молекул на поверхности МНК, выделенных из параметастатических участков, в 1,2-1,3 раза выше, чем у МНК интактных участков Различия иммунофенотипа МНК двух исследованных областей печени по уровню экспрессии активационных антигенов CD25 (5,7 и 6,6%), CD38 (42,2 и 35,9%) и НК-маркера CD57(31,9 и 37,1%) также незначительны В то же время число мононуклеаров паратуморальной области, экспрессирующих на поверхности молекулы адгезии (CD58), почти в 3 раза превышает их процентное содержание в интактном участке печени

При сравнении особенностей иммунофенотипа мононуклеарных клеток периферической крови больных и мононуклеаров пораженной опухолью печени выявлено, что наиболее выраженные различия наблюдаются между МНПК и MHJI, выделенными из паратуморального участка печени У MHJI, в пораженной метастазами печени, по сравнению с мононуклеарными лейкоцитами периферической крови онкологических больных значительно повышены уровни экспрессии дифференцировочного маркера CD8 (в 1,5 раза), активационных антигенов CD38 (в 2,6 раза), НК-маркера CD57 (в 1,7 раза) и молекул адгезии CD58 (в 4,6 раза) В то же время степень активности CD4, напротив, у МНПК почти в 4 раза превышает таковую у MHJI печени Количество CD3+, CD16+ и CD25+ клеток примерно одинаково как среди мононуклеарных лейкоцитов крови, так и среди MHJI, выделенных из печени

Таким образом, MHJI печени онкологических больных по иммунологическому фенотипу и уровню НК-активности существенно отличаются от МНПК тех же больных Исходя из наших данных, они являются преимущественно CD3+ Т-лимфоцитами, но в отличие от МНПК, активно экспрессируют на своей поверхности антигены натуральных киллеров (CD57) Морфологически популяция MHJI пораженной метастазами печени, особенно в паратуморальных областях, состоит, в основном, из молодых и синтетически активных клеток лимфоидного ряда, что свидетельствует о процессах бласттрансформации, дифференцировки и активации лимфоцитов, приводящих, по-видимому, к формированию субпопуляции НКТ-клеток

Эта субпопуляция лимфоцитов характеризуется высокой НК-активностью, повышенной экспрессией молекул адгезии (что обеспечивает их фиксацию в области поражения и взаимодействие с антигенпрезентирующими дендритными и с опухолевыми клетками), увеличенным количеством активационных антигенов на поверхности и обладает достоверно большей цитотоксической способностью по отношению к аутологичным опухолевым клеткам, чем лимфоциты периферической крови больных

При двойном окрашивании лимфоцитов, выделенных из

параметастаической области печени, моноклинальными антителами к антигенам Т-клеток - СБЗ (Р1ТС-меченные) и НК - СБ 16 (РЕ-меченные) в результате иммунофлюорецентного исследования были выявлены три субпопуляции лимфоцитов. Популяция МНЛ состояла преимущественно из Т-клеток, часть из которых одновременно экспрессировала антигены НК, т. е. могла быть отнесена к категории НКТ и лишь незначительная часть клеток обладала маркерами только НК.

На цитограмме (рис. 3) представлены результаты исследования экспрессии антигенов Т-клеток и НК на лимфоцитах пораженной метастазами печени больных, полученные с использованием метода поточной цитофлюорометрии. Как следует из рис. 3, в данном исследовании, также показано, что из параметастаического участка печени выделяются три популяции лимфоцитов Т-клетки, НК и НК-Т. При этом значительную часть рассматриваемой клеточной популяции составляют Т-лимфоциты.

ШСГ ЬичСйЗ/СО!«

"10° 10' 102 103 10' СйЗ

а б

Рис. 3. Цитофлюрограммы, характеризующие экспрессию поверхностных молекул СОЗ (Р1ТС), СО 16 (РЕ) МЛ, выделенных из печени (а-в) онкологических больных.

а - распределение МЛ печени; б - распределение МЛ печени при двойном прижизненном окрашивании (СОЗ/ С016).

