Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Гистофизиологическое исследование постоптического и добавочных нонапептидергических нейросекреторных ядер в промежуточном мозге крысы и человека

РГ6 од

па правах рукописи

ГРИНЕВИЧ Валерий Валерьевич

ГИСТОФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОСТОПТИЧЕСКОГО И ДОБАВОЧНЫХ НОНАПЕПТИДЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОСЕКРЕТОРНЫХ ЯДЕР В ПРОМЕЖУТОЧНОМ МОЗГЕ КРЫСЫ И ЧЕЛОВЕКА

14.00.23 • гистология, цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискапие ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена я лаборатории нейроэпдокрииологии Института а вол ю-ционной физиологии и биохимик И.М.Сеченова РАН

Парный руководитель - член-корреспондент РАН, доктор биологических паук, профессор А.Л.Поленов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.Л.Быков, доктор биологических паук, профессор Е.М.Чумасов.

дущам организация • Санкт-Петербургский государственный университет.

Защита диссертации состоится июня 1900г. в «ас. па заседании диссертационного сонета Д 001.23.03 при НИИ экспериментальной медицины РАМИ по адресу: 107370 С.-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376 С.-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Ученый секретарь диссертационного сопета к.6.11.

Е.С. Петрово

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Общепризнано, чго нейроэндокрпнныЛ гипоталамо-гипофизарный комплекс играет у позвоночных ведущую роль в поддержании гомеостаза и реализации разнообразных адаптивных реакций организма, в тем чисг.в и поведенческих. Поэтому становится очевидным значение этого комплекса при патологических и экстремальны* состояниях у животных и человека.

Среди структур нейроэндокринного гипоталамуса существенное место отводится нонапептидергической гипоталамо-гипофмзарной нейросекре-торной системе (ГГНС). Вырабатываемые в ГГНС нонапептидчые нойро-гормоны: окситоцин (ОТ), вазопрессин (ВП) и их гомологи помимо общеизвестного влияния на гладкомышечную ткань и эпителий почечных канальцев обладают в организме широким спектром действия. Это метаболические (Egan et al., 1990; Kimball, Sefferson, 1990; Абельсон, 1994), нейротропные (Чернышева, 1993), аденогипофизотропные (Shen et al., 1990; Филаретов, Данилова, 1994; Красновская, 1994) и иммунотроп-ные (Elands et al., 1990; Акмаев, 1995) эффекты, а также непосредственное (парааденогипофизарное) влияние на периферические эндокринные железы (Polenov et al., 1991; Поленов, 1993).

Хорошо известно, что нонапептидергичеекие нейросекреторныс клетки (НСК) образуют у Anamnia преоптическое, а у Amniota - супраоптическое (СОЯ) и паравентрикулярноо (ПВЯ) ядра. Однако, помимо этих нонапептидергических центров у высших позвоночных, включая человека, имеются массивное постоптическое ядро (ПОЯ) и несколько добавочных ядер (ДЯ). После обнаружения ДЯ у мышей А.Л.Поленовым (Поленов, Юшканцева, 1963), его школой было обращено внимание на топографию этих формаций у ряда других млекопитающих (Попович, Поленов, 1976; Борисова, 1977) и человека (Поленов, Гринцевич, Федорова, 1973).

В гипоталамусе крыс большая часть ДЯ, как и ПОЯ, давно описана (Peterson, 1966). Однако до сих пор не было проведено детального количественного изучения ил клеточного состава и нейроанатомии, но исследован вопрос о гомологии этих формаций у крыс и человека, а также о практически ничего но известно об их функциональном значении.

Однако, сам по себе факт, ч^о ДЯ и ПОЯ, возникнув на ранних этапах эволюции позвоночных, сохранились п дальнейшем и даже прошли путь прогрессивного развития (см. обзор: Гриневич, Поленов, 1994), позволил нам думать об и* особом, самостоятельном значении среди формаций ГГНС.

Исходя из этой общей идеи, нет.о настоящей работы явилось изучение сравнительной нейроанатомии ДЯ и ПОЯ в промежуточном мозге у крысы и человека, отдельных вопросов ультраструктурной и молекулярной организации, а также функциональной специализации этих формаций в мозге крыс. Дня достижения этой цели мы поставили перед собой следующие задачи:

1. Исследогст, микроанатоми© ПОЯ и ДЯ в промежуточном мозге крысы и человека в плано гомологизации этих формаций.

2. Провести количественный анализ клеточного состава ДЯ и ПОЯ и оценить интенсивность экспрессии гена вазопрессина в НСК этих центров у крысы.

J . Подтвердить на электронно-микроскопическом уровне нейросекрвтор-нук) природу нонапептидергических клеток в локализованных экстраги-погаламически ДЯ головного мозга крысы.

4. Изучить вопрос о связях НСК из ДИ и ПОЯ с задней долей гипофиза у гипофизэктомированных крыс и возможном компенсаторном значении этих формаций в поддержании гомеосгоза после экстирпации гипофиза. Ь. Исследовать гистофизиологию ДЯ и ПОЯ у крыс при осмотическом, иммобилизоционном и холодовом стрессах с целью установления функциональной специализации этих формаций.

6. Попытаться выявить в . составе ДЯ и ПОЯ гипоталамуса крыс кортиколиборим (КЛ)-оргические элементы иммуногистохимическим способом и при помощи in situ гибридизации.

Научная ноиизна результатом исслодоиаппн. Впервые показано следующее:

1 . В гипоталамусе у человека обнаружено четыре стабильных ДЯ, топография которых совпадает с таковой у крыс.

