CD95-рецепторно-лигандная система в лекарственно-индуцированном апоптозе

Соколовская, Алиса Анатольевна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:CD95-рецепторно-лигандная система в лекарственно-индуцированном апоптозе

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Соколовская, Алиса Анатольевна Москва 2001 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему CD95-рецепторно-лигандная система в лекарственно-индуцированном апоптозе

На правах рукописи

РГБ ОД

4 МАР 2002

СОКОЛОВСКАЯ АЛИСА АНАТОЛЬЕВНА

С095-РЕЦЕПТ0РН0-ЛИГАНДНАЯ СИСТЕМА В ЛЕКАРСТВЕННО-ИНДУЦИРОВАННОМ АПОПТОЗЕ

14.00.14 - ОНКОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2001г.

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина Российской Академии Медицинских Наук.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Барышников кандидат биологических наук Д.Ю.Блохин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор H.H. Тутщын доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилин

Ведущее научное учреждение:

Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена МЗ РФ

Защита диссертации состоится « ^^ » 200<£года

на заседании диссертационного совета (К 001.017.01) при Российского онкологическом научном центре им.Н.Н.Блохина РАМН

по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д.24

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН

Автореферат разослан «_ »wo? года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Ю.А.Барсуков

Bofbj. о

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

В настоящее время под апоптозом понимают всю совокупность последовательных и необратимых морфофмзнологическнх и молекулярно-биологических процессов программированной гибели клетки. Апоптоз является активным, генетически контролируемым механизмом поддержания клеточного гомеостаза органов и тканей путем уничтожения ненужных или потенциально опасных клеток, таких, как вирус-инфицировапные, облученные или онкотрансформированные клетки [Ярилин A.A., 1996; Барышников АЛО. и др., 1996; Raff М.С., 1992; Williams G.T. et al., 1993; Vaux D.L. et al., 1994; Wyllie A.H., 1993; Meier P. et al., 2000].

Молекулярные механизмы программированной гибели клетки (апоптоза) стали в последние годы предметом интенсивных исследований. Несмотря па большое количество экспериментальных данных, механизмы этого процесса до сих пор остаются не исследованными. Не до конца выяснена регуляция апоптоза отдельных клеток в многоклеточном организме. Актуальность проблемы определяется взаимосвязью нарушений регуляции процесса программированной гибели клетки с патогенезом многих заболеваний.

К заболеваниям, связанным с усилением апоптоза, относят СПИД, болезнь Альцгеймера, миелодиспластический синдром, токсическую дистрофию печени, ишемические повреждения различных органов и др. В противоположность этому, торможение апоптоза сопровождает некоторые вирусные, аутоиммунные и онкологические заболевания [Raff M.С., 1993; Thompson C.B., 1995; Tliatte U. and Dahanukar S., 1997; Engler R.L. et al., 1998].

противоопухолевые агенты (ингибиторы топоизомераз I и И, ДНК-активные препараты, гормоны) действуют, индуцируя апоптоз клеток-мишеней [Dive С. et al., 1991; Hannun Y., 1997; Makin G. et al., 2000]. Однако механизмы индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами мало изучены.

Открытие трансмембранного CD95(Fas/APO-l) рецептора и его лиганда (CD95L) позволило по-новому взглянуть на молекулярные механизмы лекарственно-индуцированного апоптоза. Предполагается, что CD95 рецепторно-лигандная система является критическим компонентом лекарственно-индуцированного апоптоза [Los М. et al., 1997; Friesen С. et al., 1997; Fulda S. et al., 1998]. Взаимоотношения компонентов сигнальных путей CD95/CD95L- и лекарственно-индуцированного апоптоза может иметь не только фундаментальное, но и практическое значение в разрешении проблемы резистентности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам. Поэтому изучение возможной роли С095(Раз/АРО-1)-рецепторно-лигандной системы в лекарственно-индуцированном апоптозе является актуальной и перспективной задачей в поиске новых методов и средств противоопухолевой терапии.

Современные методы лабораторных исследований позволяют не только регистрировать апоптоз опухолевых клеток, вызванный действием противоопухолевых препаратов, но и получать данные о молекулярных механизмах внутриклеточной трансдукции апоптотического сигнала, и, таким образом, способствовать более глубокому пониманию патогенеза заболеваний, совершенствованию дифференциальной и молекулярной диагностики для выбора наиболее эффективной стратегии противоопухолевой терапии.

В настоящей работе проведено исследование феномена лекарственно-индуцированного апоптоза н его возможных молекулярных механизмов с применением комплекса современных методов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Целью работы явился сравнительный анализ индукции апоптоза различными противоопухолевыми препаратами, а также исследование возможной роли

С095-рецепторно-лигандной системы в механизме лекарственно-индуцированного апоптоза. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Оптимизация условий индукции и регистрации апоптоза, вызванного противоопухолевыми препаратами in vitro.

2. Сравнительный анализ индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами разных классов и различного механизма действия.

3. Оценка спонтанного и индуцированного апоптоза клеток крови и костного мозга больных онкогематологическими заболеваниями.

4. Выяснение возможной роли СВ95-рецепторно-лигандной системы в механизме лекарственно-индуцированного апоптоза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Подтверждены результаты исследований ряда авторов по изучению индукции апоптоза клеток линии Jurkat противоопухолевыми препаратами разных классов. Впервые показана способность отечественного противоопухолевого препарата платины II поколения - циклоплатама - индуцировать апоптоз клеток линии Jurkat. Исследован апоптоз клеток крови и костного мозга больных онкогематологическими заболеваниями до и в процессе проведения специфической терапии. Методом негативной селекции получена уникальная С095-дефицитная линия клеток Jurkat/A4. Выявлено, что клеточная линия Jurkat/A4 является резистентной не только к С095-опосредованному апоптозу, но и к противоопухолевым препаратам различного механизма действия. НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Унифицированная методика индукции апоптоза in vitro может найти рименение для скрининга новых соединений и веществ с потенциальной ротивоопухолевой активностью и изучения их механизмов действия, спользуемые методы идентификации апоптоза клеток крови и костного мозга эльных онкогематологическими заболеваниями могут быть использованы для шественной и количественной оценки эффективности назначаемой терапии, олученная СБ95-дефицитная клеточная линия Jurkat/A4 может явиться шкальной моделью для изучения молекулярных механизмов внутриклеточной

трансдукции апоптотического сигнала и скрининга веществ, цитостатическо действие которых не связано с индукцией апоптоза. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текст. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственны исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 31 источников. Работа иллюстрирована 8 таблицами, 37 рисунками. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Апробация работы состоялась 21 июня 2001г. на совместной научно конференции с участием лабораторий экспериментальной диагностики биотерапии опухолей, биохимической фармакологии, медицинской химии НИ ЭДиТО, лаборатории клинической иммунологии НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохин РАМН. Основные положения диссертации представлены: на 8-ом международно] конгрессе по противоопухолевому лечению (Париж, 1998), на 10-ом симпозиум NCI-EORTC по новым препаратам в терапии рака (Амстердам, 1998), н международном конгрессе "Современные методы лечения аллергии, астмы иммунодефицитов" (Тбилиси, 1999), на конференциях «Дни иммунологии Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 1999 и 2001), на 2-ом съезде онколого стран СНГ (Киев, 2000), на 6-ом Европейском конгрессе фармацевтических нау (Будапешт, 2000), на 8-ом международном симпозиуме по молекулярньп аспектам химиотерапии (Гданьск, 2001).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Монокпональные антитела. Для определения иммунологического фенотип клеток-мишеней использовали монокпональные антитела (МКА) серии ИКО поверхностным дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека (CD: CD4, CDS, CD7, CD8, CD18, CD25, CD95), полученные в РОНЦ им.Н.Н.Блохин РАМН, и их коммерческие аналоги. Агонистические эффекторные МКА IPO-(aHTn-CD95/Fas/APO-l) любезно предоставлены С.П.Сидоренко (Институ

Экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого ПАН Украины).

Клеточная линия. Исследования выполнены на линии клеток Jurkat (Т-клеточный лимфобластоидный лейкоз человека) (Банк клеточных культур РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва.).

Инкубация клеток с противоопухолевыми препаратами in vitro. Клетки инкубировали в полной питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% ТЭС в присутствии различных концентраций исследуемых препаратов в течение 4-72 ч, в атмосфере с 5% содержанием С02, при 37°С. Контролем служили ннтактные клетки, которые инкубировали в тех же условиях, но в отсутствии препаратов.

Определение фрагментации ДНК методом электрофореза в геле агарозы. Фрагментацию ДНК определяли электрофорезом в агарозном геле по описанной методике [Gavrieli Y. et al., 1992].

Получение F(ab ')_> фрагментов иммуноглобулинов. F(ab')2 фрагменты получали из очищенных МКА анти-СЭ95 (1РО-4) с изотипом IgM и МКА ICO-175 (IgM) против антигена CD15 по описанному методу [Lamoyi Е. et al., 1983; Parham P., 1986].

Проточно-цитофлуориметрический анализ. Проточно-цитофлуориметрический анализ проводили с использованием проточного цитофлуориметра FACSCalibur (Decton Dickinson, США) совместно со старшим научным сотрудником Т.Н. Заботиной в лаборатории клинической иммунологии (руководитель - д.м.н., профессор З.Г. Кадагидзе) НИИ клинической онкологии РОНЦ.

Определение поверхностной экспрессии CD95L проводили с использованием МКА aiiTu-FasL, клон NOK-1 (Pharminger, США).

Определение цитотоксического действия препаратов. Для оценки цитотоксического действия препаратов использовали МТТ-тест выживаемости клеток [Mosmann Т., 1983].

Определение апоптотических клеток по окрашиванию ДНК пропидий йодидом (Р1). Апоптозные клетки определяли по методу Nicoletti I. (1991). Суспензию

клеток, окрашенных PI, анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Все измерения сделаны в триплетах со стандартным отклонением не больше 10%.

Определение апоптоза методом TUNEL (terminal dUTP nick-end labeling) проводили с использованием коммерческого набора «In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein» (Boerhringer-Mannheim, Германия) по описанной в руководстве методике для анализа методом проточной цитофлуориметрии.

Выявление апоптотических клеток методом двойного окрашивания с использованием Аннексина V-F1TC и PI. Анализ клеточных популяций апоптотических клеток проводили методом прижизненного двойного окрашивания Аннексином V-FITC в комбинации с PI по методике, приведенной в руководстве (Caltag Lab., США). Клетки анализировали методами проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии. Техническое обеспечение исследований методом флуоресцентной микроскопии осуществлено лабораторией генной терапии (руководитель - д.х.н., проф. Р.И. Жданов) НИИ Биомедицинской химии РАМН; работа выполнена совместно с A.A. Московцевым.

Иммуногистохимическое выявление апоптотических клеток на гистологических срезах методом TUNEL. Из парафинированных блоков готовили

гистологические срезы. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток флуорохромом Hoechst 33342 в сочетании с методом TUNEL проводили в соответствии с протоколом, описанным G.Whiteside и R. Munglani (1998). Для анализа методом световой микроскопии применяли иммунопероксидазное усиление окраски клеток после окрашивания TUNEL с использованием коммерческого набора «In Situ Cell Death Detection, POD» (Boerhringer-Mannheim, Германия). Количественную оценку апоптотических клеток - апоптотический индекс (АИ) - вычисляли по формуле: АИ = число окрашенных клеток / общее количество клеток X 100 %. Статистическая обработка результатов. Статистический анализ проводили с использованием программ "BIOSTAT" (Version 3.2). Достоверность различий в

исследовании оценивали по критерию Стыодента. Различия считали статистически достоверными при р<0,05 [Гланц С.А., 1998].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Индукция апоптоза противоопухолевыми препаратами in vitro.

На модели культивируемых клеток Т-лимфобластоидной линии Jurkat исследованы особенности индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами б зависимости от дозы и времени инкубации.

Известно, что классическим признаком процесса апоптоза является появление на электрофореграммах клеточной ДНК характерной «лестницы», состоящей из фрагментов, кратных 180-200 парам оснований (bp), т.е. мононуклеосоме [Muracami Т. et al., 1995; Wyllie А.Н. et al., 1984]. Подобную картину мы наблюдали при электрофорезе ДНК, выделенной из клеток Jurkat, инкубированных с доксорубицином (0,5 мкг/мл) в течение 24 ч (рисунок 1).

Рисунок 1. Электрофореграмма ДНК, выделенной из интакгных (А) и инкубированных с доксорубицином (0,5 мкг/мл, 24ч) клеток ,1шка1 (Б).

Поскольку целыо настоящего исследования являлось не столько качественное интегральное, сколько количественное популяционное определение

лекарственно-индуцированного апоптоза, то в дальнейшем мы отказались от методики определения фрагментации ДНК.

В настоящей работе применено три различных метода идентификации апоптотических клеток с использованием проточной цитофлуориметрии.

На первом этапе апоптоз регистрировали по выявлению клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК. С этой целью клетки после инкубации с препаратами фиксировали спиртом и окрашивали Р1, затем количественно оценивали клеточную популяцию методом проточной цитофлуориметрии. На рисунке 2 представлены типичные гистограммы доксорубицин-индуцированного апоптоза (0,5 мкг/мл, 24 ч).

« к

Н;

Ю о о

и к :г

Интенсивность флуоресценции (Р1) Рисунок 2. Гистограммы распределения окрашенных Р1 клеток ,1игка1 в контроле и с доксорубицином (0,5 мкг/мл, 24 ч).