При иммуногистохимическом исследовании в интактном участке печени выявлены незначительные скопления лимфоцитов, которые преимущественно можно отнести к Т-клеткам В параметастатичеком участке печени видны значительные скопления в основном Т-лимфоцитов и небольшое количество В-клеток Лимфоидные элементы в паренхиме пораженной метастазами печени активно экспрессируют маркер пролиферации Кл-67

Результаты этих исследований подтверждают основанное на экспериментальных данных предположение о наличии в лимфоидных инфильтратах, окружающих опухолевые узлы, трех основных субпопуляций клеток Т-лимфоцитов, НК и НКТ

Генерация ЛАК из лимфоцитов, выделенных из печени онкологических больных

Для целей адоптивной иммунотерапии опухолей предпринимаются попытки использования лимфокин-активированных киллеров, генерированных из лимфоцитов периферической крови, центральной лимфы, злокачественного выпота и селезенки онкологических больных Учитывая более высокий уровень киллерной активности лимфоцитов, выделенных из пораженной метастазами печени онкологических больных, по сравнению с МНЛ периферической крови представлялось целесообразным оценить морфофункциональные и иммунофенотипические особенности ЛАК, полученных из МЛ печени

Таблица 2 Цитотоксическая и НК-активность ЛАК-клеток, полученных из МНК печени и периферической крови онкологических больных с метастазами в печень (%)

Источник МНЛ Соотношение мишени* */эффекторы* * * Среднее эффективное соотношение (ЭС50)

1 5 1 2 1 1* 1 0,5*

ЛАК (из МНЛ печени) 97±15 91±19 74±11 68±14 0,27 (0,33- -0,22)

ЛАК (из МНПК) 92±21 52±18 35±11 16±12 2,2 (1,7--2,7)

МНПК 62±11 41±21 32±13 20±9 3,5 (2,7- -4,3)

МНЛ печени 90±21 56±16 43±9 27±11 1,3 (0,7--1,9)

* - достоверные разности по сравнению с МНЛ печени р<0,05

** — в качестве клеток-мишеней использованы клетки эритробластного лейкоза человека К-562

*** — в качестве клеток-эффекторов - МНК из различных источников (печень и периферическая

кровь)

Как следует из таблицы 2, при всех соотношениях мишеней и клеток эффекторов, цитотоксическая и НК-активность JIAK из МНПК существенно не отличается от исходных МНПК Что касается JIAK, полученных из МНЛ печени, то в этом случае выявляется большая активность ЛАК Это видно при снижении количества клеток-эффекторов до соотношения 1 1 и 1 0,5

Согласно данным, представленным в таблице 3, уровень экспрессии дифференцировочных антигенов CD3, CD4 и CD8 на ЛАК-клетках печени и периферической крови различен на поверхности ЛАК-клеток периферической крови количественно преобладает CD3 и CD4 (в 2 и 14,5 раз больше, чем на ЛАК-клетках печени, соответственно) В то же время уровень экспрессии CD8 несколько повышен на ЛАК-клетках печени Количество рецепторов для ИЛ-2 (CD25) на ЛАК-клетках крови и печени существенно не отличается Наиболее выраженные различия наблюдаются в уровне экспрессии маркеров адгезии количественное соотношение CD38 в 2 раза выше на ЛАК-клетках печени, чем на ЛАК-клетках периферической крови Что касается молекул, характеризующих НК-активность, то существенных различий в количестве CD 16, CD57, CD58 на ЛАК-клетках из обоих источников не выявлено, хотя,

18

количественно эти маркёры несколько превалируют на ЛАК-клетках печени. Наибольшие отличия в этой группе СО-маркёров связаны с СБ 16: на ЛАК-клетках печени он экспрессируется почти в 2 раза больше, чем на ЛАК-клетках крови.

Таблица 3. Характеристика иммунологического фенотипа ЛАК-клеток, полученных из МНК печени и периферической крови онкологических больных

СБ-маркёр ЛАК-клетки печени (%) ЛАК-клетки периферической крови (%)

СОЗ 44,7±2 73,3*±1,б

СБ4 3,3±1,8 44,1*±4,1

СБ 8 28,4±3,2 18,6±3,3

СБ16 6,3±4,1 3,9±2,6

СБ25 13,0±2,7 11,3±2,5

СБ38 49,2*±1,б 25,7±1,2

СБ57 18,1±2,9 15,1±4,0

СБ58 31,7±3,1 25,9±2,8

* - достоверное увеличение показателя

По своим морфологическим характеристикам ЛАК печени могут быть отнесены к активированным формам и представлены лимфоидными элементами типа иммунобластов и пролимфоцитов (рис. 4).

