Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:БЕРЕМЕННОСТЬ И НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННАЯ ДИСПЛАЗИЯ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ: ПАТОГЕНЕЗ, КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА

На правах рукописи

КЕСОВА Марина Исааковна

БЕРЕМЕННОСТЬ И НЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННАЯ ДИСПЛАЗИЯ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ: ПАТОГЕНЕЗ, КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА

14.01.01 - акушерство и гинекология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 Р ДПР Ш2

Москва-2012

005019642

Работа выполнена в Федеральном бюджетном государственном учрежден} «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академи! В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения и социального развит! Российской Федерации в акушерском обсервационном отделении

Научные консультанты:

доктор медицинских наук Кан Наталья Енкыновна

доктор медицинских наук,

профессор, академик РАМН Сухих Геннадий Тихонович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по науке Московского областного научно-исследовательского института

акушерства и гинекологии Логутова Лидия Сергеевн

доктор медицинских наук, профессор, заведующий родильным отделением ФГБУ «НЦ АГиП им. академика В.И.Кулакова»

Минздравсоцразвития России Баев Олег Радомирович

доктор медицинских наук, профессор

кафедры медицинской генетики

ГОУ ДПО СПБ СЗГМУ им. И.И.Мечникова

Минздравсоцразвития России Кадурина Тамара Иванова

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов.

Защита состоится « » _ 2012г. в «13» часов на заседам

диссертационного совета Д208.125.01 при ФГБУ «НЦ АГиП им. академи] В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москв ул. Академика Опарина, д.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НЦ АГиП И1 академика В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_»_2012г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Калинина Е.А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы недифференцированной дисплазии соединительной ткани в настоящее время обусловлена как высокой распространенностью данной патологии в популяции (частота отдельных ее проявлений по данным разных авторов колеблется от 26 до 80%), так и многообразием и тяжестью ее клинических проявлений (Земцовский Э.В., 2000; Кадурина Т.И., 2000; Нечаева Г.И., 2001). В настоящее время дисплазия соединительной ткани трактуется как группа генетически гетерогенных и клинически полиморфных патологических состояний, характеризующихся нарушением формирования соединительной ткани в эмбриональном и постнатальном периодах, и объединяющая ряд генных синдромов (Марфана, Элерса-Данлоса) и недифференцированные формы с мультифакториальными механизмами развития.

Несмотря на высокий риск осложнений при дифференцированной дисплазии соединительной ткани, на практике особенно часто приходится сталкиваться с нДСТ. В отличие от синдромных форм проявления, нДСТ нередко остаются без должного внимания. Вместе с тем, универсальность соединительнотканного дефекта при нДСТ предполагает разнообразие висцеральных изменений, часть из которых может иметь серьезные клинические последствия.

В акушерской практике проблема нДСТ весьма актуальна, так как распространенность данного синдрома достигает до 80% среди женщин репродуктивного возраста (Земцовский Э.В., 2000). Учитывая системность поражения, нДСТ может оказывать отрицательное влияние на течение беременности, родов, перинатальную заболеваемость и смертность новорожденных. Так, угроза прерывания беременности достигает 50% у женщин с нДСТ (Гурбанова С.Р., 2007). Также при нДСТ наблюдается плацентарная недостаточность, несвоевременное излитие околоплодных вод и др. (Милованов А.П., 1999; Барков Л.А., 2000). Описана взаимосвязь быстрого и стремительного течения родов при нДСТ, причем, при тяжелой степени частота быстрых и стремительных родов у первородящих достигает 50%, а при слабовыраженных признаках составляет около 12%. Вместе с тем, сведения об особенностях течения беременности и родов у женщин с нДСТ противоречивы. Ряд авторов указывают на высокую частоту развития осложнений во время беременности, другие же не отмечают подобной закономерности. Кроме того, по данным Козиновой О.В. (2008), во время беременности отмечается усиление симптоматики нДСТ от первого к третьему триместрам беременности.