Для вычисления специфического апоптоза, индуцированного действием противоопухолевых препаратов, использовали формулу {1}: АРОех - АРОэр

АРОб = ----------------------------------- х 100% {1}

100 - АРОвр

где: АРСЬ - специфический апоптоз - доля клеток в популяции, апоптоз которых специфически индуцирован действием препарата; АРОех - экспериментальный апоптоз - общая доля погибающих клеток (в эксперименте); АРОвр - спонтанный апоптоз - доля погибающих клеток в интактной клеточной культуре (контроль).

Как следует из полученных результатов (рисунок 3), все исследуемые препараты индуцировали апоптоз in vitro пропорционально дозе и времени инкубации.

0.1 0.3 0,5 I

Доксорубицин (мкг/мл)

Цисплатин (мкг/мл)

I 5 10

Этопозид (мкг/мл)

Циклоплатам (мкг/мл)

■24 ч.

■48 ч.

Рисунок 3. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток Ji.irk.at, зарегистрированный по появлению популяции клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК (окрашивание Р1).

В процессе апоптоза под действием эндонуклеаз образуются многочисленные разрывы нитей ДНК и, соответственно, множество 3'- и 5'-свободных концов. Присутствие свободных 3'-концов можно детектировать с помощью метода TUNEL. Под действием фермента терминальной дезоксинуклеотид-трансферазы (TdT) к 3'-концу нити ДНК ковалентно присоединяется дезоксинуклеотидтрифосфат (dUTP), меченый флуоресцентным красителем (FITC). Таким образом, количество присоединившейся метки пропорционально количеству свободных З'-концов, т.е. количеству

внутринитевых разрывов ДНК. На рисунке 4 представлена гистограмма изменения интенсивности флуоресценции клеток 1игка1 после их инкубации с цисплатином. Как следует из данных, представленных на рисунке 5, исследованные препараты индуцировали прогрессивную фрагментацию клеточной ДНК клеток 1игка1 через 24 часа инкубации.

Интенсивность флуоресценции (FITC)

Рисунок 4. Гистограммы интенсивности флуоресценции клеток Jurkat (окрашивание TUNEL), после их инкубации с цисплатином (3 мкг/мл, 24 ч).

1=1

о.

я _s

н ж ох

« 1'

та

о.

-е-

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

0,5

Доксорубнции

■ контроль

5 10 3 12 5 10 12

Этопозид Цисплатин Циклоплатам

Рисунок. 5. Индукция нитевых разрывов ДНК клеток Jurkat противоопухолевыми препаратами - доксорубицином (0,5 мкг/мл), этоиозидом (5 и 10 мкг/мл), цисплатином (3 и 12 мкг/мл), циклоплатамом (5, 10 и 12 мкг/мл) через 24 часа инкубации (окрашивание TUNEL).

В апоптотическнх клетках фосфолнпид фосфатидилсерин (ФС) перемещается на внешнюю сторону плазматической мембраны. Такое перемещение (экстернализацию) можно выявить с помощью

антикоагулянтного белка Аннексина V. В наших исследованиях мы использовали метод прижизненного двойного окрашивания клеток Аннексином У-Р1ТС (экстернализация ФС) в комбинации с Р1 (накопление в ДНК при разрушении ядерной мембраны), который позволяет выявлять популяции клеток на разных стадиях апоптоза. На рисунке 6 представлен этопозид-индуцированный апоптоз (24 ч инкубации). Как видно из таблицы 1, количество интактных (живых) клеток (Р1ТС-/Р1-) значительно уменьшается с увеличением концентрации препарата и времени инкубации. При этом соотношение ранних (Р1ТС+/Р1-) и поздних апоптотическнх (или некротических) клеток (Р1ТС+/Р1+) также зависит от этих параметров.

Контроль 24 ч

Эпюпозид Юмкг/мл

Поздние апоптотнческие или

некротические клетки

Ранние апоптотнческие клетки

* * * »•*.

То'

Аннексии У-Р1ТС

исунок 6. Этопозид-индуцированный апоптоз клеток Лчгка1, регистрируемый етодом двойного прижизненного окрашивания с помощью Аннексина У-Р1ТС комбинации с Р1.

Таблица 1. Количественный анализ популяций клеток 1игка1, инкубированных химиотерапевтическими препаратами (двойное окрашивание - Аппехш\ Р1ТС/Р1).

Препарат (мкг/мл) Живые интактные клетки (%) (FITC-/PI-) Ранние апоптотические клетки (%) (FITC+/PI-) Поздние апоптотические или некротические клетки (%) (FITC+/PI+)

Время инкубации

24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч

Интактный контроль 83+6 85+5 6±3 7±2 8±5 8±4

Доксорубицин - (0,5) 57±3 - 25+4 - 15±2* -

Этопозид-(5) 22±3 4±2 38+4 4±2* 34±5 90±4

Этопозид-(Ю) 8±2 3±1 27+3 2±1 65±7 90±5

Цисплатин - (3) 59±5 21+2 21+2 3+1 18±2* 73±2

Цисплатин-(12) 28±3 3±1 33+3 2±1 36±4 95±3

Циклоплатам - (5) 43+6 7+3 40+4 7±5* 19±3* 81±2

Циклоплатам - (10) 18±2 3±2 42+4 5±4* 36±4 90±3

Циклоплатам - (20) 9±2 - 35±5 - 54±6 -

* р > 0.05, в остальных случаях р < 0.05 по сравнению с интактным контролем.

Сравнительный анализ результатов лекарственно-индуцированного апопто (Таблица 2) показал, что доли апоптотических клеток, выявленных как методе TUNEL, так и Аннексином V-FITC (сумма ранних и поздних апоптотических /и. некротических/ клеток), не имели между собой количественных различий. I почти во всех случаях доля апоптотических клеток, выявляемых этими методам была выше доли гиподиплоидных клеток (окрашивание PI). Проведенш сравнительный анализ подтверждает мнение, что при исследовании апоптс

принципиально важно учитывать особенности различных методов, и по возможности комбинировать методы, выявляющие различные элементарные события эффекторной стадии апоптоза [Darzynkiewicz Z. et al., 1998; Фильченков A.A., 1999].

Таблица 2. Сравнительный анализ лекарственно-индуцированного апоптоза клеток линии Jurkat через 24 часа.

процент апоптоза

Annexin V-FITC

Препарат PI TUNEL (FITC+/PI-)

(п = 5) (п = 3) + (FITC+/PI+) (п =4)

Контроль 24h 11+3 4 ±2 14±2

Доксорубицин (мкг/мл)

0,5 18+5 32±5* 40±3

Этопозид (мкг/мл)

10 55±8 73±3 80±6

Цисплатин (мкг/мл)

12 45+4 55+6 64±7

Циклоплатам (мкг/мл)

5 33+7 43±5* 58±3

10 50±10 73±5 72±7

20 64±5 90±7 93+5

* р > 0.05, в остальных случаях р < 0.05 по сравнению с Р1.

Таким образом, полученные результаты показали, что противоопухолевые препараты доксорубицин, этопозид, цисплатин и циклоплатам эффективно индуцируют процесс гибели клеток Т-лимфобластоидной линии человека 1игка1 по механизму апоптоза в зависимости от концентрации и времени воздействия.

Исследование апоптоза клеток крови и костного мозга больных оикогсматологичсскимн заболеваниями.

Нарушение программы апоптоза лежит в основе патогенеза многих гематологических заболеваний. Для большинства лейкозных клеток характерна их низкая способность к апоптозу. Напротив, повышенный апоптоз клеток костного мозга рассматривают как одну из причин нарушения продукции клеток крови при миелодиспластическим синдроме (МДС). Нами были исследованы образцы периферической крови и/или костного мозга 83 больных онкогематологическими заболеваниями. При этом 37 больных были обследованы до и на фоне лечения. Уровень апоптоза в популяции лейкозных клеток оценивали по выявлению клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК (окрашивание Р1).

В исследуемую группу вошли больные острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), острым миелобластным лейкозом (ОМЛ), хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ) и МДС.

Уровень спонтанной фрагментации ДНК в бластных клетках костного мозга детей, больных ОЛЛ, до лечения составил 1,42±0,3 % (п = 19). На фоне проведения специфической терапии доля апоптотических клеток увеличивалась до 34,6±7,3 % (п = 10, р=0,001). Максимальная индукция апоптоза зафиксирована у двух больных с пре-пре-В вариантом ОЛЛ - 87,0 и 94,5 %.

У больных ОМЛ уровень спонтанного апоптоза клеток костного мозга составил 3,7±1,6 % (п=5). На фоне лечения количество апоптотических клеток оставалось на уровне спонтанного апоптоза (4,4±2,7 %, п = 3, р=0,654).

В группе больных ХЛЛ спонтанный апоптоз клеток крови и костного мозга до лечения составил 1,38±0,6 % (п=21) и 3,7±1,2 % (п=7) соответственно. На фоне лечения эти параметры возрастали до 11,1±1,7 % в клетках крови (п = 6, р= 0,002] и до 50,3±20,1 % в клетках костного мозга (п = 3, р = 0,001).

Группа больных МДС включала следующие подгруппы: 13 больных -

рефрактерной анемией (РА); 16 — РА с избытком бластов (РАИБ). В дебюте

заболевания в группе больных РА апоптотические события обнаружены в

20,1 ±4,3 % клетках костного мозга (п=13). На фоне терапии происходило снижение доли апоптотических клеток до 13,5+4,7 % (п = 8, р = 0,004). Аналогичная динамика зафиксирована в группе больных РАИБ. Апоптотические события выявлены в 19,1 ±2,3 % (п=16) клеток костного мозга до и в 6,6±1,2 % на фоне терапии (п = 8, р = 0,001).

Альтернативным методом исследования апоптоза при МДС считают метод TUNEL. В первом варианте нами был выбран протокол окрашивания клеток флуорохромом Hoechst 33342 в сочетании с методом TUNEL применительно к трепанбиоптатам костного мозга больных МДС. В данном исследовании были использованы 12 трепанбиоптатов. Апоптотические клетки идентифицировали методом флуоресцентной микроскопии. В каждом случае препараты оценивали по двум показателям. При возбуждающем УФ-свете регистрировали голубую флуоресценцию ДНК-содержащих фрагментов клеточных ядер, окрашенных флуорохромом Hoechst 33342. Зеленая флуоресценция (FITC) тех же фрагментов свидетельствовала о наличии в этих ядрах нитевых разрывов ДНК (окрашивание TUNEL); такие клетки учитывали как апоптотические. При отсутствии зеленой флуоресценции (FITC) клетки оценивали как интактные. Результаты исследований показали, что в группе больных с диагнозом РА апоптотический индекс (АИ) колебался от 10 до 50 % (Ме=30, п=5). В группе больных РАИБ и РАИБт АИ колебался от 4 до 30 % (Ме=10, п=7). Статистический анализ средних значений степени апоптоза выявил увеличение показателя АИ у больных РА до 29,0 ± 14,3 % по сравнению с группой больных РАИБ и РАИБт 11,3 ± 9,1 % (р<0,05).

Во втором варианте метода при исследовании апоптоза был использован протокол метода TUNEL с пероксидазным колориметрическим окрашиванием, что позволило оценить морфологическую картину и определить, к какому ростку гемопоэза относятся апоптотические клетки. По этой методике проведено исследование 24 трепанбиоптатов костного мозга, из них 16 - от больных МДС. Контрольную группу составили больные лимфогранулематозом (ЛГМ, п=5) и острыми нелимфобластными лейкозами (ОНЛЛ, п=3). В результате проведенных исследований в группе больных РА в апоптоз были вовлечены в основном

молодые клетки миелоидного и в меньшей степени эритроидного ряда, АИ колебался от 10 до 60 % (Ме-20 %, п=8). У больных РАИБ апоптотические клетки были представлены молодыми миелоидными клетками, клетками эритроидного ряда и мегалобластами. АИ в группе больных РАИБ и РАИБт колебался от 4 до 28 % (Ме-9 %, п=8). В контрольной группе больных (ЛГМ и ОНЛЛ) в апоптозе находились также молодые клетки гемопоэза, АИ составил от 2 до 30 % (Ме-6 %, п=8).

Статистический анализ средних значений степени апоптоза выявил увеличение показателя у больных РА до 25,38 + 6,9 % по сравнению с контрольной группой больных (ОНЛЛ и ЛГМ) - 9, 55 ± 5,45 % (р<0,05). В группе больных РАИБ и РАИБт отмечено снижение доли апоптотических клеток до 13,88 ± 3,8 % (р=0,105) по сравнению с контрольной группой больных. Между группами РА и РАИБ выявлены статистически достоверные различия значения степени апоптоза (р < 0,05).

Таким образом, результаты, полученные методом проточной цитофлуориметрии, показали, что в лейкозных клетках больных ОЛЛ, ОМЛ, ХЛЛ уровень спонтанного апоптоза низкий, тогда как в клетках костного мозга больных МДС наблюдается высокий уровень. Специфическая терапия способствует статистически значимому увеличению доли апоптотических клеток в группе больных ОЛЛ и ХЛЛ, тогда как при МДС терапия приводила к снижению количества апоптотических клеток по сравнению с уровнем спонтанного апоптоза, обнаруживаемого в дебюте заболевания. Применение двух вариантов метода TUNEL на трепанбиоптатах показало, что в различных подгруппах больных МДС уровень апоптоза клеток костного мозга разный, максимальные значения апоптоза выявлены в группе больных РА, что коррелирует с данными зарубежных исследователей [Raza A. et al., 1995; Bouscary D. et al., 1997]. Методы идентификации апоптоза могут быть использованы для качественной и количественной оценки эффективности назначаемой терапии у больных онкогематологическими заболеваниями.