2. ДЯ п гипоталамусе крыс имеет стабильный клеточный состао. суммарно в них сосредоточено около 1000 ноналептидергических ИСК с небольшим преобладанием ОТ-зргических клеток (57%). Уровень мРНХ ВП а НСК всех ДЯ (включая экотрагипоталамические), СОЯ, ПОЯ и ПОЯ (крупноклеточная часть) сходен у интактных крыс.

3 . За пределами гипоталамуса крыс обнаружены окстрагилоталамичоскио скопления ноналептидергических клеток, имеющих морфологические черты нейросекреторных.

4. ГЭ у крыо не приводит к появлению пикноморфных клеток о ДЯ, но в НСК этих формаций происходит снижение уровня синтеза нойросекрета и торможение транспорта нейрогормонов по отросткам. В ПОЯ появляется множество пикноморфных клеток и угнетаются процессы гормонообра-зования.

5. Реакция на осмотический стресс свидетельствует об осмочув-ствительности НСК осех ДЯ и ПОЯ. Параллельно с активацией синтеза белка в НСК из ДЯ при солевой нагрузке, в области форникэпьного и экстрагипоталамических ДЯ (но се в области ПОЯ) наблюдается торможение транспорта нейрогормонов по отросткам.

6. При иммобилизации у крыс происходит активация синтеза ВП » НСК форникального ДЯ и ПОЯ. При охлаждении активируются ВП-эргическио НСК циркулярного ДЯ, ОТ-и ВП-эргические НСК экстрагипогаламич«?ских ДЯ, а также ОТ-эргические НСК, располагающиеся вдоль эпендимы !И желудочка. Напротив, ВП-эргические НСК в ПОЯ при оулаждении снижают свою функциональную активность.

7. В составе форникального ДЯ у крыс выявлены НСК двух видов, содержащие КЛ-иммунореахтивное (ИР) вещество и мРНК КЛ.

Оснотша положения, выноси мне па защиту:

1. Циркулярное, форникальноо, переднекомиссуральное и дорсолатераль-ное ДЯ гомологичны у крысы и человека.

2. Нонапептидергические НСК экстрагипоталамических ДЯ в головном крысы являются нейросекреторными.

3. Некоторые ДЯ у крыс не имеют оксональных проекций в ЗДГ, в то пр»ми как основное количество ИСК в ПОЯ связано с этой нейрогомальной областью.

И. НСК всех ДЯ и ПОЯ являются осмочувствительными, подобно НСК ЛРут»'* крупноклеточных формаций.

5. Форникалыюо ДЯ и ПОЯ у крыс участвуют в оег/ляции функций коры иадпочечнихоо. Форникальное ДЯ - трансаденогипофизарным путем, ПОЯ-пораддомогипофиззрним путем.

О. Циркулярное и экстрэгипотлламическио ДЯ, а такжо НСК, располагающиеся вдоль эпендимы III желудочка, функционально связаны с гипота-ламо-i ипофиэарно-тироидмой системой.

Топрстичосхан к ирастячесхан зиа чмыосп,. Результаты работы являются теоретической базой для построения концепции ооолюции нонапсптидергических (крупноклеточных) нейросекреторных формаций, включав ДЯ и ПОЯ. Кроме того, результаты важны и для понимания нойрогормонального контроля висцеральных функций со стороны но только общеизвестных СОЯ и ПВЯ, но и со стороны практически не изученных ДЯ и ПОЯ. Хотя НСК в ДЯ являются осмочувствительными, подобно НСК в главных крупноклеточных центрах, их функция, возможно, связана не только с регуляцией водно-солевого обмена. Одно из ДЯ (форникальное) несомненно вовлечено в реализацию неспецифической стрессорной реакции, а циркулярное и окстрагипоталамичес-кие ДЯ - о процессы регуляции функций щитовидной железы. Сохранность НСК в ДЯ у ГЭ крыс можот быть экстраполирована на человека, у которого также существуют ДЯ, гомологичные таковым у крысы Возможно, у человека зги формации чвпчются неким резервом при операциях по удалению гипофиза и патологических состояниях, вызывающих поражение этого органа. Кроме того, НСК в ДЯ могут служить как у млекопитающих животных, так и у человека дополнительным источником нонапептидных нейрог.ормонов в процессах старения и разнообразных патологий, когда количество НСК в главных центрах значительно уменьшается.

Материалы настоящего исследования используютси при чтении курсов лекций по сравнительной гистофиэиологии эндокринной системы в Санкт-Петербургском государственном университете и Академии повышения квалификации работников педагогических ВУЗов (Санкт-Петербург).

Апробация работы. Основные результаты настоящего исследования доложены и обсуждены на городских семинарах по нейроэндокринологии (С.-Петербург, 1990-1994, 1996); на конференциях аспирантов и студентов Санкт-Петербургских ВУЗов и НИИ ( С.-Петербург, 1992-1994, 1996); 1-й Международной научной конференции "Выжидание человека: роэерииые возможности и нетрадиционная медицина" (Москва, 1993); Международных (страны СНГ) нейрогистологических конференциях, посвященных памяти члена-корр. АНСССР Н.Г.Колосова ( С.-Петербург, 1993, 1994); Международном симпозиуме "Физиологические и биохимические основы деятельности мозга", посвященном 70-ти летию академика РАН и РАМН Н.П.Бехтеревой (С.-Петербург, 1994); Всероссийской конференции РАМН "Здоровье и болезни человека на рубеже XXI века" (Москва, 1994). Данные, полученные автором, вошли в Руководство по нейроэндокринологии (С.-Петербург, 1993). По материалам диссертации опубликовано 24 работы.

