Автореферат и диссертация по медицине (14.03.04) на тему:Чувствительность цианобактерий к токсическому действию солей тяжёлых металлов

БОГАЧЕВА Александра Сергеевна

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЦИАНОБАКТЕРИЙ К ТОКСИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ СОЛЕЙ ТЯЖЁЛЫХ МЕТАЛЛОВ

14.03.04 - токсикология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 НОЯ 2011

Санкт-Петербург 2011

005002657

Работа выполнена на кафедре общей и клинической токсикологии ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Шилов Виктор Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бородавко Виктор Константинович доктор медицинских наук, профессор Ермолаева Елена Евгеньевна

Ведущее учреждение: ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Защита состоится «06» декабря 2011 г. в _ часов на заседа

диссертационного СовегаД208.030.01 при ФГУН «ИНС1Ит'ТОКСИКОЛОГИИ» ФК России (192019, г. Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, дом 1)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГ «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА России

Автореферат разослан «_»_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Луковникова Любовь Владимировна

Актуальность. Проблема поиска адекватных экспериментальных моделей с минимальным использованием теплокровных лабораторных животных по этическим и экономическим причинам в последние годы приобрела особую актуальность (Каспаров A.A. и др., 2008; Другов Ю.С., Родин A.A., 2009; Полозова Е.В. и др., 2009).

В современных условиях в токсикологии существует достаточно большой выбор альтернативных методов исследования для оценки токсичности широкого спектра химических веществ и биообъектов. Так, при анализе загрязнённости водоёмов, помимо простейших, принято использовать водоросли, биолюминесцентные бактерии и водных беспозвоночных - ракообразных (чаще всего ветвистоусых рачков, Daphnia magna), рыб, которые широко применяются для токсиколого-гигиенического нормирования водных источников различного назначения (Еськов А.П. и др., 2003; Евсеева Т.Н. и др., 2007).

Цианобактерии являются уникальными представителями мира микроорганизмов. Заселяя почти все освещаемые места обитания, обладая пластичным метаболизмом, они в настоящее время являются удобными модельными объектами для изучения целого ряда биологических процессов, таких как фотосинтез, азотфиксация, адаптация к изменяющимся условиям окружающей среды (Герасименко Л.М., Ушатин-ская Г.Т., 2002; Гусев М.В. и др., 2003). Благодаря короткому циклу их развития можно проследить на нескольких поколениях действие экстремальных факторов окружающей среды (Емцев В.Т. и др., 2005).

Одним из малоизученных, с точки зрения чувствительности к экотоксикантам, классов цианобактерий являются Synechocystis sp.

Тяжелые металлы относятся к наиболее широко распространенным поллютан-там водной и почвенной среды (Будников Г.К. 1998; Луковникова Л.В. и др., 2004; Rai et al., 1990). Они составляют значительную долю загрязнителей окружающей среды и по токсичности занимают второе место после пестицидов. Однажды попав в биогеохимический цикл, они крайне редко и медленно покидают его (Никаноров A.M., Жулидов A.B., 1991; Онищенко Г.Г. и др., 2002; Шилов В.В. и др., 2010).

Параметры токсикометрии и механизмы токсического действия тяжелых металлов в экспериментальных исследованиях с использованием микроорганизмов изучены недостаточно.

Известно, что физиологические реакции микроорганизмов во многом зависят от таких параметров окружающей среды, как температура и освещенность. Данные о токсичности химических веществ для микроорганизмов при изменении этих параметров окружающей среды практически отсутствуют.

Цель исследования - оценить возможность использования цианобактерий Synechocystis sp. в качестве тест-объекта для оценки токсичности ксенобиотиков на примере солей тяжёлых металлов.

Достижение поставленной цели планировалось путем решения следующих

задач:

1. Определить параметры токсичности солей тяжелых металлов (AgN03; 3CdS04-8H20; Hg(CH3C00)2; CuS04-5H20) для разных штаммов цианобактерий CALU 713 и РСС 6803 при оптимальных условиях среды обитания в динамике.

2. Исследовать влияние различных сочетаний температуры и освещенности среды обитания на параметры токсичности тяжёлых металлов для цианобактерии.

3. Оценить морфологические изменения цианобактерий в присутствии солей тяжёлых металлов.

4. Выявить наиболее чувствительный к токсическому действию солей тяжелых металлов штамм цианобактерий для использования в экспериментальной токсикологии.

Научная новизна. Впервые получены данные о параметрах токсичности солей тяжёлых металлов для цианобактерий Synechocystis sp. CALU 713 и РСС 6803. Показано, что изменения световых и температурных условий модифицируют чувствительность цианобактерий к токсическому действию солей тяжелых металлов. Снижение температуры и освещенности в разной степени усиливает токсический эффект солей тяжелых металлов.

Установлено, что морфологические изменения цианобактерий, вызванные токсическим действием солей тяжелых металлов, носят неспецифический характер, независимо от штамма и вида исследованного токсиканта, проявляются изменением формы и размеров, в том числе, делящихся клеток. На ультраструктурном уровне морфологические изменения представлены изменением толщины и целостности пептидог-ликанового слоя клеточной стенки; повреждением внутриклеточных органелл, имеющих отношение в основном к энергетическому обмену.

Наиболее чувствительным к токсическому действию солей тяжелых металлов и, соответственно, подходящим для использования в экспериментальной токсикологии является штамм Synechocystis sp. CALU 713. Для этого штамма токсичность металлов убывает в следующей последовательности (Hg > Cd > Ag > Си), для штамма Synechocystis sp. РСС 6803 (Ag > Hg > Cd > Си).

Практическая значимость. Обоснована целесообразность использования цианобактерий Synechocystis sp. CALU 713 и РСС 6803 для оценки степени загрязнённости водных объектов солями тяжёлых металлов. В результате проведённых исследований получены параметры токсичности солей тяжёлых металлов (AgN03; 3CdS04-8H20; Hg(CH3COO)2; CuS04-5H20) для двух штаммов цианобактерий Synechocystis sp. В этих условиях выявлены морфологические изменения поверхности и ультраструктуры изменений клеток Synechocystis sp. Полученные результаты могут использоваться в научно-исследовательских и практических работах в области экологической токсикологии и в скрининговых исследованиях токсичности химических веществ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Цианобактерии Synechocystis sp. штаммов CALU 713 и РСС 6803 чувствительны к токсическому действию тяжёлых металлов. Токсичность определяется до-зозависимым эффектом снижения скорости роста цианобактерий в инкубационной среде на водной основе. Параметры токсичности существенно зависят от условий температуры и освещённости.

2. Токсическое действие солей тяжёлых металлов характеризуется морфологическими изменениями формы и размеров клеток, клеточных мембран, нуклео-плазмы и содержащихся в ней рибосом, фотосинтетических органелл - тилакоидов.

Реализация работы. Материалы диссертационного исследования используются в научной работе отдела клинической токсикологии НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе при оценке токсичности биосред больных с острыми отравлениями для определения уровня эндотоксемии; в учебном процессе кафедры общей и клинической токсикологии, кафедры микробиологии и микологии и кафедры медицинской экологии и эпидемиологии ГОУ ДПО СПб МАПО, а также в научно-практической деятельности Территориального управления Роспотребнадзора по городу Санкт-Петербургу. По теме данной диссертации подготовлено два учебных пособия.

Апробация работы. Материалы настоящего исследования представлены на: международном экологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 29 июня - 2 июля 2003г.); на XXXIX научной конференции "Хлопинские чтения" - "Здоровье населения в современной среде обитания" (г. Санкт-Петербург, 2006г.); на XXXXIII научной конференции "Хлопинские чтения" - "Чрезвычайные ситуации: организационные, экологические и эпидемиологические проблемы" (г. Санкт-Петербург, 2010г.); на юбилейной научно-практической конференции молодых учёных "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины" (г. Санкт-Петербург, 22 апреля 2010г.); на Российской научной конференции с международным участием "Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии" (г. Санкт-Петербург, 19-20 мая 2011).

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ ГОУ ДПО СПбМАПО в 2006 - 1010 гг.(тема «Исследование эффективности современных методов диагностики и лечения отравлений», разделы «Мониторинг обращения потенциально-опасных химических веществ на территории Санкт-Петербурга» и «Изучение ультраструктурных механизмов токсичности тяжёлых металлов»).

Личное участие автора. Автор принимал личное участие в планировании, организации и выполнении исследований, проводил регистрацию и оценку результатов, статистическую обработку, обобщение и анализ полученных данных.