Исследование возможной роли CD95 рецепторно-лигандной системы в лекпрственпо-нпдуцированном апопгозе.

Установлено, что CD95 рецепторно-лигандная система играет важную роль не только в гибели лимфоидных и нелнмфоидных клеток, но и является одним из критических компонентов лекарственно-индуцированного апоптоза. Показано, что F(ab')2 фрагменты МКА против антигена CD95 (АРО-1) с изотипом IgG3 могут блокировать лекарственно-индуцированный апоптоз в различных опухолевых клетках [Dhein J. et al., 1995; Friesen С. et al., 1996]. Известно, что противоопухолевые препараты индуцируют экспрессию лиганда CD95 (CD95L) на поверхности опухолевых клеток с последующим активированием С095-рецепторно-лигандной системы на пара- или аутокринном уровне.

В нашем исследовании мы использовали F(ab')2 фрагменты, полученные из эффекторных МКА к антигену CD95 (IPO-4) с изотипом IgM. В качестве контрольных использованы F(ab')2 фрагменты, полученные из МКА ICO-175 (IgM) против антигена CD15. Клетки линии Jurkat преипкубировалн с F(ab')3 фрагментами aHTH-CD95 (IPO-4) в течение 1ч (0,01 мкг/мл), затем в среду роста клеток вносили противоопухолевые препараты. Апоптоз оценивали методом проточной цитофлуориметрии по выявлению клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК. Обнаружено, что F(ab')2 фрагменты aiiTii-CD95 (IPO-4) блокировали доксорубицпн- и этопозид-индуцированный апоптоз в течение 24 ч. (рисунок 7). Так, если доксорубицин в концентрации 0,5 мкг/мл индуцировал апоптоз 40±5 % клеток, то после преинкубации с F(ab')2 фрагментами анти-CD95 (IPO-4) доля клеток в состоянии апоптоза уменьшалась до 20±3 % (п=3, р<=0,001). Этопозид в концентрации 1 мкг/мл индуцировал апоптоз 35+5 % клеток, но после преинкубации с F(ab')2 фрагментами anrii-CD95 (IPO-4) количество апоптотических клеток уменьшалось до 10±4 % (р<=0,005). Однако F(ab'), фрагменты aimi-CD95 (IPO-4) не блокировали цпсплатпн - и циклоплатам-индуцированный апоптоз. Контрольные F(ab')2 фрагменты МКА ICO-175 в концентрации 0, 01 мкг/мл не блокировали доксорубицин- и этопозид-

индуцированный апоптоз: доля апоптотических клеток не зависела от преинкубации с химиопрепаратами.

ЛчЛУ

• V • - ;

Доксорубицин 0,5 мкг/мл

EEZZL

I препарат

□ препарат + контр. F(ab')2 aiiTH-CD15

□ препарат + F(ab')2 анти-CD95

Этопозид 1 мкг/мл

Рисунок 7. Эффект блокирования лекарственно-индуцированного апоптоза F(ab')2 фрагментами aiiTii-CD95 (IPO-4) МКА.

Методом проточной цитофлуориметрии мы исследовали экспрессию CD95L на поверхности клеток Jurkat, обработанных доксорубицином (0,5 мкг/мл), этопозидом (1 мкг/мл) или циклоплатамом (10 мкг/мл) в течение 4 часов. В качестве положительного контроля клетки активировали форболовым эфиром (РМА, 10 нг/мл) в комбинации с кальциевым ионофором - иономицином (1 мкг/мл). Было выявлено, что CD95L экспрессировался на поверхности 50+16 % (п=4) клеток Jurkat после активации РМА в сочетании с иономицином. После инкубации с этопозидом CD95L экспрессировался на 20 + 5 % клетках (п=2) (рисунок 8). Экспрессия CD95L на поверхности клеток Jurkat после инкубации с доксорубицином и циклоплатамом не обнаружена. Полученные результаты показывают, что лекарственно-индуцированный апоптоз не всегда приводит к появлению CD95L на поверхности клеток Jurkat.

Контроль 4 ч.

РМЛ + иономицин

Этопозид 1 м кг/мл

63 %

Рисунок 8. Экспрессия CD95L на поверхности клеток Jurkat.

Таким образом, F(ab')2 фрагменты aiiTii-CD95 (IPO-4) МКА могут блокировать этопозид - и доксорубицин-нндуцированный апоптоз клеток Jurkat. Обнаружена экспрессия CD95L на поверхности клеток Jurkat, обработанных этопозидом. Полученные результаты позволили предположить, что противоопухолевые препараты могут индуцировать апоптоз через систему CD95/CD95L, что согласуется с данными зарубежных авторов [Krammer Р-Н. et al„ 1994; Fulda S. et al., 2000].

Предполагается, что отсутствие или пониженная экспрессия CD95 на

поверхности опухолевых клеток ассоциирована с резистентностью к

противоопухолевым препаратам [Friesin С. et al., 1996; Boesen-de Cock J.G.R., et

al., 1999]. Для получения С095-дефицитного варианта линии Jurkat мы

применили метод клеточной селекции с использованием эффекторных МКА к

антигену CD95. В настоящем исследовании в качестве исходного клеточного

материала использовали родительскую линию Jurkat (далее по тексту - линия

«дикого» типа - Jurkat/WT), а в качестве селективного агента - эффекторные

МКА aiiTii-CD95 (клон IPO-4). В результате проведенной селекции получена

клеточная линия, условно названная нами Jurkat/A4. Обнаружено, что клетки

этой линии в полной мере сохранили иммунологический фенотип Т-клеточного

лейкоза, присущий родительской линии Jurkat/WT, за исключением антигена

CD95. В противоположность клеточной линии Jurkat/WT, клетки которой

экспрессируют антиген CD95 (50-80 %), доля CD95+ клеток линии Jurkat/A4

оказалась 4±2 %. Иммунологический фенотип устойчиво воспроизводился в

течение 10 мес культивирования. Таким образом, в результате С095-зависимой

селекции, создана линия Т-лимфобластоидных клеток Jurkat/A4, дефицитная по

С095-рецепторноп системе. Сравнительный анализ индукции апоптоза клеток линий ,1игка1ЛУТ и 1игка)УЛ4 противоопухолевыми препаратами доксорубицином (0,5 мкг/мл), этопозидом (10 мкг/мл) и циклоплатамом (10 мкг/мл) показал, что через 24 ч инкубации с препаратами клетки ,1игка1/А4, в отличие от линии .ГигкаС/ХУТ, не вступают в процесс апоптоза; через 48 ч по критерию появления клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК регистрируется минимально значимый уровень индукции специфического

_ антн-С095 ■ (1РО-4) МКА

0,1 мкг/мл ц Доксорубшшн 0, 5 мкг/мл

^ Этопозид 10 мкг/мл

д Цнклоплатам Юмкг/мл

Рисунок 9. Лекарственно-индуцированный апоптоз клеток Дигка^ХУТ и ,1игка(/А4, регистрируемый по появлению популяции клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК (окрашивание Р1).

Аналогичные результаты получены при анализе клеточных популяций методом прижизненного двойного окрашивания Аннексином У-РП'С в комбинации с Р1. Соотношение долей (субпопуляций) живых, ранних и поздних апоптотических (или некротических) клеток достоверно изменялось в зависимости от времени инкубации клеток Зигка^Т с препаратами, тогда как эти же показатели клеток линии .1игка1/А4 оставались на уровне интактного контроля. Исследования цитотоксического действия препаратов с помощью МТТ-теста показали, что клеточная линия .1игка1/\\ПГ чувствительна к используемым препаратам (24 ч), тогда как уровень выживаемости клеток линии

апоптоза (5-9 %) (рисунок 9).

60 Л

а •е-

Дигка^Т Ьгка^Т Ьгка1/А4 Ьгка1/А4

24 ч.

48 ч.

24 ч.

48 ч.

игка(/А4 оставался на уровне интактного контроля. Через 48 ч и 72 ч ыживаемость клеток 1игка1/А4 уменьшалась, но при этом значительно ревышала выживаемость клеток линии ^гка^ХУТ (рисунок 10).

Время, час

Контроль 1игка1/А4 .Тигкя1/\УТ

дсунок 10. Влияние противоопухолевых препаратов на выживаемость клеток пшй .Гигка^УТ и 1игка1/А4. Цнтотоксическое действие препаратов оценивали помощью МТТ - теста, р < 0.05 между линиями Мка^ХУТ и 1игка1/А4.

Таким образом, полученная нами клеточная линия 1игка1/А4 является :зистентной к воздействию не только агонистических МКА антп-СП95 (1РО-4), ) и противоопухолевых цитостатиков разных классов, которые эффективно 1дуцируют апоптоз клеток родительской линии .ГигкаМУТ.

Можно предположить, что причиной резистентности клеток линии ка1/А4 к противоопухолевым препаратам является не только их неспособность Ю95-индуцированному апоптозу, но и возможное нарушение молекулярных санизмов, необходимых для внутриклеточной трансдукции сигнала апоптоза I выполнения его терминальных стадий.

выводы

1. Противоопухолевые препараты доксорубицин, этопозид, цисплатин и циклоплатам эффективно индуцируют процесс гибели клеток Т-лимфобластоидной линии человека 1игка1 по механизму апоптоза.

2. Индукция апоптоза клеток линии ]игка1 доксорубицином, этопозидом, цисплатином и циклоплатамом зависит от концентрации последних и/или времени инкубации клеток с цитостатиками.

3. Р(аЬ')2 фрагменты моноклональных антител анти-СБ95 (1РО-4) блокируют доксорубицин - и этопозид-индуцированный апоптоз клеток ,1игка1.

4. Получена клеточная линия 1игка1/А4, дефицитная по С095-рецептору, которая резистентна к С095-опосредованному апоптозу, вызываемому агонистическими моноклональными антителами анти-СБ95 (1РО-4).

5. Клеточная линия 1игка1/А4 является резистентной к противоопухолевым препаратам разных классов (доксорубицин, этопозид, цисплатин и циклоплатам), индуцирующих апоптоз клеток родительской линии 1игка1/\\Т в тех же концентрациях.

6. При миелодиспластическом синдроме наблюдается высокий уровень (до 60 %) спонтанного апоптоза клеток костного мозга, в то время как при гемобластозах уровень спонтанного апоптоза лейкозных клеток низкий (менее 8 %). Специфическая терапия этих заболеваний приводит к снижению количества апоптотических клеток при миелодиспластическом синдроме (менее 10 %) и, напротив, к повышению при остром лимфобластном лейкозе (до 40 %) и хроническом лимфоцитарном лейкозе (до 70%).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sokolovskaya A. A., Blokhin D.Yu., Zabotina T.N., Baryshnikov A.Yu. Activation of programmed cell death (apoptosis) by doxorubicin, cisplatin in Jurkat T-lymphocytes // Abstracts Eight International Congress on Anti-Cancer Treatment.-Paris, February 3-6, 1998. - p. 193, P226.

2. Соколовская A.A., Барышников A.10., Блохин Д.Ю., Терещенко C.H., Степанова Е.В., Заботина Т.Н. Исследование роли CD95 рецептор-лигандной системы в лекарственно-индуцированном апоптозе // Тезисы докладов V Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 21-25 апреля 1998 г. - С.200.

3. Sokolovskaya A.A., Blokhin D.Yu., Stepanova E.V., Zabotina T.N., Kadagidze Z.G., Baryshnikov A.Yu. Investigation drug-induced apoptosis in vitro // Abstracts 10th NCI-EORTC symposium on new drugs in cancer therapy. - Amsterdam, June 16-19, 1998.-p.I14, 437.

4. Соколовская A.A., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю., Барышников АЛО. Лекарственно-индуцированный апоптоз // Тезисы докладов симпозиума -«Биологические основы терапии онкогематологнческих заболеваний у детей» Москва, 5-6 февраля 1999 г. - С.43.

5. Соколовская А.А., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю., Барышников А.10. Идентификация лекарственно-индуцированного апоптоза в лейкозных клетках // Медицинская иммунология - Т. 1. -№ 3-4. -1999. - С. 109-110.

6. Baryshnikov A.Yu., Sokolovskaya A.A., Blokhin D.Yu., Zabotina T.N., Kadagidze Z.G. Programmed cell death and response to anti-cancer drugs // European J. of Pharmaceutical Sciences. -2000. -Vol.11. - S105, P0218.

7. Соколовская А.А., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Противоопухолевые препараты в лекарственно-индуцированном апоптозе // Материалы 5 Всероссийского съезда онкологов «Высокие технологии в онкологии». - Казань, 4-7 октября. -2000. - Т. 1. -С. 220-221.

8. Sokolovskaya А.А., Zabotina T.N., Blokhin D.Yu., Kadagidze Z.G., Baryshnikov A.Yu. Comparative analysis of apoptosis induced various anticancer drugs in Jurkat cells // Experimental Oncology. - 2001. - Vol.23. - № 1. - P.46-50.

9. Bakhutashvili A.V., Jaguzhinsky L.S., Bakhutashvili I.V., Kadagidze Z.G., Baryshnikov A.Yu., Sokolovskaya A. A., Zabotina T.N., Bakhutashvili V.I. Amnion Apoptosis Modulator// Int. J. Immunorehabil. - 2001. -Vol.3. -№ 2. -p. 1722.