«1 ей ,

ь-.-Жо§т

Ш т с?"

1

Рис. 4. Генерация ЛАК из МНЛ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что из параметастатического участка печени онкологических больных могут быть получены активированные ИЛ-2 лимфоциты, которые по своим морфо-функциональным и иммунофенотипическим характеристикам соответствуют ЛАК ЛАК, генерированные из лимфоцитов печени, отличаются более высокой цитотоксической активностью в том числе и по отношению к аутологичным опухолевым клеткам Проведенные исследования по изучению их эффективности позволяют рекомендовать их для целей адоптивной иммунотерапии оставшихся метастазов в печени после проведения резекции этого органа у больных с опухолевым поражением печени

Выводы

1 В паренхиме печени экспериментальных животных с имплантированной опухолью и онкологических больных с метастазами отмечается лимфоидная инфильтрация наиболее выраженная в паратуморальных участках

2 По своим морфологическим свойствам печень-ассоциированные лимфоциты могут быть отнесены к активированным формам типа иммунобластов и пролимфоцитов

3 Инфильтрирующие пораженную опухолевым процессом печень лимфоциты представлены тремя основными субпопуляциями Т-клетками (CD3+), НК (CD16+, CD56+, CD57+) и НКТ (CD3+/CD56+)

4 Мононуклеарные лейкоциты печени больных, выделенные из параметастатических участков, характеризуются высоким уровнем экспрессии антигенов натуральных киллеров (CD57) и молекул адгезии (CD58), а также активационных молекул (CD38) по сравнению с мононуклеарами крови тех же больных

5 Мононуклеарные лейкоциты паратуморальных участков печени обладают более высокой НК-активностью и цитотоксичностью по отношению к аутологичным клеткам, по сравнению с мононуклеарными лейкоцитами интактных участков печени и мононуклеарными клетками периферической

крови

6 При инкубации мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из параметастатических участков печени, с ИЛ-2, могут быть получены ЛАК-клетки, характеризующиеся более высокой цитотоксической активностью, чем ЛАК, генерированные из мононуклерных клеток периферической крови

Список опубликованных работ

1 Вершинина М.Ю , Халтурина Е О , Доненко Ф В , Патютко Ю И, Забежинский Д А, Титов К С , Кузовлев Е Н , Лебединская О В , Воробьев А А, Киселевский М В Сравнительная функциональная и иммунофенотипическая характеристики лимфокин активированных киллеров (ЛАК), полученных из натуральных киллеров Т-(НКТ)-клеток у больных с опухолевым поражением печени // Вестник РАМН — № 12 — 2004 — с 32-36

2 Лебединская О В , Кузовлев Е В , Доненко Ф В , Мелехин С В , Киселевский МВ Морфология и гистохимия натуральных киллеров-Т (НКТ) клеток у мышей с опухолевым поражением печени // Фундаментальные исследования —№2 —2005 —с 27-28

3 Кузовлев Е Н, Лебединская О В , Ахматова Н К , Доненко Ф В , Шубина И Ж , Макашин А И , Киселевский М В , Семенов Б Ф Особенности иммунофенотипа лимфоцитов, выделенных из пораженной опухолью печени мышей // Современные наукоемкие технологии — № 3 — 2005 — с 44

4 Кузовлев Е Н, Лебединская О В , Ахматова Н К , Доненко Ф В , Шубина И Ж , Макашин А И, Киселевский М В , Семенов Б Ф Цитотоксическая активность натуральных киллеров (НК) у мышей с опухолевым поражением печени // Успехи современного естествознания — №4 — 2005 — с 32-33

5 Ахматова Н К , Халтурина Е О , Лебединская О В , Патютко Ю И, Забежинский Д А , Кузовлев Е Н, Вершинина М Ю , Киселевский М В Иммунофенотип и функциональная активность натуральных киллеров Т-клеток у больных с опухолевым поражением печени // Архив патологии

6 Ахматова Н К, Кузовлев Е Н, Лебединская О В , Доценко Ф В , Шубина И Ж, Макашин А И, Киселевский М В Цитотоксическая активность лимфоцитов, выделенных из пораженной опухолевым процессом печени мышей//Бюлл эксп биол и мед —2006 -№1--т 141 - с 76-79

