Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Дифференцированная иммунокоррегирующая терапия больных хроническим урогенитальным хламидиозом с учетом изменения функциональной активности клеток фагоцитарного звена

Новосибирская государственная медицинская академия

На правах рукописи

-Г)

ШАПРАНМихаил Валентинович ~ ^ ¿00

ДИФФЕРЕНЦИРОВАННАЯ ИММУНОКОРРИГИРУЮЩАЯ ТЕРАПИЯ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ХЛАМИДИОЗОМ С УЧЕТОМ ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК ФАГОЦИТАРНОГО ЗВЕНА

14.00.11 - кожные и венерические болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2003 г.

Работа выполнена на кафедре кожных и венерических болезней Красноярске] государственной медицинской академии

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор В. И. Прохоренков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор П. Н. Пестерев кандидат медицинских наук А. А. Хрянин

Ведущее учреждение: Иркутский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится « ИЗ» 2003 г. в_часов н

заседании специализированного совета К при Новосибирско

государственной медицинской академии по адресу: 630091, Новосибира Красный проспект, 52.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Новосибирской медицинской академии.

Автореферат разослан «22» к С{I {р $_2003 г.

Ученый секретарь специализированного совета, к. м. н.,доц.

Т. Б. Решетников

Актуальность темы

На фоне общего роста заболеваемости инфекциями, передаваемыми половым путем, значительный удельный вес приходится на урогенитальный хламидиоз (УГХ). По данным ВОЗ, 2000 г., около 600 - 700 млн. человек во всем мире подвергаются хламидийному инфицированию. Более 50 млн. человек ежегодно заболевают этой инфекцией. По данным Walter Е. Stamm, King К. Holmes (1994), частота обнаружения хламидий у мужчин с негонококковым уретритом в США составляет 30 - 50%. При этом распространенность УГХ у молодых мужчин составляет 3 - 5% - среди наблюдаемых в обычных медучреждениях; более 10% - среди военнослужащих без клинической симптоматики, 15 - 20% - среди наблюдаемых в кожно-венерологических клиниках. Хламидийная инфекция, по данным ВОЗ, выявляется у 10 - 20 % молодых женщин, посещающих центры здоровья для молодежи; 5 - 20 % женщин, имеющих беременность, 3 - 18 % делающих аборт, 3 - 12% наблюдаемых в клиниках планирования семьи, 4 - 33% проституток. По данным Хрянина А. А. и соавт,, 1998, распространенность хламидиоза значительна и в промышленных городах Сибири. Если учесть, что УГХ часто протекает без выраженной симптоматики, дает массу осложнений и отдаленных последствий (в том числе мужское и женское бесплодие), то становится очевидна его огромная медико-социальная значимость. Медицинский аспект данной проблемы заключается в трудностях лабораторной диагностики, бессимптомном течении, частой хронизации инфекции и ее устойчивостью к традиционной антибиотикотерапии [Чеботарев В. В., 2002]. Многие авторы в ряду причин, приводящих к хроническому процессу и неэффективности антибиотиков, ведущее место отводят нарушением со стороны иммунной системы макроорганизма [Коэн К. Р., 1999; Гомберг М. А., 1997; Чеботарев В. В., 2002]. Особенностями иммунного ответа при УГХ являются крайне низкое протективное действие противохламидийных антител, неэффективный ответ клеточного иммунитета. Хроническая хламидийная инфекция сопровождается воспалительными процессами, протекающими, как

правило, в виде реакции гиперчувствительности замедленного типа, а в ряде случаев аутоиммунной реакцией [Глазкова J1. К., 1999; Линева О. И., 1998; Williams D. М, 1997]. Ключевую роль в механизмах противохламидийной защиты отводят динамике наработки и соотношению цитокинов, прежде всего интерферонов, интерлейкинов 1, 2, 6 и альфа фактору некроза опухоли [Chen В., 1996; Yin Z., 1997, Yi Y., 1997]. Очевидна ключевая роль клеток фагоцитарного звена в формировании цитокинового ответа [Кетлинский С. А., 1992; Тотолян А. А., Фрейдлин И. С., 2000]. Описанные в литературе изменения со стороны фагоцитарной системы при УГХ не позволяют в полной мере оценить многие параметры состояния функциональной активности ПМЯЛ. Таким образом, представляется целесообразным провести комплексное изучение показателей функционирования фагоцитарной системы при данной патологии. Чрезвычайно актуальным является также разработка индивидуального терапевтического воздействия с учетом особенностей иммунопатогенеза УГХ и изменения функциональной активности клеток фагоцитарного звена.

Цель работы

Усовершенствовать подходы к назначению дифференцированной иммуномодулирующей терапии, применяемой в комплексном лечении больных хроническим урогенитальным хламидиозом, а также повысить эффективность выявления С. trachomatis методом ПЦР в моче у мужчин с хроническим УГХ.