Ю.Соколовская А.А., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю., Панкина Т.Н., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. CD95(APO-l/Fas) рецепторно-лигандная система и лекарственно-индуцированный апоптоз в клетках Jurkat // Тезисы докладов симпозиума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2001» 21-25 мая 2001, в журнале «Медицинская иммунология». -2001. — Т.1. -№ 3. -С. 278.

11.Заботина Т.Н., Соколовская А.А. Оценка спонтанного и индуцированного апоптоза у больных с гемобластозами. Тезисы докладов симпозиума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге-2001» 21-25 мая 2001, в журнале «Медицинская иммунология». -2001. - Т. 1. -№ 3. -С. 267.

12-Кохно А.В., Савченко В.Г., Паровнчникова Е.Н., Харазишвили Д.И., Соколовская А.А., Лукашнна М.И., Барышников АЛО. Апоптоз и пролифератнвная активность клеток костного мозга у больных с апластическими синдромами по данным трепанобиоптатов // Терапевтический архив. -2001. -Т.73. -№ 7. -С.51-56.

13.Blokhin D.Yu., Sokolovskaya А.А., Zabotina T.N., Inshakov A.N., Kadagidze Z.G., Baryshnikov A.Yu. A new CD95-deficient cell line resistant to drug-induced apoptosis. Abstracts 18th International Symposium on Molecular aspects of chemotherapy. - Gdansk, Poland, September 5-9, 2001. -p.121, No55.

И.Соколовская А.А., Заботина Т.Н., Блохин Д.Ю., Иншаков A.H., Михайлов А.Д., Кадагидзе З.Г., Барышников АЛО. С095-дефицитные клетки сублинии Jurkat/A4, устойчивые к лекарственно-индуцированному апоптозу. Экспериментальная онкология. - 2001. - Т.23. -№ 3. - С. 174-180.

Участок множительной техники РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

Заказ 291 • Тираж 100 экз.

Оглавление диссертации Соколовская, Алиса Анатольевна :: 2001 :: Москва

Список сокращений

Введение 4 Часть I. Обзор литературы

Глава 1. Пути трансдукции сигнала апоптоза в клетке

Глава 2. Лекарственно-индуцированный апоптоз

Глава 3. Характеристика методов регистрации апоптоза

Часть II. Собственные исследования

Глава 1. Материалы и методы

Глава 2. Индукция апоптоза противоопухолевыми препаратами in vitro

Глава 3. Исследование апоптоза клеток крови и костного мозга больных онкогематологическими заболеваниями

Глава 4. Изучение возможной роли CD95 рецепторно-лигандной системы в лекарственно-индуцированном апоптозе

Обсуждение

Выводы

Введение диссертации по теме "Онкология", Соколовская, Алиса Анатольевна, автореферат

Актуальность темы

В настоящее время под апоптозом понимают всю совокупность последовательных и необратимых морфо-физиологических и молекулярно-биологических процессов механизма программированной гибели клетки. Апоптоз является активным, генетически контролируемым процессом поддержания клеточного гомеостаза органов и тканей путем уничтожения ненужных или потенциально опасных клеток, таких, как вирус-инфицированные, облученные или онкотрансформированные клетки (Ярилин А.А., 1996; Барышников А.Ю. и др., 1996; Raff М.С., 1992; Williams G.T. et al., 1993; Vaux D.L. et al., 1994; Wyllie A.H. 1993; Meier P. et al., 2000).

Молекулярные механизмы программированной гибели клетки (апоптоза) стали в последние годы предметом интенсивных исследований. Несмотря на большое количество экспериментальных данных, механизмы этого процесса до сих пор остаются не исследованными. Не до конца выяснена регуляция апоптоза отдельных клеток в многоклеточном организме. Актуальность проблемы определяется взаимосвязью нарушения регуляции процесса программированной гибели клетки с патогенезом многих заболеваний.

Для программированной гибели клетки закрепился термин - «апоптоз» (от греческого слова «apoptosis» - опадание листьев с деревьев). Исторически сложилось так, что термин «апоптоз» первоначально использовался для обозначения морфологических проявлений заключительных этапов программированной гибели клеток (конденсация и фрагментация хроматина, солюбилизация компонентов ядерной мембраны, образование псевдоподий, деградация клетки с образованием апоптотических телец и пр.) (Lockhin R.A. & Williams С.М., 1965; Kerr J.F.R. etal., 1972; Wyllie A.H. et al., 1984).

К заболеваниям, связанным с усилением апоптоза, относят СПИД, болезнь Альцгеймера, миелодиспластический синдром, токсическую дистрофию печени, ишемические повреждения разных органов и др. В противоположность этому, торможение апоптоза определяет вирусные, аутоиммунные и онкологические заболевания (Фильченков А.А. 1998; Raff М.С. 1993; Thompson С.В. 1995; Thatte U. & Dahanukar S. 1997; Engler R.L. et al., 1998).

Феномен апоптоза рассматривают как специфическую реакцию клеток на действие различных факторов экзо - и эндогенной природы. Первыми могут выступать различного рода воздействия (радиация, токсические агенты, гипер- и гипотермия, образование свободных радикалов и др.), вызывающие «генетический стресс» клеток. К регуляторным факторам эндогенной природы относят факторы роста, цитокины, гормоны, белки из семейства TNF со своими специфическими рецепторами (Белушкина Н.Н. и др., 1998; Gorman A. et al, 1997; Schulze-Osthoff К. et al., 1998; Peter M.E and Krammer P-H. 1998). Сейчас установлено, что многие противоопухолевые агенты (ингибиторы топоизомераз I и II, ДНК-активные препараты, гормоны) действуют, индуцируя апоптоз клеток-мишеней. (Dive С. et al., 1991; Williams G.T. 1991; Hannun Y. 1997; Makin G. et al., 2000). Однако механизмы индукции апоптоза противоопухолевыми препаратами мало изучены.

Открытие трансмембранного CD95(Fas/APO-l) рецептора и его лиганда (CD95L) позволило по-новому взглянуть на молекулярные механизмы лекарственно-индуцированного апоптоза. Предполагается, что CD95 рецепторно-лигандная система является критическим компонентом лекарственно-индуцированного апоптоза (Los М. et al., 1997; Friesen С. et al 1997; Fulda S. et al 1998a, 1998b). Взаимоотношения компонентов сигнальных путей CD95/CD95L- и лекарственно-индуцированного апоптоза может иметь не только фундаментальное, но и практическое значение в разрешении проблемы резистентности опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам. Поэтому изучение роли CD95(Fas/APO-l) - рецепторно-лигандной системы в лекарственно-индуцированном апоптозе является актуальной и перспективной задачей в поиске новых методов и средств противоопухолевой терапии.

В настоящей работе проведено исследование феномена лекарственно-индуцированного апоптоза и его возможных молекулярных механизмов с применением комплекса современных методов.

Цель работы

Целью работы явился сравнительный анализ индукции апоптоза различными противоопухолевыми препаратами, а также исследование возможной роли СБ95-рецепторно-лигандной системы в механизме лекарственно-индуцированного апоптоза.

Задачи исследования

1. Оптимизация условий индукции и регистрации апоптоза, вызванного противоопухолевыми препаратами in vitro.

4. Выяснение возможной роли СБ95-рецепторно-лигандной системы в механизме лекарственно-индуцированного апоптоза.

Научная новизна

Подтверждены результаты исследований ряда авторов по изучению индукции апоптоза клеток линии Jurkat противоопухолевыми препаратами разных классов. Впервые показана способность отечественного противоопухолевого препарата платины II поколения - циклоплатама -индуцировать апоптоз клеток линии Jurkat. Исследован апоптоз клеток крови и костного мозга, больных онкогематологическими заболеваниями до и в процессе проведения специфической терапии. Методом негативной селекции получена уникальная С095-дефицитная линия клеток Jurkat/A4. Выявлено, что клеточная линия Jurkat/А4 является резистентной не только к CD95-опосредованному апоптозу, но и к противоопухолевым препаратам различного механизма действия.

Научно-практическая значимость

Унифицированная методика индукции апоптоза in vitro может найти применение для скрининга новых соединений и веществ с потенциальной противоопухолевой активностью и изучения их механизмов действия. Используемые методы идентификации апоптоза клеток крови и костного мозга больных онкогематологическими заболеваниями могут быть использованы для качественной и количественной оценки эффективности назначаемой терапии. Полученная С095-дефицитная клеточная линия Jurkat/А4 может явиться уникальной моделью для изучения молекулярных механизмов внутриклеточной трансдукции апоптотического сигнала и скрининга веществ, цитостатическое действие которых не связано с индукцией апоптоза.

Заключение диссертационного исследования на тему "CD95-рецепторно-лигандная система в лекарственно-индуцированном апоптозе"

выводы

1. Противоопухолевые препараты доксорубицин, этопозид, цисплатин и циклоплатам эффективно индуцируют процесс гибели клеток Т-лимфобластной линии человека Jurkat по механизму апоптоза.

2. Индукция апоптоза клеток линии Jurkat доксорубицином, этопозидом, цисплатином и циклоплатамом зависит от концентрации последних и/или времени инкубации клеток с цитостатиками.

3. F(ab')2 фрагменты моноклональных антител aHTH-CD95 (IPO-4) блокируют доксорубицин - и этопозид-индуцированный апоптоз клеток Jurkat.

4. Получена клеточная линия Jurkat/А4, дефицитная по СВ95-рецептору, которая резистентна к С095-опосредованному апоптозу, вызываемому агонистическими моноклональными антителами aHTH-CD95 (IPO-4).

5. Клеточная линия Jurkat/A4 является резистентной к противоопухолевым препаратам разных классов (доксорубицин, этопозид, цисплатин и циклоплатам), индуцирующих апоптоз клеток родительской линии Jurkat/WT в тех же концентрациях.

6. При миелодиспластическим синдроме наблюдается высокий уровень (до 60 %) спонтанного апоптоза клеток костного мозга, в то время как при гемобластозах уровень спонтанного апоптоза лейкозных клеток низкий (менее 8 %). Специфическая терапия этих заболеваний приводит к снижению количества апоптотических клеток при миелодиспластическим синдроме (менее 10 %) и, напротив, к повышению при остром лимфобластном лейкозе (до 40 %) и хроническом лимфоцитарном лейкозе (до 70 %).

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2001 года, Соколовская, Алиса Анатольевна

1. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников Н.Н., Кушлинский Н.Е. Система Fas-FasL в норме и патологии // Вопросы биолог, мед. и фарм. химии. -1998. -№ 4. -С.15-23.

2. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. FAS / АРО-1- антиген молекула, опосредующая апоптоз // Гематол. и трансфузиол. -1995. -т. 40. - № 6. -С.35-38.

3. Белоусова А.К. Молекулярно-биологические подходы к терапии опухолей, М.: ВИНИТИ, 1993. -208 с.

4. Белушкина Н.Н., Хасан Хамад Али, Северин С.Е. Молекулярные основы апоптоза // Вопросы биолог, мед. и фарм. химии. -1999. -№ 3. -С.3-16.

5. Блохин Н.Н., Переводчикова Н.И. Химиотерапия опухолевых заболеваний, М.: Медицина, 1984. -304 с.

6. Гланц С. А. Медико-биологическая статистика, М.: Практика, 1998. -459 с.

7. Животовский Б.Д., Хансон К.П. Сб. Биополимеры и клетка, 1985. -вып 1, №4,- С. 199-203.

8. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия. -2000.-т.65.-вып. 1. -С.34-37.

9. Программированная клеточная гибель // Под ред. проф. В.С.Новикова. -СПб.: Наука, 1996.-276 с.

10. Н.Солнцева Т.И. Влияние циклоплатама на мембранные свойства опухолевых клеток: Р-адренергические рецепторы и адгезия на пластике // Циклоплатам: Сб. научн. тр./-М.: ОНЦРАМН, 1993.-С. 100-106.

11. Стручков В.А. Механизм действия циклоплатама на структуры ДНК опухолевых клеток // Циклоплатам: Сб. научн. тр. / М.: ОНЦ РАМН, 1993.-С. 90-99.

12. Тронов В.А., Коноплянников М.А., Никольская Т.А., Константинов Е.М. Апоптоз нестимуллированных лимфоцитов человека и разрывы ДНК, индуцированные ингибитором топоизомеразы II этопозидом // Биохимия. -1999. -т.64. -вып. 3. -С.412-420.

13. Фильченков А.А. Современные представления о роли апоптоза в опухолевом росте и его значении для противоопухолевой терапии // Эксперим. онкол. -1998. -№20. -С.259-270.

14. Фильченков А.А., Стойка Р.С. Апоптоз и рак, К.: Морион, 1999. -184 с.

15. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью // Биохимия. -2000. -т.65. -вып. 1. -С.34-37.

16. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. -1996. -№6. С. 10-23.

17. Adachi S., Gottlieb R.A. and Bernand M. Lack of release of Cytochrome с from mithondria into cytosol early in the course of Fas-mediated apoptosis of Jurkat cells //J Biol Chem 1998. -V.273. -P. 19892-19894.

18. Ahmad ES., Srinivasula SM., Wang L. at el. CRADD, an novel human apoptotic molecule for caspase-2, and FasL/tumor necrosis factor receptor-interacting protein RIP // Cancer Res. -1997.-V.57.-P.615-619.

