Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Дифференцированный подход к доклинической оценке биологической безопасности имплантатов

На правах рукописи

Перова Надежда Викторовна

Дифференцированный подход к доклинической оценке биологической безопасности имплантатов

14.00.41 - Трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2004

Работа выполнена в ГУ научно-исследовательском институте трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ. Центр по исследованию биоматериалов.

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Севастьянов Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Иткин Георгий Пинкусович,

доктор медицинских наук, профессор

Соколов Михаил Владимирович,

доктор медицинских наук, профессор

Трубилин Владимир Николаевич

Ведущее учреждение:

Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники МЗ РФ.

Защита состоится «_» июня 2004 г. в 14 часов на заседании

Диссертационного совета Д.208.055.01 при ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ (123182, Москва, ул. Щукинская, д.1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ.

Автореферат разослан:«_»_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.208.055.01,

д.м.н., профессор Шевченко Ольга Павловна

ÔDOl-lj ЛЧЗёА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Применение любого изделия медицинского назначения, особенно предназначенного для имплантации, невозможно без доклинической оценки его биологического действия. В существующих стандартах дано следующее определения имплантатам - «...медицинские изделия, вводимые внутрь организма, которые классифицируются по времени пребывания в организме, по материалу, по степени контакта, по характеру контакта».

По высокой степени потенциального риска имплантаты относят к высшему 3 классу. Основное требование к ним - их биосовместимость. С 1994 года под этим термином было предложено понимать способность материала, изделия или устройства выполнять свои функции и не вызывать отрицательных реакций в организме «хозяина». Другими словами, применение имплантатов должно быть безопасным.

Биологическая безопасность имплантатов зависит от целого ряда факторов (назначение имплантата, технология изготовления, место локализации, продолжительность функционирования и др.).

До 90-х годов каждая страна имела свою систему оценки безопасности медицинских изделий, закрепленную национальными документами таких организаций, как ASTM (США), BSA (Великобритания), DIN (Германия) и др. Например, в США шли по пути отработки стандартов на отдельные виды испытаний, оставляя право выбора тестов испытателям.

В России, наряду с Государственными стандартами (ГОСТ), существовали отраслевые стандарты (ОСТ). Испытательные лаборатории разрабатывали методические рекомендации по исследованию новых медицинских изделий. Наиболее значимыми были: «Сборник руководящих методических материалов по токсиколого-гигиеническим исследованиям полимерных материалов и изделий на их основе медицинского назначения» (Лаппо В.Г., Панина С.Я., Носкова Т.И. и др., 1987); «Сборник методических

рекомендаций по оценке биосовместимых свойств искусственных материалов, контактирующих с кровью» (Доброва Н.Б., Носкова Т.И., Новикова С.П., Севастьянов В.И., 1991); «Токсико-гигиеническая оценка полимерных материалов для интраокулярных линз и других трансплантатов, применяемых в условиях повышенной биосовместимости» (Чаброва Л.С., Федоров С.Н. и др. 1988).

Образование Всемирной Торговой Организации, созданной для стандартизации и приведения к единообразию требований к товару и услугам, потребовало гармонизации соответствующей нормативной документации. С 1992 г. в большинстве стран Европы и в США оценка биологической безопасности медицинских изделий проводится в соответствии с международными стандартами серии ISO 10993 «Biological Evaluation of Médical Devices», в которых подходы к составлению программ исследований максимально унифицированы. В России национальный стандарт ГОСТ Р ЙСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий», гармонизированный в соответствии с международным стандартом ISO 10993, был введен с 1999 г. В отличие от документов ГОСТ и ОСТ, стандарт ГОСТ Р ИСО 10993-99 носит рекомендательный характер в отношении выбора методов испытаний и до недавнего времени предусматривал только биологическую оценку изделий.

Таким образом, перед российскими испытательными токсикологическими лабораториями встала задача практической реализации стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99, заключающаяся, с учетом накопленного опыта работы в области испытаний медицинских изделий, в выборе методического подхода и методов исследования.

Заметим, что использование видов испытаний, только регламентированных данным стандартом, приводило, в ряде случаев, либо к неоправданному увеличению объема испытаний, либо ложному выводу о биосовместимости имплантата. Такое положение диктует, в одних случаях, -

целесообразность сокращения объема испытаний, а в других, - необходимость привлечения дополнительных видов как физико-химических, так и биологических испытаний.

В связи с этим нахождение путей реализации основных принципов стандарта ГОСТ Р ИСО10993-99 и внедрение их в практику работы российских испытательных лабораторий является весьма актуальной и практически важной задачей.

Для решения поставленной проблемы был предложен дифференцированный подход к доклинической оценке имплантатов. Суть которого заключается в том, что программу испытаний конкретного изделия составляют с учетом наиболее вероятных факторов риска, обусловливающих возможные отрицательные эффекты при функционировании изделия, и предыстории изделия (наличие клинического опыта применения изделия или материалов, входящих в его состав, частота осложнений, отдаленные результаты имплантации и др.).

Целью исследования является разработка методологии дифференцированного подхода к доклинической оценке имплантатов, соответствующей основным принципам стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий».

Исходя из поставленной цели, основные задачи работы сводились к следующему:

- сформулировать основные положения дифференцированного подхода к доклиническим испытаниям имплантатов и общую схему его реализации;

- разработать программы исследований имплантатов с учетом его предыстории и основных факторов риска, влияющих на биологическую безопасность изделия;

- на конкретных примерах испытаний имплантатов различного назначения экспериментально обосновать правомерность применения дифференцированного подхода к биологической безопасности изделий;

- показать необходимость привлечения для повышения надежности доклинической оценки имплантатов дополнительных видов испытаний, не регламентированных стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99;

- обосновать возможность сокращения отдельных видов испытаний для медицинских изделий или входящих в их состав материалов, используемых ранее в клинической практике.

Научная новизна. Впервые разработана и экспериментально обоснована методология дифференцированного подхода к доклинической оценке имплантатов, учитывающая основные принципы национального стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99.

Показано, что введение в программу видов испытаний, учитывающих природу материала, места локализации имплантата, его конструкцию и технологию изготовления, но не регламентированных стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99 видов испытаний, позволяет не только повысить достоверность исследования, но и выяснить причины возможных отрицательных результатов биологических испытаний.

Доказана применимость однотипных программ доклинических испытаний для имплантатов различного назначения со сходным набором наиболее вероятных факторов риска, обусловливающих возможные отрицательные эффекты при функционировании изделия.

Разработаны и экспериментально обоснованы программы испытаний биодеградируемых материалов для биоискусственных органов и трансплантации клеток, полимерных интраокулярных линз, орбитальных имплантатов и антиглаукомных дренажей.

Практическая значимость. В качестве практического пути реализации основных принципов национального стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских

изделий» предложен дифференцированный подход к доклинической оценке импланхатов.

Разработанная методология внедрена в практику испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий Центра по исследованию биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов Минздрава РФ. Внедрение дифференцированного подхода к доклиническим испытаниям импланхатов в практику национальных испытательных лабораторий, аккредитованных при Минздраве РФ и Госстандарте России, позволит значительно сократить время и затраты на анализ медико-биологических свойств изделий с одновременным повышением надежности получаемых результатов.

Проведенные доклинические испытания имплантатов дали возможность рекомендовать производителям офтальмологических изделий внести коррективы в технологию производства и контроль качества выпускаемой продукции.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции «Современные подходы к разработке и исследованию биоматериалов и изделий медицинского назначения» (г. Саров, октябрь, 2000 г.); межлабораторном семинаре «Система сертификации медицинских изделий в США» (ВНИИИ медицинской техники, Москва, сентябрь, 2000 г.); Российском симпозиуме по рефракционной и пластической хирургии глаза (г. Москва, декабрь, 2002 г.); семинаре экспертов медицинских изделий (Госстандарт России, январь 2002 г.); II Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (г. Москва, октябрь, 2002 г,), межлабораторных семинарах Центра по исследованию биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов (г. Москва, 2002 и 2004 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 45 печатных работ, включая главу в книге, 11 статей в центральных журналах, 3 статьи в зарубежных журналах, 2 российских патента.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 270 листах машинописного текста. Состоит из введения, семи глав, заключения, выводов, 5 приложений, актов внедрения результатов работы. Работа иллюстрирована 30 рисунками, содержит 50 таблиц. Список цитируемой литературы включает 224 источников из них 137 отечественных и 87 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Оценка биологического действия медицинских изделий.

В 1992 году большинство европейских стран и США ввели в действие стандарт ISO 10993 «Biological Evaluation of Medical Devices» («Оценка биологического действия медицинских изделий»), включающий в себя в настоящее время 18 частей.

Резко возросший в Россию импорт медицинских изделий в начале 90-х годов обусловил необходимость перехода работы национальных испытательных токсикологических по стандарту ISO 10993.

Приведение (гармонизация) российской системы испытаний к международным стандартам (ISO) была начата в 1997 г. в специально созданном для этих целей национальном техническом комитете ТК 422 «Оценка биологического действия медицинских изделий». Активное участие в работе Комитета приняли официальные представители НИИ трансплантологии и искусственных органов Севастьянов В.И. и Перова Н.В.

Целью гармонизации было, как введение общих терминов и определений, так и стандартизация требований к программам и методам для оценки биологического действия медицинских изделий.

Программы испытаний должны учитывать свойства самого изделия и материалов, из которых оно изготовлено.

При общей оценке биологической безопасности изделий принимают во внимание следующие факторы:

- материал/ы из которого изготовлен имплантат;

- наличие добавок, примесей, не прореагировавших компонентов и продуктов деградации, а также возможность их экстрагирования;

- взаимодействие вышеперечисленных веществ в конечном продукте;

- свойства конечного продукта.

Стандартная программа исследований биологического действия имплантируемых изделий регламентирует виды испытаний в соответствии со временем и условиями их функционирования (таблица 1).

Таблица 1.

Виды испытаний имплантируемых изделий в соответствии с

_ ГОСТРИСО 10993-99.___

Категория изделия в зависимости от контакта с организмом человека Метод исследования

Продолжительность контакта циготоксическое действие сенсибилизирующее действие раздражающее действие общая токсичность субхроническая токсичность генотоксичность имплантационный тест б 0 § § 1 хроническая токсичность канцерогенности

Мягкие Кратковременный + + . + - - - - - -

ткани, Длительный + + - - + + - - -

кость Постоянный + + - - - + + - + +

Кратковременный + + + + + + -

Кровь Длительный + + + + - + + + - -

Постоянный + + + + + + + + + +

При составлении программы рассматривается соответствие изделия указанному назначению с учетом медико-технических свойств использованных

материалов, наличие опыта клинического применения имплантата. Важным условием при проведении медико-биологических испытаний изделий является предварительный анализ химических, физико-химических и физико-механических свойств материалов, входящих в состав изделия.

Испытания невозможны без технической документации с информацией о назначении изделия, о характере и длительности контакта с организмом, о составе и свойствах композиций, а также сведения о технологическом процессе изготовления изделия.

Глава 2. Основные источники потенциального риска при применении имплантатов.

При составлении программы испытаний стандарт ГОСТ Р ИСО 10993.99 рекомендует учитывать наиболее вероятный риск от применения имплантата. Однако, рекомендательный характер стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 и стремление исследователей унифицировать программу испытаний, независимо от конкретного назначения медицинского изделия, могут привести к ошибочному заключению о биологической безопасности исследуемого имплантата.

Биологическая безопасность имплантатов зависит от целого ряда факторов потенциального риска, имеющих разные источники (рис.1).