Задачи исследования

1. Оценить иммунологические особенности инфекционного процесса при УГХ с изучением параметров клеточного и гуморального иммунитета.

2. Исследовать особенности функционирования системы полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) крови больных УГХ.

3. Оптимизировать пути иммунологической коррекции, применяемой в комплексном лечении УГХ.

4. Разработать способы повышения диагностической эффективности обнаружения С. trachomatis методом полимеразной цепной реакции в моче у мужчин с хроническим УГХ.

Положения, выносимые на защиту

1. Изменения иммунологических параметров у больных УГХ проявляются Т-иммунодефицитом I и II степени, дисбалансом иммунорегуляторных субпопуляций, а также умеренной напряженностью гуморального иммунитета.

2. Уровень метаболической активности ПМЯЛ и их реакция на специфическую и неспецифическую антигенную стимуляцию носит разнонаправленный характер у больных УГХ и лиц контрольной группы и зависит от стадии инфекционного процесса.

3. Дифференцированную иммуномодулирующую терапию больных УГХ целесообразно проводить с учетом функциональных нарушений со стороны полиморфноядерных лейкоцитов и их реакции на иммуномодуляторы in vitro.

4. Эффективность выявления возбудителя УГХ в первой порции мочи у мужчин методом ПЦР повышается при предварительном проведении массажа предстательной железы, а также массажа предстательной железы и сеанса вакуумной фаллодекомпрессии.

Научная новизна исследования

1. Впервые исследована реакция клеток фагоцитарного звена больных УГХ и здоровых людей на присутствие комплексного хламидийного антигена (лизат элементарных телец хламидий), доказано его ингибирующее влияние на функциональную активность лейкоцитов здоровых лиц.

2. Впервые изучена кинетика и интенсивность «респираторного взрыва» фагоцитирующих клеток больных УГХ при воздействии неспецифической

антигенной субстанции (опсонизированный зимозан), показана зависимость клеточного метаболизма от фазы инфекционного процесса.

3. Доказана индивидуальность реакции полиморфноядерньгх лейкоцитов на иммунотропные препараты in vitro и продемонстрирована эффективность использования данного теста для оптимизации путей дифференцированной иммуномодулирующей терапии больных УГХ.

4. Впервые предложено повысить эффективность ПЦР диагностики С. trachomatis первой порции мочи при хронической хламидийной инфекции у мужчин с использованием предварительно массажа предстательной железы и сеанса вакуумной фаллодекомпрессии.

Практическая значимость работы

1. Предложен метод диагностики хронического УГХ путем комплексной оценки специфических серологических параметров и реакции ПМЯЛ на неспецифическую и специфическую антигенную стимуляцию.

2. Предложено использовать дифференцированную иммунокорригирующую терапию с учетом изменения функциональной активности клеток фагоцитарного звена и предварительным скринингом иммуномодуляторов in vitro. Данное внедрение является недорогим тестом, может быть проведено на базе иммунологической лаборатории, позволяет индивидуально подходить к назначению иммунотропных препаратов и сократить сроки восстановления функциональной активности ПМЯЛ.

3. Применение массажа предстательной железы и сеанса вакуумной декомпрессии проводимые перед забором мочи для исследования методом ПЦР у мужчин с хроническим УГХ позволяет повысить диагностическую эффективность выявления С. trachomatis на 2,56%.

Реализация м внедрение результатов

По результатам исследования опубликовано учебно-методическое пособие для врачей «Современные принципы диагностики и лечения урогенитального хламидиоза», 5 статей, из них 1 в центральной печати. Зарегистрировано 2 рационализаторских предложения (от 14 марта 2000 г. и 18 апреля 2002 г.), 1 изобретение (патент № 2202787 от 20 апреля 2003 г.)

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на Краевой конференции специалистов по клинической и лабораторной диагностике 15-16 апреля 1999 г., г. Красноярск, Всероссийской научно-практической конференции «Внутриутробные и урогенитальные инфекции у населения в условиях Сибири и Севера» 14-15 ноября 2000 г., г. Красноярск, заседаниях Краевого общества врачей-дерматовенерологов в марте 2000 г., январе 2002 г., марте 2003 г., Краевой научно-практической конференции «Дни иммунологии в Красноярском крае» 25 - 26 сентября 2003 г., научно-практической конференции дерматовенерологов «Актуальные вопросы дерматологии, косметологии и инфекций, передаваемых половым путем», 30-31 октября 2003 г., Красноярск.

Структура п объем диссертации

Настоящая диссертационная работа изложена на 132 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов по результатам исследования и библиографического списка, содержит 18 таблиц и 14 рисунков. Библиографический список включает 237 литературных источников, из них 126 российских и 111 иностранных.

Материалы и методы исследования.