Несмотря на интерес исследователей к проблеме нДСТ, до настоящего времени отсутствуют работы по комплексной оценке акушерских и перинатальных исходов в зависимости от степени выраженности нДСТ, что

определяет актуальность проведения данного исследования. Системное поражения при нДСТ обусловливает сложность диагностики и отсутств] единых диагностических критериев и терминологии. Учитывая, что развитии ДСТ ведущее значение имеют мутации генов, кодирующих синт и пространственную организацию коллагена, перспектива диагностики ДС заключается в выявлении генных мутаций и сопоставлении их клиническими проявлениями (Кадурина Т.И., 2000).

Учитывая, что нДСТ представляет собой аномалию тканев< структуры с уменьшением содержания отдельных видов коллагена ш нарушением их соотношения, вызывающую снижение механическ( прочности ткани, что потенциально может приводить к нарушению течет процессов репарации, интерес представляет изучение морфологических иммуногистохимических особенностей миометрия при нДСТ с выявление возможных морфологических, имммуногистохимических и молекулярн генетических предикторов акушерских и перинатальных осложнений.

Цель исследования:

Обоснование системы диагностических мероприятий у пациенток недифференцированной дисплазией соединительной ткани на основан! морфологических, молекулярно-генетических методов исследования д. снижения акушерских и перинатальных осложнений.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности течения беременности, родов и послеродово периода, состояния плода и новорожденного у пациенток недифференцированной дисплазией соединительной ткани и выдели факторы риска развития осложнений.

2. Исследовать взаимосвязь клинических проявлен! недифференцированной дисплазии соединительной ткани аллельными вариантами генов, участвующих в формирован! соединительной ткани (коллаген III, IV, ламинин, матриксн! металлопротеиназы 2 и 9, тканевой ингибитор металлопротеиназы) регулирующих гомеостаз (сосудисто-эндотелиальный фактор рост магниевые каналы (Т11РМ-7), эстрогеновые рецепторы альфа и бета).

3. Установить наиболее значимые фенотипические и молекулярн генетические предикторы развития акушерских и перинатальнь осложнений.

4. Изучить морфологические и иммуногистохимические особенное-миометрия при недифференцированной дисплазии соединительш ткани с анализом течения репаративных процессов у пациенток рубцом матки.

5. Уточнить механизмы дезорганизации соединительной ткани во время беременности и сопутствующих осложнений на основании выявления молекулярно-генетических и клинико-морфологических параллелей.

6. Разработать алгоритм ведения беременности, родов и послеродового периода у женщин с недифференцированной дисплазией соединительной ткани.

Научная новизна

Впервые изучена взаимосвязь акушерских и перинатальных осложнений с клиническими проявлениями нДСТ и особенностями генов, кодирующих белки, участвующие в формировании соединительной ткани (CoL III, CoL IV, LAMC1, VEGF, MMP9, TIMP1, TRPM-7, ERa, ERß), и установлена прямая корреляционная связь между степенью выраженности нДСТ и развитием акушерских осложнений. Показано, что течение беременности, родов и послеродового периода сопровождается высокой частотой развития таких осложнений, как угроза прерывания беременности, истмико-цервикальная недостаточность, плацентарная недостаточность, аномалии родовой деятельности. Впервые определена диагностическая ценность выявления полиморфизма генов матриксной металлопротеиназы (ММР9), сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF), эстрогенового рецептора бета (ERß) при нДСТ. Выявлена зависимость между полиморфизмом генов ламинина, сосудисто-эндотелиального фактора роста, эстрогенового рецептора альфа, интерлейкинов (IL1, ILIO) и несостоятельностью рубца на матке. Впервые установлена взаимосвязь развития слабости родовой деятельности с полиморфизмами генов ламинина и коллагенов (III и 1Утипа).