19. Alnemri, E.S., Livingston, D.J., Nicholson, D.W., Salvesen, G., Thornberry, N.A., Wong, W.W., and Yuan, J. Human ICE/CED-3 protease nomenclature // Cell.-1996. -V.87. -P. 171.

20. Althaus F.R. & Richer C. ADP-ribosylation of proteins. Ezimology and biological significance // Mol.Biol.Biohem.Biophys. -1987.-V.37.-P.1-126.

21. Ambrosini G., Adida C. & Altieri D. A novel antiapoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma//Nat.Med.-1997.-V.3.-P.917-921.

22. Ashkenasi A. & Dixit V.M. Death receptors: signaling and modulation //

23. Science. 1998. - Vol.281. - P.1305-1308.

24. Barry M.A, Behnke C.A. and Eastman A. Activation of programmed cell death (apoptosis) by cisplatin, other anticancer drugs, toxins and hyperyheremia // Biochem. Pharmacol. -1990. -Vol.40. -P.2353-2362.

25. Basa A, Teicher B.A. & Lazo J.S. Involvement of protein kinase С in phorbol ester-induced sensitization of HeLa cells to cis-diamminedichloroplatinum (II) //J.Biol.Chem. 1990. - Vol.265. - P.8451-8457.

26. Basco Z, Everson B.R. and Eluason J. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells are highly fragmented. Cancer Research; 2000. 60: 4623-4628.

27. Bates S. & Vousden K.H. p53 in signaling checkpoint arrest or apoptosis // Curr. Opin. Genet. Dev.- 1996. Vol.6. - P.12-19.

28. Bellgrau D, Gold D, Selawry H. et al. A role for CD95 ligand in preventing graft rejection // Nature. 1995. - Vol.377. - P.630-632.

29. Bennet M, Macdonald K, Chan S.W. et al. Cell surface trafficking of Fas: a rapid mechanism of p53-mediated apoptosis // Science. -1998. -Vol.282. -P.290-293.

30. Bennet M.W, O'Connell J, O'Sullivan G.C, et al. Expression of Fas ligand by human gastric adenocarcinomas: a potential mechanism of immune escape in stomach cancer// GUT. 1999. - Vol.44. - P.156-162.

31. Bodmer J.L, Burns K, Schnaider P. TRAMP, a novel apoptosis -mediating receptor with sequence homology to tumor necrosis factor receptor 1 and Fas (APO-1/CD95) // Immunity. -1997. -Vol.6. -P.79-88

32. Boldin, M.P., Varfolomeev E.E., Pancer Z, et al. A novel protein that interacts with the death domen of Fas/APO-1 contains a sequence motif related to the death domain // J.Biol.Chem. 1995. -Vol.270. -P.7795-7798.

33. Bossy-Wetzel, E., Green D.R. Caspases induced Cytohrome с release from mitochondria by activating cytocolic factors //J.Biol.Chem. -1999. -Vol.274.-P.17484-17490.

34. Bouscary D., De Vos J., Guesnu M. et al. Fas/APO-1 (CD95) expression and apoptosis in patients with myelodysplastic syndromes // Leukemia. -1997. -Vol.11.-P.839-845.

35. Brunner Т., Yoo N.J., Griffith T.S., Ferguson T.A., Green D.R. Regulation of CD95 ligand expression: a key element in immune regulation? // Behring Inst. Mitt. -1996. -Vol.97. -P161-174.

36. Buckbinder L., Talbott R., Valesco-Miguel S., et al. Induction of the growth inhibitor IGF-binding protein 3 by p53 //Nature. -1995. -Vol.377. -P.646-649.

37. Buzyn A., Petit F., Ostankovitch M., et al. Membrane-bound Fas (Apo-l/CD95) ligand on leukemic cells: a mechanism of tumor immune escape in leukemia patients //Blood. 1999. - Vol.94. - P.3135-3140.

38. Calabresi P. and Chabner B.A. Chemotherapy of neoplastic diseases // In Pharmacological Basis of Therapeutics, Eight Edition. -1990. -P.1202-1263.

39. Chaudhary P.M., Eby m., Jasmin A. Et al. Death receptor 5, a new member of the TNFR-1 family, and DR4 induce FADD-dependent apoptosis and activated the NF-кВ pathway // Immunity. -1997. -Vol.7. -P.821-830.

40. Chautan M., Chazal G., Cecconi F., Gruss P., and Golstein P. Interdigital cell death can occur through a necrotic and caspase independent pathway // Current

41. Biology 1999. - Vol.9. - P.967-970.

42. Chen G.L., Yang L., Rowe R.C. et al. Nonintercalative antitumor drugs interfere with the breakage-reunion reaction of mammalian DNA topoisomerase II // J. Biol. Chem. 1984. -Vol.259. - P.l3560-13566.

43. Chinnaiyan A.M, Orth K, O'Rouke K, Duan H, Poirier GG, Dixit VM: Molecular ordering of the cell death pathway // J Biol Chem.-1996b. -Vol.271. -P.4573-4582.

44. Chinnaiyan A.M., O'Rourke K., Tewari M & Dixit VM. FADD, a novel death-containing protein, interacts with the death domain of Fas and initiates apoptosis // Cell. -1995. -Vol.81. -505-512.

45. Chinnaiyan A.M., O'Rourke K., Yu G.L. Signal transduction by DR3 a death domain-containing receptor related to TNF-1 and CD95 // Science. -1996a. -Vol.274. -P.990-992.

46. Chou J.J., Li H., Salvesen G.S. et al. Solution structure of BID, an intracellular amplifier of apoptotic signaling. // Cell. -1999. -Vol.96. -615-624.

47. Chresta C.M., Arriola E.L., Hickman J.A. Apoptosis and cancer chemotherapy // Behring Inst Mitt, PL Web. -1996. (Document 97). - P.232-240.

48. Cohen, G.M. Caspases: the executioners of apoptosis // Biochem. J. -1997. -Vol.326.-P. 1-16.

49. Cotter T.G., Glynn J.M., Echeverri F. and Green D.R. The induction of apoptosis by chemotherapeutic agents occurs in all phases of cell cycle // Anticancer Res. -1992. -Vol.12. -P.795-808.

50. Cozzarelli N.R. DNA topoisomerases // Cell. 1980. - Vol.22. - P.327-238.

51. Cummings J. & Smyth J.F. DNA topoisomerase I and II as targets for rational design of new anticancer drugs // Ann Oncol 1993. - Vol.4. - P.533-543.

52. Currach M.E., Connor T.M.F., Knudson C.M. et al. Bax-difeciency promotes drug resistance and oncogenic transformation by attenuating p-53-dependent apoptosis // PNAS USA. -1997. -Vol.94. -P.2345-2349.

53. Datta R, Banach D, Kojima H, Talanian RV, Alnemri ES, Wong WW, Kufe DW: Activation of the CPP32 protease in apoptosis induced by 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine and other DNA-damaging agents // Blood. 1996. -Vol.88.-P.1936.

54. Datta R., Dudek H., Tao X., Masters S., Fu H., Gotoh Y., and Greenberg M.E. Cellular survival: a play in tree Akts // Genes Dev., 1999. - Vol. 13. - P.2905-2927.

55. Degli-Esposti M. A., Dougall W.C., Smolak P.J. et al. The novel receptor TRAIL-R4 induced NF-кВ and protects against TRAIL-mediated apoptosis, yet retains an incomplete death domain // Immunity. -1997. -Vol.7. -P.813-820.

56. Degli-Esposti M. A., Smolak P.J., Walczak H. et al // Cloning and characterization of TRAIL-R3, a novel member of the emerging TRAIL receptor family//J.Exp.Med. -1997. -Vol.186. -P. 1165.

57. Deveraux Q., Leo E., Stannicke KW et al. Cleavage of human inhibitor of apoptosis protein XIAP results in fragments with distinct specificities for caspases.// EMBO J.-1999.-Vol. 18.-P.5242-5251.

58. Deveraux Q., Takahashi R., Salvasen G.S., & Reed J.C. X-linked IAP is a direct inhibitor of cell death proteases //Nature. -1997. -Vol.388. -P.300-303.

59. Dhein J., Walczak H., Baumler C., Debatin K-M., Krammer P.H. Autocrine T-cell suicide mediated by APO-l(Fas/CD95). // Nature. -1995. -Vol.373. -P.438-441.

60. Dive C., Hickman J.A. Drug-target interactions: only the first step in thecommitment to a programmed cell death? // Br. J. Cancer -1991. -Vol.64. -P.192-196.

61. Dress M, Dengler W.M. Hendriks H.R. et al. Cycloplatam: a new platinum compound exhibiting a different spectrum of anti-tumour activity to cisplatin // Eur. J. Cancer 1995. - Vol.31 A. - P.356-361.

62. Drewinko B, Barlogie B. Survival and cycle-progression delay of human lymphoma cells in vitro expoed to V-16-213.Cancer Treatm. Rep. -1976 -Vol. 60. P.1295-1304

63. Du Vernay V. H, et al. Molecular pharmacological difference between carminomycin and its analog carcinomicin-11-methyl ether and adriamycin. Cancer Res. -1980. Vol.40. -P.387-394.

64. Duan H, and Dixit V.M. RAIDD is new death adaptor molecule. // Nature. -1997.-Vol.385.-P.86-89.

65. Dubrez L, Savoy I, Hamman A, Solary E: Pivotal role of a DEVD-sensitive step in etoposide-induced and Fas-mediated apoptotic pathways. // EMBO J. -1996. -Vol. 15. -P.5504-5512.

66. Duckett C.S, Nava V.E, Gedrich R.W. et al. A conserved family of cellular genes related to the baculovirus IAP gene and encoding apoptosis in hibitors.EMBO.J. -1996. -Vol.15. -P.2685-2694.

67. Earnshaw W.C. Nuclear changes in apoptosis. // Curr.Opin. Cell Biol. -1995.-Vol.7.-P.337-343.

68. Eastman A. Activation of programmed cell death by anticancer agents: cisplatin as model system // Cancer Cells. 1990. - Vol.2. - P.275-280.

69. Eastman A. The formation, isolation, and characterization of DNA adducts produced by anticancer platinum complexes // Pharmacol. Ther. 1987. -Vol.34. -P.155-166.

70. Eischen C.M, Leibson P. The Fas pathway in apoptosis // Adv Pharmacol.-1997b.- Vol.41.-P.107-116.

71. Eischen C.M., Kottke Т.J., Martins L.M. et al. Comparison of apoptosis in wild-type and Fas-resistant cells: Chemotharapy-induced apoptosis is not dependent on Fas/Fas ligand interactions // Blood. 1997a. - Vol.90. - P.935-943.

72. Ellis R.E., Yuan J., and Iorvitz H.R. Mechanisms and functions of cell death // Annu. Rev. Cell Biol. -1991 -Vol.7. -P.663-698.

73. Enari M., Sakahiera H., Yokoyama H. et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD // Nature. -1998. -Vol.391. -P.43-50.

74. Enari N., Hug H., and Nagata S. Involvement of an ICE-like protease in Fas-mediated apoptosis//Nature. -1995. -Vol.375. -P.78-81.

75. Engler R.L., Gottlieb R.A. Programmed cell death: apoptosis and cardiovascular disease // Dialogues in cardiovascular medicine. -1998. -Vol.3. -№2. -P.67-81.

76. Epstein R.G. Drug-induced DNA damage and tumor chemosensitivity // J. Clin. Oncol. -1990. Vol.8. - 2062-2084.

77. Fadok V.A., Voelker P.A., Campbell J.J. et al. Exposure of phosphatidylethanol-amine on the surface of apoptotic cells // Exp. Cell. Res.-1992.-Vol.232.-P.430-434.

78. Falcieri E, Martelli AM, Bareggi R et al. The protein kinase inhibitor staurosporine induces morphological changes typical of apoptosis in MOLT-4 without concomitant DNA fragmentatiuon. Biochem Biophys Res Com. -1993. -Vol.193.-P.19-23.

79. Fenaux P. Molecular biology and apoptosis in myelodysplastic syndromes // Combined Haemotology Congress. 1998. - P.81-84.

80. Fenidi A., Harrigton E.A. and Evan G.I. Cooperative interaction between c-myc and bcl-2 proto-oncogenes // Nature. 1992. -Vol.359. - P.554-556.

81. Ferrari D., Stepczynska A., Los M. et al. Differential regulation and ATPrequirement for caspase-8 and caspase-3 activation during CD95 and drug-induced apoptosis // J. Exp. Med. -1998. -Vol.188, No.5. P.979-984.

82. Ferrari, D., Stepczynska, A., Los, M., Wesselborg, S. and Schulze-Osthoff, K. Differential regulation and ATP requirement for caspase-8 and caspase-3 activation during CD95- and anticancer drug-induced apoptosis // J. Exp. Med.-1998.-Vol.88. P.979-984.

83. Fisher D.E. Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold. // Cell. -1994. -Vol.78. -P.539-542.

84. Friesen C., Fulda S., Debatin K-M. Cytotoxic drugs and the CD95 pathway // Leukemia.- 1999.-Vol.13.-P.1854-1858.

85. Friesen C., Fulda S., Debatin K-M. Deficient activation of the CD95 (APO-1/Fas) system in drug-resistant cells // Blood. 1997. - Vol.90. - P.3118-3129.

86. Friesen C., Herr I., Krammer P.H., Debatin K-M. Involvement of the CD95 (APO-l/Fas) receptor/ligand system in drug-induced apoptosis in leukemia cells. // Nature Medicine. -1996.- Vol.2- P.574-577.