В настоящей работе было обследовано 120 больных хроническим урогенитальным хламидиозом, 76 мужчин и 44 женщины в возрасте 15 - 47 лет. Исследования проводились на нескольких клинических базах: Красноярский краевой кожно-венерологический диспансер, андрологическое отделение Городской больницы №4 г. Красноярска, Центральной научно-исследовательской лаборатории Красноярской медицинской академии. Обследованию подвергались лица с верифицированным топическими методами (прямая иммунофлюоресценция, полимеразная цепная реакция) диагнозом урогенитального хламидиоза. Давность заражения урогениталыюй монохламидийной инфекцией составляла более 2,5 - 3 месяцев. Комплексная диагностическая программа включала: сбор анамнеза, жалоб, визуальный осмотр, проведение бактериологического и бактериоскопического исследования отделяемого уретры, шейки матки, влагалища, анализ секрета предстательной железы, ультразвуковое исследование. При постановке реакции прямой иммунофлюоресценции использовались разработанные НПФ «Лабдиагностика» тест-системы «РекомбиСлайд Хламидия», в которых применяются поликлональные антитела к МОМР С. trachomatis, меченые флюоресцинизотиоционатом. Учет результатов оценивался визуально в зависимости от яркости флюоресценции ЭТ и РТ хламидий по 4-плюсовой шкале.

Диагностика урогенитального хламидиоза методом ПЦР велась с помощью наборов НПФ «Внедрение систем в медицину» (Россия) серии 51, №№14 - 17, серии 53 №№67 - 74 и "Ампликор CT/NG. Набор для подготовки проб, Apr. 07 5941 4 США 83315", "Ампликор CT/NG. Набор для амплификации, Арт. 07 5990 2 США 83319" и "Ампликор Хламидия трихоматис. Набор для детекции, Арт. 07 5349 1 США 83252", производимыми фирмой "f. Hoffman La Roche". Материалом для исследования у мужчин являлась первая порция мочи. Преимуществом

анализа мочи считается неинвазивность метода и возможность получения смывов по всей протяженности уретры. При хронических малосимптомных формах у 28 обследуемых забор ППМ предварялся массажем предстательной железы, а у 15 - массажем предстательной железы и сеансом вакуумной фаллодекомпрессии. У женщин материалом для исследования служил соскоб слизистой цервикального канала и уретры. Иммуноферментное определение противохламидийных IgA и IgG проводилось с помощью наборов фирмы "Orgenics", Израиль, в образцах плазмы крови больных с предварительно верифицированным диагнозом урогенитального хламидиоза. Всем больным проводилась стандартная антибактериальная терапия препаратами тетрациклинового ряда (доксициклина гидрохлорид, или доксициклина моногидрат по 100 мг два раза в день - 14 дней) и макролидами (рокситромицин 150 мг два раза в день, или кларитромицин 250 мг два раза в день 14 дней, или джозамицин по 500 мг два раза в день 14 дней). В качестве иммуномодулятора использовали реаферон, препарат рекомбинантного аг-интерферона, циклоферон, низкомолекулярный индуктор интерферона, и лолиоксидоний, являющийся стимулятором фагоцитарной активности и обладающий умеренной интерфрониндуцирующей активностью. Реаферон назначался по 1 млн ЕД внутримышечно через день, на курс 10 инъекций, циклоферон по 2 мл внутримышечно в 1, 2, 4, 6, 8, 11, 14, 17, 20, 23 дни, полиоксидоний по 6 мг внутримышечно через день, на курс 10 инъекций. Комплексная терапия включала также препараты системной энзимотерапии (вобэнзим), витамины (аевит, аскорутин, триовит), биогенные стимуляторы (алоэ, стекловидное тело), препараты, улучшающие микроциркуляцию (трентал, ксантинола никотинат). Контроль излеченности проводился не ранее, чем через 4-6 недель после окончания антибактериальной терапии методами ПИФ и ПЦР.

Иммунологическое обследование больных предусматривало изучение показателей клеточного, гуморального иммунитета и анализ функциональных нарушений со стороны клеток фагоцитарного звена.

Для изучения особенностей Т -клеточного иммунитета и динамики иммунологических реакций при УГХ проведено обследование 30 больных методом лазерной проточной цитофлюориметрии на цитофлюориметре FACS (Becton Dickinson Immunocytometry, США). Объектом исследования служили лимфоцитарные клетки периферической крови больных УГХ. В качестве тест-системы использовался набор Becton Dickinson Simultest11" JMK-Lymphocyte, содержащий двухцветные реагенты для прямой иммунофлюоресценции, предназначенной для подсчета процентного содержания зрелых субпопуляций лейкоцитов человека в лизированной цельной крови: Т-лимфоциты (CD3+); Т-хелперы (CD3+CD4+), цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+). С помощью этого набора можно также определять соотношение Т-хелперы/цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD4+/ CD3+CD8+). В каждом конкретном случае оценивали степени иммунодефицита по Т-клеткам. Показатели рассчитывались по формуле:

Абсолютное количество CD3(+)-iuictok больного

Среднее количество абсолютного числа СОЗ(+)-клеток 400% нормы

При снижении абсолютного количества CD3(+) - лимфоцитов на 133% диагностировалась легкая степень (I); на 34-66% - средняя (И), на 6780% - тяжелая степень Т-иммунодефицита. Параметры гуморального иммунитета определяли методом радиальной диффузии в геле по Манчини.