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 139 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методик исследования, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Диссертация содержит 17 таблиц, иллюстрирована 15 рисунками. Список использованной литературы включает 187 источников, из которых 84 отечественных, 103 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа состояла из двух этапов. На первом этапе - проводили сравнительную оценку токсичности солей тяжелых металлов в разных условиях температуры и освещенности с использованием культур двух штаммов цианобактерий Synechocystis sp.; на втором - оценивали влияние тяжелых металлов на морфологические изменения клеток Synechocystis sp. с помощью световой и электронной микроскопии.

В работе использованы штаммы цианобактерий РСС 6803 и CALU 713.

Исследования токсичности солей металлов при разных условиях температуры и освещённости. Культивирование штаммов проводили в жидкой питательной среде № 6 (Громов Б.В., 1976) в колбах объемом 200-250 мл (pH = 6,9 ± 0,4) при температуре 23 °С и непрерывном освещении люминесцентными лампами с интенсивностью 2200 лк. Исследования проводились на базе лаборатории микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета.

Токсичность тяжёлых металлов (AgN03; 3CdS04-8H20; Hg(CH3COO)2; CuS04-5H20) оценивали по их среднеэффективным концентрациям (ЕС50, мкг-л"1) через разные промежутки времени (4, 7, 10 и 14-е сутки) после помещения в инкубационную среду, содержащую исходную культуру разных штаммов цианобактерий Synechocystis sp. Опыт проводили в 3-х параллельных пробах.

За среднеэффективные концентрации солей тяжёлых металлов (ЕС50, мкг-л"1) -принимали концентрации, при которых количество клеток в культуре цианобактерий при инкубации с разными концентрациями солей тяжелых металлов снижалось на 50% по сравнению с начальной плотностью культуры к определенному сроку.

Исследуемую среду инкубации с убывающими концентрациями солей тяжелых металлов (200; 20; 2; 0,2; 0,02; 0,002 мг-л'1) готовили путем добавления 0,5 мл исходного концентрированного раствора соли металла в 4,5 мл разведенной в 10 раз жидкой питательной среды № 6 (Громов Б.В., 1976), затем стерилизовали путем авто-клавирования. По минеральному составу инкубационная среда соответствовала усредненному стандарту пресноводного водоема Северо-Западного региона России.

На следующем этапе в каждую пробирку добавляли посевной материал в объёме 0,4 мл в активной фазе роста так, чтобы начальная плотность культуры составляла 250-10"6 клеток-мл"1.

Культура выращивалась при освещении 500 и 2200 лк, и температурах 15 и 23 °С в течение 14 сут. Поддержание необходимого температурного режима в разных сериях опытов достигалось путём термостатирования в специальных лабораторных помещениях (культиваторных). Выбранные диапазоны изменения температуры и освещенности соответствовали границам оптимальной жизнеспособности данных микроорганизмов (Заварзин Г.А., Колотилова H.H., 2001).

Условия освещённости моделировались с помощью люминесцентных ламп фирмы Philips. Интенсивность освещения измеряли на разных расстояниях от ламп с помощью люксметра. По результатам измерения освещённости определяли место расположения стеклянных стаканов, в которых находились пробирки с культурой. Для достижения результата 2200 лк культуру располагали на расстояние 10 см от лампы, а для получения освещения 500 лк - на расстоянии 50 см от источника света.

Подсчёт клеток в культурах производился на 4, 7, 10 и 14-е сутки в камере Го-ряева (объём камеры 0,9 мм3), на всей площади квадрата камеры при увеличении х 40 светового микроскопа.

Методы световой и электронной микроскопии. Морфометрический анализ клеток выполняли на базе лаборатории микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета при помощи светового микроскопа с телевизионным анализатором (МТ-9, Польша, 1970г.) при увеличении х 90.

Для электронной микроскопии предварительно готовили пробирки с исходной питательной средой № 6, разведенной в 10 раз (Громов Б.В., 1976), по 4,5 мл. Затем в каждую пробирку добавляли по 0,5 мл солей тяжёлых металлов (концентрация металла соответствовала минимальной среднеэффективной концентрации солей тяжелых металлов (ЕС50, мкг-л"1) при оптимальных условиях температуры и освещенности (23 °С, 2200 лк), стерилизовали путем автоклавирования.

На следующем этапе добавляли посевной материал по 0,2 мл так, чтобы начальная плотность культуры составляла 125-Ю"6 клеток-мл"1. Исследование проводили через 7 суток культивирования, т.е. к сроку достижения оптимальной репродуктивной активности культуры.

Материал из жидкой питательной среды фиксировали равным объемом фиксатора Карковского: 4%-ный параформальдегид и 0,6%-ный глутаровый альдегид в 0,2 М фосфатном буфере (pH = 7,0). Смесь выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали 20 мин при 2000 оборотов. К суспензии добавляли тот же фиксатор в объёме 0,2 мл и выдерживали в течение 2 ч в холодильнике при температуре 4 °С. Материал фиксировали 2%-ным параформальдегид

и 0,3%-ным глутаровым альдегидом в 0,1 М фосфатном буфере в течение 1 ч при комнатной температуре и затем отмывали дважды фосфатным буфером. Смесь с добавлением третьей смены буфера выдерживали в течение 12 ч в холодильнике при 4 °С. Затем смесь заливали 3%-ным агаром Difco (Sigma) и центрифугировали 4 мин при 7000 оборотов. Смесь отмывали дважды фосфатным буфером в течение 5 мин.

В ходе постфиксации к смеси добавляли 1,25%-ный тетроксид осмия (0s04) в 0,1 М фосфатном буфере (pH = 7,0) и отмывали 0,5 мл воды с добавлением 200 мкл 1%-ного уранил ацетата в 70 °С этаноле в течение 0,5 ч. Материал после заключения в агарозу обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации (30, 40, 50, 60, 70% - по 5 мин; 80, 90% - по 10 мин; 100% - 2 смены по 10 мин) и переносили сначала в смесь 100%-ного этанола с ацетоном на 10 мин, а затем в 100%-ный ацетон (2 смены по 30 минут).

Материал заливали полимерной смесью Spurr (Sigma). Затем раскладывали в виде кусочков в специальные резиновые шаблоны, заливали смесью Spurr и помещали в термостат при температуре 70 °С на 12 часов для полимеризации. Ультратонкие срезы готовили на микротоме Reichert и контрастировали 1%-ным раствором водного уранилацетата и цитрата свинца. Затем срезы просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе TESLA-BP 500 с ускоряющим напряжением 80 кВ при увеличении х 8000,10000,14000.

Оценивали форму и размер клеток, толщину клеточной стенки, процесс деления, изучали состояния нуклеоплазмы и цитоплазмы, а также изменения, происходящие в области нуклеоида, рибосом и тилакоидных мембран.

Статистический анализ количественных и размерных показателей клеток. Анализ полученных данных был выполнен с использованием пакета статистических программ Statistica версия 6.0 фирмы StatSoft, построение графиков выполнено с использованием встроенного пакета прикладной графики офисного приложения EXCEL - 2003 в операционной системе Windows-XP.

Вычисляли среднее значение показателя, средне-квадратичное отклонение, ошибку среднего. Оценка достоверности проводилась с использованием t-критерия Стьюдента. Разницу между средними значениями показателей считали достоверной с вероятностью 95% и выше. Статистическую значимость частоты встречаемости непараметрических признаков оценивали методом Фишера и вычислением «^-квадрата».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительная чувствительность цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803 и CALU 713 к токсическому действию солей тяжёлых металлов

На первом этапе проводили сравнительную оценку чувствительности цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803 И CALU 713 к токсическому действию солей тяжелых металлов в оптимальных условиях культивирования (23 °С, 2200лк).

В результате проведённых исследований установлено, что для Synechocystis sp. CALU 713 при оптимальных условиях (23 °С, 2200лк) наиболее токсичными были соли ртути (ЕС50 = 1,0 ± 0,1 мкг-л'1) и кадмия (ЕС50 = 2,0 ± 0,3 мкг-л"1), а наименее - серебра (ЕС50 = 14,0 ± 0,1 мкг-л"1) и меди (ЕС50 = 15,0 ± 2,1 мкг-л"1) Проявление токсического эффекта исследуемых токсикантов убывало в следующей последовательности: Hg> Cd > Ag > Си (табл. 1).