Структура и объем диссертация. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Общий объем диссертации - 183 страницы машинописного текста с 52 рисунками и 4 таблицами. Список литературы включает 268 источников, из них - 197 иностранных.

НАТЕ РИАЛЫ И МЕТОДИКИ СОВСТВЕ1ШОГО ИССПКДОПАНИЯ* Характеристика исиользоиаиного материала. Объектами исследования служили самцы крыс линии МУ^эг весом 150-250г. Суммарно

* Автор выражает глубокую благодарность ректорату Курского государственного медицинского университета (ректор - чл.-корр. РАМП Л.В.Завьялов) и кафедре гистологии (зпв. - доц. Л.Н.Морален) птого университета »а предоставленную возможность проведения исследовании по теме диссертегот в Санкт-Петербурге.

в работе было использовано более 150 животных. Кроме того, гипота-лемо-гилофизарный комплекс изучали у пяти человек, погибших в результате несчастных случаев или заболеваний, не связанных о первичным поражением головного мозга.

Характеристика эксипримеитов. Экспериментальные животные разделены на 5 групп.

1 группа. У пяти крыс под эфирным наркозом транссфеноидально, используя парафарингеальный подход, удаляли гипофиз. Крыс умерщвляли на 7-о сутки.

2 группа. Крыс содержали на сухом корме и в качестве питья им давали 2.5% раствср NaCI. Животных' докапитировали на 2-е (7 крыс) и 8-е (7 крыс; сутки после начала эксперимента.

3 i руина. Пять крыс фиксировали на спине с растянутыми лапами, голову фиксировали за верхние резцы. Продолжительность иммобилизации была 20 мин.

4 группа. Ппть крыс содержали в индивидуальных камерах при 4°С в точение 2-х часов.

Ь группа. Трем крысам под эфирным наркозом в cisterna magna сводили колхицин (75 мкг/10 мкл фиэ. р-ра). Спустя двое суток животных декапитироволи. Использование колхицина в этом эксперименте позволяло злтормозить транспорт КЛ по волокнам, что могло облегчить визуализацию иммунореактивмого КЛ.

В каждой из экспериментальных групп контролем служили 5-6 интактных крыс, содержащиеся в условиях вивария на обычном рационе.

Гистопогнчсся.хи oöpjöorta материи па. Иммунная гнетохикнн. Морфо истрин, После быстрой дскапитации гипоталамус и прнпежащие отделы мозга крыс и мозг человека фиксировали п р-ре Буэиа или пикроформоле (пикриновая кислотп-40% формалин (3:5)). Материал, в?>иый у крыс, заливали в парафин, а гипоталамус че/юп«?ка - в нарлфин-црллоидим.

Основная часть срезов мозга обрабатывалась иммуногистохимически пероксидазно-антиппроксидазным методом с помощью немеченых антител

к ОТ, ВП и КЛ. Нч серийных срзгилх головного мозга у шести крыс подсчитывали общее количество ОТ- и ВП-ИР НСК в каждом из ДЯ.

С помощью винтового окуляр-микрометра при увеличении 15x90 у интактных и экспериментальных крыс измеряли диаметры ядрышек, ядер и клеточных тел всех ОТ-ИР и ВП-ИР НСК, входящих 8 состав ДЯ и болио.ЗО НСК из ПОЯ у каждого животного с обоих сторон. Площади сечений ядрышек вычисляли по формуле: S=jt/4d2, а ядер и клеточных тел - по формуле: S~n/4Dd. Достоверность различий результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента и нопэрамотрического U-критерич Манна-Уитни-Вилкоксона.

Электронна» микроскопия. Из головного мозга интактных крыс (7 животных) вырезали кусочки, содержащие экстрогипоталамические ДЯ. Кусочки фиксировали в 2,5% растворе глкзтпральдогида и далее обрабатывали по стандартной методике.

In situ гкбридиэацпя. В работо использовано 29 животных (5 крыс для исследования экспрессии гена ВП и 24 крысы для изучения экспрессии гена КЛ). После транскардиальной перфузии 4% параформальдегидом на PBS (pH 7.0, 200 мл на крысу) мозг фиксировали в перфузиотюм растворе на 10% сахарозе в течение ночи при 4°С. Гипоталамус заливали на сухом льду в Tissue Teck (Sigma) и серийно резали во фронтальной плоскости на крисстате (толщина среза 10 мкм). Срезы монтировали на поляризованные стекла и хранили при -80°С.

Фрагменты ДНК препро-ВП были подзргны докторами Serge Rivest (Laval University, Quebec, Canada) и Willy Vale (The Solk Institute, 1л Jolla, CA, USA). Проба состояла из следующих комлонентоа: nr'SUTP, HIJAre-frco Н^О, DNA fragment, SP8, RNA quard. После инкубации при 37°С на водяной бане пробу центрифугировали и определяли радиоактивность в 1мкл.

Препро-КЛ cRNA проба была синтезирована с помощью SP-6 попимераэн. Плазмида pGEM-4, содержащая ген КЛ крысы, была раскрыта с помощью Hind III. Радиоактивные cRNA копии приготовлялись путем инкубации с 3R мМ Tris (pH 7.5), 0.1 мкг ппаамиды п 6 мМ MçiCU, '?. >iM спормидинп, 8 мМ DIT, 25 мМ IJTP/G7P/CTP, 5 мМ нпмечоной GTP,

OTP. 1U RNAsin (Promega) и 10U SF6 полимеразы (Promega) в течение 90 мин при 37°С. Радиоактивность измеряли из расчета 200 млн микроКюри на 1 мкл.