87. Fulda S., Friesen C., Debatin K.M. Molecular determinants of apoptosis induced by cytotoxic drugs //Klin. Padiatr. 1998b. - Vol.210. - P.148-52.

88. Fulda S., Friesen C., Los M. et al. Betulinic acid triggers CD95 (APO-l/Fas)-and p53-independent activation of caspases in neuroectodermal tumors // Cancer Res. 1997a. - Vol.57. - P.4956-4964.

89. Fulda S., Los M., Friesen C. et al. Chemosensitivity of solid tumor cells in vitro is related to activation of the CD95 system // Int J Cancer. 1998a. - Vol. 76. -P.105-114.

90. Fulda S., Scaffidi C., Susin S.A. et al. Activation of mitochondria and realese of mitochondrial apoptogenic factors by betulinic acid // JBC. 1998c. - Vol.273. -P.33942-33948.

91. Fulda S., Sieverts H., Friesen C., Herr I., Debatin K-M. The CD95 (APO-l/Fas) system mediates drug-induced apoptosis in neuroblastoma cells. //

92. Cancer Res. -1997b. -Vol.57 (17). -P.3823-3829.

93. Fulda S., Strauss G., Meyer E. & Debatin K-M. Functional CD95 ligand and CD95 death-induced cell death and doxorubicin-induced apoptosis in leukemic T cells // Blood. 2000. - Vol.95. - P.301-308.

94. Gamen S., Anel A., Lasierra P. et al. Doxorubicin induced apoptosis in human T-cell leukemia is mediated by caspase-3 activation in a Fas-independent way // FEBS Letters. -1997. - Vol.417. -P.360-364.

95. Gavrieli Y, Sherman Y, and Ben Sasson S. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation // J. Cell Biol. -1992. -Vol.119. -P.493-501.

96. Gerasimova G.K., Blokhin D.Y., Solntceva T.I. et al. Mechanism of action of cycloplatam, a new anticancer platinum II complex // Ann Oncol 3 (Suppl 1): A168- 1992.

97. Gewitrtz D.A. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the antracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin // Biochemical Pharmacology. -1999. -Vol.57. -P.727-741.

98. Ghayur Т., Hugunin R.V., Talanian S., et al. Proteolytic activation of protein kinase С delta by an ICE/CED 3-like protease induces characteristics of apoptosis. // J.Exp.Med. -1996. Vol.184. -P.2399-2404.

99. Glisson S.C. & Ross W.E. DNA topoisomerase II: a primer on the enzyme and its unique role as a multidrug target in cancer chemotherapy // Pharmacol. Ther. 1987. - Vol.32. - P.89-106.

100. Godard Т., Deslandes E., Lebailly P. et al. Early detection of staurosporine-induced apoptosis // Histchem. Cell Biol. -1999. -Vol.112. -P.l55-161.

101. Goltsev Y.V., Kovalenko A.V., Arnold E., et al. CASH, a novel caspase homologue with death effector domains // J.Biol.Chem. -1997. -Vol.272.о1. P.19641-19644.

102. Gong J., Traganos F. and Darzynkiewicz Z. A selective procedure for DNAexraction from cells applicable for gal electroporesis and flow cytometry // Analytical Biochemistry. -1994. -Vol.218. -P.314-319.

103. Gorczyca W., Bigman K., Mittelman A. et al. Induction of DNA stand breaks associated with apoptosis during treatment of leukemias // Leukemia -1993c.-Vol.7.-P.659.

104. Gorczyca W., Gong J., Ardelt В., Traganos F., Darzynkiewicz Z. The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by various antitumor agents. // Cancer Res. 1993b. - July. - Vol.53. - P.3186-3392.

105. Gorczyca W., Gong J., Darzynkiewicz Z. Detection of DNA strand breaks individual apoptotic cells by the in situ by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays // Cancer Res. -1993a. -Vol.52. -P.1945-1951.

106. Gorman A., McGowan A. and Cotter T.G. Role of peroxide and superoxide anion during tumour apoptosis // FEBS Lett. -1997. -V.404. -P.27-33.

107. Green D.R. Apoptotic pathways: the roads to ruin // Cell. -1998. -Vol.94. -P.695-698.

108. Green D.R. Apoptotic Pathways: Paper wraps stone blunts scissors // Cell. -2000. -Vol.102.-P. 1-4.

109. Griffith Т., Brunner Т., Fletcher D.R. et al. Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege // Science. 1995. - Vol.270. - P.1189-1192.

110. Gross A. et al., Caspase cleaved BID targets mithochondria and is required for cytochrome С release, while BCL-XL this release but not tumor necrosisfactor-R-l/Fas death // J.Biol.Chem. 1999. - Vol.274. - P.l 156-1163.

111. Han D.K.M, Chaudry P.M., Wright M.E, et al. MRIT, a novel death-effector domain-containing protein interacts with caspases and BclXL and initiates cell death.// Proc. Natl Acad. Sci.USA.-1997.-Vol.94.-P.l 1333-11338.

112. Hannun Y. Apoptosis and dilemma of cancer chemotherapy // Blood.-1997.-Vol. 89.- P.1845-1953.

113. Hengarther M.O. The biochemistry of apoptosis // Nature. 2000. -Vol.407.-P.770-776.

114. Hickman J.A. Apoptosis and chemotherapy resistance // European J. of Cancer. -1996. Vol.32A. -P.921-926.

115. Hickman J.A. Apoptosis induced by anticancer drugs // Cancer Met. Rev. -1992.-Vol.11.-P.121-139.

116. Hirata H, Takahashi A, Kobayashi S.Y, at el. Caspases are activated in branched proteases cascade and control downstream processes in Fas-induced apoptosis// J.Exp.Med. 1998. - Vol.187. -P.587-600.

117. Hockenberry D, Nunez G, Schreiber R.D, & Korsmeyer S.J. Bcl-2 is an inner mitochondrial membrane protein that blocks programmed cell death // Nature.-I990.-Vol.348.- P.334-336.

118. Holmstrom Т. H, Tran S.E.F, Johnson V.L, Ahn H.G, Chow S.C, and Eriksson J.E. Inhibition of mitogen-activated kinase signaling sensitizes HeLa cells to Fas recepor-mediated apoptosis // Molecular and Cellular biology. -1999.-Vol.19.-P.5991-6002.

119. Howell S.B, Vick J, Andews P.A. et al. 1987

120. Hu S, Vincenz C, Ni J, et al. I-FLICE, a novel inhibitor of tumor necrosis143factor receptor-1 and CD95-induced apoptosis. // J.Biol.Chem. -1997. -V.272. -P.17255-17257.

121. Huang S., Jiang Y., Li Z. et al. Apoptosis signaling pathway in T cells is composed of ICE/Ced 3 family and MAP kinase kinase 6b // Immunity.-1997.-Vol.6.-P.739-749.

122. Huddart R.A., Titley J., Robertson D., Williams G.T., Horwich A. and Cooper C.S. Programmed cell death in response to chemotherapeutic agents in human germ cell tumour lines // European Journal of Cancer. -1995. -Vol.31 A. -No.5. -P.739-746.

123. Husctscha L.I., Bartier W.A., Ross C.E.A. et al. Characteristics of cancer cell death after exposure to cytotoxic drugs in vitro // Br. J. Cancer. -1996. -Vol.73. -P.54.

124. Ichijo H., Nishida E., Irie K. et al. Induction of apoptosis by ASK1, a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways // Science. -1997.-Vol.275.-P.90-94.

125. Inohara N., Koseki Т., Hu Y., et al. CLARP, a death-effector domain-containing protein interacts with caspase-8 and regulates apoptosis // Proc. Natl Acad. Sci.USA. -1997. -Vol.94.-P10717-10722.

126. Irmler M., Thome M., Hahne M. et al. Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP // Nature.-1997.-Vol.388.-P. 190-195.

127. Itoh N. & Nagata S. A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of Fas antigen // J. Biol. Chem.-1993. -Vol.268. -P.10932-10937.

128. Jaattela M. Escaping cell death: survival proteins in cancer // Experimental Cell Research 1999. - Vol.248. - P.30-43.

129. Jacqus R. Resistance to cytotoxic dagents // Current Opnion in Pharmacology -2001. Vol.1. P.353-357.

130. Kamesaki S., Kamesaki H., Jorgensen T.J. Bcl-2 protein inhibits etoposide-induced apoptosis to topoisomerase II-induced DNA strand breaks and their repair // Cancer Research. 1993. - Vol.53. - P.4251-4256.

131. Kastan M.B., Onoekwere O., Sindransky D. et al. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage // Cancer Res.- 1991. Vol.51. - P.6304-6311.

132. Kaufmann S.H. Induction of endonucleolytic DNA cleavage in human acute myelogenous leukemia cells by etoposide, camtothecin, and other cytotoxic anticancer drugs: a cautionary note // Cancer Res.- 1989. Vol.49. - P.5870-5878.

133. Kaufmann S.H. Proteolytic cleavage during chemotherapy-induced apoptosis // Mol Med Today. -1996. Vol.2. -P.269.

134. Kaufmann S.H., Desnoyers S., Ottaviano Y. et al. Specific proteolytic cleavage of Poly (ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy-induced apoptosis // Cancer Res.- 1993. Vol.53. - P.3976-3985.

135. Kayagaki N.A., Kawasaki A., Ebata T. et al. Metalloproteinase-mediated release of human Fas ligand // J. Exp. Med. 1995. - Vol.182. - P.1777-11783.

136. Kerr J.F.F., Wyllie A.H. & Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomen with wide-ranging implication is tissue kinetics // Br. J. Cancer -1972.-Vol.26.-P.239-257.

137. Kessel D. Enhanced glycosylation induced by adriamycin. Mol. Pharmocol. 1979.-Vol.16. P.306-315.

138. Kirsch D.G., Doseff A., Nelson B.C., et al. Caspase-3-dependent Cleavage of Bcl-2 Promotes Release of Cytochrome c* // J Biol Chem.-1999. -Vol.274. -Issue 30. -P.21155-21161.

139. Kischkel F.C., Hellbardt S., Behrmann I. et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins from a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor// EMBO J 1995. -Vol.l4.-P.5579-5588.

140. Kluck R.M., Bossy-Wezel Т., Green D.R. & Newmeyer D.D. The release of cytochrome с from mitochndria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science. -1997. -Vol.275. -P.l 132-1136.

141. Kohn K.W., Pommier Y., Kerrigan D. et al. Topoisomerase II as a target of anticancer drug action in mammalian cells // Natl. Cancer Inst.- 1987. Vol.4. -P.61-71.

142. Kolenko V.M., Uzzo R.G., Bukowski R., and Finke J.H. Caspase-dependent and -independent death pathways in cancer therapy // Apoptosis. 2000. -Vol.5.-P.17-20.

143. Kondo S., Banara B.P., Morimura T. et al. Interleukin-lp -converting enzyme mediates cisplatin-induced apoptosis in malignant glioma cells // Cancer Res., 1995. - Vol.55. - P.6166-6171.

144. Konovalova A.L., Cheltcov P.A, Stetsenko A.I et al. Antitumor activity of new platinum complexes // 7th NCI EORTC Symposium on new drugs in cancer therapy - Amsterdam 1992, March 17-20. - Abstract 136. - P.92.

145. Koopman G., Reutelingsperger C.P.M., Kuijten G.A.M., Keehnen R.M.J., Pals S.T. & van Ors M.H.J. Annexin V for Flow Cytometric Detection of phosphatidylserine exspression on В cells undergoing apoptosis // Blood. -1994.-Vol.84.-P.1415-1420.

146. Krammer PH, Dhein J, Walczak H. et al. The role of APO-1-mediated apoptosis in the immune system. // Immunol Rev.-1994. -Vol.142. -P.175-185.

147. Krammer, P.H. CD95 (APO-l/Fas)-mediated apoptosis: live and let die. // Adv. Immunol. -1999. 71, 163-210

148. Krippner A., Matsuno-Yagi A., Gootlieb R.A. loss of function of cytochrome С in jurkat cells undergoing Fas-mediated apoptosis. J.Biol. Chem. 1996. Vol.271. -P.21629-21636.

149. Kroemer G. The proto-oncogen Bcl-2 and its role in regulating apoptosis // Nature Med. -1997a. -Vol.3. -P.614-620.

150. Kroemer, G. Mitochondrial control of apoptosis // Immunol. Today.-1997b.1461. Vol.18. -P.44-51.

151. Kuerbitz S.J., Plunkett B.S., Walsh W.V. et al. Wild-type p53 is a cell cycle checkpoint determinant following irradiation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992. -Vol.89. P.7491-7495.

152. Labat-Moleur F., Guillerment C., Lorimier P. TUNEL apoptic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement // The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. -1998. -Vol.46 (3). -P.327-334.

153. Lamoyi E., and Nisonoff A. Preparation of F (ab') 2 fragments from mouse IgG of various subclasses // J.Immunol. Methods. -1983. -Vol.56. -P.235.

154. Landowski Т.Н., Gleason-Gusman M.C. & Dalton W.S. Selectioon for drug resistance results in resistance to Fas-mediated apoptosis // Blood. 1997. -Vol.89. -P.1854-1861.

155. Landowski Т.Н., Shain K.H., Oshiro M.M. et al. Myeloma cells selected for resistance to CD95-mediated apoptosis are not cross-resistant to cytotoxic drugs: evidence for independent mechanism of caspase activation // Blood. -1999.-Vol.94.-P.265-274.