Таблица 1 - Максимальные параметры токсичности (минимальное значение ЕС50, мкг-л"1) и сроки их регистрации для БупесИосуэия ер. САШ 713 при разной температуре и освещенности

Соли тяжёлых металлов Оптимальные условия 23 °с, 2200 лк Снижение освещенности до 500 лк, 23 °С Снижение температуры до 15 °С, 2200 лк Снижение температуры и освещенности до 15 °С, 500 лк

ес5„ сут ес50 сут ес50 сут ес50 сут

Си804-5Н20 15,0±2,1 4 9,Ш,6* 10 9,8±1,2* 14 1,5±0,2* 14

ЗСс1804-8Н20 2,0±0,3 7 2,0±0,1 14 1,8±0,2* 7 1,5±0,2 14

Нё(СН3СОО)2 1,0±0,1 10 1,2±0,3* 10 1,3±0,3 7 1,6±0,1 14

14,0±0,1 7 16,0±0,4* 7 1,5±0,1* 7 1,9±0,1* 10

Примечание: * - р < 0,05 - по сравнению с оптимальными условиями культивирования

Для БупесИосузИя ер. РСС 6803 при этих же условиях (23 °С, 2200 лк) наиболее токсичными были соли серебра и ртути (ЕС50 = 15,1 ± 1,1 мкг-л"1; ЕС50 = 18,3 ± 1,2 мкг-л"1, соответственно). Проявление токсического эффекта исследуемых токсикантов убывало в следующей последовательности: А§ > > Сс1 > Си (табл. 2).

Таблица 2 - Максимальные параметры токсичности (минимальное значение ЕС50, мкг-л'1) и сроки их регистрации для Бупес/госузИз ер. РСС 6803 при разной температуре и освещенности

Соли тяжёлых металлов Оптимальные условия 23 °С, 2200 лк Снижение освещенности до 500 лк; 23 °С Снижение температуры до 15 °С; 2200 лк Снижение температуры и освещенности до 15 °С, 500 л^

ЕС50 сут ЕС50 сут ЕС50 сут ЕС50 су

Си804-5Н20 130,0±9,6 4 1,7±0,3* 7 5,5±1,1* 4 21,0±0,9* 7

ЗСс1804-8Н20 60, 5±2,3 4 59,0±6,2 4 57,0±3,4 4 18,7±0,3* 7

Нё(СН3С00)2 18,3±1,2 4 4,5±0,2* 4 19,0±1,6 7 6,7±0,5* 14

АёЫ03 15,1±1,1 14 16,0±2,1 4 11,6±0,5* 7 4,0±0,5* 10

Примечшше: * - р < 0,05 - по сравнению с оптимальными условиями культивирования

Таким образом, наиболее чувствительными к токсическому действию всех исследованных металлов были цианобактерии З^иес/госу^/я йр. штамма САШ 713. При оптимальных условиях диапазон ЕС50 тяжелых металлов для штамма САШ 713 колебался от 1,0 ± 0,1 до 15,0 ±2,1 мкг-л"1, в то время как для штамма РСС 6803 этот диапазон составил от 15,1 ± 1,1 до 130,0 ± 9,6 мкг-л"1.

Анализ литературы показал, что основными факторами, влияющими на рост и метаболическую активность клеток цианобактерий, являются температура и интенсивность освещения. От этих двух параметров зависит не только развитие, но и жизнеспособность микроорганизмов (Заварзин Г.А., Колотилова H.H., 2001).

В связи с этим на следующем этапе исследовали чувствительность цианобактерий Synechocystis sp. CALU 713 и РСС 6803 к токсическому действию солей тяжёлых металлов при изменении световых и температурных условий. Наши исследования показали, что изменения световых и температурных условий по-разному модифицируют токсичность металлов для исследованных штаммов цианобактерий.

Так, для Synechocystis sp. РСС 6803 понижение температуры с 23 °С до 15 "С при 2200 лк увеличивало токсический эффект соли серебра в 1,4 раза по сравнению с оптимальными условиями. В то же время снижение освещенности с 2200 до 500 лк при оптимальных условиях температуры не влияло на токсичность соли этого металла. Однако совместное воздействие неблагоприятных условий культивирования (500 лк, 15 °С) почти в 4 раза усиливало токсичность данного металла (ЕС50 = 4,0 ± 0,5 мкг-л"1) (табл. 2).

Согласно данным, представленным в таблице 2, токсичность соли ртути, по отношению к штамму РСС 6803, возрастала в 4 раза при снижении освещенности с 2200 лк до 500 лк по сравнению с оптимальными условиями культивирования (значение ЕС50 снизилось с 18,3 ± 1,2 до 4,5 ± 0,2 мкг-л"1), тогда как уменьшение температуры до 15 °С (2200 лк) практически не влияло на исследуемый показатель (ЕС50 = 19,0 ± 1,6 мкг-л'1).

При этом надо отметить, что совместное влияние низких световых и температурных условий приводило к увеличению токсического эффекта в 2,7 раза (ЕС50 = 6,7 ± 0,5 мкг-л*1) по сравнению с оптимальными условиями.

При исследовании чувствительности Synechocystis sp. РСС 6803 к токсическому действию соли кадмия установлено, что изолированное воздействие низких температурных и световых условий не оказывало влияния на чувствительность данного штамма к токсическому действию этой соли. Однако совместный эффект неблагоприятных условий (15°С, 500 лк) усиливал токсичность соли кадмия в 3,2 раза по сравнению с оптимальными условиями культивирования (значение ЕС50 снизилось с 60,5 ± 2,3 до 18,7 ±0,3 мкг-л"1).

Токсичность соли меди по отношению к цианобактериям Synechocystis sp. РСС 6803 существенно возрастала как при снижении освещенности с 2200 лк до 500 лк при 23°С в 76,5 раза от оптимальных условий, так и при снижении температуры с 23 °С до 15 °С при 2200 лк в 23,6 раза. Совместное влияние неблагоприятных условий (15 °С, 500 лк) также приводило к возрастанию токсичности исследуемых солей по сравнению с оптимальными условиями культивирования, однако, в меньшей степени (в 6,2 раза).

Таким образом, для Synechocystis sp. РСС 6803 снижение освещенности приводило к усилению токсического эффекта солей меди и ртути, и практически не оказывало влияния на токсичность солей кадмия и серебра (рис. 1). Снижение температурных условий с 23 °С до 15 °С повышало чувствительность данного штамма к токсическому действию солей меди и серебра (рис. 2). В то же время совместное снижение освещенности и температуры (15 °С; 500 лк) усиливало токсический эффекта всех исследуемых солей тяжёлых металлов (рис. 3).

Снижение освещённости с 2200 до 500 лк при 23 °С

Штамм Synechocystis sp. РСС 6803

ЛнШЯм

Штамм Synechocystis sp. CALU 713

Рисунок 1 Влияние снижения освещённости на токсичность солей тяжёлых металлов Т4 - возрастание или убывание токсичности (обратно снижению или возрастанию ЕС50) по сравнению с оптимальными условиями культивирования

_^ - сдвиг срока регистрации минимального значения ЕС50 в динамике наблюдения (к более раннему или позднему времени) по сравнению с оптимальными условиями культивирования

При исследовании чувствительности Synechocystis sp. CALU 713 к токсическому действию солей тяжёлых металлов установлено, что изолированное снижение температурных и световых условий в 1,5 раза увеличивало токсичность соли меди. А при максимально неблагоприятных условиях (15 °С, 500 лк) чувствительность циано-бактерий к данной соли увеличилась почти в 10 раз по сравнению с оптимальными условиями культивирования.

При исследовании чувствительности Synechocystis sp. CALU 713 к токсическому действию соли кадмия установлено, что как изолированное воздействие низких температурных и световых условий, так и максимально неблагоприятные условия (15 °С, 500 лк) не оказывало влияния на чувствительность данного штамма к токсическому действию этой соли.

Чувствительность цианобактерий CALU 713 к токсическому действию соли ртути, при всех условиях культивирования, также оставалась постоянно высокой на протяжении всего периода наблюдения.

Снижение освещённости не влияло на токсический эффект соли серебра по отношению к данному штамму цианобактерий. В то же время снижение температуры до 15 °С при 2200 лк, а также и максимально неблагоприятные условия культивирования значительно усиливали (в 9,3 - 7,3 раза, соответственно) токсичность серебра по сравнению с оптимальными условиями культивирования (табл. 1).

Таким образом, для штамма CALU 713 при снижении освещенности повышается токсичность только соли меди. Максимальные параметры токсичности солей кадмия, ртути и серебра при этом практически не изменяются. Однако сроки проявления максимальной токсичности этих металлов могут меняться (рис. 1).