Конкретизация программы, заключающаяся в выборе видов и методов испытаний. Целесообразно объединение медицинских изделий по наиболее вероятным факторам риска, обусловливающие возможные отрицательные эффекты при функционировании изделия, что позволяет для имплантатов различного назначения предложить однотипную программу испытаний.

и

Рис.1. Основные источники и факторы потенциального риска, влияющие на биологическую безопасность имплантатов.

При испытаниях медицинских изделий очень важно проанализировать природу того или иного фактора потенциального риска. К ним относятся: склонность к воспалительной реакции, нежелательная кальцификация. нежелательная биодеструкция, повышенная иммунногенность и др..

Глава 3. Программы и методы испытаний имплантатов.

Основные принципы оценки безопасности изделий заключаются в следующем: 1) физико-химические свойства материала и его поверхности должны соответствовать назначению медицинского изделия; 2) возможные изменения конечного продукта во времени не должны влиять на его биологическую безопасность. При необходимости оценке биологического действия может предшествовать идентификация и количественное определение входящих в конечный продукт экстрагируемых химических компонентов. Исследования мотут осуществляться на любом этапе создания конечного

входящих в конечный продукт экстрагируемых химических компонентов. Исследования могут осуществляться на любом этапе создания конечного продукта, однако, для представления документации с целью получения разрешения к медицинскому применению, тестируют конечный продукт. Объем испытаний зависит от степени изученности изделия и материалов, из которого оно изготовлено, включая наличие клинического опыта их применения.

Главной задачей решаемой при составлении программ испытаний является выбор системы методов, учитывающей, по возможности, наиболее вероятные факторы риска, независимо от источников их провоцирующих (рис. 2).

Рис. 2. Общая схема изучения биологической безопасности медицинских изделий.

При составлении программы биологических испытаний медицинского изделия следует учитывать, что:

- рекомендации ГОСТ Р ИСО 10993-99 относятся лишь к получению достоверной информации о биологической безопасности медицинских изделий и не включают в себя виды испытаний физико-химических свойств самих имплантатов;

- ГОСТ Р ИСО 10993-99 не предусматривает поиск того или иного физико-химического или технологического параметра, отвечающего за отрицательный результат биологических испытаний.

После критического анализа существующих систем испытаний медицинских изделий и собственного опыта работы в испытательных лабораториях МНТК «Микрохирургия глаза» и ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов были сформулированы следующие положения дифференцированного подхода к доклинической оценке имплантатов:

- методология дифференцированного подхода к доклинической оценке имплантатов учитывает основные принципы национального стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий».

- многофакторность понятия «биосовместимость» (биологическая безопасность) делает невозможным стандартизацию системы методов даже для основной программы испытаний различных по назначению имплантатов, не говоря уже о дополнительных методах исследования;

- при составлении про1рамм испытаний имплантата необходимо принимать во внимание его предысторию и наиболее вероятные факторы риска, влияющие на биологическую безопасность изделия;

- в программу испытаний могут привлекаться методы, не входящие в виды испытаний, регламентированные ГОСТ Р ИСО 10993-99.

- возможно сокращение отдельных видов исследований для уже используемых в клинической практике имплантатов или материалов, входящих в их состав;

- использование однотипных npoipami испытаний корректно только для имплантатов со сходным набором факторов потенциального риска.

В процессе работы был обоснован перечень физико-химических и биологических методов исследования, рекомендуемый для составления программ испытаний имплантатов с учетом их особенностей.

Содержание экспериментальной части работы является доказательство эффективности методологии дифференцированного подхода к доклинической оценке биологической безопасности имплантатов различного назначения как практического пути реализации национального стандарта ГОСТ Р ИСО10993-99.

Глава 4. Имплантаты из гидрогелевых материалов.

При контакте с организмом гидрогелевых имплантатов основными факторами риска являются, во-первых: диффузия не прореагировавших веществ в окружающие ткани на ранних сроках после имплантации, во-вторых: увеличение количества диффундирующих токсичных продуктов биодеградация гидрогелей на поздних сроках после имплантации. § 1. Внутриорбитальные эндопротезы из акрилатных гидрогелей.

Примером имплантата для лечения пациентов с удаленным глазным яблоком (анофтальмом) могут служить эндопротезы из гидрогеля. Выбор гидрогелевых имплантатов обусловлен сродством их с естественными тканями, мягкостью материала и проницаемостью для многих молекул (Давыдов Д.В., 2000).

Исследовали внутриорбитальные протезы двух видов (прозрачный и молочного цвета), изготовленные в Институте нефтехимического синтеза им. A.B. Топчиева РАН. Материалом для протезов в обоих случаях был р-НЕМА. Протезы отличались технологией изготовления и имели разную прозрачность: образцы 1 - непрозрачные; образцы 2 - прозрачные. При составлении программы испытаний была учтена склонность гидрогелевого материала имплантата к биодеградации на поздних сроках имплантации, как одного из основных факторов потенциального риска при функционировании изделия. В

связи с этим, программа испытаний была дополнена методом измерения ускоренной деструкции в модельных средах. Деструкцию материалов, входящих в состав имплантатов, исследовали после инкубации образцов в модельных средах при 1=70°С, имитирующих физиологические условия (бидистиллированная вода (рН=6,5); раствор фосфатного буфера (рН=7,4); реактив Фентона - раствор сильно разбавленной перекиси водорода (Н2О2) и соли двухвалентного железа (РеБ04 'ТКгО) в соотношении 100 мкМ Бе2+ на 1мМ Ц2О2, моделирующий условия воспалительного процесса при контакте материала с кровью.

Из проведенных санитарно-химических испытаний и рекомендуемой ГОСТ Р ИСО 10993-99 стандартной программы биологических испытаний следует, что образцы эндопротезов отвечают требованиям, предъявляемым к биосовместимым материалам.

Однако было обнаружено существенное уменьшение массы прозрачных образцов эндопротезов 2 по сравнению с непрозрачными образцами 1. Это говорит о повышенной склонности внутриорбитальных протезов 2 к гидролитической деструкции. Более того, в процессе повторной инкубации исследуемых протезов в буферной среде, замечено значительное увеличение размеров образца 2 по сравнению с образцом 1 (рис. 3), а растворе Фентона отмечено полное растворение образца 2.

При выяснении причин нежелательного набухания имплантата производителями была установлена ошибка в технологическом регламенте, которая привела к неполной полимеризации материала изделия. Этот технологический просчет обусловил низкую устойчивость имплантата (образца 2) к гидролитической деструкции, приводящей, в частности, к увеличению набухаемости эндопротеза и к потере его функциональных свойств.

Учет факторов риска, свойственных данному виду изделия цри составлении программы испытаний и введение дополнительного метода, позволило выявить слабые стороны и скорректировать технологию изготовления эндопротеза.

1)

2а)

26)

Рис. 3. Вид орбитальных имплантатов после инкубации в модельных средах: 1)-образец 1; 2а) - образец 2 после инкубации в буферном растворе; 26) - образец 2 после инкубации в растворе Фентона.

Правильность выбора программы испытаний с учетом особенностей свойств полимерного материала имплантата была подтверждена результатом клинических исследований, проведенных в МНТК «Микрохирургия глаза». В отдаленные сроки после операции с имплантацией гидрогелевого протеза, обследовано 50 человек в возрасте от 8 до 19 лет. Сроки наблюдения составили от 1 года до 6 лет, у большинства пациентов (33 человека) - 2-4 года. Случаев набухания и отторжения имплантатов не было выявлено ни в одном случае (Беспалова Е.О., 2004).

^ 2. Акрилатные дренажи для лечения тяжелых форм глаукомы.

При тяжелых формах глаукомы (неоваскулярной, увеальной, неоднократно оперированной первичной) большое распространение получают антиглаукоматозные операции с использованием дренажей.

В качестве объекта испытания были взяты образцы антиглаукомного дренажа, изготовленные в ЗАО «Биомир - сервис» (Москва). Микротрубочки выполнены из полипропилена с внутренним диаметром 200 мкм, толщиной

стенки 25 мкм, наружным диаметром 250 мкм и диаметром пор 0,02-0,04 мкм. Корпус дренажа изготовлен из микропористого сополимера пздроксиэтилмегакрилата (р-НЕМА) и тридексаэтиленгликольдиметилакрилат (ТШ-13).

Одним из основных медико-биологических требований к имплантату является сохранение им биосовместимых и функциональных свойств в течение всего времени эксплуатации. Наиболее вероятными факторами риска, влияющими на биологическую безопасность антиглаукомного дренажа, являются, во-первых, непрореагировавшие исходные продукты синтеза полимеров, во-вторых, во-вторых, наличие контакта изделия с реактивными тканями глаза.

Учитывая, что все компоненты дренажа ранее в других изделиях были исследованы на биосовместимость, было принято решение существенно сократить количество методов основной программы биологических исследований (см. таблицу 1). Из стандартных методов, мы выбрали испытания образцов дренажей на цитотоксичность на клеточной культуре мышиных фибробластов линии ЗТЗ и имплантационный тест. Метод in vivo представлял собой моделирование операции имплантации в глаз кролика. Контролем служил левый глаз того же животного, на котором проводили все манипуляции, за исключением имплантации дренажа (ложно оперированный глаз).

Как в экстрактах, так и при непосредственном контакте культуры клеток с дренажом цитотоксичности выявлено не было.

Моделирование антиглаукоматозной операции на кролике не привело к образованию гипотонии на глазах животных за счет сохранения клапанных свойств дренажа. Микроскопическое и гистологическое исследование тканей, окружающих дренаж после его имплантации в слои склеры кролика показало, что воспалительная реакция соответствовала тяжести операционной травмы и завершалась к 5-му дню наблюдения. Течение воспалительной реакции при внутри склеральной имплантации дренажа сопоставимо с наблюдаемой

воспалительной реакцией на ложно оперированном глазу. Вокруг имплантата образовывалась тонкая соединительно-тканная капсула, которая была сформирована к концу 3 недели (рис. 4).

Рис. 4. Гистологическая картина тканей глаза после имплантации дренажа. Срок 3 недели. Ув. Х120.

В качестве дополнительных были привлечены: метод регистрации гемолитической активности системы комплемента и метод ускоренной биодеструкции в модельных средах.

Относительная (по Купрофану) константа скорости активации системы комплемента in vitro для полипропилена и гидрогеля соответствовала норме.

По результатам исследования биодеструкции уменьшение массы образцов не отмечено. Среднее ее значение всем модельным средам составляет 3,6±2,1%.

По результатам всех испытаний дренаж показал себя как биосовместимое изделие, сохраняющее функциональные свойства в условиях имплантации.

Таким образом, примененный дифференцированный подход позволил значительно сократить стандартную программу испытаний с одновременным введением двух дополнительных методов, позволяющих оценить факторы риска, связанные с природой материала, технологией изготовления изделия и местом его локализации.

Положительный результат клинических испытаний, проведенных в НИИ глазных болезней им. Гельмгольца с 2001 по 2003 гг. на 10 пациентах, дает основание сделать вывод о правильности предложенной программы испытаний для оценки биологической безопасности щцрогелевого дренажа (Бессмертный А.М. и др., 2003).

Глава 5. Интраокулярные линзы (ИОЛ) из материалов различной природы.

К внутриглазным имплантатам, помимо общих требований биологической безопасности предъявляются специфические условия: сохранения прозрачности, устойчивость к действию жидких сред глаза; Наиболее изученными и часто используемыми являются ИОЛ из полиметилметакрилата (ПММА), полидиметилсилоксана (ПДМС) и гидрогеля р-НЕМА, выпускаемые фирмами, такими как А11ег§ап, А1соп, В&Ь и др. В хирургии имеется 60-ти летний опыт применения искусственного хрусталика, однако до сих пор не снят вопрос о разработке новых методов подтверждения их биосовместимости.