7 Макашин А И, Кузовлев Е Н, Ахматова Н К, Лебединская О В , Доненко Ф В , Шубина И Ж, Киселевский М В Генерация дендритных клеток из клеток-предшественников костномозгового происхождения // Успехи современного естествознания - 2005 - №4 - С 59

8 Макашин А И , Кузовлев Е Н , Ахматова Н К , Лебединская О В , Доненко Ф В , Шубина И Ж, Киселевский М В Роль дендритных клеток в стимуляции противоинфекционного иммунного ответа на модели Klebsiella pneumoniae//Успехи современного естествознания -2005 -№4 -С 59-61

9 Кузовлев Е Н, Лебединская О В , Ахматова Н К, Доненко Ф В , Шубина И Ж, Макашин А И, Киселевский М В, Семенов Б Ф Цитотоксическая активность лимфоцитов, выделенных из пораженной опухолевым процессом печени мышей // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке разработка, производство и применение. / Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня основания филиала "Иммунопрепарат" МЗ и СР РФ 6-8 июня 2005 года, г Уфа в 2-х ч, ч 1, (разд 1-3) - Уфа, РИО филиала "Иммунопрепарат" ФГУП "НПО "Микроген" МЗ и СР РФ, 2005 - 300 с

Подписано в печать 14 03 08 Формат 60x84/16 Бумага офсетная

_Тираж 100 экз Заказ № 188_

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им Н Н Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш , 24