Снижение температуры повышало чувствительность штамма CALU 713 к токсическому действию солей меди и серебра, но не солей кадмия и ртути. Схожая ситуация наблюдалась и для Synechocystis sp. РСС 6803 (рис.2). Однако совместное снижение света и температуры оказывало более выраженное по сравнению с опти-

мальными условиями усиление токсического эффекта для солей меди и серебра (рис.

3).

Снижение температуры с 23 °С до 15 °С при 2200 лк

Штамм БупёскосузШ зр. РСС 6803

Штамм ЗупесИосуяНз зр. САШ 713

Т

Си

т Ag

>

>

щ

>

>

С(]

1

С(]

Рисунок 2 Влияние снижения температуры на токсичность солей тяжёлых металлов Ц. - возрастание или убывание токсичности (обратно снижению или возрастанию ЕС50) по сравнению с оптимальными условиями культивирования

*— - сдвиг срока регистрации минимального значения ЕС50 в динамике наблюдения (к более раннему или позднему времени) по сравнению с оптимальными условиями культивирования

Снижение освещённости и температуры до 15 °С при 500 лк

Штамм 5упесЬосузйз зр. РСС 6803

Штамм 8упескосувйз зр. САН! 713

>

>

■

т Сс1

Нё

>

>

Т Си

Рисунок 3 Влияние снижения температуры и освещённости на токсичность солей тяжёлых металлов

- возрастание или убывание токсичности (обратно снижению или возрастанию ЕС50) по сравнению с оптимальными условиями культивирования

< - сдвиг срока регистрации минимального значения ЕС50 в динамике наблюдения (к более раннему или позднему времени) по сравнению с оптимальными условиями культивирования

Таким образом, анализ полученных результатов показал, что цианобактерии Synechocystis sp. CALU 713 более чувствительны к токсическому действию солей тяжёлых металлов, чем штамм РСС 6803. При этом изменение условий культивирования (снижение температуры и освещённости) в основном повышало чувствительность обоих штаммов цианобактерии к токсическому действию исследуемых солей. В одних случаях, снижение температуры или освещённости не оказывало влияния на изменение чувствительности Synechocystis sp. к токсическому действию солей тяжёлых металлов (соль кадмия - для штамма РСС 6803), в других напротив, изолированное изменение условий культивирования приводило к значительному усилению токсического эффекта солей тяжёлых металлов (например, воздействие солей меди и серебра при снижении температуры, а при снижении освещённости - меди - для обоих штаммов). В то же время совместное снижение температуры и освещённости сопровождалось значительным повышением чувствительности цианобактерий к токсическому действию всех исследуемых солей тяжёлых металлов.

По-видимому, выявленный, с учётом литературных данных, эффект токсического действия солей тяжёлых металлов на цианобактерии может быть обусловлен следующими механизмами.

1. Внутриклеточной аккумуляцией. Концентрация металла внутри бактерий зависит от его взаимодействия с поверхностными лигандами и пассивного транспорта в клетку (Aickin R.M., Dean A.C., 1979).

2. Связыванием металлов клеточной стенкой. Многие металлы легко связываются в результате присутствия специфических функциональных групп, которые легко замещают протоны на дивалентные катионы (Friedberg J., 1977).

3. Металл-сидерофорными взаимодействиями. Сидерофоры - это хелати-рующие агенты, выделяемые многими микроорганизмами и способствующие поглощению катионов железа. Однако они могут реагировать и с другими металлами (Lel-and H.V. etal., 1979).

4. Экстрацеллюларной мобилизацией/иммобилизацией металлов метаболитами бактерий (Al-Schadwani M.F. et al., 1984).

5. Экстрацеллюларными полимер-металл-взаимодействиями. Многие микроорганизмы синтезируют внеклеточные полисахариды, которые активно связывают металлы (Ford Т., Mitchell R., 1992).

6. Трансформацией металлов. В качестве примера можно указать образование метилированных и этилированных форм ртути (Avery S.V.et al, 1993).

Морфологические изменения клеток цианобактерий Synechocystis sp. при воздействии солей тяжелых металлов

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что в экстремальных условиях главным регулирующим механизмом, способствующим выживанию организмов, является адаптация. Фенотипическая пластичность прокариот, как совокупность гибких систем быстрого адаптивного реагирования на изменение внешних условий, проявляется на разных уровнях клеточной организации: метаболическом, морфологическом (на уровне световой микроскопии) и ультраструктурном (Баулина О.И., 2005). Нельзя исключить, что токсичность солей тяжелых металлов в отношении цианобактерий Synechocystis sp. может быть связана и с генетической перестройкой микроорганизмов (Lowley D.R., 1994).

В связи с этим для изучения основных проявлений цитотоксического действия солей тяжёлых металлов, представлялось важным исследовать их влияние на структурные изменения цианобактерий Эупескосузйв ер. САШ 713 и РСС 6803.

Для решения этой задачи мы использовали световую и электронную микроскопию. Исследование проводили на 7-е сутки инкубации культур обоих штаммов цианобактерий с солями тяжелых металлов в минимальных значениях среднеэффектив-ных концентраций (ЕС50, мкг-л"1). Данный срок исследования был выбран с учётом того, что к этому времени культуры цианобактерий достигают оптимальной репродуктивной активности (Гусев М.В., 2003).

Следует отметить, что выявленные морфологические изменения, как по данным световой, так и электронной микроскопии при действии всех исследованных солей тяжёлых металлов были однотипными. В связи с этим иллюстрированный материал наших исследований представляем на примере токсического действия соли ртути (Н§(СН3СОО)2) на цианобактериях Бупескосу.чИ.'; ер. САШ 713.

Морфологические изменения клеток ЗупесИосуя/к ер. при воздействии солей тяжёлых металлов по данным световой микроскопии

В результате проведённых исследований установлено, что в контроле при оптимальных условиях культивирования (23 °С, 2200 лк) оба штамма Зуяес/госу^и эр. САШ 713 и РСС 6803 были представлены клетками сферической формы. Диаметр клеток 2-3 мкм. Деление клеток бинарное, в двух или трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Клетки в культуре обычно располагались парами (рис. 4).

о

о

о

Л

г**

в О о С)

С

О

ь <7 "

О

о

<о с?

о о

Рисунок 4 Результаты световой микроскопии клеток .Ууяес/здсуя//.? ер. в контроле: а - штамм РСС 6803 (х 40); б- штамм САШ 713 (х 90). Масштаб: 10 мкм

В присутствии солей тяжёлых металлов у БупесНосух^ ер. РСС 6803 были обнаружены изменения формы и размеров клеток: появление атипичных форм клеток, появление относительно крупных (до 4,7 мкм) и мелких клеток (до 1,3 мкм) (рис. 5 а). При этом выявлена тенденция, не свойственная для данного штамма - формировать многоклеточные микроагрегаты и цепочки, состоящие из 4 - 10 клеток (рис. 5 б).

В то же время, у клеток штамма САШ713 токсическое действие солей тяжелых металлов не сопровождалось образованием подобных микроагрегатов.

Ms

Ж

г _

Рисунок 5 Результаты световой микроскопии клеток Synechocystis sp. к 7-м суткам инкубации в среде с исследованными солями тяжелых металлов: а - атипичная форма клетки штамма CALU 713 (х 90); б - формирование многоклеточных цепочек у штамма РСС 6803 (х 90). Масштаб: а-б-2 мкм

По-видимому, выявленные изменения формы и размеров клеток, связаны с обратимой перестройкой структуры бактерий в ответ на изменение внешних условий. Она проявляется в изменении размеров, конфигурации и других параметрах архитектоники, что согласуется с литературными данными (Voloshko L.N. et al., 2001).

Результаты морфометрического анализа представлены в таблице 3. Согласно представленным данным, в присутствии всех исследуемых солей тяжёлых металлов величина среднего размера клеток изменялась разнонаправлено. При этом значения минимального размера клеток достоверно сдвигались в сторону снижения, а максимального - в сторону увеличения по сравнению с контролем. Наиболее выраженные изменения отмечены в инкубационной среде с солью ртути.