§ 1. Исследование адсорбции белка на поверхности интраокуляриыхлию.

В качестве объектов исследования были взяты 4 вида интраокулярных линз, изготовленных дочерними предприятиями МНТК «Микрохирургия глаза»:

- серийно выпускаемые ИОЛ из ПММА и сополимера р-НЕМА с коллагеном (СК);

- лабораторные образцы ИОЛ из силиконовой композиции с дополнительной обработкой поверхности (СИЭЛ-М) и гидрогелевых ИОЛ из р-НЕМА.

Все ИОЛ имели практически одинаковые параметры биологических свойств, исследованных по стандартной программе испытаний. Тем не менее, анализ имеющихся данных доклинических испытаний ИОЛ и

постоперационных осложнений, периодически возникающих в клинической практике, свидетельствует о недостаточной изученности имплантатов.

Адсорбция белков является первичной реакцией крови и других биологических жидкостей при их контакте с изделиями медицинского назначения. Взаимодействие имплантата с белковыми компонентами внутриглазной жидкости непосредственно влияет на проявление реакции глаза в раннем послеоперационном периоде, на интенсивность клеточных и пигментных отложений на поверхности ИОЛ, на состояние клеток эндотелия роговицы в отдаленном послеоперационном периоде. Однако ни в одной известной нам системе испытаний медицинских изделий имплантатов исследователи не используют методов оценки хотя бы общего количества адсорбированного белка за время контакта тестируемого материала или изделия с кровью или белоксодержащей жидкостью.

Можно предположить, что такие параметры адсорбции, как общее количество адсорбированного белка, количество прочно связанного с поверхностью белка и степень его конформационных изменений, во многом определяют не только функциональные, но и биологические свойства ИОЛ.

Было предложено исследовать ИОЛ по двум дополнительным методам оценки биосовместимости: измерение кинетики адсорбции сывороточного альбумина человека (САЧ) на поверхности образцов методом флуоресценции полного внутреннего отражения (ФПВО) и определение степени активации системы комплемента по общей гемолитической активности комплемента сыворотки крови человека до и после инкубации с исследуемыми образцами (таблица 2).

Таблица 2.

Количественные параметры адсорбции САЧ на поверхность ИОЛ.

Тип ИОЛ [САЧ]с5рт.±с,% (п=3) К^адзмл/мгсх 10+2

ИОЛр-нема 48,7 ±8,2 (а) 3,1 ±0,4

ИОЛск 64,7 ±11,0 (б) 2,1 ±0,3

ИОЛсиэл-м 62,1 ±9,6(5) 2,4 ±0,4

ИОЛпммл 71,6 ± 10,0 (б) 2,4 ±0,3

а) р < 0,05 по сравнению с другими ИОЛ

б) нет существенных различий между этими ИОЛ

Из таблицы 2 видно, что на линзах из р-НЕМА адсорбируется наибольшее количество белка с наименьшими значениями его обратимости. Меньшая адсорбция белка из изученных линз наблюдается у ИОЛ из ПММА. С этой точки зрения вероятность биосовместимости гидрогелевых линз ИОЛ из р-ГЕМА ниже по сравнению с другими ИОЛ.

При взаимодействии с белками (иммуноглобулинами) большая степень активации системы комплемента поверхностями наблюдается для линз из р-НЕМА и СК, по сравнению с гидрофобными ИОЛ из ПММА и ИОЛ из СИЭЛ-М. (таблица 3)

Высокие значения количества необратимо адсорбированного альбумина и относительной константы скорости индуцированной активации комплемента, наблюдаемые для ИОЛ из р-НЕМА увеличивают вероятность отрицательных реакций при имплантации этих ИОЛ, а именно: индуцированные линзы из р-НЕМА могут привести к острым сосудистым реакциям, таким как гемостаз и увеличение проницаемости кровеносных сосудов радужки в раннем послеоперационном периоде. И, наконец, адсорбция значительного количества белка может провоцировать развитие вторичной катаракты на поздних сроках имплантации.

Таблица 3.

Значения времени полулизиса, констант скоростей и относительной константы скорости индуцированной активации системы комплемента.

Тип ИОЛ т к О), сек кивд, см'2 сек'1 ггг хоти (•»ивд)

ИОЛр-нема (а) 260 ±15 (2,3±0,2)»10"6 1,3 ± 0,2 ^

ИОЛск(б) 275 ± 14 (1,8±0,1>10-6 0,53 ± 0,081о)

ИОЛсиэл-м (а) 245 ± 18 (0,30±0,02)«10"6 0,60 ± 0,09(с)

ИОЛпммл (с) 250 ± 15 (1,2±0,1>10'6 0,8 ± 0,1(0)

а - (хм )ку,ч">ф = 250 ± 12 с; (кши )171,роф = 1,8 10"6 см'2 сек'1 б - (тм )купр"ф = 306 ± 12 с, (кШ1Д )кучх,ф = 3,4 10-й см'2 сек1 с - (тш )"упроф = 270 ± 10; (кшщ )кущюф = 1,5 Ю* см"2 сек'1 д - р < 0, 05 по сравнению с другими ИОЛ е - нет существенных различий между этими ИОЛ

Таким образом, испытания методов оценки взаимодействия поверхности ИОЛ с белковыми компонентами внутриглазной жидкости дает возможность не только увеличить достоверность прогноза безопасности клинического применения ИОЛ на стадии их доклинических испытаний, но и контролировать качество выпускаемой продукции по этим параметрам.

ЗАО «Экспериментально-техническое производство «Микрохирургия глаза» было рекомендовано изменить регламент производства ИОЛ с точки зрения минимизации тем или иным способом процессов адсорбции на поверхность интраокулярных линз. Действительно, введение в технологический процесс стадии гидрофилизации поверхности ИОЛ из ПММА и силикона позволило существенно уменьшить склонность материалов ИОЛ к адсорбции белков и снизить риск ранних постоперационных осложнений.

По результатам проведенных исследований стала очевидным включение в программу испытаний ИОЛ методов адсорбции белка и определение степени активации комплемента.

§2. Исследование структуры ИОЛ из полиметилметакрилата (ПММА) и полидиметилсилоксана (ЦЦМС).

Исследуемыми объектами были серийные образцы ИОЛ из ПММА и ПДМС изготовленные ЗАО «Экспериментальное техническое производство «Микрохирургия глаза».

В литературе имеются данные о сроке пребывании интраокулярной линзы из ПММА в глазу более 30 лет. Однако наряду с положительным опытом применения, имеют место и отрицательные моменты. ПММА относится к жесткоцепным полимерным материалам, что диктует необходимость большого разреза роговицы (до 10 мм) при имплантации ИОЛ. ПММА достаточно стоек в биологических средах, тем не менее, под действием внутренних напряжений, возникающих в процессе формования линзы, могут активизироваться процессы химической деструкции. Кроме того, имеется риск проявления токсической реакции из-за остаточного не прореагировавшего мономера в объеме линзы, а также из-за образования этилен оксида в процессе старения полимера.

Силоксаны относят к эластомерам с ярко выраженными высокоэластичными свойствами при обычных температурах. Эластичность силиконовых ИОЛ позволяет имплантировать их через разрезы менее 5 мм. Более того, они цельнолитые, и это дает им большое преимущество перед ИОЛ из ПММА с крепежными конструкциями из других материалов.

Имеются литературные данные о случаях поражения глаза в отдаленном послеоперационном периоде, выражавшиеся воспалительными реакциями тканей глаза (увеитом), отеком заднего отрезка глаза (макулярной области). Причиной осложнений может быть денатурация белков на поверхности ИОЛ вследствие диффузии из них низкомолекулярных токсических веществ. Наиболее важным для имплантатов из ПММА и ПДМС на сегодняшний день является контроль качества их производства.

Из практики испытательной лаборатории известно, что не всегда нетоксичность экстрактов, получаемых по регламентированной стандартом

ГОСТ Р ИСО 10993-99 рекомендациям, свидетельствует о биологической безопасности ИОЛ из ПММА и ПДМС.

Для получения более полной и достоверной информации о влиянии свойств изделия на его биологическое действие было решено привлечь два независимых физико-химических метода: фрактографию для обеих линз и ИК-спектроскопию для ИОЛ из ПДМС.

Методом фрактографии с помощью оптического микроскопа ОрЬп («Карл Цейс Йена» Германия) исследовали структуру скола материала после воздействия на него жидкого азота. Количественным критерием метода служила плотность дефектов в объеме материала (к), вычисляемая как отношение площади (в) дефектов (полости, вакуоли, трещины) к толщине образца (ф.

Степень сшивки материала при полимеризации силикона определяли методом инфракрасной Фурье-спектроскопии на спектрофотометре ИКФ Регкш-Е1тет 1710 (Великобритания). Количественным параметром метода являлся показатель степени полимеризации 1сш, который равен отношению амплитуд пиков поглощения групп БЮ-Б! (2054 см"1) и БьН (2156 см"1). Чем больше значение 1сш, тем выше степень сшивки материала.

Данные по фрактографии и ИКФ-спекгроскопии образцов интраокулярных линз сравнивали с результатами двух методов из стандартной программы испытаний: спектрофотометрией водных экстрактов в ультрафиолетовом диапазоне длин волн от 200 до 360 нм и имплантацией фрагментов ИОЛ в переднюю камеру глаза кролика.

В этой же серии экспериментов было решено измерить динамику оптической плотности экстракта в УФ-области от времени инкубации образцов. Время экстракции при 37 С меняли в диапазоне от 3 суток (рекомендуемой по стандартной методике) до 3 месяцев.

Образцы ИОЛ из ПММА.

Ранее было установлено, что при одинаковых условиях изготовления ИОЛ в них возникает надмолекулярная структура, характерная для конкретного полимерного материала. Известно так же, что любое изменение в технологии неизбежно влечет за собой изменения структуры изделия. Механические напряжения интенсифицируют процесс диффузии воды в полимер. В связи с этим, наличие внутренних напряжений в материале заготовок является крайне неблагоприятным фактором для дальнейшего использования его в качестве сырья для ИОЛ.

Особенностью образцов из ПММА является неоднородность структуры по толщине. Количество дефектов в приповерхностных слоях значительно больше, чем в объеме линзы, что может быть следствием перегрева поверхности ИОЛ в процессе формования (рис.5).

а) б)

Рис. 5. а) Фрактограмма ИОЛ ¡группы; б) ФракгограммаИОЛ Ш группы.

Структурные неоднородности поверхности и объема линз обусловлены неравномерным распределением добавок. Увеличение содержания низкомолекулярных веществ в зонах повреждения может быть причиной преждевременного старения ИОЛ в биологической среде. Можно предположить, что большей плотности дефектов в объеме (к) должны соответствовать большее значение оптической плотности Б (Уф).

В таблице 4 приведен сравнительный анализ данных критериев по методу фрактографии и спекгрофотометрии. Оказалось, что все исследованные образцы можно разбить на три группы. Для I и Ш группы ИОЛ действительно наблюдается корреляция между концентрацией непредельных соединений в водных экстрактах ИОЛ и количеством дефектов (микротрещины, вакуоли с жидкостью, пустоты).

Таблица 4.

Значения оптической плотности водного экстракта в УФ-области и

процента повреждения структуры ИОЛ из ПММА.