У 61 больного хроническим УГХ (38 мужчин и 23 женщин) проводилось определение показателей люминол зависимой хемилюминесценции полиморфноядерных лейкоцитов крови больных и их реакции на неспецифический антиген (зимозан). В качестве специфического стимулятора использовался лизат элементарных телец хламидий, применяемый также как антиген для ИФА-диагностики («ИмДи»), Одновременно проводилось определение реакции ПМЯЛ на иммунокорректоры (реаферон, циклоферон, полиоксидоний) in vitro. За основу при постановке теста с антигенами или иммунокорректорами in vitro

брали методику, предложенную для использования в дерматовенерологической практике А. В. Резайкиной, Москва, 1995, 1996 гг. Измерения проводили на серийном медицинском хемилюминометре CL-3606 («Биофизика», Красноярск), предназначенном для исследования сверхслабых свечений биологически активных объектов в спектральной области 200 - 650 нм. С целью интегральной оценки результатов исследований вычисляли индексы хемилюминесценции по зимозану, хламидийному антигену и коэффициенты стимуляции по иммунокорректорам как отношение максимума стимулированной данными агентами JI3XJI к спонтанной. Результаты клинического, лабораторного и иммунологического обследования, данные анамнеза вносились в специальную карту обследования больного инфекциями, передаваемыми половым путем, разработанную с учетом особенностей данной группы заболеваний. Больные с установленным диагнозом УГХ в дальнейшем находились под динамическим наблюдением врача с целью оценки клинической и микробиологической эффективности проведенной антибактериальной и иммуномодулирующей терапии. Исследование функциональной активности ПМЯЛ методом JI3XJI проводилось сразу по окончании терапии у 26 больных, при этом 12 пациентам иммунотропные препараты назначались по результатам предварительного хемилюминесцентного скрининга, а 14 пациентам без предварительного тестирования in vitro. О динамике восстановления функциональной активности клеток судили по приближению показателей хемилюминограммы к контрольным цифрам.

Комплексному иммунологическому обследованию, включающему постановку метода люминол зависимой хемилюминесценции, подверглись также 14 практически здоровых человек контрольной группы, ранее не болевших УГХ и другими ИППП. Полученные результаты больных УГХ и контрольной группы были обработаны методом математической статистики с использованием для оценки статистической значимости различий непараметрического критерия Вилкоксона-Мэнн-Уитни для независимых

совокупностей. Графическое отображение предлагаемых Вашему вниманию результатов получено с помощью ПК типа IBM с использованием графического редактора EXCEL.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При оценке повозрастного распределения больных обращает на себя внимание преимущественное поражение лиц молодого трудоспособного, сексуально активного возраста, то есть возрастных групп 20-24 лет и 25-29 лет. Одним из дополнительных факторов распространения УГХ, его хронизации, можно считать практически бессимптомное течение, которое отмечали у себя более половины больных (53,33%). Отсутствие в большинстве случаев яркой клинической симптоматики, наличие нескольких половых партнеров затрудняло анамнестическое установление сроков заражения. Традиционное окрашивание мазков по Грамму также не выявляло каких-либо патогномоничных признаков УГХ, увеличение числа лейкоцитов установлено лишь у 15,0 % больных. Таким образом, клинические признаки и рутинные лабораторные методики для диагностики УГХ являются малоинформативными, могут соответствовать картине вялотекущего длительного хронического воспалительного процесса и лишь в незначительной степени позволяют заподозрить наличие очага хламидийной инфекции.

В последнее время важное место в диагностике УГХ отводят амплификационным молекулярно-биологическим методам, в частности, полимеразной цепной реакции (ПЦР). У мужчин в качестве материала для исследования применяют соскоб слизистой уретры, а также первую порцию мочи (ППМ). К преимуществам анализа мочи относят его неивазивность и возможность получения смыва по всей уретре. Вместе с тем, в моче не всегда присутствуют необходимое для анализа количество инфицированных хламидиями эпителиальных клеток, что затрудняет диагностику при хронических процессах, протекающих без выраженной воспалительной