Таблица 3 - Морфометрические данные Бупескосуз^ Бр. РСС 6803 после 7-и суток экспозиции в 3-х сериях экспериментов (п =40)

Диаметр клетки (мкм) Контроль Си2+ Cd2+ Hg2+ Ag+

Средний Минимальный Максимальный 2,2 ± 0,03 1,9 ±0,02 2,4 ± 0,02 2,4 ± 0,06 1,8 ±0,04 3,3 ± 0,05* 2,5 ± 0,05* 1,5 ±0,04* 2,9 ± 0,05* 2,6 ± 0,07* 1,3 ±0,06* 3,2 ± 0,04* 2,1 ±0,05* 1,3 ±0,04* 2,7 ± 0,04*

Примечание: * - р < 0,05 - в сравнении с контролем

У обоих исследуемых штаммов БупесИосузШ эр. в присутствии солей тяжёлых металлов (Си2+, Сс12+, Н§2+ и Ag+) отмечалось увеличение или уменьшение размера клеток в 1,5 - 2,0 раза от контроля (табл. 3, 4). Таким образом, величина среднего и максимального размеров клеток заметно возрастает по сравнению с контролем. При этом значения минимального размера клеток цианобактерий достоверно сдвигались в сторону снижения; исключением являлись клетки, культивированные в среде с солью меди.

I

Таблица 4 - Морфометрические данные БупескосузНБ ер. САШ 713 после 7-и суток экспозиции в 3-х сериях экспериментов (п=40)

Диаметр клетки (мкм) Контроль Си2+ Cd2+ Hg2+ Ag+

Средний Минимальный Максимальный 2,0 ±0,06 1,7 ±0,04 2,3 ± 0,05 3,5 ± 0,04* 2,5 ± 0,06* 4,7 ± 0,06* 2,4 ± 0,05* 1,6 ±0,06* 2,9 ±0,04* 2,7 ± 0,05* 1,4 ±0,05* 4,6 ±0,04* 2,3 ±0,04* 1,5 ±0,03* 2,8 ±0,05*

Примечание: * - р < 0,05 - в сравнении с контролем

Изучение формы клеток показало, что в поле зрения микроскопа при воздействии всех исследованных токсикантов появлялись атипичные клетки, существенно отличные от традиционной сферической формы. Согласно данным представленным в таблице 5, после 7-и суток инкубации с растворами солей тяжёлых металлов, количество атипичных клеток у штамма РСС 6803 составило 19,3 ± 0,06 % - 29,1 ± 0,06 % (максимальное количество - в среде с солью серебра; минимальное - с солью меди), а у более чувствительного штамма - Бупескосувйз эр. САШ 713 - среднее количество деформированных клеток варьировало от 34,4 ± 0,05 % до 41,5 ± 0,06 % (максимальное количество - в среде с солью ртути; минимальное, так же как и у штамма РСС 6803 - с солью меди).

Таблица 5 - Поверхностные изменения клеток Бупескосузйя эр. при воздействии солей тяжёлых металлов (п = 100)

Штаммы Synechocystis sp. Соли металлов Доля атипичных форм клеток (% от 100 клеток в 3-х сериях) Количество цепочек в поле зрения

РСС 6803 Си2+ 19,3 ±0,06 15,2 ±0,04

Cd2+ 21,8 ±0,04 13,8 ±0,06

Hg2+ 25,0 ±0,02 10,5 ±0,01

Ag+ 29,1 ± 0,06 14,4 ± 0,07

CALU 713 Cu2+ 34,4 ±0,05

Cd2+ 38,3 ±0,01 -

Hs2+ 41,5 ±0,06 -

Ag+ 36,7 ±0,02 -

Примечание: « - » - обозначает отсутствие цепочек в поле зрения

Таким образом, чувствительность штамма цианобактерий РСС 6803 к токсическому действию исследованных токсикантов по количеству присутствующих в поле зрения атипичных форм клеток заметно ниже, чем штамма CALU 713. Однако выявлена особенность проявления токсического эффекта солей тяжелых металлов для штамма РСС 6803 - формирование цепочек из клеток цианобактерий. Обнаруженный факт может служить специфическим признаком токсического действия исследуемых солей тяжёлых металлов для данного штамма.

Ультраструктурные изменения клеток Synechocystis sp. при воздействии солей

тяжелых металлов

Выявленные по данным световой микроскопии морфологические признаки токсического действия солей тяжелых металлов в отношении исследуемых одноклеточных микроорганизмов позволили предположить отражение этого эффекта на ультраструктурном уровне.

В настоящее время, ультраструктурные внутриклеточные изменения при воздействии солей тяжёлых металлов у цианобактерий Synechocystis sp. изучены недостаточно.

В связи с этим на трансмиссионном электронном микроскопе были проведены исследования ультраструктуры клеток цианобактерий Synechocystis sp. штаммов РСС 6803 и CALU 713 при культивировании в средах с тяжёлыми металлами.

В ходе проведённых исследований были получены следующие результаты.

В контроле у Synechocystis sp. РСС 6803 внутриклеточные органеллы тилакои-ды расположены в 6 - 8 концентрических рядах в форме подковы. Наружный чехол дифференцирован слабо. Область нуклеоида четко выражена, сферической или овальной формы, несколько ассиметричная, зернистой структуры (рис. 6 а).

У Synechocystis CALU 713 в контроле тилакоиды расположены в 5 - 6 концентрических рядах, местами резко изгибающимися. Наружный чехол дифференцирован слабо. Область нуклеоида полигональной формы, зернистой структуры (рис.6 б).

Рисунок 6 Результаты электронной микроскопии клеток цианобактерий Synechocystis sp. в контроле: а - штамм РСС 6803; б - штамм CALU 713; А - зона нуклеоида; Б - тилакоиды. Масштаб: а-б- 0,5 мкм

Клеточная стенка является первой преградой, с которой сталкиваются тяжелые металлы. На начальной стадии металлы адсорбируются на клеточной поверхности и затем поступают внутрь клетки путем пассивного или активного транспорта. Металлы, достигают клеточной мембраны и, возможно, связываются с различными лиган-дами и функциональными группами типа -СООН, -SH, -NH2, -Р304 и т. д., которые присутствуют в цитоплазматической. мембране. Это приводит к изменению проницаемости цитоплазматической мембраны (Савельев И.Б., Селях И.О., 2000; Voloshko L.N. et al, 2001; Rai В. et al„ 1990; Shuster et C. et al., 1990).

В результате наших исследований, показано, что при культивировании Бупе-сИосузШ эр. в средах с солями тяжёлых металлов, происходило утолщение клеточной стенки, был зарегистрирован плазмолиз. Деградация пептидогликанового слоя - по-видимому, является проявлением токсического действия тяжелых металлов на штаммы 8упесНосу$й& ер. Местами пептидогликановый слой утолщается и становится менее электронноплотным. В результате клетка теряет сферическую форму, и происходит плазмолиз, то есть отслоение клеточной стенки от протопласта (рис. 7 а-б).

Рисунок 7 Результаты электронной микроскопии клеток Synechocystis sp. к 7-м суткам инкубации в среде с солью ртути Hg(CH3COO)2: а - штамм РСС 6803; б- штамм CALU 713; А - зона нуклеоида; Б - деструкция тилакоидов в хроматоплазме; В - отслоение клеточной стенки; Г - полифосфатные тела. Масштаб: а-б - 0,5 мкм

Анализ результатов, полученных при помощи электронной микроскопии, показал, что при культивировании в средах с солями всех исследуемых тяжёлых металлов внутри клетки штамма РСС 6803 происходит расхождение тилакоидных мембран с расширением внутритилакоидного пространства, а также деструкция этих фотосинтетических органелл (рис. 8 а).

Результаты наших исследований согласуются с данными В. Rai et al. (1990), которые показали, что при воздействии тяжёлыми металлами на клетку эукариотиче-ских зеленых водорослей наблюдается разрушение хлорофилла и каротиноидов, отмечается снижение фотосинтетической активности. Роль белков и липопротеинов в связывании металлов внутри клеток ранее была продемонстрирована N. Robinson, (2001).

В наших исследованиях в этих же условиях в хроматоплазме штамма CALU 713 происходила вакуолизация тилакоидов, деструкция фикобилисом и их агглютинация при воздействии исследованных токсикантов (рис. 8 б). Известно, что фикоби-линовые пигменты способны связывать ионы металлов (Бреховских A.A., 2006). Это может являться проявлением неспецифического механизма естественной детоксика-ции.