№ п.п. 1)(УФ) к=8/с1, %

I (п=25) 0,12 <10 ±5

II (п=25) 0,20 >20 ±5

III (п=25) 0,30 »30

ИОЛ из I группы с низкими значениями к отвечают требованиям к имплантатам по значениям оптической плотности (О) в УФ-области спеюра. Линзы из III группы с высокими значениями к имеют значения Б (УФ), выходящие за рамки критерия отбора (Б<0,20) по данному параметру. Это говорит о том, что количество дефектов в структуре ИОЛ из ПММА, аналогично величине оптической плотности Б(УФ), является одним из критериев физико-химических испытаний.

Динамика изменения значений Б(УФ) проб водных экстрактов из всех трех групп ИОЛ из ПММА во время инкубации образцов 3 сут., 1 мес., 2 мес. и 3 мес. представлена в таблице 5.

Таблица 5.

Динамика 0(УФ) водной вытяжки ИОЛ из ПММА от времени экстракции.

№ п.п. к=8/«1, % Ю(УФ)

3 суток 1 мес. 2 мес. 3 мес.

I (п= 10) <15 ±5 0,120 0,153 0,161 0,168

II (п= 10) >20± 10 0,200 0,258 0,285 0,331

III (п= 10) »30 0,300 0,374 0,390 0,420

Для всех образцов наблюдается рост величины Б (УФ) с увеличением времени экстракции. Однако если для I группы образцов с малым количеством дефектов структуры значение оптической плотности остается ниже пороговой (не более 0,20), то, для П группы, значение Б (УФ) уже для времени экстракции равной 1 мес. не соответствует пороговому уровню отбора.

Полученные, результаты дают основание предположить, что при имплантации образцов ИОЛ из П и Ш трупп высока вероятность возникновения отрицательных реакций со стороны глаза, по сравнению с имплантацией линз из I группы. Кроме того, с учетом ошибки метода, значения к для ИОЛ из ПММА не должны превышать 20±5%.

Действительно, имплантация фрагментов ИОЛ из ПММА в переднюю камеру глаза кролика, выявили значительную склонность к биодеструкции линз Ш группы, для которой выявлено большее количество дефектов, по сравнению с образцами ИОЛ из группы I.

Введение метода фрактографии дало возможность еще на стадии физико-химических испытаний выявить ИОЛ, не соответствующие требованиям, предъявляемым: к имплантатам. Сравнительный анализ результатов фрактографического анализа структуры ИОЛ и УФ-спектрофотометрии экстрактов позволил определить критический уровень дефектов структуры ИОЛ (не более 20±5%), превышение которого приводит к увеличению потенциального риска при клиническом применении данного изделия.

Достоверность оценки биологической безопасности медицинских изделий методом УФ-спектрофотометрии экстрактов может зависеть от времени экстракции. В связи с этим, при выборе времени экстракции исследователь не всегда должен следовать рекомендуемому протоколу, а принимать во внимание также специфические особенности материалов и технологию изготовления изделия.

Образцы ИОЛ из ПДМС.

Методом ИК-Фурье спектроскопии было исследовано около 100 силиконовых ИОЛ разных партий. Оказалось, что по значению отношения амплитуд пиков БьО-Б! и БьН (1т-) они могут быть разделены на 3 группы: 1сш < 1,5; 1Сш ~~ 1,5-2,0; 1СШ > 2,0. Образцы ИОЛ из этих групп были проанализированы фракгографическим методом и методом УФ-спехсгрофотометрии соответствующих экстрактов (таблица 6).

Таблица 6.

Характеристические параметры ИОЛ из ПДМС, полученные методами фрактографии, ИК-Фурье и УФ-спектрофотометрии.

№ группы В(УФ) Icm=Si-0-Si/Si-H k=s/d, %

I (п=30) 0,25±0,05 0,9 »30

II (п=30) 0,20+0,05 1,6 < 20

III (п=30) 0,09±0,03 2,4 -30

На фрактограммах линз I группы (рис. 6а) в приповерхностном слое отмечается большое количество вакуолей, наполненных жидкостью и газовых пузырей. Все это говорит о незавершенности процесса полимеризации силиконового каучука. Действительно, по данным УФ-спектрофотометрии водных экстрактов этой группы ИОЛ наблюдалось увеличение количества непредельных соединений, превышающих пороговые значения (0,20) по данному параметру (см. таблицу 7).

Структура материала ИОЛ из П группы гомогенна, и на сколе практически отсутствуют какие-либо дефекты (рис. бб). Степень сшивки у II группы ИОЛ соответствует допустимым значениям для силиконовых ИОЛ, лежит в диапазоне от 1,5 до 2,0. Имплантаты этой группы удовлетворяют требованиям по количеству экстрагируемых непредельных соединений.

Третью группу, а именно ИОЛ с степенью сшивки I > 2,0 и плотностью дефектов k ~ 30 можно отнести к группе риска, так как дальнейшие исследования m vivo показали ускорение деструктивных процессов этих линз в отсроченном послеоперационном периоде. В процессе проведения подготовки

этих линз к фрактографическим исследованиям такой материал рассыпается на мелкие осколки при минимально приложенной силе. Заметим, что Б(УФ) для силиконовых ИОЛ, в отличие от значений показателя I, не отражают склонность линз к биодеструкции.

а) б)

Рис. 6. Фрактограмма линз из силикона а) П группа; б) I группа.

Дополнительным подтверждением правомерности привлечения метода фрактографии в программу доклинических испытаний являются результаты по влиянию времени инкубации силиконовых ИОЛ всех трех групп на параметр В(УФ) (таблица 7).

Таблица 7.

Динамика ИКФ и Б(УФ) от времени инкубации ИОЛ и степени повреждения внутренней структуры.

№ п.п. к=вМ, % 0(УФ)/1сш

3 сут. 1 мес. 2 мес. 3 мес.

I (п=10) »30 0,3//1,0 0,53//0,9 0.61//0.8 0,б8//0,9

II (№=10) < 20 0,15//1,7 0,15//1,7 0Д6//1.7 0,16//1,7

III (п=10) -30 0,09//3,0 0,14/13,2 0,19//3,0 0,20/13,0

Рост оптической плотности Б (УФ) с увеличением срока экстракции для группы I говорит об увеличении выхода непредельных соединений из объема ИОЛ. Во второй и в третьей группах такого эффекта не наблюдается. Было предположено, что по показателю фрактографии могут быть допущены к дальнейшим исследованиям только ИОЛ из II группы.

Для доказательства сделанного предположения образцы ИОЛ из всех трех групп были исследованы в условиях in vivo. Имплантация в переднюю камеру фрагментов линз со значениями 1сш.<135 (группа 1) вызывала воспалительную реакцию глаза, которая составляла по шкале 2-3 степень. Реакция, соответствующая 3 степени, выразилась в отеке роговицы, образованием синехий, экссудата на имплантате. Выявленные отрицательные эффекта не только не исчезали со временем, а приводили, в дальнейшем, к сильнейшему токсическому поражению тканей с формированием бельма роговицы.

Имплантаты второй группы силиконовых ИОЛ (I сШ-=1,5) не вызывали реакций, превышающих реакцию на операционную травму.

При имплантации образцов третьей группы реакция тканей глаза соответствовала 1 степени, которую давала послеоперационная травма. Спустя месяц, появился экссудат на линзе, однако на окружающих тканях признаки воспаления отсутствовали. Помутнение роговицы начало отмечаться к 3 месяцу и достигло апогея к б месяцам. У животного развилась эндотелиально-эпителиальная дистрофия роговицы.

Реакция на имплантат развилась к 6 месяцам, учитывая, что был имплантирован фрагмент ИОЛ. Реакция на целую линзу развивается к году после имплантации, что было выявлено нами в анализе осложнений в отдаленном периоде после имплантации в клинике.

Результаты проведенного исследования ИОЛ из ПММА и ПДМС после длительной (до 3 месяцев) инкубации показали, что скорость процессов деструкции ИОЛ зависит от природы полимерного материала и его структуры. Установлено, что структура материалов меняется в процессе изготовления ИОЛ, что может инициировать биодеструкцию ИОЛ и приводить к развитию постоперационных осложнений в отдаленном периоде. Для снижения риска развития осложнений необходим контроль качества ИОЛ на различных этапах технологического процесса.

Глава 6. Имплантаты из биополимерных материалов.

Среди биодеградируемых материалов медицинского назначения биополимеры привлекают внимание исследователей как экологически чистые и биологически безопасные материалы.

§ 1. Биосовместимость и гемосовместимость полиоксибутирата и его сополимеров.

Особое место среди биодеградируемых материалов занимают полиоксиалканоаты (ПОА) - полиэфиры оксипроизводных жирных кислот бактериального происхождения.

Известно свыше 100 различных по структуре и составу полиоксиалканоатов. Наиболее полно охарактеризованными являются высококристалличный полимер /í-оксимасляной кислоты - полиоксибутират (ЛОБ) и двухкомпонентные сополимеры уЗ-оксибутирата и Д-оксивалерата (ПОБ-со-ПОВ).

Биосовместимость полиоксибутирата основывается на том, что мономер, образующий данный полимер и являющийся продуктом его биодеградации - /?-оксимасляная кислота, входит в число метаболитов у высших животных и человека.

Сополимеры ПОБ-со-ПОВ имеют большие перспективы, так как в зависимости от соотношения мономеров их базовые характеристики (температура плавления, пластичность, механическая прочность и др.) меняются в широких пределах. Однако наличие в сополимерах оксибутирата и оксивалерата, помимо оксимасляной кислоты, других мономеров делает необходимым проверку биологической безопасности соответствующих изделий в полном объеме. Имеющиеся результаты биологических исследований в условиях in vitro и in vivo сополимеров ПОБ-со-ПОВ и композитов на их основе, выполненные за рубежом на лабораторных препаратах (Biopol®, DegraPol/btc®), производимых известными фирмами (ZENEKA, ALDRICH, FLUKA, METABOLIX), не однозначны. Имеются данные как о полной

биологической инертности образцов, так и о выраженной в различной степени их цитотоксичности при исследовании in vitro на культурах макрофагов и фибробластов, а также о проявлении воспалительных реакций в экспериментах in vivo.

Анализ литературных данных показал, что при токсикологических исследованиях образов ПОА отсутствовали данные о химической чистоте полимерных материалов. Вместе с тем установлено, что в промышленных образцах ПОБ присутствуют обломки клеток-продуцентов полимера, содержащие эндотоксины липополисахаридной природы (до 100-120 Ед/г), способные вызывать воспалительные и пирогенные реакции. Известно также, что липополисахариды (ЛПС) стенок бактерий являются активаторами ферментных систем крови, в частности, системы комплемента. Противоречивость результатов биологических свойств ПОА может быть связана и с некорректным выбором методов исследования. Так, например, гемосовместимость ПОА оценивали только по интенсивности реакции лизиса эритроцитов, характеризующей, в основном, токсичность материалов.

Было предположено, что сравнительное исследование биологических свойств ПОА по расширенной программе с введением в нее методов оценки гемосовместимости образцов даст возможность получить достоверную информацию о биосовместимых свойствах ПОА. В связи с имеющимся интересом к ПОА как материалу для сердечно-сосудистых имплантатов изучение их гемосовместимых свойств особенно актуально.

Объектами исследования были пленки гомополимера (ПОБ) и сополимера (ПОБ-со-ПОВ), изготовленные из полимерных гранул, полученных из Института биофизики, г, Красноярск. Более эластичные пленки из менее кристалличного ПОБ-со-ПОВ, имеют выраженную пористую и ламинарную структуру по сравнению с ПОБ.

Учитывая возможное влияние ЛПС на биологические свойства бактериальных полимеров, в программу исследований были включены методы,

характеризующие состав и химическую чистоту материалов, а биологические тесты были дополнены методами оценки гемосовместимосга ПОА.