Протокол проведения гибридизаций мРНК ВП и Кл был аналогичен: (1) Промывание срезов в ТЕ буфере (1М TRIS, рН 8.0 + 1М EDTA, рН 8.0) с добавлзнием пртеинкиназы К (0.S мкг/мл) при 37°С 30 мин; (2) Промывание срезов в ТЕ буфере с 0.1М триэтаноламином при комнатной температуре; (3) Промывание срезов в ТЕ буфере с 0.25% уксусным ангидридом при комнатной температуре 10 мин; (4) Нанесение гибридизационного буфера (без добавления радиоактивной пробы), 500 мкл на стекло, при комнатной температуре 2 часа. Буфер состоял из следующих компонентов: 5% формамид, 5xDenxart's, Yeast-t-RNA 200 мкг/мл, Poly А 0.002 мкг/мл, SSDNA 200 мкг/мл, 4% дестран сульфат; (5) Нанесение гибридизационного буфера с добавлением радиоактивной пробы из расчета 200 млн микроКюри в 100 мкл буфера на каждое стекло. Стекла хранились при 37°С в течение ночи; (6) Длительная промывка в SSC буфере (NaCI + NaHCOs, рН 7.0) нисходящих концентраций, перенесение в 70% этанол, высушивание.

Поело проведения in situ гибридизации стекла погружали в кассеты с рентгеновской пленкой Kodak. Экспозиция составляла 3-4 дня. Затем на стекла наносили эмульсию Kodak NTB-2, экспонировали 6-8 дней и проявляли.

Денситометрический анализ интенсивности мечения производили на препаратах в темном поле с помощью Olimpus Optical System (ВХ-50, ВМАх, Olimpus Corp., Melville, NY), совмещенной с компьютером Macintosh (PowerPC 7100/66) и Image software (версия 1.55 non-FPU, W Rasband, NIH). Оптическую плотность гибридизационного сигнала (площадь структуры х средняя оптическая плотность) измеряли при увеличении х10 с введением поправки для фонового мечения. Статистический анализ проводили с использованием Duncan's mutiplo range test.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОНСУЖДКЛМВ Микроанатомия иостопттчсского и добаяочных ядер пронеяугочпого мозга хрнсы. Иммунная гистохимии. Топография ПОЯ и ДЯ (а таюко НСК, расположенных у эпендимы И)

желудочка) в головном мозго крыс представлена на рис. 1.

Рис.1. Распределение ОТ-ИР (+) и ВП-ИР (•) НСК в гипоталамусе и прилежащих отделах голопного мозга крысы на фронтальных срезах (а-г). Обозначения: Шж- третий желудочек; БЖ- боковой желудочек; ВК- внутренняя капсула; ДЛЯ- дорсолатеральное ДЯ; КП- конечная полоска: КС-писходящие колонны сподп; МП- медуллярная полоска талпмуся; ОТ- оптический трякт; ОХ- оптическая хиазма; ИВК- перивяптрикуллрпо расположенные НСК; 1ШЯ- паравентрикулярпое ядро; И1СЯ- иереднекомнесу-ральное ДЯ; ПОЯ- постонтипескоо ядро; СОЯ- супроонтическое ядро; ФЯ-форникпльно'? ДЯ; ЦЯ- циркулярное ДЯ; ПП1 экстрогипотпламипсекир ДЯ; ЯМП- ядро медиального пучка переднего мезгя.

Каждое из ДЯ имеет стабильную локализацию и постоянный клеточный состав (табя.1).

Таблица 1. Количество ИСК в каждом из ДЯ разной локализации и соотношение (%) мснслу ВП- и ОТ-ИР клетклми. Сокращенные названия ДЯ см. рис.).

ДЯ Общее количество ИСК % ОТ-ИР % ВП-ИР

ПКЯ 3¡i9< 29.59 п=Ю0%

ЦЯ 230'13.46 54% 46%

ФЯ 102'9.28 32% 68%

ЯМП 10015.03 »50% »50%

ДЛЯ 74.<6.69 72% 28%

ЭГЯ 46'4 45 82% 18%

РВК 49Í3.76 -=100%

Ра.чмеры теп, ядер и ядрышек о НСК ПОЯ и ДЯ разной локализации варьируют. Наибопгп мелкие НСК содержит циркулярное ДЯ. б ОТ-ИР НСК этого ядра площади сечений гюрикарионов составляют 168.50113.1 мкмг, ядер - 63.48i0.04 мкм2, ядрышок - 5.1110.35 мкм2; в ВП-ИР НСК указанные параметры составляют 178.1519.87 мкмг, 63л3.43 мкмг и 4.94^0.25 мкм2, соответственно. Самыо крупные клетки среди ИСС/1СЛОП.ИШМХ формаций сосредоточены в форникальном ДЯ. В ОТ-ИР НСК этого ДЯ площади перикарнонов с.сстачлнют 274.01^26.11 мкм?, ядер- 80.62'.3.47 мкм?, ядрышок - 6,52+0.4 мкм2; в ВП-ИР НСК форни*апыюго ДЯ оти показатели составляют 308 82126.71 мкм3, 86.23.!7.5 мкмг, 6.85'0.41 мкм2, соотватственно.