Рисунок 8 Результаты электронной микроскопии клеток Synechocystis sp. к 7 сут инкубации в среде с солью ртути Hg(CH3COO)2: а - штамм РСС 6803; б - штамм CALU 713; А -зона нуклеоида; Б - деструкция тилакоидов в хроматоплазме; В - отслоение клеточной стенки; Г - фикобилисомы. Масштаб: а-б - 0,5 мкм

У Synechocystis sp. РСС 6803 после культивирования в среде с добавлением солей кадмия, меди, ртути и серебра наблюдалось разрушение рибосом, в результате чего цитоплазма теряла характерную зернистость и в ней появлялись обширные светлые участки (рис. 9 а). Нуклеоид, в норме гомогенный, агрегировал в нерегулярно расположенные плотные тяжи.

При культивировании Synechocystis sp. CALU 713 в среде с солями тяжёлых металлов также выявлялись изменения как в цитоплазме, так и в нуклеоиде. Таким образом, нуклеоид приобретал волокнистую структуру. А в нуклеоплазме на некоторых срезах появлялись электронноплотные внутрицитоплазматические структуры. На основе данных Т.Е. Jensen et al. (1982), В. Rai et al. (1990), И.Б. Савельева (2000), выявивших накопление полифосфатных гранул у цианобактерий Anabaena flos-aqnae, А. variabilis, Nostoc sp. и Plectonema boiyanum в ответ на воздействие ионов цинка и кадмия, можно предположить, что и в нашем случае вышеупомянутые внутриклеточные структуры являются полифосфатными телами, играющими важную роль в связывании ионов металлов и их детоксикации (рис. 9 б).

Рисунок 9 Результаты электронной микроскопии клеток ^уиесАосуйм эр. к 7-м суткам инкубации в среде с солью ртути ^(СНзСООЬ: а - штамм РСС 6803; б- штамм САШ 713; А - зона нуклеоида; Б - деструкция тилакоидов в хроматоплазме; В - отслоение клеточной стенки. Масштаб: а-б - 0,5 мкм

Согласно данным, представленным на рисунке 10, установлено, что при культивировании цианобактерий обоих штаммов в средах, содержащих соли тяжёлых металлов, происходило скопление муреина в области септы, что препятствовало процессу деления клеток (рис. 10 а-6).

Вероятно, это связанно с тем, что предпосылкой клеточного деления у бактерий является правильный баланс между транспептидазной системой, осуществляющей заключительный этап биосинтеза клеточной стенки (сшивки пептидных цепей), и карбоксипептидазной системой, катализирующей гидролитическое расщепление пептидных боковых цепей пептидогликанового слоя (Mirelman D.Y. et al., 1978). Стрессовое воздействие на регуляторные функции этой системы приводит к нарушению процесса клеточного деления.

Рисунок 10 Результаты электронной микроскопии клеток Synechocystis sp. к 7-м суткам инкубации в среде с солью ртути Hg(CH3COO)2: а - штамм РСС 6803; б - штамм С ALU 713; Б - деструкция тилакоидов; Д - скопление муреина в области септы; Е - деструкция фи-кобилисом. Масштаб: а-6- 0,5 мкм

В результате проведённых исследований установлено, что под действием солей тяжёлых металлов в культуре цианобактерий обоих штаммов наблюдалось появление деструктивных клеток, у которых в цитоплазме не дифференцировались отдельные органеллы при сохранении целостности мембраны (рис.11 а-6).

Рисунок 11 Результаты электронной микроскопии клеток Synechocystis sp. к 7-м суткам инкубации в среде с солью ртути Hg(CH3COO)2: а - штамм РСС 6803; б - штамм CALU 713. Масштаб: а-б- 0,5 мкм

Анализ результатов электронной микроскопии позволяет говорить, что под влиянием солей тяжёлых металлов (AgN03; 3CdS04-8H20; Hg(CH3COO)2; Cu-S04-5H20) у цианобактерий развиваются морфологические изменения, имеющие одинаковый характер для исследуемых штаммов Synechocystis sp. CALU 713 и РСС 6803.

Таким образом, в результате проведённых исследований установлено, что циа-нобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 и CALU 713 чувствительны к токсическому действию солей тяжелых металлов. При этом у исследуемых штаммов Synechocystis sp. наблюдалась разная чувствительность к токсическому действию солей тяжёлых металлов. Так у цианобактерии Synechocystis sp. CALU 713 наблюдалась более высокая чувствительность к токсическому действию солей тяжёлых металлов, как при оптимальных условиях, так и при снижение параметров светового и температурного режимов.

В нашей работе получены новые данные о токсичности солей тяжёлых металлов для цианобактерий Synechocystis sp. Установлено, что изменения световых и температурных условий модифицируют чувствительность цианобактерий к токсическому действию солей тяжелых металлов. Снижение температуры и освещенности меняет токсический эффект солей тяжелых металлов, главным образом, в сторону его усиления.

В ходе проведённых исследований было показано, что поверхностные морфологические изменения цианобактерий, вызванные токсическим действием солей тяжелых металлов, носят неспецифический характер, который независимо от штамма и вида исследованного токсиканта, проявляется изменением формы и размера клетки, в том числе и делящихся клеток.

На ультраструктурном уровне морфологические изменения представлены изменением толщины и целостности пептидогликанового слоя клеточной стенки; повреждением внутриклеточных органелл (тилакоидов), имеющих отношение к энергетическому обмену.

Сравнение полученных нами результатов с данными литературы показало, что цианобактерии обладают большей чувствительностью к токсическому действию исследуемых токсикантов, чем некоторые другие микроорганизмы, используемые в ка-

честве тест-объектов в экспериментальной токсикологии. Так, чувствительность Те-trahymena pyriformis к солям меди и кадмия в 20 раз ниже, а у Dafnia magna - в 3 - 6 раз ниже, чем у Synechocystis sp. CALU 713 (Прядко А.Л., 1992; Шилова H.A., 2010). Сравнительный анализ среднеэффективных концентраций солей тяжелых металлов для E.coli, Scenedesmus quadricauda (Курбатова С.А., 2007; Nilsson J.R., 1986), Nostok muscorum (Бреховских A.A., 2006), Euglena, сперматозоидов крупного рогатого скота и других штаммов цианобактерий (Волошко Л.Н., 2001), так же показал, что Synechocystis sp. CALU 713 более чувствительны к воздействиям изучаемых токсикантов.

Таким образом, анализ полученных данных позволяет рассматривать цианобактерий Synechocystis sp. CALU 713 в качестве перспективного тест-объекта в экспериментальной токсикологии.

Результаты работы представляют практический интерес в области токсикологии, главным образом, для использования в качестве одного из альтернативных методов при скрининговых исследованиях токсичности химических веществ.

ВЫВОДЫ

1. Цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 и CALU 713 чувствительны к токсическому действию солей тяжелых металлов. Наибольшей чувствительностью к токсическому действию исследованных солей тяжёлых металлов при оптимальных условиях культивирования обладает штамм цианобактерий Synechocystis sp. CALU 713. При этом степень выраженности токсического эффекта солей тяжёлых металлов неодинакова: Hg(CH3COO)2 > 3CdS04-8H20 >AgN03 > CuS04-5H20.

2. Изменения световых и температурных условий культивирования модифицируют чувствительность цианобактерий Synechocystis sp. к токсическому действию солей тяжёлых металлов. Снижение температуры и освещённости усиливает токсический эффект исследованных токсикантов.

3. Морфологические изменения цианобактерий, по данным световой микроскопии, вызванные токсическим действием солей тяжелых металлов, независимо от штамма и вида исследованного токсиканта, проявляются изменением формы и размеров, в том числе, делящихся клеток.

4. Выявлена особенность проявления токсического эффекта солей тяжёлых металлов для штамма РСС 6803 - формирование цепочек из клеток цианобактерий в водной среде.

5. На ультраструктурном уровне морфологические изменения клеток цианобактерий представлены изменением толщины и целостности пептидогликанового слоя клеточной стенки; повреждением внутриклеточных органелл, имеющих отношение к энергетическому обмену: расхождением тилакоидных мембран с образованием внутритилакоидных пространств; агглютинацией фикобилисом и накоплением полифосфатных гранул; волокнистым преобразованием нуклеоплазмы с потерей характерной зернистости.

6. Чувствительность цианобактерий к токсическому действию исследованных тяжёлых металлов позволяет рекомендовать эти микроорганизмы в качестве тест-объекта в альтернативных методах исследования токсичности ксенобиотиков, в том числе металлосодержащих загрязнителей водной среды.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При использовании цианобактерии Synechocystis sp. CALU 713 и РСС 6803 в качестве тест-объекта в альтернативных методах исследования инкубационную среду следует готовить на основе жидкой питательной среды № 6 (Громов Б.В., 1976), разведенной в 10 раз.