Практическая значимость

1. Использование балльной шкалы оценки степени выраженности нДСТ позволило выделить группу риска по развитию акушерских осложнений, которым показана целесообразность определение полиморфизма генов ламинина и коллагенов для прогнозирования акушерских осложнений. Дополнительными критериями диагностики нДСТ являются: полиморфизм гена матриксной металлопротеиназы (ММР9: 855 A>G), сосудисто- эндотелиального фактора роста (VEGF (634 G>C) [rs2010963], VEGFA: -2578 A>C [rs699947]) и эстрогенового рецептора бета (ESR2: -12214 G>T [rsl271572]). Клиническими предикторами неполноценного рубца на матке являются миопия высокой степени и пролапс митрального клапана. Молекулярно-генетическими критериями неполноценности рубца на матке являются полиморфные локусы генов LAMC1: -2204 С>Т [rsl0911193], VEGFA: -634 G>C [rs2010963], VEGFA: -2578 A>C [rs699947], ESR1: -397 T>C

(Руи11) [гб2234693] и -3510А (ХЬа1) [^9340799], 1Ь 1Ь [гэ1143627 Полиморфизм генов ламинина и коллагенов (III и IV) являютс предикторами слабости родовой деятельности. Разработан алгорит ведения беременности, родов и послеродового периода у женщин недифференцированной дисплазией соединительной ткани.

Положения, выносимые на защиту:

1. Течение беременности при недифференцированной дисплази соединительной ткани характеризуется высокой частотой развита акушерских (угроза прерывания - 42,4%, истмико-цервикальна недостаточность - 8,6%, плацентарная недостаточность - 34,8%, слабост родовой деятельности - 12,4% и перинатальных (неонатальная желтуха 19,5%, кожно-геморрагический синдром - 8,6% и недостаточность питания 10,5%) осложнений. Доля встречаемости синдрома нДСТ по обращаемости ФГБУ «НЦАГ и П им.В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития Росси составила 54,3%.

2. Высокая частота осложнений в течение беременности и родов пр недифференцированной дисплазии соединительной ткани сопровождаете стромально-паренхиматозными нарушениями и уменьшение васкуляризации, морфологическими проявлениями которых являютс признаки дезорганизации соединительной ткани вследствие дефекте пространственной организации структурных белков соединительной ткан (коллаген III и IV типов, ламинин).

3. Течение репаративных процессов в миометрии пр недифференцированной дисплазии соединительной ткани характеризуете преобладанием механизмов субституции, приводящих к формирована неполноценного рубца матки, морфологическими критериями которой является увеличение доли фиброзной ткани (более 10%) и признак дезорганизации соединительной ткани. Возможными молекулярным факторами формирования неполноценного рубца матки являете полиморфизм гена эстрогенового рецептора альфа, ламинина и сосудистс эндотелиального фактора роста.

4. Недифференцированная дисплазия соединительной ткани являете многофакторным симптомокомплексом, одним из основных механизме которого являются полиморфизм генов, регулирующих ремоделировани соединительной ткани, таких как: матриксная металлопротеиназа ! эстрогеновый рецептор бета, сосудисто-эндотелиальный фактор рост; Развитие акушерских осложнений ассоциировано с полиморфизмом гене структурных белков (ламинин, коллаген).

Личный вклад автора

Автор принимала непосредственное участие в выборе направления исследования, постановке задач, клиническом обследовании и лечении пациенток, в сборе биологического материала. Диссертантом разработаны специальные анкеты для сбора анамнеза, проведен анализ медицинской документации, статистическая обработка и научное обоснование полученных результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - «акушерство и гинекология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на X, XI и XII Российских научных форумах «Мать и дитя» (Москва, 2009, 2010, 2011); на IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010), на Российских конгрессах «Амбулаторно-поликлиническая практика - новые горизонты» и «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы» (Москва 2010, 2011); на итоговой научно-практической конференции ФГУ НИИФХМ ФМБА РФ (Москва, 2010), на 57th и 58thAnnual Meeting (Orlando, Florida, 2010, 2011), на научно-практической конференции «Развитие идей академика А.И.Струкова в современной патологической анатомии» (Москва, 2011) и V Региональном научном форуме «Мать и Дитя» (Геленджик, 2011), IV Всероссийском образовательном конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии» (Москва, 2011), на VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2012).