НСК в ПОЯ и ДП у ингактных крыс находятся о различных фазах секреторного цикла. Доминируют НСК, содержащие умеренное количество нейросекрета.

la ;;il.u T-n(ipHji¡> зацпм Hl'IIK iii >oui><*i-'Cmhj . Ну авторадиографических препаратах з темном поло не было обнаружено меченых » леток в псрсднекомисгуралыюм ядре. В перивешрикулярной jone 1)1 желудочка встречались единичное меченые клетки. Н;щ каждой ВГ1-оргичпской НСК вс«х крулнокмоточны- формаций определялось 40-.г)0 гранул серебра. Нои (ценситом<:трим(е1:|.ом анализе содержания мРНК БП r НСК глэиных и

добавочных ядер оказалось, что у иитактных крыо этот показатель достоверно не различается в НСК из СОЯ, ПВЯ, ПОЯ и всех ДЯ. включая экстрагипоталамические. Интенсивность мочения в нейрокальннх ВП-оргических формациях (супрахиазматическоо ядро, ядро ложа коночной полоски) была гораздо ниже (5-10 грануд серебра над клеткой), чем и нейроэндокринных ядрах.

Сходный базальный (фоновый) уровень мРНК ВП но всех крупноклеточных формациях (включая ДЯ разной локализации, в том число экстрагипоталамические) у интактных крыс свидетельствует об их единой нейроэндокринной природе.

Упьтраструктура нонапагтидсргичсскнх клеток экстрагн' иоталанмчески расиопояенных добачочных ядер у крысы. С целью выяснении вопроса о нейросекреторной природе зктрзгипота-лямически расположенных ОТ- и ВП- ИР клеток (область у медиального края внутренней капсулы) было проведено их электронно-микроскопическое исследование.

Экстрагипоталамические ДЯ содержат крупные светлые клетки, которые имеют крупные ядра с декомдонсированным хроматином и большие ядрышки, расположенные в центре ядра. В цитоплазме клеток имеется сильно развитая гранулярная эндоплозматическая сеть, представленная многочисленными канальцами, расположенными компактно и ориентированными параллельно друг другу. В цитоплазме много свободных рибосом и полисом. Аппарат Гольджи сильно развит и состоит из обычных компонентов. Крупные митохондрии обнаруживаются ка;< в перикприонах, так и п отростках Цитоплазма теп клеток содержит немногочисленные лизосомы и мультивезикулирнме тельца. В перикарнонах и отростках выявляются элементарные сек|1еторныо гранулы размером 250-300 им, имеющие электронноплогную сердцевину, светлое гало и пограничную мембрану. Размер и степень сформированное™ гранул разные, что отражает стадию их "созревания". Таким образом, впервые нами обнаруженные и исследованные клетки экстрагипоталамичепких ДЯ на

сватооптическом и ультраструктурном уровнях имеют все характерные черты нейросекреторных.

Кмкроаиатомкн аостоитческого ш добавочных ядер иромешуточиого мозга человека. Топография'ПОЯ и ДЯ, а также соотношение в них ОТ- и ВП-ИР НСК в гипоталамусе и прилежащих отделах мозга человека представлены на рис.2.

Рис. 2. Топография ОТ-ИР (+) и ВП-ИР (•) НСК в гшшталпмуее и прилежящих отделах мозга у человека на фронтальных грезах (а-г). Обозначения: Т- тдлпмус; остальные сокращения см. рис.. 1.

Следует отметить, что локализация и клеточный состав ДЯ весьма вариабелен. Однако, на основании изучения нейроанатомии ДЯ у всех исследованных объектов, мы считаем возможным выделить четыре области гипоталамуса, в которых сосредоточено абсолютное большинство встречаемых ДЯ. Это области между СОЯ и ПОЯ, вблизи нисходящих колонн свода, позади передней комиссуры и дорсолатерально от ПВЯ. ДЯ, обнаруженные в этих областях, названы нами по аналогии с подобными формациями у крыс (рис. 2).

Выявление кортиколпбсрннергнчссяих элементов н добавочных ядрах гипоталамуса ' крыс. Реакция с аитителани ж кортиколиберипу. Только после введения в cistorma magna колхицина (но не у интактных крыс) КЛ-ИР элементы были обнаружены в досомедиальной части ПВЯ и □ одном из ДЯ -форникальном. В форникальном ДЯ выявлены две разновидности КЛ-ИР клаток. Первая - это немногочисленные отросчатые (биполярные) клетки размером 15-20 мкм в диаметре, которые на светооптическом уровне не отличаются от КЛ-ИР клеток в дорсомедиальной части ПВЯ. Вторая - ото единичные клетки, имеющие морфологические черты нонапептидергичес-. ких (крупные, 40-50 мкм в диаметре, мультиполярные, со светлым ядром и большим ядоышком), цитоплазма которых дает очень слабую реакцию с ангисывороткой к КЛ.

In situ гибридизация ыРПК хортмкохшбернна. Основное количество ИСК, содержащих мРНК КЛ сосредоточено в дорсомедиальной части ПВЯ. Среди крупноклеточных формаций специфическое мечение мРНК КЛ обнаружено только в клетках форникального ДЯ. В этом ядре метка выявлена как в мелких классических КЛ-зргических НСК диаметром около 20 мкм, так и в единичных крупных НСК размером от 40 до 50 мкм. Среднее количество гранул серебра над одной клеткой в первом случае было гораздо большим, чем во втором (30-40 и 5-10, соответственно).