Состав полимеров определяли на хроматомасс-спектрометре GCD plus (Hewlett Packard, США). Этим же методом выявляли в составе образцов ПОА наличие длинноцепочечных жирных кислот, входящих в состав липополисахаридов (ЛПС) клеточных мембран. Для идентификации микропримесей белковой природы использовали микрометод Кьельдаля и Лоури, углеводов - антроновый метод. Присутствие калия и натрия в ПОА регистрировали на ионизационно-пламенном фотометре FIapho-4 (Carl Zeiss, Германия); магния, кальция и металлов - на атомно-абсорбционном спектрометре ААС IN (Carl Zeiss, Германия). Молекулярный вес ПОА (Mw) определяли вискозиметрически, степень кристалличности - на автодифрактометре Дрон-2 (CuKa-излучение, графитовый монохроматор); температурные характеристики - методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

Испытания ПОА проводили в соответствии со стандартными методиками санитарно-химического анализа и исследования биологической безопасности медицинских изделий.

В образцах ПОА не обнаружено посторонних примесей белковой и углеводной природы. Однако в них идентифицированы минеральные элементы и металлы, присутствие которых в полимере обусловлено применяемыми в ходе экстракции полимера реагентами (щелочи, этанол). Содержание отдельных минеральных элементов в образцах ПОА составляло (в % к абсолютно сухому веществу): Na 0,036-0,013; Ca 0,005; Mg 0,0013-0,0025; Fe 0,0052-0,009; Си 0,0046-0,0145; Zn 0,0019-0,0045; Mn - не выявлено.

По данным рН-метрии значения сдвига pH водных вытяжек из всех исследуемых ПОА значительно ниже пороговых значений. Спекгрофотометрия образцов в диапазоне ультрафиолетовых волн показала, что гомополимер и сополимер с 18 мол.% оксивалерата по данному показателю отвечают

требованиям, предъявляемым к материалам, контактирующим с кровью.

Используемый тест на цитотоксичностъ по клеточному тест-объекту показал отсутствие отрицательной реакции во всех трех образцах; при этом относительная выживаемость клеток в опыте составила (95-100%) от контроля.

Раздражающего действия вытяжек из ПОА на кожу и слизистые не выявлено. Аллергической реакции немедленного типа, а также гемолитической активности образцов ПОА не наблюдали.

Однако при имплантации фрагментов пленок ПОА в переднюю камеру глаза кролика при оценке реакции тканей по 4-х бальной шкале для всех образцов получена реакция 2-3 степени, то есть средней тяжести. Регистрировали отек эпителия роговицы, фибрин во влаге передней камеры, экссудат на имплантате, выраженный отек, расширение сосудов радужки. На всех образцах ПОА отмечены белковые отложения. Наблюдаемые острые реакции глаза на присутствие ПОА через 7 дней после имплантации исчезли, однако белковые отложения сохранялись в течение всего срока наблюдения (~ 1 мес.). Эти проявления, возможно, связаны с присутствием в тестируемых образцах следовых количеств компонентов клеток продуцента.

В эксперименте по оценке общетоксического действия вытяжек ПОА при их внутрибрюшинном введении белым мышам внешних проявлений интоксикации у животных в течение наблюдаемого периода не выявлено.

Фагоцитарная активность макрофагов перитонеальной жидкости испытуемых животных во всех случаях в пределах выбранной достоверности результатов измерений (2сг) сопоставима с контролем, что свидетельствует об отсутствии иммунотоксического эффекта со стороны всех образцов.

Сенсибилизирующее действие ПОА оценено по реакции дегрануляции тучных клеток в опыте на белых 1фысах. Во всех экспериментальных группах животных, сенсибилизированных по вышеописанной методике, дегрануляция тучных клеток составила менее 10% относительно контроля. Это позволяет сделать вывод об отсутствии сенсибилизирующего эффекта всех испытуемых

образцов.

Из проведенных санитарно-химических и токсикологических испытаний следует, что все три исследованных образца полиоксиалканоатов отвечают требованиям, предъявляемым к биосовместимым материалам.

Следующим шагом было изучение гемосовместимых свойств ПОА, которые оценивали по относительному количеству и морфологии адгезированных на поверхности тромбоцитов, активации свертывающей системы крови и системы комплемента.

Существенных различий в морфологии адгезированных тромбоцитов на поверхности всех трех исследуемых образцов не обнаружено. Количество агрегатов убывало с увеличением содержания оксивалериата в сополимере. Для всех образцов ПОА количество не активированных клеток было выше, а распластанных - меньше, чем на поверхности полиэтилена (контроль), что говорит о хорошей гемосовместимости ПОА на стадии клеточного ответа.

Для сополимеров не выявлено активирующее действие на систему свертывания, в то время как для плазмы после инкубации с ПОБ наблюдается значительное увеличение времени рекальцификации, сопоставимое с поведением гепаринизированных материалов. По-видимому, использованная технология очистки полимеров не исключает присутствия в образцах примесей биологически активных веществ, например ЛПС мембран, которые способны ингибировать каскадный путь активации свертывания крови.

Предположение о наличие в образцах полимеров биологически активных веществ - компонентов макромолекул клеток продуцента, относящегося к грамм-отрицательным бактериям, подтверждается обнаруженным комплемент-акгивирующим действием ПОА (таблица 8).

Все тестируемые образцы показали высокую активирующую способность относительно системы комплемента, существенно превышающую пороговое значение константы скорости активации системы комплемента - 1,5. Наибольшее значение Кщщ получено для гомогенного полиоксибутирата,

наименьшее - для сополимера с 18 мол. % оксивалерата.

Анализ хроматомасс-спектров тестируемых образцов ПОА выявил присутствие в них длинноцепочечных жирных кислот, суммарная концентрация которых составляла 0,01-0,02 мол.%. При этом до 70% от этой величины приходится на долю пальмитиновой (С^) кислоты.

Таблица 8.

Значения абсолютной (кивд)о5ри относительной (Кшщ) констант скоростей активации системы комплемента, индуцированной

поверхностью полимеров.

Образец (кии)°6р см2сек1 ±а (п=3) (Кшщ) ±а(п=3)

Купрофан (контроль 1) (1.7±0.1)*10-6 1.00±0.08

ПЭНП (контроль 2) (1.3±0.1) '10"6 0.76±0.08

ПОБ (7.5 ±0.5) ПО"6 4.4±0.4

ПОБ-со-ПОВ (включение валерата - 4 мол. %) (5.3 ±0.4) ПО"6 3.1±0.3

ПОБ-со-ПОВ (включение валерата -18 мол. % ) (4.3 ±0.2) "Ю-6 2.5±0.2

Дополнительной очисткой удалось полностью устранить выявленный отрицательный эффект активации ферментных систем крови поверхностью ПОБ и ПОБ-со-ПОВ. Введение стадии дополнительной очистки в технологию биосинтеза ПОА позволило получать биополимеры, обладающие как биосовместамыми, так и гемосовместимыми свойствами.

Проведенные исследования физико-химических и медико-биологических свойств эластичного пленочного материала на основе сополимера ПОБ-со-ПОВ и высокомолекулярного гидрофильного пластификатора, названного ЭластоПОБ™, доказали возможность его применения для создания био- и гемосовместимых изделий медицинского назначения, в том числе, для закрытия дефектов мягких тканей и в качестве матрикса (носителя) для трансплантации клеток.

§2. Коллагенсодержащий матрикс СфероТЕЛЬ™.

Одной из ключевых проблем при культивировании клеток и формировании тканей in vitro для последующей имплантации является разработка и конструирование биодеградируемых трехмерных (губки, гели) матриксов, обладающих необходимыми физико-химическими и медико-биологическими свойствами.

До настоящего времени не существует полимерной системы, допущенной к широкому клиническому применению в качестве матрикса дня трансплантации клеток в мяпше ткани. Существенным недостатком известных нам зарубежных матриксов (гидрогелевые материалы Neurogel™ (U.S. Patent 5,863,551) и Matrigel® (Woerly S., 1999) на основе синтетических мономеров метакриламида и акриламида, композиты полиоксиалканоатов с полиуретанами DegraPol/btc® (Saad В., 1998), пористый полиэфируретан Hyaff® (Brun P., 1999) является то, что они полностью или частично состоят из синтетических материалов. Это, несомненно, отрицательно влияет на их биологическую безопасность, увеличивает вероятность образования рубцовых тканей и опухолей, что и сдерживает их внедрение в клиническую практику.

Сравнительно недавно был разработан биодеградируемый коллагенсодержащий материал СфероТЕЛЬ™ с гетерогенной структурой, обусловленной разной степенью радиационной сшивки его составных частей. Использование радиационной обработки в технологии получения и стерилизации СфероТЕЛЬ™ требует проверки биологической безопасности нового материала. Более того, при составлении программы испытаний необходимо учесть потенциальное назначение СфероТЕЛЬ™, как временного имплантируемого каркаса для формирования непосредственно в организме пациента той или иной ткани.

В качестве объекта исследования были взяты стерильные образцы СфероТЕЛЬ™, находящиеся в шприцах. Помимо стандартных методов, программа испытаний была расширена методами определения

цитотоксичносш на различных линиях клеток, методами исследования гемосовместимых свойств материала и методами оценки склонности СфероГЕЛЬ™ к биодеградации в условиях in vitro и in vivo.

Измеренная набухаемость СфероГЕЛЬ™ по воде составила 80-90 %. Время полной деградации СфероГЕЛЬш варьируется от нескольких недель до б месяцев в зависимости от соотношения компонентов и степени сшивки.

Из результатов проведенных токсикологических и санитарно-химических испытаний следует, что СфероГЕЛЬ™ соответствует требованиям, предъявляемым к изделиям для длительного контакта с внутренней средой организма.

При культивировании стволовых клеток костного мозга крыс было отмечено, что к исходу первых 2 часов после посева, клетки располагались по поверхности СфероГЕЛЬ™. Через 7 дней культивирования клетки формировали монослой как на пластиковой чашке Петри, так и на геле. К концу 9 суток существенной разницы в количестве клеток и структуре монослоев отмечено не было.

Рис. 7. Фибробластоподобные мезенхимальные клетки костного мозга 1фысы на поверхности коллагенсодержащего гетерогенного матрикса СфероГЕЛЬ™ Время культивирования клеток 7 дней (Ув. Х400. Фазово-контрастный микроскоп (Nikon, Япония).

С учетом проведенных исследований, можно сделать вывод о возможности применения гетерогенного биополимерного геля СфероГЕЛЬ™ в

качестве матрицы для биоискусственных органов и тканей, временно выполняющей функции каркаса и культуральной среды для стволовых и предифференцированных клеток.

Таким образом, дифференцированный подход к оценке биологической безопасности с привлечением дополнительных методов физико-химического анализа самого изделия и способности культивирования клеток на нем позволили обеспечить всестороннюю оценку нового в медицине изделия. Правильность подхода подтвердили положительные результаты /и vivo по доказательству эффективности матрикса СфероТЕЛЬ™ на экспериментальной модели тяжелых повреждений спинного мозга крыс.

Глава 7. Склероукрепляющий материал.