Обсуждение диссертации состоялось на конференции сотрудников акушерского обсервационного отделения (23 июня 2011), заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦ АГ и П им. академика В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России (05 сентября 2011) и ученом совете Центра(04 октября 2011).

Внедрение результатов работы в практику

Практические рекомендации, основанные на результатах исследовани: используются в работе акушерского обсервационного отделения ФГБ' «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академик В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. Материалы диссертаци используются в лекционном материале при обучении клинически ординаторов, аспирантов, повышении квалификации врачей в ФГБ' «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академик В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России, на семинарах, симпозиума; форумах.

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликованы 24 научные работы, в том числе 1 работ в журналах, утвержденных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 215 страницах компьютерного текста. Работ состоит из введения, 7 глав (обзор литературы, материал и метод! исследования, клиническая характеристика обследованных беременны? акушерские и перинатальные исходы, морфологические иммуногистохимические особенности миометрия и рубца мати молекулярно-генетические аспекты и обсуждение), выводов, практически рекомендаций и списка использованной литературы. Работа иллюстрирован 13 таблицами и 64 рисунками. Библиографический указатель включает 25 работ цитируемых авторов, из них на русском языке - 100 , на иностранны языках -150.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Согласно поставленным цели и задачам было обследовано 43 пациенток, находившихся под наблюдением и родоразрешенных в ФГБ' «НЦ АГиП им. В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России (директор д.м.н., профессор, академик РАМН Сухих Г.Т.) за период с 2007 по 2011 п (4 года). В ходе исследования были получены данные об особенностя анамнеза, состояния здоровья обследованных беременных. Всем пациентка]

проведено анкетирование и определение степени выраженности симптомов нДСТ (Кадурина Т.И., 2009).

Для определения критерия разделения пациенток на группы был проведен ROC-анализ. В качестве анализируемых исходов в ROC-анализе были использованы наиболее часто встречающиеся акушерские осложнения: острая гипоксия плода, отслойка плаценты, преэклампсия и др. Была проведена оценка данных моделей. При анализе риска острой гипоксии плода площадь под ROC-кривой составила 0,643 (0,545-0,740), р=0,01. Данное значение согласно экспертной шкале позволило оценить предложенную модель как удовлетворительную.

При анализе риска развития преэклампсии (плода площадь под ROC-кривой составила 0,608 (0,520-0,696), р=0,024. Данное значение согласно экспертной шкале позволило оценить предложенную модель как удовлетворительную.

В качестве порогового значения (cut-off) принят уровень выраженности нДСТ, соответствующий максимальной сумме чувствительности и специфичности. Для острой гипоксии плода значение cut-off находилось между 5,5 и 6,5 баллами (рис. 1), а для преэклампсии - между 5,5 и 8,5 баллами (рис. 2).

Выраженность нДСТ, баллы

» Чувствительность —•—Специфичность — — -Cut-off

Рисунок 1. Чувствительность и специфичность предсказания острой гипоксии плода по уровню балльной оценки выраженности нДСТ (по шкале Кадуриной Т.И., 2009).

100% 80% 60% 40% 20%

0%

,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00

Выраженность нДСТ, баллы

» Чувствительность ■ Специфичность — — -ол-оА

Рисыгок 2. Чувствительность и специфичность предсказания преэклампсни по уровш балльной оценки выраженности иДСТ (но шкале Кадуриной Т.И., 2009),

В качестве порогового значения выраженности нДСТ было принят значение, соответствующее максимальной суммарной чувствительности г: специфичности обеих моделей, которое соответствовало 6 баллам. Балльна-1 оценка нДСТ более 6 порогового значения классифицировалась как маркер акушерских осложнений. Для выбранного порогового значени чувствительность и специфичность предсказания острой гипоксии плод были 60,0% и 55,9% соответственно, а преэклампсни - 77,3% и 43,1°/' соответственно. Учитывая, что в обоих случаях предсказания акушерски:: осложнений по степени выраженности нДСТ чувствительность была выш: специфичности, данный критерий может быть использован в качеств скринингового теста для определения группы риска.