При определении среднеэффективных концентраций (ЕС50, мкг-л"1) рекомендуется в инкубационную среду объёмом 4,5 мл добавлять по 0,5 мл растворов солей тяжелых металлов в убывающих концентрациях. Например: 200; 20; 2; 0,2; 0,02; 0,002 мг-л"1. Затем необходимо провести стерилизацию путем автоклавирования.

На следующем этапе в каждую пробирку следует добавить культуру цианобак-терий в активной фазе роста плотностью 250-Ю"6 клеток-мл'1.

Оптимальные условия культивирования: освещённость - 2200 лк, температура -

23°С.

Поддержания необходимого температурного режима достигается путём термо-статирования.

Наиболее оптимальным сроком инкубации являются 7-е сутки культивирования, поскольку к этому времени достигается максимальная репродуктивная активность культур.

Оценку результатов желательно проводить через разные промежутки времени (например, на 4, 7,10 и 14-е сутки), путём подсчёта клеток культуры в камере Горяе-ва (объём камеры 0,9 мм3), на всей площади квадрата камеры при увеличении х 40 светового микроскопа. Расчёты ЕС50 производить методом пробит-анализа.

При исследовании морфологии цианобактерий методом световой микроскопии следует обращать внимание на изменение формы, размеров клеток, наличие клеточных цепочек.

Наиболее информативными показателями токсического действия ксенобиотиков при исследовании ультраструктуры клеток цианобактерий с помощью трансмиссионной электронной микроскопии являются: изменения толщины и целостности пептидогликанового слоя; расхождение тилакоидных мембран с образованием внут-ритилакоидных пространств; агглютинация фикобилисом и накопление полифосфатных гранул; изменение структуры нуклеоплазмы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Богачева A.C. Исследование чувствительности цианобактерий к токсическому действию солей тяжёлых металлов / В.В. Шилов, A.C. Богачева // Экология человека. -2008. -№ 10.- С.50-53.

2. Богачева A.C. Сравнительная оценка токсического эффекта спиртов для биологических тест-объектов (бактерий, тетрахимен и сперматозоидов) / В.В. Шилов, A.C. Богачева, Е.В. Полозова // Сибирский медицинский журнал. - 2007. - № 6. - С.37-39.

3. Богачева A.C. Оценка токсичности плазмы крови больных с острыми отравлениями угарным газом методом биотестирования с использованием инфузорий Tetra-hymena pyriformis / В.В. Шилов, A.C. Богачева, E.B. Полозова // Медицина труда и промышленная экология. - 2010. - № 4. - С. 36-39.

Другие публикации по теме диссертационного исследования:

4. Богачева A.C. Преимущества и недостатки методов исследования токсикологии с использованием биологических тестов (альтернативных методов) / В.В.Шилов, Е.В. Полозова, A.C. Богачева, JI.C. Салова // Здоровье населения в современной среде обитания //Материалы XXXIX науч. конф. «Хлопинские чтения». Под ред. А.П.Щербо. -СПб МАПО, 2006. - С. 285-288.

5. Богачева A.C. Влияние тяжелых металлов на рост цианобактерий / В.В. Шилов, A.C. Богачева, Е.В. Полозова// Вестник Российской военно-медицинской академии. -

2008.-№ 3(21), приложение 1.-С. 110-111.

6. Богачева A.C. Исследование токсичности химических веществ с использованием биологических тестов (альтернативных методов) / A.C. Богачева, В.В. Шилов, Е.В. Полозова, JLC. Салова // Вестник Российской военно-медицинской академии,- 2008. -№ 1(21), приложение 1. - С. 262-263.

7. Богачева A.C. Методы оценки токсичности с использованием гидробионтов и клеточных культур / Е.В. Полозова, В.В. Шилов, JI.C. Салова, Т. Г. Мартинсон, A.C. Богачева // Учебное пособие. - СПб.: Издательство Политехнического университета,

2009.-68 с.

8. Богачева A.C. Токсикология свинца /В.В. Шилов, Е.В. Полозова, A.C. Богачева, Н.М. Фролова // Пособие для врачей. - СПб.: Издательство Политехнического университета, 2010. - 27 с.

9. Богачева A.C. Экспериментальная оценка токсичности солей тяжёлых металлов в отношении цианобактерий / A.C. Богачева // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины // Материалы юбилейной конференции молодых ученых. - СПб МАПО, 2010. - С. 104-105.

10. Богачева A.C. Токсичность соли кадмия для цианобактерий / В.В. Шилов, A.C. Богачева, Е.В. Полозова // Чрезвычайные ситуации: организационные, эколого-гигиенические и эпидемиологические проблемы // Материалы XXXXIII науч. конф. «Хлопинские чтения». Под ред. А.П. Щербо. - СПб МАПО, 2010. - С. 141-143.

11. Богачева A.C. Чувствительность цианобактерий Synechocystis sp. к токсическому действию солей тяжёлых металлов / A.C. Богачева, В.В. Шилов, Е.В. Полозова // Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии // Материалы Российской научной конференции с международным участием. - СПб, ФОЛИАНТ, 2011. - С. 26.

12. Bogacheva A.S. Tetrahimen test in assessnent of severity of endotoxicosis in ecopa-thologies of different origin / V.V. Shilov, E.V. Polozova, A.S. Bogacheva // Environment and human health /Editor in chief prof. G.A. Sofronov: The complete Works of international Ecologie Forum. - June 29 - Jule 2., 2003. - St. Petersburg, Russia. - 2003. - P. 840-841.

Автор считает своим долгом выразить глубокую благодарность за организационную и методическую помощь в выполнении работы, за предоставленную возможность использования научного оборудования при проведении экспериментальных исследований и методическую помощь в выполнении работы сотрудникам Санкт-Петербургского государственного университета и лично заведующему кафедрой микробиологии д.б.н. профессору A.B. Пиневичу и к.б.н. доценту Л.Н. Волошко.

Подписано в печать « »_г. Формат 60x84/16

Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 425

Типография «Восстания -1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Проблема поиска адекватных экспериментальных моделей с минимальным использованием теплокровных лабораторных животных по этическим и экономическим причинам в последние годы приобрела особую актуальность [20, 33, 64].

В современных условиях существует достаточно широкий спектр альтернативных методов исследования в токсикологии. Так, при анализе загрязнённости водоёмов, помимо простейших, принято использовать водоросли, биолюминесцентные бактерии и водных беспозвоночных -ракообразных (чаще всего ветвистоусых рачков, Daphnia magna), рыб, которые широко применяются для токсиколого-гигиенического нормирования водных источников различного назначения [24].

Цианобактерии являются уникальными представителями мира микроорганизмов. Заселяя почти все освещаемые места обитания, обладая пластичным метаболизмом, они в настоящее время являются удобными модельными объектами для изучения целого ряда биологических процессов, таких как фотосинтез, азотфиксация, адаптация к изменяющимся условиям окружающей среды [12, 17]. Благодаря короткому циклу их развития можно проследить на нескольких поколениях действие экстремальных факторов окружающей среды [22].

Одним из малоизученных, с точки зрения чувствительности к экотоксикантам, классом цианобактерий являются Synechocystîs sp.

Тяжелые металлы относятся к наиболее широко распространенным поллютантам водной и почвенной среды [7, 49, 158]. Они составляют значительную долю загрязнителей окружающей среды и по токсичности занимают второе место после пестицидов. Однажды попав в биогеохимический цикл, они крайне редко и медленно покидают его [57, 59, 80].

Параметры токсикометрии и механизмы токсического действия тяжелых металлов в экспериментальных исследованиях с использованием микроорганизмов изучены недостаточно.

Известно, что физиологические реакции микроорганизмов во многом зависят от таких параметров окружающей среды, как температура и освещенность. Данные о токсичности химических веществ для микроорганизмов при изменении этих параметров окружающей среды практически отсутствуют.

Цель исследования - оценить возможность использования цианобактерий Synechocystis sp.b качестве тест-объекта для оценки токсичности ксенобиотиков на примере солей тяжёлых металлов.

Достижение поставленной цели планировалось путем решения следующих задач:

1. Определить параметры токсичности солей тяжелых металлов (AgN03; 3CdS04-8H20; Б£(СНзСОО)2; CuSO^SbkO) для разных штаммов цианобактерий С ALU 713 и РСС 6803 при оптимальных условиях среды обитания в динамике.

2. Исследовать влияние различных сочетаний температуры и освещенности среды обитания на параметры токсичности тяжёлых металлов для цианобактерий.