156. Lazebnik YA, Kaufmann SH, Desnoyers S. et al. Cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature. 1994. -Vol.371.-P.346-347.

157. Lazebnik YA, Takahaski A, Moir R. et al. Studies of the lamin proteinase reveal multiple parallel biochemical pathways during apoptotic execution // Proc Natl Acad Sci USA. -1995. Vol.92. -P.9042.

158. Lee Y. C., Byfield J. E. Induction of DNA degradation in vivo by Adriamycin. J. Nat. Cancer Inst. -1976. -Vol.57. -P.221-224.

159. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division // Cell.1997. -Vol.88. -P.323-331.

160. Li H., Bergeron L., Cryns V., et al. Activation of caspase-2 in apoptosis // J. Biol. Chem.-1997a. -Vol.272. -P.21010-21017.

161. Li P., Nijhavvan D., Budihadjo I. Cytochrome с and dATP-dependent formation of Apaf-l/Caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade// Cell. -1997a. -Vol.91. -P.479-489

162. Li, H., Zhu, H., Xu, C.J., and Yuan, J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis // Cell.1998.-Vol.94. P.491-501.

163. Lieberthal W., Triaca V., Levine J. Mechanisms of death induced by cisplatin in proximal tubular epithelial cells: apoptosis vs. necrosis // Am. J. Physiol. -1996. -Vol.270 (4 Pt 2). -P.700-708.

164. Ling Y.H., Priebe W. and Perez-Soler R. Apoptosis induced by anthracycline antibiotics in P388 parent and multidrug-resistant cells // Cancer Res.- 1993. Vol.53. - P.1845-1852.

165. Liu Z. G., Hsu H., Goaddel D., et al. Dissection of TNF receptor 1 effector functions: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-кВ activation prevents cell death // Cell. -1996. -Vol.87. -P.565-576.

166. Liu L.F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs // Annu. Rev. Biochem. 1989. Vol.58. - P.351-375.

167. Liu X., Kim C.N., Yang J. at al. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for d ATP and cytochrome С // Cell. -1996. -V.86.-P.147-157.

168. Liu X.S., Zou H., Slaughter C., and Wang XD. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis.//Cell.-1997.-Vol.89.-P175-184.

169. Loehrer P.J. and Einhor L.H. Cisplatin // Ann. Intern. Med. 1984.1. Vol.100.-P. 704-713.

170. Lockhin R.A. & Williams C.M. Programmed cell death. J. Insect Physiol. -1965.-Vol.11.-P.803-809.

171. Long B.H. Mechanism of action teniposide (VM-26) and comparison with etoposide (VP-16) // Semin. Oncol. 1992. - Vol.19. - P.3-19.

172. Los M, Wesselborg S, Schulze-Oshoff K. The Role of Caspase in Development, Immunity, and Apoptotic Signal Transduction: Lesson from Knockout Mice // Immunity. -1999. -Vol.l0.-P.629-639.

173. Los, M, Herr, I., Friesen, C. et al. and Debatin, K.M. Cross-resistance of CD95- and drug-induced apoptosis as a consequence of deficient activation of caspases (ICE/Ced-3 proteases)//Blood. -1997. -Vol.90. -P.3118-3129.

174. Los, M, van de Craen, M, Penning et al. Requirement of an ICE/Ced-3 protease for Fas/Apo-1 mediated apoptosis //Nature. -1995. -Vol.375. -P.81-83.

175. Lotem J. & Sachs L. Hematopoietic cells from mice deficient in wild-type p53 are more resistant to induction of apoptosis by some agents // Blood.-1993.- Vol.82.- P.1092-1096.

176. Lowe S.W, Ruley H.E, Jacks T. et al. p-53- dependent apoptosis modulates the cytotoxity of anticancer agents // Cell. 1993. - Vol. 74. - P.957-967.

177. Luo, X, Budihardjo, I, Zou, H, Slaughter, C, and Wang, X. Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome с release fom mitochondria in response to activation of cell surface death receptors // Cell. -1998. -Vol.94. -P.481-490.

178. Makin G, Hicman J.A. Apoptosis and cancer chemotherapy // Cell Tissue Res. 2000. - Vol.301. -P.143-152.

179. Mariani S.M, Krammer PH. Surface expression of TRAIL/Apo-2 ligand in activated mouse T and В cells // Eur J Immunol.- 1998.- Vol.28.-P.1492-1498.

180. Mariani S.M, Matiba B, Krammer PH. Regulation of cell surface APO-1/Fas (CD95) ligand expression by metalloproteinases // Eur J Immunol. -1995.- Vol.25.-P.2303-2307.

181. Marsters SA., Sheridan J.P., Donahue C.J. et al. APO-3, a new member of the tumor necrosis factor receptorfamily, contains a death domain and activates apoptosis and NF-кВ.// Curr.Biol.-1996.-Vol.6.-P. 1669-1676.

182. Martin DA., Siegel RM., Zheng L., and Lenardo MJ. Membrane oligomerization and cleavage activates the caspase-8 (FLICE/MACHalpha 1) death signal // J.Biol.Chem. -1998. -Vol.273. P.43545-4349.

183. Martins LM, Kottke TJ, Mesner P. et al. Activation of multiple interleukin-1 beta converting enzyme homologues in cytosol and nuclei of HL-60 human leukemia cell lines during etoposide-induced apoptosis // J Biol Chem.-1997.-Vol.272.-P.7421.

184. Matsumura H., Shimizu Y., Ohsawa Y., Kawahara A., Uchiyama Y. and Nagata S. Necrotic death pathway in Fas receptor signaling // The J. of Cell Biology. -2000. -Vol.151. -N. 6. -P.1247-1255.

185. McCarthy N.J. and Evan G.I. Methods for detection and quantifying apoptosis // Currents Topics in Developmental Biology. -1998. -Vol.36. -P.259-278.

186. Meier P., Andrew F. and Evan G. Apoptosis and development // Nature. -2000.-Vol.407.-P.796-801.

187. Meyn R.E., Stephens L.C., Hunter N.R. et al. Apoptosis in murine tumors treated with chemotherapy agents // Anticancer Drugs. -1995. -Vol.6. P.443.

188. Michaevich I.S., Vlasenkova N.K., Gerasimova G.K. Platinum drugs, cisplatin and cycloplatam inhibit protein kinase С in cell free system and in human melanoma BRO cells. Himiko-farmacevtichesky; 1996. 1:24-29.

189. Mignotte В., and Vayssiere. Mitochondria and apoptosis. Eur. J.B.-1998. -Vol.252. -P.1-15.

190. Minn A.J., Velez P., Schendel S.L. et al. Bcl-xL forms an ion channel is synthetic lipid membranes // Nature. -1997. -Vol.385. -P.353-357.

191. Miyashita T. & Reed J.C. Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene // Cell. -1995. -Vol.80. -P.293-299.

192. Miyashita T. & Reed JC: Bcl-2 oncoprotein blocks chemotherapy-induced apoptosis in a human leukemia cell line //Blood. -1993. Vol.81. -P.151-153.

193. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays // J Immunol Methods -1993. -Vol.65. -P.55-63.

194. Muller M., Scaffidi C.A., Galle P.R. et al. The role of p53 and the CD95 (APO-l/Fas) death system in chemotherapy-induced apoptosis // Eur. Cytokine Netw. 1998. - Vol.9 (4). - P.685-686.

195. Muracami T, Li X, and Cong J et al. Induction of apoptosis by 5-Azacytidine: Drug Concentration-dependent Differences in Cell Cycle Specificity. Cancer Res. -1995. Vol.55. P.3093-3098.

196. Muzio M., Chinnaiyan A.M., Kischkel F.C., et al. FLICE, a novel FADD-homologous ICE/CED-3-like protease, is recruited to the CD95 (Fas/APO-1) death-inducing signaling complex // Cell.- 1996.-Vol.85.-P.817-827.

197. Muzio M., Stockwell BR., Stennicke HR et al. An induced proximity model for caspase-8 activation. //J.Biol.Chem. -1998. Vol.273. - P.2926-2930.

198. Nagata, S. Apoptosis by death factor// Cell. -1997. -Vol.88. -P.355-365.

199. Nagata, S., & Golstein, P. The Fas death factor // Science. -1995. -Vol.267. -P. 1449-1456.

200. Negoescu A., Lorimier P., Labat-Moleur F. et al. TUNEL: Improvement and evaluation of the method for in situ apototic cell identification // BIOCHEMICA. -1997. -No.2.

201. Newton K.5 Harris A.W., Bath M.L., Smith K.G.C., and Strasser AA dominant interfering mutant of FADD/MORT1 enhances deletion of autoreactive thymocytes and inhibits proliferation of mature T lymphocytes // EMBO J. -1998. -Vol.17. -P.706-718.

202. Newton. K. and Strasser A. Ionizing radiation and chemotherapeutic drugs induce apoptosis in lymphocytes in the absence of Fas or FADD/MORT1 signaling: Implications for cancer therapy // J. Exp. Med. -2000. Vol.191. -No.l. -P. 195-200.

203. Nicholson D.W., Ali A., Thornerberry N.A. et al. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis// Nature. -1995.-Vol.376.-P.37-43.

204. Nicholson DW: ICE/CED3-like proteases as therapeutic targets for the control of inappropriate apoptosis. Nature Biotech. 1996. -Vol.14. P.297-312.

205. Nicholson, D.W., and Thornberry, N.A. Caspases: killer proteases // Trends Biochem. Sci. 1997-Vol.22. P.299-306.

206. Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C., Grignani F., Riccardi C.A. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J.Immunol Methods. 1991. Vol.139. -P.271-280.

207. Nishitoh N., Saitoh M., Mochida Y., et al. ASK1 Is Essential for JNK/SAPK Activation by TRAF2 // Molecular Cell, 1998, Vol. 2, 389-395.

208. Ormerod M.G., O'Neill C.F., Robertson D., Harrap K.P. Cisplatin induces apoptosis in human ovarian carcinoma cell line without concomitant internucleosomal degradation of DNA // Exp. Cell Res. -1994. -Vol.211 (2).1521. Р.231-237.

209. Orth К., Chinnaiyan A.M., Garg M., Froelich C.J., Dixit V.M: The CED-3/ICE-like protease Mch2 is activated during apoptosis and cleaves the death substrate lamin A // J Biol Chem. -1996. -Vol.271. -P. 16443-16458.

210. Ozols R.F. Ovarian cancer: New clinical approaches // Cancer Treat Rev.-1991.-Vol.18.-P.77-83.

211. Pan G., Ni J., Wei Y.F. et al An antagonist decoy receptor and a death domain-containg-receptor for TRAIL //Science. 1997b.-Vol.277.-P.815-818.

212. Pan G., O'Rourke K., Chinnaiyn A.M. et al. The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL. //Science. 1997a. -Vol.276. -P. 111-113.

213. Parham P. Preparation and purification of active fragments from mouse monoclonal antibodies // In Cellular immunology. -1986. -4th ed. -Vol.1. -Chap. 14. -Blacwell Scientific Publications, California.

214. Peter M.E and Krammer P-H. Mechanisms of CD95 (APO-l/Fas)-mediated apoptosis // Current Opinion in Immunology. -1998. -Vol.10. -P.545-551.

215. Petit P.X., Susisn S.A., Zamzani N., Mignote B. and Kroemer G. Mithohondria and programmed cell death: back to the future // FEBS Lett. -1996.-Vol.396.-P.7-13.

216. Pitti R.M., Marsters S.A., Ruppert S. et all. Induction of apoptosis by APO-2 Ligand, a new member of the tumor necrosis factor cytokine family // J. Biol Chem.-1996. -Vol.271. P.12686-12690.

217. Powell W.C., Fingleton В., Wilson C.L. et al. The metalloproteinase matrilysin proteolytically generates active soluble Fas ligand and epithelian cell apoptosis // Curr Biol 1999. Vol.9. - P.1441-1447.

218. Prchal J.T., Throckmorton D.W., Caroll A.J. et al. A common progenitor for human myeloid and lymphoid cells // Nature. -1978. -Vol.274. -P.590-591.

219. Presnov M.A., Konovalova A.L. Cycloplatam and oxoplatin the newantitumor platinum compounds of the second generation // Arc Geschwulstforsch 1988. - Vol.1. - P.43-49.

220. Raff M.C. Social controls on cell survival and cell death // Nature. -1993. -Vol.356. -P.397-400.

221. Raza A, Geser S, Mundle S. et al. Apoptosis in bone marrow biopsy samples involving stromal and hematopoietic cells in 50 patients with myelodysplastic syndromes // Blood. 1995. - Vol. 86. - P.26S-276.

222. Raza A, Gregory S, Mundle S. et al. Increased apoptosis as the significant cause of inefective hematopoises in in myelodysplastic syndromes // Blood. -1994.-Vol.84.-P.2528.

223. Reed J.C. Apoptosis-regulating proteins as targets for drug discovery // TRENDS in Molecular Medicine. -2001. -Vol.7. No-7. -P.314-319.

224. Richardson D.S, Allen P.D, Kelsey S.M. et al. Inhibition of Fas/Fas-ligand does not block chemotherapy-induced apoptosis in drug sensitive and resistance cells // Adv. Exp. Med. Biol. -1999. Vol.457- P.259-66.

225. Roberts J.J. and Thompson A.J. The mechanism of action of antitumor platinum compounds // Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 1979. -Vol.22. -P.71-133.