Как показывает опыт испытательных лабораторий, не всегда на стадии доклинических испытаний медицинских изделий можно выявить все отрицательные эффекты, проявляющиеся при функционировании имплантата. Никакая программа испытаний не может учесть все факторы риска, особенно те, которые связаны с нарушениями технологического процесса при опытном производстве изделия. Как правило, выяснение причин осложнений, полученных при клинических исследованиях нового имплантата, в большинстве случаев, ложится на плечи производственных испытательно-контролирующих лабораторий, имеющих меньшие возможности, по сравненшо с сертифицированными ИЛ. Учитывая ограниченность материально-технической базы производственных лабораторий, использование ими дифференцированного подхода к оценке биологической безопасности медицинских изделий может быть особенно эффективным. Примером эффективности внедрения дифференцированного подхода в практику испытательно-контролирующих лабораторий явились испытания склероукрепляющих материалов, проведенные совместно с МНТК «Микрохирургия глаза».

Наиболее широко для хирургического лечения прогрессирующей близорукости врачи используют склероукрепляющий материал из твердой мозговой оболочки (ТМО) человека и перикарда (ПРК) сельскохозяйственных животных.

Изделия представляют собой пластины определенного размера из обработанной соединительной ткани. Пластины имплантируют за глазное яблоко и прижимают к нему с тыльной стороны.

Ежегодно только в МНТК «Микрохирургия глаза» и его филиалах проводится более 20 тысяч склероукрепляющих операций. Несмотря на большой опыт хирургов в этой области, осложнения в раннем послеоперационном периоде составляют по данным разных авторов от 14% до 95%. Хотя большая часть осложнений купируется на ранних стадиях, причины их возникновения были не ясны. В процессе внедрения изделия в клиническую практику и при дальнейшем его широком использовании претензий хирургов ни к конструкции, ни к материалам не было. Однако было замечено, что процент послеоперационных осложнений менялся от партии к партии сюгеропластического материала.

Было предположено, что имеющиеся осложнения могут быть связаны либо с индивидуальной реакцией пациента, либо с нарушениями в технологии производства изделия, в частности, с несоблюдением режимов стерилизации и условий хранения изделия. Последние два фактора очень важны для изделий из биотканей.

Задачей данной главы является доказательство возможности внедрения дифференцированного подхода к оценке биологической безопасности медицинских изделий в работу испытательно-контролирующих лабораторий предприятий.

В отличие от предыдущих программ, данная программа испытаний направлена не на оценку биологической безопасности изделия, а на выяснение

причин возникающих осложнений, зависящих от возможного нарушения в технологическом процессе.

При анализе технологического процесса было предположено, что причинами осложнений могли быть: недостаточная экстракция белка из изделия, образование продуктов радиолиза при стерилизации, деградация материала при несоблюдении режима хранения. Поэтому в программу испытаний были включены следующие методы: исследование механической прочности имплантатов при разных условиях переработки; определение количества несвязанного белка в экстрактах; выявление влияния радиационной стерилизации и условий хранения на свойства изделия; ответную реакцию тканей глаза и орбиты на имплантацию материала.

В качестве объектов испытаний были взяты промышленные образцы изделий, выпускаемые ООО «Научно-экспериментальное производство «Микрохирургия глаза»: аллотрансплантат из твердой мозговой оболочки (ТМО) человека и ксено- (гетеро-) трансплантат из перикарда (ПРК) сельскохозяйственных животных.

Контролем служили образцы необработанных материалов ТМО и ПРК. Дополнительно исследовали склеропластические материалы получившие дополнительную дозу радиации (65 кГр), а также изделия после моделирования условий неправильного хранения. Исследования in vivo проводили на экспериментальной модели склероукрепляющей операции на предварительно иммунизированных, соответствующими экстрактами, животных.

В процессе эксперимента получено, что обработка биотканей приводит к существенному снижению количества несвязанного белка в экстракте с 176 мкг/мл до 6,3 мкг/мл для ТМО, а для ПРК со 120 мкг/мл до 4,5 мкг/мл. В то же время для обоих экстрактов, содержание белка на порядок повышается при увеличение дозы радиации, и в 3-4 раза - при моделировании неправильного хранения образцов.

Моделирование склероукрепшпощей операции на кроликах показывает, что в первый день после операции незначительная реакция в виде отека и покраснения отмечалась практически во всех случаях. Однако ко 2-3 дню реакция снижалась до 0 степени (по 4-х бальной шкале). Самую сильную реакцию 3 степени, выразившуюся в значительном отеке места операции и конъюнктивы, вызвали имплантаты с неправильным хранением. Наименьшая реакция наблюдалась у кроликов, которым имплантировали готовое изделие из ПРК (таблицы 9,10).

Таблица 9.

Выраженность тканевой реакции глаза кролика при имплантации ТМО.

Вид материала Степень выраженности реакции

1 день 2 день 3 день 4 день 5 день 1нед

ТМО коммерч. 1 1 0 0 0 0

ТМО нативная 2 1 0 0 0 0

ТМО неправильное хранение 3-2 2 2 1 0 0

ТМО (65 КГр) 2 2 1 1 1 0

Таблица 10.

Выраженность тканевой реакции глаза кролика при имплантации ПРК.

Вид материала Степень выраженности реакции

1 день 2 день 3 день 4 день 5 день 1 нед

ПРК коммерч. 1 0 0 0 0 0

ПРКнативный 2 1 0 0 0 0

ПРК неправильное хранение 2 2 1 1 0 0

ПРК(65 КГр) 2 2 1 1 1 1

Из сравнения данных in vitro по количеству остаточного белка в экстрактах и тканевой реакции глаза животных в обеих сериях экспериментов следует, что наихудшие результаты in vivo показали образцы биотканей ТМО и ПРК с содержанием остаточного белка выше 50 мкг/мл.

Таким образом, проведенная серия экспериментов от vitro и in vivo показала, что критическим параметром, определяющим качество склероукрепляющего материала, является количество остаточного

несвязанного белка. Его содержание зависит не только от природы материала, но и от соблюдения технологического регламента, в том числе, нарушение режимов стерилизации и хранения.

Полученные результаты позволили рекомендовать производителю склероукрепляющего материала удлинить время отмывки материала, строго выдерживать технологический регламент стерилизации и условий хранения конечного продукта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

На основе анализа основных принципов национального стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий», опыта работ российских испытательных токсикологических лабораторий, а также собственного опыта работы в этой области, был предложен и экспериментально обоснован дифференцированный подход к выбору системы методов для доклинической оценки биологической безопасности имплантатов. Показано, что биологическая безопасность медицинских изделий зависит от природы материала, локализации имплантата в организме, его конструктивных особенностей и технологических параметров. В процессе работы выработана общая система методов для составления программ испытаний медицинских изделий с учетом их особенностей.

Предложенный дифференцированный подход позволяет не только повысить эффективность конкретных программ испытаний, но и существенно сократить время их проведения и стоимость. При выборе методов испытаний и условий их проведения следует учитывать факторы потенциального риска, связанные с областью применения имплантата.

Все основные положения методологии дифференцированного подхода внедрены в практику испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий Центра по исследованию биоматериалов ГУ НИИТиИО МЗ РФ. Реализованные в ходе выполнения работы программы доклинические испытания имплантатов позволили дать рекомендации производителям по

изменению технологии производства и контролю качества выпускаемой продукции.

ВЫВОДЫ.

1. Сформулирована и экспериментально обоснована методология дифференцированного подхода к доклинической оценке имплантатов, отвечающая основным принципам национального стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Оценка биологического действия медицинских изделий». Объем испытаний и выбранная система методов испытаний должны учитывать факторы потенциального риска, обусловливающие возможные отрицательные эффекты при функционировании изделия, и его предысторию.

2. Эффективность предложенного дифференцированного подхода доказана на примере программ доклинических испытаний биодеградируемых материалов для биоискусственных органов и трансплантации клеток, полимерных интраокулярных линз, орбитальных имплантатов и антиглаукомных дренажей. Достоверность полученных результатов подтверждается независимыми результатами клинических исследований.

3. Показано, что введение в программу исследований не регламентированных стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99 видов испытаний дает возможность не только повысить достоверность доклинической оценки имплантатов, но и выяснить причины отрицательных результатов биологических испытаний.

4. Установлено, что привлечение метода фрактографии позволяет исключить на этапе физико-химической исследований образцы интраокулярных линз из полиметилметакрилата ' и полидиметилсилоксана, не отвечающих требованиям, предъявляемых к имплантатам.

5. Показана опасность получения положительных ложных результатов доклинических испытаний имплантатов при слепом следовании прописям, рекомендованных стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99. Увеличение времени приготовления образцов экстрактов от трех суток, рекомендуемых стандартом, до 1 месяца позволило на стадии физико-химических (санитарно-химических) испытаний интраокулярных линз из полиметилметакрилата и полидиметилсилоксана выявить изделия, не соответствующие требованиям, предъявляемым к имплантатам.

6. Обоснована применимость однотипных программ доклинических испытаний для имплантатов со сходным набором наиболее вероятных факторов риска. С использованием разработанной программы испытаний физико-химических и медико-биологических свойств биодеградируемых биополимеров доказана возможность применения коллагенсодержащих и бактериальных материалов в качестве имплантируемых систем для восстановления функций пораженных органов и тканей.

7. Учитывая положительный опыт применения медицинских изделий из акрилатных гелей и привлекая методы измерения гемолитической активности комплемента и ускоренной биодеструкции в модельных средах, удалось существенно сократить объем испытаний акрилатных дренажей для лечения тяжелых форм глаукомы без ущерба для достоверности полученных результатов.

8. Включение в программу испытаний гидрогелевых внутриорбитальных протезов метода ускоренной биодеструкции позволило выявить ошибки в технологическом регламенте, приводящие к неполной полимеризации материала изделия и, как следствие, к нарушению функциональных свойств имплантата.

9. При анализе технологического процесса изготовления склеропластического материала из биотканей установлено, что

причинами клинических осложнений было увеличенное количество несвязанного белка в изделии из-за нарушений режимов радиационной стерилизации и хранения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. При составлении программы доклинических испытаний конкретного имплантата необходимо принимать во внимание не только наиболее вероятные факторы риска, обусловливающие возможные отрицательные эффекта при функционировании изделия, но и положительный опыт клинического применения изделия или входящих в его состав материалов.

2. При подготовке к испытаниям образцов экстрактов имплантатов из синтетических полимерных материалов время экстракции следует выбирать с учетом химического состава и конструкционных особенностей изделия.

3. Программа доклинических испытаний имплантатов длительного срока функционирования обязательно должна включать методы исследования склонности изделия к биодеструкции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Багров С.Н., Чаброва Л.С., Перова Н.В., Бузоверя М.Э. Влияние способа переработки заготовок ПММА на морфологию поверхности ИОЛ. Деп. в «Союзмединформ» № 22584 от 10.07.92.

2. Чаброва Л.С., Перова Н.В., Багров С.Н. Исследование физико-химических свойств материала для контактных линз НЕМА+Коллаген. Деп. в «Союзмединформ» № 23181 от 4.03.93.

3. Багров С.Н., Чаброва Л.С., Перова Н.В., Бузоверя М.Э. Микроструктурный анализ линз из ПММА. Деп. в «Союзмединформ» № 23177 от 4.03.93.

4. Багров С.Н., Чаброва Л.С., Перова Н.В., Бузоверя М.Э. Исследование морфологии поверхности ИОЛ из ПММА и силикона после биостарения. Деп. в «Союзмединформ» № 23180 от 4.03.93.

5. Линник Л.Ф., Чаброва Л.С., Перова Н.В. Исследование физико-химических и оптических свойств ПММА и силикона. Деп. В «Союзмединформ» № 23178 от 4.03.93.

6. Багров С.н., Чаброва Л.С., Перова Н.В., Бузоверя М.Э. Микроструктурный анализ интраокулярных линз в процессе старения. Материалы 6 съезда офтальмологов России 22-24 марта 1994, Москва, с. 14.