3. Оценить морфологические изменения цианобактерий в присутствии солей тяжёлых металлов.

4. Выявить наиболее чувствительный к токсическому действию солей тяжелых металлов штамм цианобактерий для использования в экспериментальной токсикологии.

Научная новизна

Впервые получены данные о параметрах токсичности солей тяжёлых металлов для цианобактерий ЗупескосуяНз Бр. САЬИ 713 и РСС 6803. Показано, что изменения световых и температурных условий модифицируют чувствительность цианобактерий к токсическому действию солей тяжелых металлов. Снижение температуры и освещенности в разной степени усиливает токсический эффект солей тяжелых металлов.

Установлено, что морфологические изменения цианобактерий, вызванные токсическим действием солей тяжелых металлов, носят неспецифический характер, независимо от штамма и вида исследованного токсиканта, проявляются изменением формы и размеров, в том числе, делящихся клеток. На ультраструктурном уровне морфологические изменения представлены изменением толщины и целостности пептидогликанового слоя клеточной стенки; повреждением внутриклеточных органелл, имеющих отношение в основном к энергетическому обмену.

Наиболее чувствительным к токсическому действию солей тяжелых металлов и, соответственно, подходящим для использования в экспериментальной токсикологии является штамм ЗупесЬосузИз Бр. САЬИ 713. Для этого штамма токсичность металлов убывает в следующей последовательности (Щ > С<1 > Ag > Си), для штамма БупескосузйЕ эр. РСС 6803 ^>Н§>Сс1>Си).

Практическая значимость

Обоснована целесообразность использования цианобактерий ЗупесИосуяМя Бр. САШ 713 и РСС 6803 для оценки степени загрязнённости водных объектов солями тяжёлых металлов. В результате проведённых исследований получены параметры токсичности солей тяжёлых металлов

ЗСс1804-8Н20; Hg(CHзCOO)2; Си804-5Н20) для двух штаммов цианобактерий Буггескосухйя эр. В этих условиях выявлены морфологические изменения поверхности и ультраструктуры клеток БупескосузШ эр. Полученные результаты могут использоваться в научно-исследовательских и практических работах в области экологической токсикологии и в скрининговых исследованиях токсичности химических веществ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Цианобактерии Зупескосухйз Бр. штаммов САЫ1 713 и РСС 6803 чувствительны к токсическому действию тяжёлых металлов. Токсичность определяется дозозависимым эффектом снижения скорости роста цианобактерий в инкубационной среде на водной основе. Параметры токсичности существенно зависят от условий температуры и освещённости.

2. Токсическое действие солей тяжёлых металлов характеризуется морфологическими изменениями формы и размеров клеток, клеточных мембран, нуклеоплазмы и содержащихся в ней рибосом, фотосинтетических органелл - тилакоидов.

Реализация работы

Материалы диссертационного исследования используются в научной работе отдела клинической токсикологии НИИ скорой помощи им. И.И. Джанелидзе при оценке токсичности биосред у больных с острыми отравлениями для определения уровня эндотоксемии; в учебном процессе кафедры общей и клинической токсикологии, кафедры микробиологии и микологии и кафедры медицинской экологии и эпидемиоглогии ГОУ ДПО СПб МАЛО; а также в научно-практической деятельности Территориального управления Роспотребнадзора по городу Санкт-Петербургу. По теме данной диссертации подготовлено два учебных пособия.

Апробация работы

Материалы настоящего исследования представлены на: международном экологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 29 июня - 2 июля 2003г.); на XXXIX научной конференции "Хлопинские чтения" - "Здоровье населения в современной среде обитания" (г. Санкт-Петербург, 2006г.); на ХХХХШ научной конференции "Хлопинские чтения" - "Чрезвычайные ситуации: организационные, экологические и эпидемиологические проблемы" (г. Санкт-Петербург, 2010г.); юбилейной научно-практической конференции молодых учёных "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины" (г. Санкт-Петербург, 22 апреля 2010г.); на Российской научной конференции с международным участием "Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии" (г. Санкт-Петербург, 19-20 мая 2011).

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения

Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ ГОУ ДПО СПбМАПО в 2006 - 1010 гг. (тема «Исследование эффективности современных методов диагностики и лечения отравлений», разделы «Мониторинг обращения потенциально-опасных химических веществ на территории Санкт-Петербурга» и «Изучение ультраструктурных механизмов токсичности тяжёлых металлов»).

Личное участие автора

Автор принимал личное участие в планировании, организации и выполнении исследований, проводил регистрацию и оценку результатов, статистическую обработку, обобщение и анализ полученных данных.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования результатов исследований, выполненных на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Объём и структура работы

Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, главы обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 15 рисунками. Библиографический указатель содержит 187 источников (84 - отечественных и 103 - зарубежных авторов).

ВЫВОДЫ

1. Цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 и С ALU 713 чувствительны к токсическому действию солей тяжелых металлов. Наибольшей чувствительностью к токсическому действию исследованных солей тяжёлых металлов при оптимальных условиях культивирования обладает штамм цианобактерий Synechocystis sp. С ALU 713. При этом степень выраженности токсического эффекта солей тяжёлых металлов неодинакова: Hg(CH3COO)2 > 3CdS04-8H20 > AgN03 > CuS04-5H20.

2. Изменения световых и температурных условий культивирования модифицируют чувствительность цианобактерий Synechocystis sp. к токсическому действию солей тяжёлых металлов. Снижение температуры и освещённости усиливает токсический эффект исследованных токсикантов.

3. Морфологические изменения цианобактерий, по данным световой микроскопии, вызванные токсическим действием солей тяжелых металлов, независимо от штамма и вида исследованного токсиканта, проявляются изменением формы и размеров, в том числе, делящихся клеток.

4. Выявлена особенность проявления токсического эффекта солей тяжёлых металлов для штамма РСС 6803 - формирование цепочек из клеток цианобактерий в водной среде.

5. На ультраструктурном уровне морфологические изменения клеток цианобактерий представлены изменением толщины и целостности пептидогликанового слоя клеточной стенки; повреждением внутриклеточных органелл, имеющих отношение к энергетическому обмену: расхождением тилакоидных мембран с образованием внутритилакоидных пространств; агглютинацией фикобилисом и накоплением полифосфатных гранул; волокнистым преобразованием нуклеоплазмы с потерей характерной зернистости.

6. Чувствительность цианобактерий к токсическому действию исследованных тяжёлых металлов позволяет рекомендовать эти микроорганизмы в качестве тест-объекта в альтернативных методах исследования токсичности ксенобиотиков, в том числе металлосодержащих загрязнителей водной среды.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При использовании цианобактерии Synechocystis sp. С ALU 713 и РСС 6803 в качестве тест-тобъекта в альтернативных методах исследования инкубационную среду следует готовить на основе жидкой питательной среды № 6 (Громов Б.В., 1976), разведенной в 10 раз.

При определении среднеэффективных концентраций (ЕС50, мкг-л"1) рекомендуется в инкубационную среду объёмом 4,5 мл добавлять по 0,5 мл растворов солей тяжелых металлов в убывающих концентрациях. Например: 200; 20; 2; 0,2; 0,02; 0,002 мг-л"1. Затем необходимо провести стерилизацию путем автоклавирования.

На следующем этапе в каждую пробирку следует добавить культуру цианобактерий в активной фазе роста плотностью 250-10"6 клеток-мл'1.

Оптимальные условия культивирования: освещённость - 2200 лк, температура - 23 °С.

Поддержания необходимого температурного режима достигается путём термостатирования.

Наиболее оптимальным сроком инкубации являются 7-е сутки культивирования, поскольку к этому времени достигается максимальная репродуктивная активность культур.

Оценку результатов желательно проводить через разные промежутки времени (например, на 4, 7, 10 и 14-е сутки), путём подсчёта клеток культуры в л камере Горяева (объём камеры 0,9 мм ), на всей площади квадрата камеры при увеличении х 40 светового микроскопа. Расчёты ЕС50 производить методом пробит-анализа.

При исследовании морфологии цианобактерий методом световой микроскопии следует обращать внимание на изменение формы, размеров клеток, наличие клеточных цепочек.

Наиболее информативными показателями токсического действия ксенобиотиков при исследовании ультраструктуры клеток цианобактерийс помощью трансмиссионной электронной микроскопии являются: изменения толщины и целостности пептидогликанового слоя; расхождение тилакоидных мембран с образованием внутритилакоидных пространств; агглютинация фикобилисом и накопление полифосфатных гранул; изменение структуры нуклеоплазмы.