симптоматики. С целью повышения результативности исследования ППМ в подобных клинических ситуациях, была разработана методика забора ППМ у мужчин сразу после проведения пальцевого массажа предстательной железы, а также после массажа предстательной железы в сочетании с сеансом вакуумной фаллодекомпрессии (ЛОД-терапии). Указанные манипуляции проводились в соответствии с общепринятыми рекомендациями. В этом случае секрет предстательной железы выделяется в просвет уретры и при мочеиспускании оказывается также в ППМ. Вакуумная фаллодекомрессия способствует разглаживанию складок слизистой уретры, расширению устьев желез и их дренированию, что тоже увеличивает объем потенциально инфицированного материала. Такой подход особенно оправдан в случае хронических уретропростатитов, когда иммунная система обособляет очаги инфекции. Были проанализированы данные ПЦР-лаборатории ЦНИЛ КрасГМА. При заборе ППМ традиционным способом выявлены два недостатка. У 9 из 65 обследуемых, что составляет 13,85% получить материал для исследования (осадок мочи) не представлялось возможным, что сделало пробы не пригодными для анализа. Таким образом, провести диагностику хламидиоза можно было лишь в образцах мочи у 86,15% больных. В обеих предложенных модификациях пробы оказались пригодными для анализа у 100% обследуемых и содержали достаточное количество осадка. Из 65 обследуемых традиционным способом положительный результат идентифицирован у 7 пациентов (10,77%). При предварительно проведенном массаже предстательной железы этот результат увеличивается до 35,71% (10 из 28 обследуемых), а при сочетании массажа предстательной железы и сеанса вакуумной фаллодекомпрессии - до 46,67% (7 из 15).

В дальнейшем проводилась комплексная оценка наличия хламидийной инфекции различными лабораторными методами, что позволило в каждой группе выделить истино- и ложноположительные (ИП и ЛП) и истино- и ложноотрицательные (ИО и ЛО) результаты, а также рассчитать диагностическую чувствительность (ДЧ), специфичность (ДС) и

эффективность (ДЭ). Установлено, что использование предложенных нами модификаций забора мочи позволяет увеличить ДЭ с 90,77% до 92,86% при предварительном проведении массажа предстательной железы и до 93,33% при сочетании массажа предстательной железы и вакуумной декомпрессии (таблица 1).

Таким образом, с целью повышения результативности диагностики хламидиоза методом ПЦР с использованием ППМ в качестве исследуемого материала целесообразно забор пробы предварять массажем предстательной железы, а также массажем предстательной железы и сеансом вакуумной фалодекомпрессии.

Таблица 1

Диагностическая эффективность различных модификаций забора

ППМ у мужчин для диагностики хламидиоза.

Диагностическая чувствительность Диагностическая специфичность Диагностическая эффективность

Пациенты, обследованные на СЛгасЬотаНз в ППМ традиционным способом (п=65) 53,85% 100% 90.77%

Пациенты с предварительно проведенным массажем предстательной железы (п=28) 90,91% 94,12% 92,86%

Пациенты с предварительно проведенным массажем предстательной железы и ЛОД-терапией (п=15) 100% 87,5% 93,33%

Проведено комплексное иммунологическое обследование 30 больных урогенитальным хламидиозом, включающее постановку развернутого анализа крови и классической иммунограммы. В результате проведенных исследований установлено, что показатели СДЗ(+), СД4(+), СД8(+) в обследуемой и контрольной группах статистически достоверно не отличались. Однако соотношение иммунорегуляторных субпопуляций СД4(+)/СД8(+) у больных УГХ оказалось статистически значимо снижено до 0,7610,03 (р<0,01), при том, что в контроле этот показатель составлял 0,96±0,08. Установлено, что иммунодефицит по СЮЗ (+)-лимфоцитам отмечается в целом у 56,6% больных, при этом у 43,3% - это ИД I степени, у 13,3% - ИД II степени. Таким образом, изменения со стороны клеточного иммунитета больных УГХ характеризуются по большей части незначительным Т-иммунодефицитом, но в основном, дисбалансом иммунорегуляторных субпопуляций с преимущественной депрессией С04 (+)- лимфоцитов. Данные гуморального иммунитета больных УГХ выглядят следующим образом: в обследуемой группе показатели ^А - 1,9±0,34; 1{>М -

I,89±0,41, - 12,85±1,36; ЦИК - 16,5±2,52. При этом в контроле аналогичные параметры составляют: IgA - 1,77±0,41; 1цМ - 1,04+0,48, -

II,14±1,78; ЦИК - 15,8±3,46. Статистически значимое изменение у больных имеет место только по 1{»М в сторону увеличения (р<0,05). В результате проведенных нами исследований клеточного и гуморального иммунитета больных УГХ нами не было выявлено грубых иммунологических нарушений. Изменения носили неспецифический характер и проявлялись, как правило, Т-иммунодефицитом 1 и реже II степени, дисбалансом иммунорегуляторных субпопуляций и умеренной напряженностью гуморального иммунитета.

Для оценки параметров фагоцитоза было проведено обследование 61 больного хроническим урогенитальным хламидиозом и 14 человек контрольной группы. В совокупности определены показатели гуморального

иммунитета и функционального состояния ПМЯЛ методом люминол зависимой хемилюминесценции и были получены следующие данные. Исключительно антитела класса выявлялись в диагностическом титре у 51 пациента, оба класса ^А и 1дС - у 10 человек, что расценивалось как лабораторные признаки некоторой активации инфекции. Таким образом, обозначались 2 группы больных хроническим УГХ: вне- и в стадию реактивации инфекции. Весьма любопытными в этой связи оказались характер и параметры хемилюминесцентных кривых, очевидно отражающих функциональные изменения системы неспецифической резистентности организма, как в отсутствие раздражителя, так и при воздействии неспецифической и специфической антигенной стимуляции.