7. Чаброва Л.С., Перова Н.В., Багров С.Н. Повышение качества полимерных материалов для офтальмохирургии. Вопросы офтальмологии. Материалы научно-практической конференции. Омск, 1994, с. 89.

8. Чаброва Л.С., Перова Н.В. Эффективность системы критериев биосовместимости полимерных материалов, разрабатываемых для офтальмохирургии. Материалы б съезда офтальмологов России 22-24 марта 1994, Москва, с. 80.

9. Перова Н.В., Джавришвили Г.В. Иммунологическая типизация пациентов с тяжелыми бельмами роговицы. Материалы 6 съезда офтальмологов России 22-24 марта 1994, Москва, с. 293.

Ю.Линник Л.Ф., Фоменко В .В., Перова Н.В., Треушников В.М., Викторова Е.А., Большакова ШО. Новые эластичные полимерные материалы для изготовления интраокулярных линз. Актуальные проблемы современной офтальмологии. Российская конференция офтальмологов, поев. 75-летию Смоленской ГМА. Тезисы доклада. Смоленск. 1995, с. 22-23.

П.Перова Н.В., Бузоверя М.Э., Валюнин И.Г. Структурные особенности и биологические свойства интраокулярных линз из полиметилметакрилата и силикона. В ж. Биосовместимость, т. 3, №1-2, с. 63-71.

12.Perova N.V., Buzoveiya М.Е., Vahlunin I.G. Structural peculiarities and biological properties of intraocular lenses made of polymethylmetacrylate and silicone. Biomaterial-Living System interactions, 3, No 1-2, p.p. 57-65.

13. Линник Л.Ф., Чеглаков Ю.А., Фоменко B.B., Перова Н.В., Большакова И.Ю., Треушников В.М., Егорова Э.В. О биосовместимости ИОЛ из нового материала для внутриглазной имплантации. Актуальные проблемы современной офтальмологии. Сб. статей. Бишкек, 1996, с. 23-24.

14.Федоров С.Н., Линник Л.Ф., Фоменко В.В., Пряхина Н.П., Ронкина Т.И., Перова Н.В., Васин В.И., Треушников В.М., Викторова Е.А.. Упругоэластичные интраокулярные линзы нового поколения (ИОЛ-ФЛЕКС). В ж. Офтальмохирургия, 1996, № 4, с. 3-10.

15.Давыдов Д.В., Валуев Л.И., Сытов Г.А., Перова Н.В. Гидрофильный инъекционный имплантат для коррекции мягких тканей орбиты при анофтапьмическом синдроме. Актуальные проблемы современной офтальмологии. Материалы зональной конференции офтальмологов Сибири и Дальнего востока. Благовещенск, 1997, с. 6-8.

16.Шилкин Г. А., Гемонов В.В.. Андрейцев А.Н., Колединцев М.Н., Перова Н.В. Роль ретробульбарной клетчатки в развитии патологии орбиты и глазного яблока. Сб. научных работ (ММСИ-75 лет). М., 1997, с. 270-271.

17.Валуев Л.И., Давыдов Д.В., Сытов Г.А., Перова Н.В., Кузина Л.Д., Валуев И.Л. Биосовместимый полимерный имплантат в пластической

реконструктивной хирургии. Современные подходы к разработке перевязочных средств, шовного материала и полимерных имплантатов. Материалы 3-й междунар. конф. М.,1998, с. 217-218.

18.Давыдов Д.В., Валуев Л.И., Сытов Г.А., Перова Н.В., Кузина Л.Д., Усенко Я.Р., Валуев И.Л. Гидрогели в реконструкции анофтальмической орбиты. Современные подходы к разработке перевязочных средств, шовного материала и полимерных имплантатов. Материалы 3-й междунар. конф. М.,1998, с. 310-311.

19.Давыдов Д.В., Валуев Л.И., Сытов Г.А., Перова Н.В., Кузина Л.Д. Биосовместимый инъекционный имплантат для реконструкции мягких тканей анофтальмической орбиты. Материалы 1 Евро-Азиатской конференции по офтальмологии. Екатеринбург, 1998, с. 117-118.

20.Борзенок С.А., Золотаревский A.B., Перова Н.В., Довжик И.А., Балабина О.В. Патофизиологический скрининг пациентов с прогрессирующей миопией, склонной к развитию аллергических отеков после имплантосклеропластики. Материалы 1 Евро-Азиатской конференции по офтальмологии. Екатеринбург, 1998, с. 131.

21.Борзенок С.А., Золотаревский A.B., Ронкина Т.Н., Комах Ю.А., Перова Н.В., Довжик И.А., Балабина О.В. Клинико-цитохимические параллели иммуннопатологических реакций у пациентов с высокой миопией в ответ на склеропластические операции. Материалы 1 Евро-Азиатской конференции по офтальмологии. Екатеринбург, 1998, с. 131-132.

22.Ронкина Т.Н., Золотаревский A.B., Перова Н.В., Довжик И.А., Балабина О.В. Особенности приживления склеропластического материала в эксперименте. Материалы 1 Евро-Азиатской конференции по офтальмологии. Екатеринбург, 1998, с. 139-140.

23.Федоров С.Н., Давыдов Д.В., Васильев A.B., Перова Н.В., Данилова Т.Н., Шинин В.В., Терских В.В. Применение культур постнатальных

фибробластов кожи человека в офтальмотоксикологических исследованиях. В ж. Офтальмохирургия, 1998, №3, с. 49-53.

24.Давыдов Д.В.. Васильев А.В., Перова Н.В., Данилова Т.И., Терских В.В.Токсиколошческая оценка полимерных орбитальных имплантатов в культуре постнатальных фибробластов. Новые технологии в повышении качества лечения заболеваний глаз в Приамурье. Материалы научно-практической конф. офтальмологов Дальневосточного региона и Восточной Сибири. Хабаровск, 1998, с. 275-276.

25.Davydov D.V., Valuyev L.I., Sytov G.A., Perova N.V., Usenko Y.R. Reconstuction of anophthalmic orbit with injective hydrogel. 28-th International Congess of Ophthalmology. Amsterdam, 1998, p. 173.

26.Davydov D.V., Valuyev L.I., Sytov G.A., Perova N.V., Valuyev I.L., Kuzina L. Biocompatible hydrogel implant-endoprothesis in plastic ophthalmology. 9-th Congress of Ophthalmology & Optometry. Riga, 1998, p. 81.

27.Davydov D.V., Valuyev L.I., Sytov G.A., Perova N.V. Biocompatible hydrophilic implants in the surgical reconstruction of the anophthalmic orbit. 12th Congress Europefn Society of Ophthalmology. Stockholm, 1999, p. 45.

28.Ронкина Т.Н., Золотаревский A.B., Балабина O.B., Перова Н.В., Довжик И.А., Новиков С.Н. Воздействие обработки и режима хранения склеропластического материала и состояния организма реципиента на эффективность склероукрепляющих операций. Тезисы докладов, 7 съезд офтальмологов России. - Москва, 2000. ч.1, с. 284-285.

29. Ронкина Т.И., Багров С.Н., Золотаревский А.В., Балабина О.В., Перова Н.В., Довжик И.А., Маклакова И.А., Новиков С.Н., Чулков Р.В. Влияние обработки и хранения склеропластического материала на качественные и количественные характеристики имплантата и результаты приживления его в эксперименте. Офтальмохирургия. 2000,2, с.11.

30. Багров СЛ., Могилевцев В.В., Перова Н.В., Маклакова И.А, Экспериментальное обоснование применения сополимера коллагена в хирургическом лечении глаукомы. В ж. Офтальмология, 2001, №3, с. 24-39.

31. Севастьянов В.И.. Васин С.Л., Перова Н.В. Методы исследования биоматериалов и медицинских изделий. В книге: Биосовместимость. Под ред. Севастьянова В.И., М., «ИЦ ВНИИГС», 1999, с. 47.

32. В.И. Севастьянов, Н.В. Перова, Н.В. Довжик, И.А. Титушкин, Е.А. Немец, З.М. Беломестная, Е.И. Шишацкая. Т.Г. Волова. Медико-биологические свойства полиоксиалканоатов - биодеградируемых бактериальных полимеров. Перспективные материалы. 2001, №5, с. 46-55.

33. Н.В. Перова, А.Н. Самойлов, И.А. Довжик, В.И. Севастьянов. Исследование диффузии лекарственного средства «Пиявит» (в виде глазных капель) через роговицу глаза кролика в условиях in vivo. Материалы 7-й научно-практической конференции Ассоциации гирудологов России и стран СНГ. Практическая и экспериментальная гирудология: итоги за десятилетие (1991-2001 гг.), Москва, 2001, с. 84-85.

34. Е. N. Pokidysheva, I. A. Maklakova, Z. М. Belomestnaya, N. V. Perova, S.N. Bagrov, V. I. Sevastianov. Comparative analysis of human serum albumin adsorption and complement activation for intraocular lenses. Artificial Organs, 2001, Vol. 25, No 6, p.p. 453-458.

35. Перова H.B., Севастьянов В.И. Особенности испытаний медицинских изделий. Партнеры и конкуренты, 2002, № б, с. 37-40.

36. Перова Н.В., Севастьянов В.И. Доклиническая оценка имплантатов с позиций потенциального риска. Вестник трансплантология и искусственных органов, 2002, № 3, с. 115 (Материалы II Всероссийского съезда по трансплантологии и искусственным органам, Москва, 17-19 октября 2002 г.)

37. Перова Н.В., Севастьянов В.И., Довжик И.А. Особенности доклинической оценки интраокулярных линз. В сборнике научных статей, Российский

симпозиум по рефракционной и пластической хирургии глаза, Москва, 2002 г., 20-21 декабря, с. 170-173.

38. Давыдов Д.В., Копылова Н.Е., Беспалов Е.О., Перова Н.В., Сытов Г.А., Валуев И.Л., Валуев Л .И. Особенности гидрогелевого орбитального имплантационного материала и тканевая реакция на его имплантацию. Офтальмохирурпгя, 2002, № 2, с. 4044.

39. Давыдов Д.В., Копылова Н.Е., Беспалов Е.О., Перова Н.В., Довжик И.А., Пименова Д.В., Сытов Г.А., Валуев Л.И., Валуев И.Л. Экспериментальная оценка биосовместимости нового орбитального имплантата из комбинированного материала. В сб. новые технологии микрохирургии глаза (морфология, регенерация, трансплантация). ХШ Российская ежегодная научно-практическая конференция, Оренбург, 2002, с. 18-24.

40. Shishatskaya Е., Sevastianov V., Volova Т., Perova N. Results of biomedical investigations of PHB and PHB/PHV. Abstracts of International Symposium of Biological Polymers, Germany, 2002, September 22-26,2002, p. 157.

41. Sevastianov V.I., Volova T.G., Perova N.V., Shishatskaya E.I., Kalacheva G.S. Production of purified polyhydroxyalkanoates (PHAs) for applications in contact with blood.- J. of Biomater. Sci. Polymer. Edn.-2003.-V.14, N.10.-p.p. 10291042.

42. Перова H.B., Довжик Й.А., Севастьянов В.И., Бессмертный А.М., Еричев В.П., Робустова О.В. Медико-биологические исследования дренажа для лечения тяжелых форм глаукомы. Глаукома, 2003, № 4, с. 40-44.

43. Порунова Ю.В., Перова Н.В., Севастьянов В.И. Медико-биологические свойства СфероГЕЛЬ™ - биодеградируемого коллагенсодержащего матрикса для биологических искусственных органов и тканей. В сб. Актуальные вопросы клинической транспортной медицины, М., Репроцентр, 2003, т. 11, с. 250-257.