На основании полученных результатов пациентки были разделены на группы: основную (выраженность нДСТ более 6 баллов) расцениваемые ка пациентки с выраженной нДСТ, и группу сравнения (выраженность нДСТ менее 6 баллов), расцениваемые как пациентки без выраженной нДСТ. Такт образом, в исследование было включено 420 пациенток (случай - контроль) Из них 210 пациенток составили I (основную группу), имевшие более С

баллов по классификации Кадуриной Т.И., и 210 пациенток -II (группу сравнения), имевшие менее 6 баллов. Критериями включения пациенток Гг исследование являлись: наличие признаков нДСТ, возраст пациенток (18 д< 45 лет), срок беременности (38-40 недель). Критерии исключения дифференцированные формы ДСТ, тяжелая экстрагенитальная патология, многоплодная беременность, расположение плаценты в области рубца нг матке (при наличии рубца на матке).

Клиническое наблюдение беременных проводилось лично автором г акушерском обсервационном отделении ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Амбулаторное обследование проводилось в научно-поликлиническом отделении ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Клинические, гемостазиологические, иммунологические исследования выполнены в лабораториях ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. Ультразвуковые обследования беременных, послеродовой матки, а также кардиотокография плода проводились в отделении функциональной диагностики ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Морфологическое и иммуногистохимические исследования проводились в патологоанатомическом отделении №1 ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Молекулярно-генетическое исследование проводилось в лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

В работе были использованы следующие методы исследования:

1. Общеклинические.

2. Лабораторные:

а) клинический анализ крови (гемоглобин, гематокрит, лейкоциты, тромбоциты, СОЭ, лейкоцитарная формула);

б) исследование системы гемостаза с определением следующих параметров (концентрация фибриногена, уровень протромбинового индекса, агрегации тромбоцитов, тромбоэластографии, продуктов деградации фибрина и фибриногена);

в) биохимическое исследование крови (определение содержания общего белка, глюкозы, мочевины, креатинина, АсТ, АлТ, щелочной фосфатазы);

г) молекулярно-биологические методы (диагностика вируса простого герпеса, цитомегаловируса, хламидий, уреа- и микоплазм проводили методом полимеразной цепной реакции). ПЦР включала выявление ДНК-инфекционного агента путем праймерспецифической амплификации ДНК в клинических образцах термостабильным полимеразным ферментом до точки, где реакционный продукт может быть обнаружен путем электрофореза в агарозном геле, гибридизацией нуклеиновых кислот или основанной на иммуноферментном тесте колориметрической реакцией;

д) иммунологические методы. Наличие в крови специфических антител к вирусу простого герпеса, цитомегаловирусной инфекции классов ^О («анамнестических») и 1§М («острых») определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА). Учет результатов ИФА проводили на

фотометре «Мультискан» по оптической плотности в исследуемых лунках н длине волны 492 нм. Результаты выражали величиной титра антител. Состояние иммунной системы оценивали по концентрациі иммуноглобулинов трех основных (А, М, G) классов методом радиальноі иммунодиффузии по Манчини. Фенотипическую характеристик; лимфоцитов в периферической крови изучали методом проточної цитофлюориметрии на приборе «Bio Rad» (США), с использование( моноклональных антител «Becton Dickinson» основных популяциі лимфоцитов: Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цитолитических Т-клеток естественных киллеров, В-лимфоцитов с помощью моноклональных антите. к дифференцировочным антигенам соответственно CD3+, CD4+, CD8+, CD164 CD19+, CD25+, HLA-DR. Кроме того, вычисляли иммунорегуляторньїі индекс (CD4+/CD8+).