Таким образом, о гипоталамусе крыс источником КЛ служит не только мелкоклеточная часть ПВЯ (Nappi, Rivest, 1993), но и форникальное ДЯ. Феномен козкспрессии генов КЛ и нонапептидных нейрогормонов в НСК крупноклеточной части ПВЯ был установлен ранее (Sawchenko et al., 1992).

Постоитичсскос м доба»очные клра промежуточного мозга крыс в экспериментальных условиях. Гииофкээктонмя (ГЭ). На 7-е сутки после ГЭ в ПОЯ значительно преобладают переполненные секретом НСК и появляются пикноморфные клетки. В области ПОЯ уменьшается количество волокон, заполненных ИР содержимым. При морфометрическом анализе выявлено, что в ПОЯ происходит достоверное {Р<0,01) уменьшение размеров тел клеток, ядер и ядрышек, более выраженное среди ОТ-ИР НСК. У ГЭ крыс в ДЯ пикноморфных клеток не обнаруживается. Однако наблюдается накопление ИР материала в перикарионах и отростках клеток. Только в экстрагипотапамических ДЯ не встречено подобных картин. Морфометрически в ОТ- и ВП-ИР НСК большинства ДЯ достоверно уменьшаются площади сечений ядрышек. Исключение составляют ВП-ИР НСК из форникального ДЯ и ВП- и ОТ-ИР НСК из ядра медиального пучка, в которых размеры ядрышек существенно не отличаются от контрольных цифр.

Таким образом, результаты, полученные у ГЭ крыс, однозначно свидетельствуют о связи НСК из ПОЯ с ЗДГ, что согласуется с данными других исследователей (ЗДгоЫеу е! а!.. 1980; Уи, 1988). После ГЭ в НСК всех ДЯ снижается интенсивность процессов гормонообразования и транспорта нейрогормонов. Однако отсутствие пикноморфных клеток в них свидетельствует о том, что их аксоны но идут в ЗДГ. Такое предположение согласуется с недаиней работой МаЬопеу и соавт. (1990). Оскотичесж км стресс. В ПОЯ на 2-е сутки эксперимента отмечается появление наиболее крупных, светлоокрашивающихся почти лишенных секрета НСК с увеличенными ядрами и ядрышками. В области ПОЯ резко снижается количество волокон, содержащих ИР материал. Указанные изменения прогрессируют и ярче выражены на 8-е сутки эксперимента.

В ДЯ на 2-е сутки после начала солевой нагрузки выявляются сходные признаки активации НСК. В области некоторых ДЯ (в первую очередь, Форниклльном и экстрагигютламических) нарастает количество волокон, заполненных ВП-ИР содержимым. К 8-м суткам эксперимента во всех ДЯ нарастает количество активных НСК. В некоторых НСК из ДЯ нарастает количество ВП-ИР материала, а в области форникального ДЯ выявляется множество волокон, заполненых ВП-ИР мейросекретом.

Таким образом, на основании этих данных можно утверждать, что ИСК из ДЯ, как и ПОЯ, СОЯ и ПВЯ (Яйэтотопз е» о1.< 1992; МсСоЬв е» а1., 1992), являются осмочувствительными. Картины задержки транспорта нейрогормонов по волокнам могут объясняться различиями в локализации контактов аксонов в нейрогомальных областях, как отмечалось в кратком анализе данных у ГЭ крыс.

Иннобмпнзациоииий стрссс. После иммобилизации крыс в НСК ПОЯ ярких морфологических изменений не обнаружено; только в ВП-ИР НСК достоверно увеличиваются ядрышки и тела клеток (рис. 3).

Г.

О ядрышко ¡□ядро

порикариом

и'щ'-Щ'цГ

Цифровые обозначения: 1- ПОЯ;

ДЯ: 2- циркулярное, 3-форникальное, 4- медиального пучка породного мозга, 5-

дорсолаторальмоо, 6-экстрагипоталамичоскио.

Рис. 3. Изменение площадей сечений (мкм2) ядрышек, ядер и тел ПП-ИР НСК в НОЯ и ДЯ при иммобилизации крыс. Результаты представлены в виде % по отношению к контролю, принятому зп 100%. Достоверность различий: *Р«.0.05, **- Р<0.01, ***• Р<0.001

В ВП-ИР ИСК двух формаций - форникального и циркулярного ДЯ. происходит существенное увеличение площадей ядрышек. Напротив, в циркулярном ДЯ обнаружено достоверное уменьшение клеточных тел и ядрышек ВП-ИР НСК (рис. 3).

Холодочой стресс, В ПОЯ крыс, подвергнутых охлаждению, в ВП-ИР НСК значительно уменьшаются размеры перикарионов, ядер И ядрышек (рис. 4). В ОТ-ИР клетках достоверно уменьшаются только псрикаоионы.

■ едзьию И ядро

□ герюэрион

Обозначения: 1- ПОЯ; ДЯ: 2- ццэкупцрное, 3- фориикальмоа, 4- медиального пука перодтего мозга, 5- дорсалатеральное, 6-эшгграгипоталзмическио

Рис. 4. Изменение площадей сечений (мкм2) ядрышек, ядер и тел ВП-ИР НСК в ПОЯ и ДЯ при охлаждении крыс. Результаты представлены в виде % по отношению к контролю, принятому за 100%. Достоверность различий: *-Р<0.05, **- Р<0.01, ***- Р<0.001.