В таблице 2 представлены значения спонтанной ЛЗХЛ, показатели хемилюминесценции при стимуляции клеток опсонизированным зимозаном, а именно время наступления пика, площадь, высота пика хемилюминесценции. В качестве интегральных показателей ответа ПМЯЛ на стимуляцию взяты индексы хемилюминесценции по зимозану и хламидийному антигену. Спонтанная ЛЗХЛ, по сути, означает изначальный уровень активации ПМЯЛ. Отчетливо видно, что если в контрольной фуппе спонтанная ЛЗХЛ составляет 2430,86±426,48, то по мере обострения инфекции она возрастает от 3451,25±575,16 (р<0,05) до 4058,78±611,29 (р<0,01). При этом статистически значимое отличие от контроля наблюдается в обоих случаях. В контрольной группе высота пика при стимуляции зимозаном составляет 70995,57±4195,11. У больных УГХ стимулированная ЛЗХЛ статистически значимо снижается и составляет 54505,04±2165,52 (р<0,01) и 51541,89±2065,46 (р<0,01) при реактивации инфекции. Интегральным показателем, связывающим спонтанную и стимулированную ЛЗХЛ ПМЯЛ, является индекс хемилюминесценции по зимозану (ИХЛ-з), непосредственно отражающий изменение функционального резерва клеток. У больных хламидиозом ИХЛ-з статистически значимо снижается и составляет 19,9±1,45 при хронической вне обострения инфекции и 15,06±0,92

в стадию реактивации. Причем в контрольной группе функциональный резерв фагоцитов существенно выше - 29,15±0,86. Надо отметить, что статистические различия ИХЛ-з больных от контрольной группы оказались более значимыми (Р<0,001) в обеих группах обследуемых, в то время как при оценке стимулированной ЛЗХЛ различия были меньшими (р<0,01 и р<0,05). Из вышеописанного очевидно, что именно интегральный показатель ИХЛ-з претерпевает наибольшие изменения и в наивысшей степени отражает нарушения хемилюминесцентного ответа.

Достаточно информативным показателем готовности клеток к ответу на раздражитель, позволяющим оценить динамику наработки свободных радикалов ферментными системами клеток является время наступления пика ЛЗХЛ. В контрольной группе время выхода на пик составляет 895,43+31,84 сек. У больных хламидиозом этот показатель резко отстает. При вялотекущем хроническом процессе он составляет 1031,85+32,89 (р<0,01), а в стадию реактивации инфекции 1448,67±42,16 (р<0,001).

Было предложено использование специфического хламидийного антигена для воздействия на клеточную суспензию, рассчитан индекс хемилюминесценции по хламидийному антигену (ИХЛ-АГ). Так, в контрольной группе лизат элементарных телец хламидий ингибирует ЛЗХЛ и ИХЛ-АГ составляет 0,51 ±0,02. При относительном иммунном обособлении очагов хламидийной инфекции ингибирующий эффект снижается: ИХЛ-АГ 1,03+0,03 (р<0,001). В стадию реактивации инфекции, когда антигенные структуры становятся доступны антигенпрезентирующим клеткам, хемилюминесцентный ответ заметно увеличивается и составляет 1,48±0,12 (р<0,001).

В результате проведенных исследований у больных УГХ установлены существенные сдвиги ряда функциональных параметров ПМЯЛ, в частности спонтанной и стимулированной ЛЗХЛ, времени наступления пика при стимуляции зимозаном, индексов хемилюминесценции по зимозану и

Таблица 2

Параметры хемилюминесценции полиморфноядерных лейкоцитов больных хроническим урогенитальным хламидиоэом

Спонтанная ЛЗХЛ Стимуляция зимозаном ИХЛаг

Время пика Высота пика Площадь пика ихл

Контроль п=14 2430,86± 426,48 895,43± 31,84 70995,57± 4195,11 3,16х10о± 0,87x106 29,15± 0,86 0,51 ±0,02

Хронический хламидиоз ^А-отр; п=51 3451,25± 575,16 р<0,05 1031,85± 32,89 р<0,01 54505,04± 2165,52 р<0,01 3,08х106± 1,01x106 19,9± 1,45 р<0,001 1,03±0,03 р<0,001

Обострение инфекции п=10 4058,78±611,29 р<0,01 1448,67± 42,16 р<0,001 51541,89± 2065,46 р<0,01 2,65x106± 0,51x106 15,06± 0,92 р<0,001 1,48±0,12 р<0,001