3. Дополнительные методы исследования:

а) ультразвуковое исследование. Всем беременным проведеї ультразвуковой скрининг в 22-24 и 36-38 недель с использование» ультразвуковых аппаратов «Aloka SSD-680», «Toshiba-38A» (Япония] работающих в реальном режиме времени. Полученные результаті биометрии плода сравнивали с нормативными значениями, предложенным] В. Н. Демидовым и соавт. (1995), рассчитывали предполагаемую массу тела і длину плода. Зрелость плаценты оценивали по степеням: О, I, II, III (п< методике P. A. Grannum, 1983). Особое внимание уделяли толщине нижнеп сегмента матки, наличию дефектов, варикозному расширению вен, ниш и т.,п в области рубца на матке, расположению плаценты;

б) допплерометрия параметров кровотока в сосудах системы мать- плацента плод проводилась при помощи ультразвуковых сканеров «Siemens» - Antare и «Aloka SSD-4000» с использованием трансабдоминальных датчико: частотой 3,5 и 5,0 МГц в режиме пульсовой допплеровской волны;

в) антенатальная кардиотокография проведена методом неинвазивноп ультразвукового зондирования, основанного на эффекте Допплера прі абдоминальном расположении датчика. Исследование выполнено прі помощи аппаратов 8030А фирмы «Hewlet Packard» (США), МТ-801 фирмі «Toitu» (Япония) и современного многофункционального монитор «Феталгард-2000», дополненного персональным компьютером і математическим обеспечением анализа кардиотокограмм в реальном режима времени.

4. Морфологические методы исследования.

Использовали ткань из стыка миометрия и рубцовой ткани, полученные і ходе повторной операции кесарева сечения (160 биоптатов) и миометрий полученный в ходе первичного кесарева сечения (47 биоптатов). Материа. фиксировали в 10% нейтральном формалине с фосфатным буфером обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей фирмы «Роо Scientific Instruments» (Швейцария) и заливали в парафин. Срезь

фиксировали на предметные стекла, покрытые адгезивом (полилизин, APES) и инкубировали в термостате при 37° С в течение 12 часов. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, толлуидиновым синим и пикрофуксином по Ван Гизону. Проводили качественную сравнителую оценку содержания клеток СТ (фибробластов и фиброцитов), сосудистого компонента и КВ.

Иммуногистохимическое исследование выполнялось на биоптатах рубцов и ткани миометрия матки, взятых в ходе операции кесарева сечения у 207 женщин. ИГХ реакции проводили на депарафинированных срезах толщиной 3-4 мкм, расположенных на стеклах, покрытых APES - слоем (Janice А., 1983). Срезы от каждого случая обрабатывали с помощью стандартного микроволнового метода иммуногистохимии. В качестве первичных антител использовались моноклональные антитела к Col Ш, IV типов, ламинину и VEGF (Lab Vision, ready-to-use) и рецепторам эстрогенов (а и Р) и прогестерона (Lab Vision, 1:100).

Для иммуногистохимических реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергали стандартной процедуре иммуногистохимии, но без добавления первичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы производителя. Оценку результатов проводили по ббалльной шкале: для рецепторов эстрогенов и прогетсерона - по процентному содержанию окрашенных клеток в 5 полях зрения; для коллагенов и ламинина - по процентному содержанию окрашенной соединительной ткани в 5 полях зрения.

5. Молекулярно-генетические методы исследования.

Выделение ДНК проводили по методу Higuchi (R.Higuchi, H.Erlich, 1989) с некоторыми модификациями. Полученные образцы ДНК до типирования хранили при t-20°C. Концентрация ДНК определенная на ДНК-минифлуориметре (Hoefer, США), составляла в среднем 50-100 мкг/мл.

В ходе генотипирования использовали один общий олигонуклеотид с гасителем флуоресценции и два сиквенс-специфичных олигонуклеотида несущих различные флуорофоры. Определение генотипа проводили путем анализа кривых плавления. ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

ДНК для генотипирования выделяли из цельной крови с помощью системы выделения «Проба-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Определение замен одиночных нуклеотидов проводили модифицированным методом «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing probes), используя оригинальные олигонуклеотиды (Кофиади И. А., Ребриков Д.В., 2006).

Для оценки распространенности исследуемых генных полиморфизмов популяции использовали коллекцию периферической крови 102 здоровы женщин

Таблица 1. Изученные полиморфизмы генов.