В циркулярном, форникальном и экстрагипоталамических ДЯ, а также перивентрикулярных НСК обнаруживается увеличение размеров клеточных тел, ядер и ядрышек. Причем, в экстрагипоталамических ДЯ ядрышки

увеличивались как в ОТ-ИР, так и в 0П-ИР ИСК, а в циркулярном ДЯ-только в ВП-ИР ИСК.. Наибольшая выраженность изменений отмечена в перивентрикулярных ОТ-ИР НСК, где увеличение ядрышек достигает 144% по отношению к контролю и сопровождается достоверным увеличением перикарионов и ядер. Особенным образом на холодовой стресс реагирует форникальное ДЯ. В ОТ-ИР НСК этой формации достоверно уменьшаются ядрышки и тела клеток, а в ВП-ИР НСК значительно увеличиваются ядрышки.

Таким образом, при сравнении морфометрических показателей ВП-ИР НСК из ПОЯ в условиях охлаждения и иммобилизации нам удалось установить отчетливую зависимость их реакции от характера стрессорного воздействия: при иммобилизации эти клетки стимулированы, а при охлаждении их активность понижена. Можно сделать предположение о возможности участия ВП-эргических НСК этого ядра в реализации реакции нейрогонного стресса через общий кровоток, парааденогипофизарным путем по А. Л. Поленову (1968, 1993). Совершенно противоположная картина наблюдается в ВП-ИР НСК циркулярного ДЯ, активирующихся при . охлаждении и снижающих свою активность при иммобилизации. Эти данные приводят к мысли, что циркулярное ДЯ реагирует при охлаждении однонаправленно с гипоталамо-гипофизарно-тироидной системой и, возможно, вовлечено в регуляцию функций щитовидной железы.

Следуот отметить, что НСК у эпендимы ill желудочка и экстрагипотала-мических ДЯ активируются при охлаждении параллельно гипоталамо-гипофизарно-тироидной системе, но не реагируют на иммобилизацию. Не исключено, что НСК указанной локализации взаимодействуют с этой системой.

Среди ДЯ нами обнаружена лишь одна формация (форникальное ДЯ), ВП-ИР НСК которой активируются при обоих видах стресса и, возможно, как и ПОЯ, вовлечены в реализацию нейрогенного стресса (тем более, что в составе форникалького ДЯ выявлены КЛ-зргические элементы). Мы считаем возможным предположить, что НСК форникального ДЯ (в отлично от клеток ПОЯ), участвует в осуществлении неспецифической стрессорной реакции трансаденогипофизарным путем.

ВЫВОДЫ

1. В гипоталамусе крыс, помимо главных нонапептидергических нейросек-реторных центров (супраоптическое и паравентрикулярное ядра), имеются массивное постоптическое ядро (ПОЯ) и пять добавочных ядер (ДЯ): переднокомиссуральное, циркулярное, форникальное, дорсолатеральное и медиального пучка переднего мозга. Часть нонапептидергических нейро-сехреторных клеток (НСК) локализована в перивентрикулярной области III желудочка. Кроме того, выявлены скопления экстрагипоталамических нонапептидергических клеток, обладающих ультраструктурными признаками нейросскрсторных.

2. Суммарно в ДЯ сосредоточено около 10С0 НСК с преобладанием окситоцин (ОТ)-иммунореактивных (ИР) (57%). Общее количество ОТ- и вазопрессин (ВП)-ИР НСК в каждом из ДЯ и их соотношение является достоверно постоянной величиной (колебания составляли не более 10%). Уровень транскрипта мРНК ВП в НСК всех крупноклеточных формаций, включая ПОЯ и ДЯ, у интактных животных сходои.

3. Помимо ОТ- и ВП-эргических НСК, в одном из ДЯ - форникальном, впервые выявлены кортиколиберин (КЛ)-ИР клетки и транскрипт мРНК КЛ и них. Существует два вида таких клеток: 1 - "классические" КЛ-эргические клетки, подобные таковым в мелксклеточной части паравентрикулярного ядра; 2 - клетки, имеющие морфологические черты нонапептидергических, цитоплазма которых дает слабую реакцию с антисывороткой к КЛ и содержит гораздо меньшее количество мРНК КЛ, чем в НСК первого вида.

4. В гипоталамусе человека обнаружено ПОЯ и множество ДЯ, среди которых наиболее стабильными мы считаем переднекомиссуральное, циркулярное, форникальное и дорсолатеральное, гомологичные таковым у крыс.

5. На 7-е сутки после удаления гипофиза у крыс в ДЯ не обнаружено пикноморфных ИСК. Однако в ДЯ увеличивается количество заполненных нейросекретом перикарионов и волокон; значительно уменьшаются размеры ядрышек НСК. Эти данные свидетельствуют об угнетении процессов синтеза нонапептидов в НСК и торможении транспорта нонапептидных

нейрогормонов по аксонам. В ПОЯ у гипофиээктоммровзнных крыс появляется множество пикноморфных ИСК. что свидетельствует о связи этого ядра с задней долей гипофиза. Морфометрически обнаруживается значительное уменьшение размеров ядрышек в ОТ- и ВП-ИР НСК, что отражает угнетение синтеза белка в них.