Актуальность темы Заболеваемость злокачественными новообразования в последние десятилетия в России постоянно возрастает и, как показывают расчеты, прирост числа онкологических больных в XXI веке будет постоянно увеличиваться. На современном этапе, несмотря на развитие медицины, по-прежнему основными методами лечения рака остается хирургический и химиотерапевтический. При основных локализациях неоплазий показатель резектабельности по отношению к числу заболевших не превышает 20 а около 50 оперированных больных умирают в первые два года от прогрессирования заболевания. После радикальных и условно-радикальных операций больные умирают не столько от рецидива опухоли, сколько от отдаленных метастазов, что свидетельствует о необходимости проведения системного лечения даже при местно- распространенных формах злокачественных новообразований. Современные схемы химиотерапии оказываются недостаточно эффективными, прежде всего, при так называемых иммуночувствительных формах неоплазий (меланома, рак почки) и ряде относительно химиорезистентных форм рака (немелкоклеточный рак легкого, рак желудка, метастатические поражения печени и т. п.). Поэтому поиск методов, направленных на стимуляцию противоопухолевого иммунитета и повышение распознаваемости опухолевых антигенов, представляется перспективным [Давыдов М. И. с соавт., 2000]. Опухолевое поражение печени может быть как самостоятельным заболеванием, так и метастатическим, и отмечается при многих онкологических заболеваниях. Но и в том и в другом случае развитие как первичного, так и метастатического узла в печени указывает на резкое ухудшение прогноза в течении заболевания. Такое ухудшение прогноза связывают с тем, что развитие онкологического процесса в печени может наблюдаться на фоне практически полного истощения иммунной системы организма и, в частности, иммунной системы этого органа. Иммунная система печени; включает в себя* большинство компонентов врожденной иммунной системы: натуральные киллеры (НК), натуральные киллеры-Т-клетки (НКТ-клетки), дендритные клетки, макрофаги и др: и небольшую часть эффекторов; специфического* иммунитета (Т-клетки) [Beaudoih L. et al., 2002] i Взаимосвязь между этими двумя звеньями иммунной защиты печени доконца не изучена. О-роли специфического иммунного ответа известно достаточно много- гораздо меньше сведений, посвящено, другим субклассам мононуклеарных клеток печени;, особенно об; их участии- в инициации иммунного ответа. НКТ-клеткш печени составляют основную часть Т-клеточной популяции этого органа: Информация о популяции*НКТ-клеток в* печени человека весьма малочисленна и противоречива; Практически все сведения об их внутрипечёночной активации и взаимодействии с другими звеньями иммуннош системы, печени-были получены в эксперименте на мышах.. Однако участие НКТ-клеток печени в противоопухолевом иммунитете остается мало изученным [Berzins S.P: et-ali, 2004]i Очевидным является что НКТ-клетки охватывают более гетерогенную популяцию Т-лимфоцитов, чем считалось изначально; [Fuji N.. et al., 2000]. Дальнейший анализ функций НКТ-клеток печени и исследование их иммунофенотипа, является крайне важным в оценке роли НКТ-клеток в противоопухолевом иммунитете. Цель исследования Изучение иммунофенотипа и функциональной активности мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из печени онкологических больных, пораженной опухолевымепроцессом.Задачи исследования 1. Изучить содержание лимфоцитов в пораженных метастазами, и интактных участках печени. 2. Исследовать морфологические особенности лимфоцитов печени, пораженной опухолевым процессом. 3. Оценить цитотоксическую активность лимфоцитов из паратуморальной> области и периферической крови онкологических больных. 4. Провести сравнительный иммунофенотипический анализ мононуклеарных лейкоцитов паратуморальной области и интактных участков печени. 5. Исследовать особенности иммунофенотипаи киллерных свойств лимфокинактивированных киллеров, генерированных из мононуклеарных лейкоцитов паратуморальной области, интактного участка печени и периферической крови. Научная новизна Впервые в сравнительном аспекте исследованы морфологические иммунофенотипические и функциональные свойства лимфоцитов, выделенных из параметастатического, интактного участков печени и периферической крови, онкологических больных. Установлено, что особенностью иммунного процесса при онкологических заболеваниях печени является формирование лимфоидных инфильтратов в паратуморальной области. Впервые установлено, что лимфоциты параметастатической области печени обладают высокой спонтанной цитотоксической и НК активностью, сопоставимой с таковой для ЛАК. Впервые показана возможность получения из лимфоцитов печени онкологических больных ЛАК, способных эффективно лизировать аутологичные опухолевые клетки. Впервые установлено, что в области опухолевых узлов образуютсялимфоидные инфильтраты, состоящие из Т-лимфоцитов, НК и НКТ, характеризующихся высоким уровнем экспрессии молекул адгезии и маркера пролиферации Ki-67. Исследованы иммунофенотипические и функциональные свойства ЛАК, генерированных из лимфоцитов, инфильтрирующих печень. Получены новые данные о соотношении субпопуляции лимфоцитов в различных участках печени на фоне опухолевой прогрессии. Научно-практическая значимость Полученные в работе данные расширяют представления о механизмах местного противоопухолевого иммунитета. В ходе исследования отработан алгоритм экстракорпоральной генерации из лимфоцитов, выделенных из пораженной киллерной опухолевым процессом активности печени, ЛАК с высоким к аутологичным уровнем по отношению клеткам. ЛАК, генерированные из лимфоцитов печени, могут быть локорегионарной радикально адоптивной иммунотерапии с целью использованы для и условнорецидивов радикально оперированных больных профилактики метастазирования в печени.

1. В паренхиме печени экспериментальных животных с имплантированной опухолью и онкологических больных с метастазами отмечается лимфоидная инфильтрация наиболее выраженная в паратуморальных участках.2. По своим морфологическим свойствам печень-ассоциированные лимфоциты могут быть отнесены к активированным формам типа иммунобластов и пролимфоцитов.3. Инфильтрирующие пораженную опухолевым процессом печень лимфоциты представлены тремя основными субпопуляциями: Т-клетками (CD3*), НК (CD16+, CD56+, CD574) и НКТ (CD3+/CD56+).4. Мононуклеарные лейкоциты печени больных, выделенные из параметастатических участков, характеризуются высоким уровнем экспрессии антигенов натуральных киллеров (CD57) и молекул адгезии (CD58), а также активационных молекул (CD38) по сравнению с мононуклеарами крови тех же больных.5. Мононуклеарные лейкоциты паратуморальных участков печени обладают более высокой НК-активностью и цитотоксичностью по отношению к аутологичным клеткам, по сравнению с мононуклеарными лейкоцитами интактных участков печени и мононуклеарными клетками периферической крови.6. При инкубации мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из параметастатических участков печени, с ИЛ-2, могут быть получены ЛАК клетки, характеризующиеся более высокой цитотоксической активностью, чем ЛАК, генерированные из мононуклерных клеток периферической крови.