Примечание: р - показатель достоверности различий

35 30 25 20 15 10 5 О

29,15 0,86

—1ЭГ9= ^ 1,45

15,06- ->. 0,92

контроль (п=14)

р<0,001 р< 0,001 хронический реактивация хламидиоз (п= 51) инфекции (п=10)

Рисунок 1. Изменение ИХЛ-з лейкоцитов больных хроническим урогенитальным хламидиозом в зависимости от стадии инфекционного процесса

1.6

1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

1,48 +

0,51 + -0,02—

т;оз +

0;03-

контроль(п=14)

р<0,001 хронический хламидиоз (п=51)

р<0.001 реактивация инфекции (п=10)

Рисунок 2. Индекс хемилюминесценции при взаимодействии лейкоцитов с хламидийным антигеном

хламидийному антигену. Реакция полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови больных УГХ на воздействие специфической и неспецифической антигенной стимуляции носит разнонаправленный характер и зависит от фазы инфекционного процесса. Установленные изменения могут быть использованы как диагностические критерии

заболевания. Учитывая, что количественные нарушения клеточного и гуморального иммунитета не были ярко выраженными и не носили специфического характера, можно предполагать, что именно глубинные изменения функционального состояния клеток фагоцитарной системы могут играть важную роль в патогенезе хронического хламидиоза.

Выявленные нарушения функциональной активности фагоцитов дают основание для разработки дифференцированного подхода к иммуномодулирующей терапии на основе изучения реакции ПМЯЛ на воздействие иммуномодуляторов in vitro. В качестве таковых использовался реаферон, препарат рекомбинантного аг-интерферона, циклоферон -низкомолекулярной индуктор интерферона и полиоксидоний - активатор фагоцитоза с определенной интерферониндуцирующей активностью, действие которого опосредовано изменением проницаемости кальциевых каналов. Установлено, что не все используемые иммуномодуляторы оказывали равнозначное влияние на функциональное состояние ПМЯЛ in vitro (см. табл. 3). Так, коэффициент стимуляции (КС) полиоксидония был существенно увеличен у 28 из 54 обследованных пациентов и составлял 2,21±0,06. Существенная стимуляция клеток наблюдалась и при применении реаферона и циклоферона, соответственно, у 22 и 16 человек со значениями КС 2,29±0,07 и 1,93±0,04. Проведенные исследования, таким образом, показывают, что хемилюминесцентный ответ ПМЯЛ больных УГХ при воздействии различных иммуностимуляторов является индивидуальным и дифференцированным.

Таблица 3

Результаты изучения ЛЗХЛ при стимуляции лейкоцитов иммуномодуляторами in vitro

Полиоксидоний 11=28 Реаферон п=22 Циклоферон п=16

2,21± 0,06 2,10± 0,07 1,93± 0,04

Следует отметить, что нами не было выявлено никакой корреляционной зависимости между интегральными показателями ИХЛ, ИХЛ-АГ, коэффициентами стимуляции иммунокорректоров и характером инфекции.

Далее обследуемые были разделены на 2 группы: в первой (12 обследуемых) пациентам назначались указанные иммунокорректоры на основании тестов in vitro; во второй (14 обследуемых) - вне зависимости от оценки их in vitro. Назначения препаратов проводилось по рекомендованным фирмами-производителями методикам. В течение 5 дней после окончания курса антибактериальной и иммунокорригирующей терапии проводилась оценка ЛЗХЛ ПМЯЛ в обеих группах. Как уже отмечалось выше, ИХЛ-з, являющийся интегральным показателем, наиболее объективно отражает изменения функционального резерва клеток. На рисунке 3 представлено соотношение ИХЛ-з в группах больных, получавших иммунокорригирующую терапию с учетом тестов in vitro, вне зависимости от них, и контрольной группы. Проведение иммунокорригирующей терапии в целом благоприятно влияет на функциональную активность ПМЯЛ, что графически отражено на рисунке 3. При этом в группе 1, в которой иммунотропные препараты назначались после скрининговых тестов in vitro, ИХЛ-з составляет 24,34+2,60 и статистически значимо отличается от ИХЛ-з контрольной группы (р<0,05). Вместе с тем, в группе 2, в которой иммунокорректоры назначались спонтанно, статистически значимое отличие от контроля было гораздо более выражено и составляло р<0,01.

Таким образом, в результате проведенных исследований показана целесообразность предварительного скрининга иммуномодулирующих препаратов методом люминол зависимой хемилюминесценции in vitro. Применение подобного подхода оказывает позитивное влияние на динамику восстановления функциональной активности полиморфонуклеаров и, соответственно, фагоцитарной системы в целом.

35 30 „25 520 ®15 10 5 0

0,86 24,34 ±

2,60 «

-1- ^.........1— —

Контрольная группа (п= 14)

р<0,05 группа 1 (п=12)

р<0,01 группа2 (п=14)

Рисунок 3. Индексы хемилюминесценции групп больных после иммуномодулирующей терапии

ВЫВОДЫ.