6. В экспериментах с разными функциональными нагрузками на основании морфологических и морфометрических данных выявлено несомненное участие ВП-оргических НСК в ПОЯ и формикальиом ДЯ в реакции на иммобилизацию, а циркулярного, экстрагипоталамических ДЯ и перивен-трикулярных НСК - в реакции на охлаждение. Все НСК изученных ДЯ и ПОЯ активируются при осмотическом стрессе ток же, как НСК супраопти-ческого и паравентрикулярного ядер.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Гриневич В.В., Харзеев Э.К., Язева Г.Г. Морфологическое исследование нейросекреторных ядер гипоталамуса в филогенетическом ряду позвоночных И Деп. ВИНИТИ. - 1988. - N7640. - 8с.

2. Гриневич В.В., Язева Г.Г. К вопросу о дополнительных группах нейросекреторных клеток гипоталамуса у крыс // Матер, научн. конф. Курского госмединститута. - Курск, 1991. - С. 144-146.

3. Гриневич В.В. Иммуногистохимическоо исследование дополнительных 'гомори-положительных" центров гипоталамуса крыс // Морфология (Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии). - 1993. - N 7-8. - С. 27.

4. Гриневич В.В., Данилова О.А., Черниговская Е.В., Поленов А.Л. Выявление кортиколиберина в нейросекрсторных клетках гомориположительных дополнительных центров гипоталамуса крыс // Бюл. зкспеоим. биологии и медицины. - 1993. - Т. 116, N7,- С. 13-15.

5. Гриневич В.В., Краснооскяя И.А., Поленов А.Л. Реакция дополнительных групп нонапептидергических клеток на хо подо пой и иммобилизационный стрессы у крыс Ц Бюл. зкспсрим. биологии и медицины. - 1993,- Т.116, N8,- С.201-203.

6. Grinevich V.V., Krasnovskaya I.A., Danilova O A. Functional significance of tho accessory "gomory-positive" hypothalamic centers in stress // Abstr. 1st

Intern. Conf "Human survival: reserve capability and untraditional medicine". -Moscow, 1S93. - Р.Й1-62.

7. Красновская И.Л., Гриневич В.В., Шейбак Т.В., Поленов А.Л. Морфо-функциональное исследование постоптического ядра гипоталамуса после гипофизэктомии, охлахедсния и иммобилизации крыс // Бюл. аксперим. биологии и медицины. - 1993,- Т.116, N8,- С.203-205.

8. Гриневич В.В. Дополнительные группы (ДГ) нонапептидергических нейросекреторных клеток (ИСК) промежуточного мозга крыс при осмотическом, холодовом и иммобилмзационном стрессах // Тез. 2-й между-нар. нейрогистол. конф., посвящ. памяти чл.-корр. АНСССР Н.Г.Колосова ("Колосовские чтения*-94). - СПб., 1994. - С.18.

9. Гриневич В.В. Иммуногистохимическое исследование дополнительных групп нонапептидергических нейросекреторных клеток у гипофизэктоми-рованных крыс // Тез. всерос. конф. РАМН "Здоровье и болезни человека на рубеже XXI века". - М., 1994. - С.17.

10. Гриневич В.В., Воропанова Л.С., Красновская И.А. Исследование дополнительных групп; нонапептидергических клеток промежуточного мозга у интактных и гипофизэктомиро ванных крыс // Морфология (Арх. анатомии, гистологии, и эмбриологии). - 1994. - Т.106, N4-6. - С.38-46.

11. Гриневич В.В., Воропанова Л.С., Красновская И.А., Поланов А.Л. Реакция дополнительных нонапептидергических центров гипоталамуса на гилофизэктомию у крыс // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1994. -Т. 117, N6. - С.605-608.

12. Гриневич В.В., Озирская Е.В., Поленов А.Л. Обнаружение экстраги-поталамических нонапептидергических нейросекреторных клеток в головном мозге крыс //Докл. Рос. АН. - 1994,- Т.339, N 5. - С.688-690.

13. Гриневич В.В., Поленов А.Л. Эволюция нонапептидергических нейросекреторных центров гипоталамуса у позвоночных животных (проблемная статья) // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. - 1994.- Т.ЗО, N.2. -С.270-292.

14. Grinevich V.V., Polenov A.L. Extrahypothalamic complex (EHC) of nona-peptidergic neurosecretory cells (NSC) // Abstr: Intern. Symp. "Physiological and biochemical basis of brain activity". - St.-Petersburg, 1994. - P.56.

15. Гриневич В.В., Данилова О.А., Кузик В.В., Романова И.В., Поленов А.Л. Нетрадиционные крупноклеточные нейроэндокринные формации (добавочные ядра) а головном мозгу некоторых Anamina и Amnhta Ц Журн. эволюц. биохимии и физиологии. - 1995. - Т.31, N 5-6. - С. 605-610.

16. Гриневич В.В., Поленов А.Л., Жураеин И.А., Косткин В.Б. Сравнительное иммуногистохимическое исследование нейроанатомии нонапептидер-гических нейросекреторных формаций у обезьяны Масаса nemestrinus L и человека // Тез. 4-й всерос. конф. "Нейроэндокринология-95". - СПб., 1995. - С. 36.

17. Гриневич В.В., Пеллетье Дж., Поленов А.Л. Экспрессия генов кортиколиберина и соматостатина в добавочных крупноклеточных ядрах гипоталамуса крыс // Докл. Рос. АН. - 1996 (в печати).

18. Grtnevich V.V., Polonov A.L., Pelletipr G. Accessory magnocellular neuroendocrine nuclei (AN) In the diencepholon of vertebrates (Immunohistochemlcal and In situ hybridization studies) // Abstr. 18th Intern. Conf. European Comparative Endocrinologists. - Rouen, 1996 (in press).

Тц„. З'/Шо/w. Jot N9 /-"/' ''