226. Rosenberg B, Van Camp L, Trosko J.E. et al. Platinum compounds: a new class of potent antitumor agents // Nature (Lond.). 1969. - Vol.222. - P.385-386.

227. Ross W, Rowe T, Glisson B. et al. Role topoisomerase II in mediating epidophyllotoxin-induced DNA cleavage // Cancer Res. 1984. - Vol.44. -P.5857-5860.

228. Rothe M, Pan M.G, Henzel W.J.et al. The TNFR2-TNF signaling complex contains two novel proteins to baculoviral inhibitor of apoptosis proteins // Cell. -1995.-Vol.83.-P. 1243-1252.

229. Roy N, Mahadevan R.S, McLean M. et al. The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individualis with spinlal muscular154atrophy //Cell. -1995. -Vol.80. -P. 167-178.

230. Savill J., Fadok V., Henson P and Haslett C. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis //Immunol Today. -1993. -Vol.14. -P. 131-136.

231. Scaffidi С & Krammer P.H. Differential modulation of apoptosis sensitivity in CD95 Type I and Type II. J.Biol.Chem. -1999. Vol.274.- P.22532-22538.

232. Scaffidi, C., Fulda, S., Srinivasan, A., Friesen, C., Li, F.^Tomaselli, K.J., Debatin, K.-M., Krammer, P.H., and Peter, M.E. Two CD95 (APO-l/Fas) signaling pathways // EMBO J. 1998. Vol. 17. - P. 1675-1687.

233. Schuler M., Bossy-Wetzel E., Goldstein J.C. et al. p53 induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome с release // J.Biol.Chem. -2000. Vol.275. - P.7337-7342.

234. Schulze-Osthoff K., Ferrari D., Los M., Wesselborg S., and Peter M.E. Apoptosis signaling by death receptors // Eur. J. Biochem. -1998. -Vol.254. -P.439-459.

235. Screaton G.R., Xu X.N, Olsen et al. LARD: a new lymphoid-specific death domain containg receptor regolated by alternative pre-m RNA splicing. // Proc.Natl Acad. Sci. -1997.-Vol.94.-P.4615-4619.

236. Sen S. and D'lncalci M. Apoptosis: biochemical events and relevance to cancer chemotherapy // FEBS Lett. -1992. -Vol.307. -P.122-127.

237. Sentman C.L., Shutter J.R., Hockenberry D. et al. Bcl-2 inhibits multiple forms of apoptosis but no negative selection in thymocytes // Cell.-1991.-Vol.67.- P.879-888.

238. Sheridan J.P., Marsters S.A., Pitti R.M. et al. Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors // Science. -1997.-Vol.277.-P.818-821.

239. Sherman S.E. and Lippard S.J. Structural aspects of platinum anticancer drug interactions with DNA // Chem. Rev. 1987. - Vol.87. - P. 1153-1181.

240. Shimizi S., Narita M., and Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome с by the mitochondrial channal VDAC //155

241. Nature 1999.-Vol.399.P.483-487.

242. Shimizi S., Eguchi Y., Kamiike W. et al. Bcl-2 blocks loss of mitochondrial membrane potential while ICE inhibitors act at different step during inhibition of death induced by respiratory chain inhibitors. Oncogene. -1996.-Vol. 13.-P.21-29.

243. Shinomiya N., Shinomiya M., Wakiyama H. et al. Enhancement of CDDP cytotoxity byy caffeine is characterized by apoptotic cell death // Exp Cell Res.-1994.-Vol.210.-P.236.

244. Shiraki K., Tsuji N., Shioda T. et. al. Expression of Fas ligand in liver metastases of human colonic adenocarcinomas // PNAS. 1997. - Vol.94. -P.6420-6425.

245. Shu H.B., Haplin D.R. & Goeddel D.V. Casper is a FADD- and caspase-related inducer of apoptosis // Immunity. -1997. -Vol.6.-P.751-763.

246. Skladanowski A. and Konopa J. Adriamycin and daunomycin induce programmed cell death (apoptosis) in tumor cells // Biochem. Pharmacol. -1992. -Vol.46. -P.375-382.

247. Sorenson C.M. and Eastman A. Mechanism of cis-Diamminedichloroplatinum (Il)-induced cytotoxity: Role of G2 arrest and DNA double-strand breaks // Cancer Res. -1988. -Vol.48. -P.4484-4488.

248. Srinivasula SM., Ahmad M., Fernandes-Alnemri Т., Alnemri ES. Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization // Mol.Cell. -1998. -Vol.1. -P.949-957.

249. Srinivasula SM., Ahmad M., Ottilie S., et al. FLAME-1, a novel FADD-like anti-apoptotic molecule that regulates Fas/TNFRl-induced apoptosis.// J.Biol.Chem.-1997.-Vol.272.-P. 18524-18545.

250. Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide // Science. -1995. -Vol.267.-P.1445-1449.

251. Suda Т., Okazaki Т., Naito Y. et al. Expression of the Fas ligand in the of Tcell lineage // The J. of Immunology. 1995. - Vol.154. - P.3806-3813.

252. Suda Т., Takahashi Т., Golstein P. & Nagata S. Molecular cloning and expression of the Fas ligand: a novel member of the tumor necrosis factor family // Cell.- 1993.-Vol.75.-P.l 169-1178.

253. Sun X-M., MacFarlane M., Zhuang J., Wolf B.B., Green D.R. and Cohen M.C. Distinct caspase cascade are initiated in receptor-mediated and chemical-induced apoptosis // J.Biol.Chem. 1999. -Vol.274. -P.5053-5060.

254. Susin S.A. Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease//J. Exp. Med.- 1996. -Vol.184. -P.1331.

255. Tanaka M., Suda Т., Haze K. Fas ligand in human serum // Nat.Med.-1996.-Vol.2.-P.317-322.

256. Tewari M and Dixit V.M.Fas- and tumor necrosis factor induced apoptosis in inhibited by the poxvirus crmA gene product // J.Biol.Chem. -1995. -Vol.270. -P.3255-3260.

257. Thatte U. & Dahanukar S. Apotosis: Clinical relevance and pharmacological manipulation // Drugs. 1997. Vol. 54. - P.511-532.

258. Thome M., Schneider P., Hofmann K. et al. Viral FLICE-iinhibitory proteins (FLIPs) prevent apoptosis induced by death receptors // Nature. -1997. -Vol.386.-P.517-521.

259. Thompson C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease // Science. -1995. -Vol.267. -P.1456-1462.

260. Thornberry N.A., Rano T.A., Peterson E.P. et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis //

261. J.Biol.Chem. -1997.- Vol.272.- P.17907-17911.

262. Trauth B.C., Klas C., Peters A.M., et al. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis // Science. -1989. -Vol.245.-P.301-305.

263. Tritton TR, Murphree SA, Sartorelli AC. Characterization of drug-membrane interactions using the liposome system // Biochem. Res. Commun. -1978.-Vol.84.-P.802-810.

264. Tsangaris G.T., Moschovi M., Mikraki V. et al. Study of apoptosis in peripheral blood of patients with acute lumphoblastic leukemia during induction therapy. // Anticancer Research. -1996. -V.16 -P.3133-3140.

265. Vassilev P.M. Kanazirska M.P., Charamella L.J. et al. Changes in calcium channel activity in membranes from cis-diamminedichloro-platinum (II) resistant and -sensitive L1210 cells// Cancer Res. 1987. - Vol.47. - P.519-522.

266. Vial J.P., Belloc F., Dumain P., Besnard S., Lacombe F., Boisseau MR.,

267. Reiffers J., Bernard P. Study of the apoptosis induced in vitro by antitumoral drugs on leukaemic cells // Leuk. Res. -1997. Feb. 21(2). P.163-172.

268. Vollunger A., Egle A., Marschitz I. et al. Constitutive expression of Fas (Apo-l/CD95) ligand on multiple myeloma cells: a potential mechanism of tumor-induced suppression of immune surveillance //Blood. 1997. - Vol.90. -P.12-20.

269. Walker P.R, Saas P., Diettich P.Y. Tumor expression of Fas ligand (CD95L) and the consequences // Curr Opin Immunol. 1998. - Vol.10. - P.564-572.

270. Walker P.R., Saas P., Dietrich P-Y. Role of Fas ligand (CD95L) in immune escape // J.Immunology. -1997. -Vol.158. -P.4521-4524.

271. Walker P.R., Smith C., Yoydale T. et al. Topoisomerase II-reactive chemotherapeutic drugs induce apoptosis in thymocytes // Cancer Res.- 1991. -Vol.51.-P.1078-1085.

272. Wang J.C., Caron P.R. & Kim R.A The role of DNA topoisomerase in recombination and genome stability: a double-edged sword? // Cell. 1985. -Vol.62.-P.403.

273. Wang S., Miura M., Jung Y. et al. Identification and characterization of Ich-3, a member of the interleukin-IB-converting enzyme (ICE)/Ced-3 family and an upstream regulator of ICE // J. Biol. Chem.-1996. -Vol.271.-P.20580-20587.

274. Wang S., Miura M., Jung Y.K. et al. Murine caspase-11, an ICE-interacting protease, is essential for the activation of ICE // Cell. -1998. -Vol.92. -P.501-509.

275. Wang X.S., Diener K., Jannuzzi D. et al. Molecular cloning and characterization of a novel protein kinase with a catalytic domain homologous to mitogen-activated protein kinase kinase kinase // J. Biol. Chem. -1996. -Vol.159271. -Р.31607-31611.

276. Watt P.M., Hickinson I.D Structure and function of type DNA topoisomerase // Biochem. J. 1994. - Vol.303. - P.681-695.

277. Watts JD, Gu , Patterson SD, Aebersoid R, Polverino AJ. On the complexities of ceramide in cells undergoing apoptosis: lack of evidence for a second messenger function of apoptotic induction.// Cell Death Differ.- 1999-Vol.2.-P.105-114.

278. Weis M, Schlegel J, Kass G.E.N, et al. Cellular events in Fas/APO-1-mediated apoptosis in Jurkat T lymphocytes // Experemental Cell Research. -1995. -Vol.219. -P.699-708.

279. Wesselborg S, Engels I.H, Rossmann E. et al. Anticancer drugs induce caspase-8/FLICE activation and apoptosis in the absence of CD95 receptor/Ligand interaction // Blood. -1999. -Vol.93. No.9. - P.3053-3063.

280. Whiteside G. and Munglani R. TUNEL, Hoechst and immunohistochemistry triple-labeling: an improved method for detection of apoptosis in tissue sections an update // Brain Research Protocols - Vol.3. - P.52-53.

281. Wiley S.R, Schooley K, Smolak P.J. et al. Identification and characterization of new member of the TNF family that induced apoptosis. // Immunity.-1995.-Vol.3. -P.673-682.

282. Williams G.T. Programmed cell death: apoptosis and oncogenesis // Cell. -1991.-Vol. 65. P.1097-1098.

283. Willingham M.C. Cytochemical methods for detection of apoptosis // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. -1999. -Vol.47. -P. -1101-1110.

284. Wozniak A.J. & Ross W.E. DNA damage as a basis for 4'-demethyle-pipedophyllotoxin-9-(4,6-0-ethylidene-P-D-glycopyranoside) etoposide cytotoxicity // Cancer Res. 1983. - Vol.43. - P. 120-124.

285. Wyllie A.H. Apoptosis. (The 1992 Frank Rose Memorial Lecture) // Br. J. Cancer. -1993. Vol. 67. - P. 205 - 208.

286. Wyllie A.H, Morris R.G, Smith A.L. and Dunlop D. Chromatin cleavage inapoptosis: association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis 11 Am. J. Pathology. -1984. -V.142. -P.67-77.

287. Yang X., Khosravi-Far R., Chang H.Y., et al. Daxx, a novel Fas-binding Protein that activates JNK and Apoptosis // Cell. -1997. -Vol.89.-P. 1067-1076.

288. Yin X.M., et al. Bid-deficient mice are resistant to Fas-induced hepatocellular apoptosis // Nature. 1999. - Vol.400. - P.886-891.

289. Yonehara S, Nishimura Y, Kishil S, Yonehara M, Takazawa K, Tamatani T, Ishii A: Involvement of apoptosis antigen Fas in cloncal deletion of human thymocytes // Int Immunol. -1994. -Vol.6. -P.1849-1857.

290. Yonehara S., Ishii A. & Yonehara M. A cell killing monoclonal antibody (anti-Fas) to cell surface antigen co-down-regulated with the receptor to tumor necrosis factor//J.Exp.Med. -1989. -Vol.169. -P. 1747-1756.

291. Yonehara S., Nishimura Y., Kishi S., Ishii A. Expression and function of apoptosis antigen Fas on T cells in thymus and periphery // Tissue antigens. -1993. Vol.42. -N.4 -P.253.

292. Yoshida Y., Anzai N., and Kawabata H. Apoptosis in myelodysplasia: a paradox or paradigm //Leukemia Research. 1995. - Vol.19. -P.887-891.

293. Zeytunn A., Hassuneh M., Nagarkatti M. et al. Fas-Fas ligand -based interactions between tumor cells and tumor -specific cytotoxic T lymphocytes: a lethal two -way street // Blood. 1997. - Vol.90. - P. 1952-1959.

294. Zhivotovsky В., Gahm A. and Orrenius S. Two different proteases are involved in the proreolysis of lamin during apoptosis // Biochemical and biophysical communications. -1997. -Vol.233. -P.96-101.