1. Изменения показателей клеточного иммунитета при УГХ проявляются Т-иммунодефицитом первой или второй степени и дисбалансом иммунорегуляторных субпопуляций, при котором СЕИ(+)/С08(+) составляет 0,76±0,03, р<0,01. Изменения гуморального иммунитета, проявляющиеся статистически значимым (р<0,05) увеличением концентрации общего сывороточного ^М до 1,89±0,41 у больных хроническим УГХ при 1,04+0,48 в контроле свидетельствуют о его умеренной напряженности.

2. Реакция полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови на воздействие специфической и неспецифической антигенной стимуляции носит разнонаправленный характер, статистически значимо отличается у больных хламидиозом от аналогичных показателей контрольной группы и

зависит от фазы инфекционного процесса. Так, ИХЛ-з у больных хламидиозом составляет 19,90±1,45 (р<0,001), а в стадию реактивации инфекции 15,06±0,92 (р<0,001) при контрольных значениях 29,15±0,86. Хемилюминесценция клеток в присутствии лизата ЭТ хламидий у больных превышает контрольные показатели в 2,9 раза и прогрессивно возрастает по мере активации инфекции. Установленные изменения свидетельствуют о существенной роли фагоцитарной системы в патогенезе УГХ и могут быть использованы как диагностические критерии заболевания.

3. Дифференцированный подбор иммуномодуляторов и включение их в комплексную терапию больных хроническим урогенитальным хламидиозом на основании предварительного скрининга препаратов in vitro позволяет ускорить восстановление функциональной активности клеток фагоцитарного звена.

4. Диагностическая эффективность выявления ДНК С. trachomatis в первой порции мочи у мужчин при хронической урогенитальной хламидийной инфекции повышается на 2,09% при предварительно проведенном массаже предстательной железы и на 2,56% при сочетании массажа предстательной железы и сеанса вакуумной декомпрессии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Комплексное определение специфических противохламидийных иммуноглобулинов и оценка реакции ПМЯЛ на специфическую и неспецифическую антигенную стимуляцию может быть использовано в качестве дополнительного диагностического критерия хронического урогенитального хламидиоза.

2. В целях дифференцированного подбора иммуномодулируюшего препарата для использования в комплексной терапии хронического УГХ рекомендуется проведение предварительного скрининга

иммуномодуляторов in vitro методом люминол зависимой хемилюминесценции ПМЯЛ. 3. Для повышения эффективности обнаружения С. trachomatis в первой порции мочи у мужчин методом ПЦР предлагается перед забором материала проводить массаж предстательной железы и сеанс вакуумной декомпрессии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В. И. Прохоренков, М. В. Шапран «Современные принципы диагностики и лечения урогенитального хламидиоза. Уч.- метод, пособие для врачей последипломной подготовки»/Красноярск,- 2000,- 43 с.

2. В. И. Прохоренков, М. В. Шапран, Б. В. Протопопов и др. Показатели хемилюминесценции полиморфноядерных лейкоцитов больных хроническим урогенитальным хламидиозом//Материалы краевой юбилейной конференции «СПИД: опыт первого десятилетия».-Красноярск,- 2000 г.- С. 68-69.

3. В. И. Прохоренков, М. В. Шапран «О классификации урогенитального хламидиоза»//Инфекции, передаваемые половым путем.- 2002,- №2.- С. 36.

4. В. И. Прохоренков, М. В. Шапран, Ю. В. Михайленко и др. ПЦР идентификация С. trachomatis в первой порции мочи у мужчин с хроническим хламидиозом//Бюл. лабораторной службы,- 2003.- №10.- с. 46.

5. В. И. Прохоренков, М. В. Шапран, Ю. В. Михайленко, А. В. Кузьмин. К вопросу о лабораторных критериях диагностики урогенитального хламидиоза//Бюл. лабораторной службы,- 2003,- №10,- с. 47-49.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

УГХ - урогенитальный хламидиоз

JI3XJI - люминол зависимая хемилюминесценция

ПМЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

ПЦР- полимеразно-цепная реакция

ПИФ - прямая иммунофлюоресценция

ИХЛ - индекс хемшцоминесценции

КС - коэффициент стимуляции

ЭТ - элементарное тельце

РТ - ретикулярное тельце

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ППМ - первая порция мочи

АГ - антиген

AT - антитело

ВК - внутренний контроль

МОМР - major outer membrane protein (основной белок наружной мембраны)

ИФА - иммуноферментный анализ

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ИФ - интерферон

ФНО - фактор некроза опухоли

ИЛ - интерлейкин

ЛПС - липополисахарид

БТШ - белок теплового шока

ЛОД - локальное отрицательное давление

Заказ № £//// Тираж 100 экз.

Отпечатано ООО "Новые компьютерные технологии", г. Красноярск, ул. К. маркса, 62-120, тел. 26-34-92, Лицензия ПЛД №48-49 от 16.04.97 г.