44. Перова Н.В., Порунова Ю.В., Урьяш В.Ф., Фаминская Л.А., Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., Оншценко НА, Севастьянов В.И.,

Шумаков В.И. Биодеградируемый коллагенсодержащий матрикс СфероГЕЛЬ™ для биоискусственных органов и тканей. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2003, № 4, с. 46-49. 45. Перова Н.В., Порунова Ю.В., Урьяш В.Ф., Фаминская Л.А.,

Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., Онищенко H.A., Севастьянов В.И., Шумаков В.И. Биодеградируемый коллагенсодержащий матрикс Сферогель™ для клеточной трансплантации. Перспективные материалы, 2004, №2, с. 52-59,

Патенты по теме диссертации.

1. Патент РФ № 2192821. Дренаж дня лечения глаукомы (Севастьянов В.И., Бессмертный А.М., Еричев В.П., Перова Н.В., Довжик И.А.), приоритет от 04.01,2001.

2. Еричев В.П., Бессмертный А.М., Робустова О.В. Севастьянов В.И., Перова Н.В., Довжик И.А. Способ хирургического лечения тяжелых форм глаукомы. Л/с 2003112598 от 30 апреля 2003. Полож. реш. от 26.02.94.

Заказ № 605. Объем 2п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш» Москва. Ул. Палиха 2Ател. 250-92-06

РНБ Русский фонд

2007-4 17921

13 (Х„. mi>

Актуальность проблемы.

Применение любого изделия медицинского назначения, особенно предназначенного для имплантации, невозможно без доклинической оценки его биологического действия. В существующих стандартах дано следующее определения имплантатам - «.медицинские изделия, вводимые внутрь организма, которые классифицируются по времени пребывания в организме, по материалу, по степени контакта, по характеру контакта» [30].

По высокой степени потенциального риска имплантаты относят к высшему 3 классу [36]. Основное требование к ним — их биосовместимость. С 1994 года под этим термином было предложено понимать способность материала, изделия или устройства выполнять свои функции и не вызывать отрицательных реакций в организме «хозяина» [15]. Другими словами, применение имплантатов должно быть безопасным.

Биологическая безопасность имплантатов зависит от целого ряда факторов (назначение имплантата, технология изготовления, место локализации, продолжительность функционирования и др.).

До 90-х годов каждая страна имела свою систему оценки безопасности медицинских изделий, закрепленную национальными документами таких организаций, как ASTM (США), BSA (Великобритания), DIN (Германия) и др. Например, в США шли по пути отработки стандартов на отдельные виды испытаний, оставляя право выбора тестов испытателям [139,145].

В России, наряду с Государственными стандартами (ГОСТ), существовали отраслевые стандарты (ОСТ). Испытательные лаборатории разрабатывали методические рекомендации по исследованию новых медицинских изделий. Наиболее значимыми были: «Сборник руководящих методических материалов по токсиколого-гигиеническим исследованиям полимерных материалов и изделий на их основе медицинского назначения» (Лаппо В.Г., Ланина С .Я., Носкова Т.И. и др., 1987) [99]; «Сборник методических рекомендаций по оценке биосовместимых свойств искусственных материалов, контактирующих с кровью» (Доброва Н.Б., Носкова Т.И., Новикова С.П., Севастьянов В.И., 1991) [100]; «Токсико-гигиеническая оценка полимерных материалов для интраокулярных линз и других трансплантатов, применяемых в условиях повышенной биосовместимости» (Чаброва Л.С., Федоров С.Н. и др. 1988) [117].

Образование Всемирной Торговой Организации, созданной для стандартизации и приведения к единообразию требований к товару и услугам, потребовало гармонизации соответствующей нормативной документации. С 1992 г. в большинстве стран Европы и в США оценка биологической безопасности медицинских изделий проводится в соответствии с международными стандартами серии ISO 10993 «Biological Evaluation of Medical Devices», в которых подходы к составлению программ исследований максимально унифицированы. В России национальный стандарт ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий», гармонизированный в соответствии с международным стандартом ISO 10993, был введен с 1999 г. В отличие от документов ГОСТ и ОСТ, стандарт ГОСТ Р ИСО 10993-99 носит рекомендательный характер в отношении выбора методов испытаний и до недавнего времени предусматривал только биологическую оценку изделий.

Таким образом, перед российскими испытательными токсикологическими лабораториями встала задача практической реализации стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99, заключающаяся, с учетом накопленного опыта работы в области испытаний медицинских изделий, в выборе методического подхода и методов исследования.

Заметим, что использование видов испытаний, только регламентированных данным стандартом, приводило, в ряде случаев, либо к неоправданному увеличению объема испытаний, либо ложному выводу о биосовместимости имплантата. Такое положение диктует, в одних случаях, — целесообразность сокращения объема испытаний, а в других, -необходимость привлечения дополнительных видов как физико-химических, так и биологических испытаний.

В связи с этим нахождение путей реализации основных принципов стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 и внедрение их в практику работы российских испытательных лабораторий является весьма актуальной и практически важной задачей.

Для решения поставленной проблемы был предложен дифференцированный подход к доклинической оценке имплантатов. Суть которого заключается в том, что программу испытаний конкретного изделия составляют с учетом наиболее вероятных факторов риска, обусловливающих возможные отрицательные эффекты при функционировании изделия, и предыстории изделия (наличие клинического опыта применения изделия или материалов, входящих в его состав, частота осложнений, отдаленные результаты имплантации и др.).

Цельюисследования является разработка методологии дифференцированного подхода к доклинической оценке имплантатов, соответствующей основным принципам стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий».

Исходя из поставленной цели, основные задачи работы сводились к следующему:

- сформулировать основные положения дифференцированного подхода к доклиническим испытаниям имплантатов и общую схему его реализации;

- разработать программы исследований имплантатов с учетом их предыстории и основных факторов риска, влияющих на биологическую безопасность изделия;

- на конкретных примерах испытаний имплантатов различного назначения экспериментально обосновать правомерность применения дифференцированного подхода к биологической безопасности изделий;

- показать необходимость привлечения для повышения надежности доклинической оценки имплантатов дополнительных видов испытаний, не регламентированных стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99;

- обосновать возможность сокращения отдельных видов испытаний для медицинских изделий или входящих в их состав материалов, используемых ранее в клинической практике.

Научная новизна. Впервые разработана и экспериментально обоснована методология дифференцированного подхода к доклинической оценке имплантатов, учитывающая основные принципы национального стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99.

Показано, что введение в программу видов испытаний, учитывающих природу материала, места локализации имплантата, его конструкцию и технологию изготовления, но не регламентированных стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99 видов испытаний, позволяет не только повысить достоверность исследования, но и выяснить причины возможных отрицательных результатов биологических испытаний.

Доказана применимость однотипных программ доклинических испытаний для имплантатов различного назначения со сходным набором наиболее вероятных факторов риска, обусловливающих возможные отрицательные эффекты при функционировании изделия.

Разработаны и экспериментально обоснованы программы испытаний биодеградируемых материалов для биоискусственных органов и трансплантации клеток, полимерных интраокулярных линз, орбитальных имплантатов и антиглаукомных дренажей.

Практическая значимость. В качестве практического пути реализации основных принципов национального стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий» предложен дифференцированный подход к доклинической оценке имплантатов.

Разработанная методология внедрена в практику испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий Центра по исследованию биоматериалов НИИ трансплантологии и искусственных органов Минздрава РФ. Внедрение дифференцированного подхода к доклиническим испытаниям имплантатов в практику национальных испытательных лабораторий, аккредитованных при Минздраве РФ и Госстандарте России, позволит значительно сократить время и затраты на анализ медико-биологических свойств изделий с одновременным повышением надежности получаемых результатов.

Проведенные доклинические испытания имплантатов дали возможность рекомендовать производителям офтальмологических изделий внести коррективы в технологию производства и контроль качества выпускаемой продукции.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 220 листах машинописного текста. Состоит из введения, семи глав, заключения, выводов, 5 приложений, актов внедрения результатов работы. Работа иллюстрирована 30 рисунками, содержит 50 таблиц. Список цитируемой литературы включает 224 источников из них 137 отечественных и 87 зарубежных.

ВЫВОДЫ.

1. Сформулирована и экспериментально обоснована методология дифференцированного подхода к доклинической оценке имплантатов, отвечающая основным принципам национального стандарта ГОСТ Р ИСО 10993-99 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий». Объем испытаний и выбранная система методов испытаний должны учитывать факторы потенциального риска, обусловливающие возможные отрицательные эффекты при функционировании изделия, и его предысторию.

2. Эффективность предложенного дифференцированного подхода доказана на примере программ доклинических испытаний биодеградируемых материалов для биоискусственных органов и трансплантации клеток, полимерных интраокулярных линз, орбитальных имплантатов и антиглаукомных дренажей. Достоверность полученных результатов подтверждается независимыми результатами клинических исследований.

3. Показано, что введение в программу исследований не регламентированных стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99 видов испытаний дает возможность не только повысить достоверность доклинической оценки имплантатов, но и выяснить причины отрицательных результатов биологических испытаний.

4. Установлено, что привлечение метода фрактографии позволяет исключить на этапе физико-химической исследований образцы интраокулярных линз из полиметилметакрилата и полидиметилсилоксана, не отвечающих требованиям, предъявляемых к имплантатам.

5. Показана опасность получения положительных ложных результатов доклинических испытаний имплантатов при слепом следовании прописям, рекомендованных стандартом ГОСТ Р ИСО 10993-99. Увеличение времени приготовления образцов экстрактов от трех суток, рекомендуемых стандартом, до 1 месяца позволило на стадии физико-химических (санитарно-химических) испытаний интраокулярных линз из полиметилметакрилата и полидиметилсилоксана выявить изделия, не соответствующие требованиям, предъявляемым к имплантатам.

6. Обоснована применимость однотипных программ доклинических испытаний для имплантатов со сходным набором наиболее вероятных факторов риска. С использованием разработанной программы испытаний физико-химических и медико-биологических свойств биодеградируемых биополимеров доказана возможность применения коллагенсодержащих и бактериальных материалов в качестве имплантируемых систем для восстановления функций пораженных органов и тканей.

7. Учитывая положительный опыт применения медицинских изделий из акрилатных гелей и привлекая методы измерения гемолитической активности комплемента и ускоренной биодеструкции в модельных средах, удалось существенно сократить объем испытаний акрилатных дренажей для лечения тяжелых форм глаукомы без ущерба для достоверности полученных результатов.

8. Включение в программу испытаний гидрогелевых внутриорбитальных протезов метода ускоренной биодеструкции позволило выявить ошибки в технологическом регламенте, приводящие к неполной полимеризации материала изделия и, как следствие, к нарушению функциональных свойств имплантата.

9. При анализе технологического процесса изготовления склеропластического материала из биотканей установлено, что причинами клинических осложнений было увеличенное количество несвязанного белка в изделии из-за радиационной стерилизации и хранения. нарушений

158 режимов

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. При составлении программы доклинических испытаний конкретного имплантата необходимо принимать во внимание не только наиболее вероятные факторы риска, обусловливающие возможные отрицательные эффекты при функционировании изделия, но и положительный опыт клинического применения изделия или входящих в его состав материалов.

2. При подготовке к испытаниям образцов экстрактов имплантатов из синтетических полимерных материалов время экстракции следует выбирать с учетом химического состава и конструкционных особенностей изделия.

3. Программа доклинических испытаний имплантатов длительного срока функционирования обязательно должна включать методы исследования склонности изделия к биодеструкции.