Хромо сома Ген Идентификат ор* Полиморфизм Тип, регион Позиция хромосом

2 СОЬЗА1 «1800255 2092 (2209) (А1а698Т11г) Миссенс 18957 232

2 СОЬЗА1 «1801184 2244Т>С (ау74801у) Синоними чная 18957282'

12 СОЬ2А1 «1635529 8184А>С Интрон 1 46681369

17 СОЫА1 « 1107946 -19970А Промотор 45635989

1 ЬАМС гз10911193 -2204 ОТ Промотор 18125727:

20 ММР9: «17576 836 (855) А>в (С1п279Агя) Миссенс 44073632

16 ММР2 «243865 -1306 С>Т Промотор 54069307

16 ММР2 «2285052 -735 ОТ Промотор 54069658

11 ММРЗ «3025058 -1171 5А>6А Промотор 10222116:

22 Т1МРЗ «5749511 -1296 ОТ Промотор 31526384

6 ЕО!М1 «10478694 -13Ые1А Промотор 12398718

6 ЕЭЫ1 «5370 5940Т Миссенс 12404241

(Lysl97Asn)

6 ESR1 rs2077647 (rs 17847075) 30 A>G (SerlOSer) Синоними чная 152129 077

6 ESR1 Rs2234693 -397 T>C (Pvull) Интрон 1 152163 335

6 ESR1 Rs9340799 -351G>A(Xbal) Интрон 1 152168 381

6 ESR1 Rs2228480 2014 G>A (Thr594Thr) Синоними чная (Ехоп 8) 152420 095

6 ESR1 rs3798577 1029 C>T З'-UTP 152421 130

14 ESR2 rsl271572 -12214 G>T Промотор 63831670

6 VEGFA rs2010963 -634 (-94) G>C Промотор 43846328

6 VEGFA rs699947 -2578 A>C Промотор 43844367

6 VEGFA rs3025039 936 C>T З'-UTP 43860514

* - Обозначение в базе данных dbSNP национального центра биотехнологической информации США (National Center for Biotechnological Information, NCBI)

6. Статистическая обработка полученных результатов была проведена н персональном компьютере при помощи программного пакета "SPS! Statistics 17.0 for Windows". Распределение исследуемых величи; значительно отклонялось от нормального, поэтому при анализе применял непараметрические методы, так же как и для анализа переменны* относящихся к порядковой шкале (данные по выраженности клинически: симптомов, степень выраженности и активности воспаления). По этой ж причине в описательном (дескриптивном) анализе данных приведен! медиана и межквартильный интервал (25-й и 75-й процентиль), а н среднее значение и стандартное отклонение. Для сравнения средни: величин использовали следующие непараметрические тесты:

• тест Уайта (для малых выборок: обработка результате: иммуногистохимического анализа с малыми выборками была проведен вручную при помощи калькулятора и таблиц значений F);

• U тест по методу Манна-Уитни (при сравнении 2-х независимы: выборок);

• ранговый коэффициент корреляции по Спирману (для определени связи между переменными). При оценке достоверности выявленны: различий между средними значениями выборок и достоверност: вьивленной корреляции рассчитывали вероятность ошибки р;

• критерий у2 (для определения статистической значимости различи] частот аллелей и генотипов).

Анализ неравновесности сцепления проводили с помощью свободно распространяемого продукта Haploview версии 4.2 (Barrett J.C., 2005' Подготовку данных для анализа осуществляли с помощью SNP_tools вереи] 1.61 - свободно-распространяемого расширения для MS Excel (Chen В 2009).

Статистическую обработку данных проводили с помошью свобод» распространяемого программного продукта WINPEPI версии 10.7 (Abramsoi J.H., 2004). Для определения статистической значимости различи] применяли критерии Фишера и Манна-Уитни для несвязанны: совокупностей.

Непосредственная оценка эффективности классификации и качеств модели была получена с помощью расчета численного показателя площад! под ROC-кривой (AUC) с помощью метода трапеций (табл. 2).

Таблица 2. Оценка эффективности классификации и качества модели

Интервал AUC Качество модели

0,9-1,0 Отличное

0,8-0,9 очень хорошее

0,7-0,8 Хорошее

0,6-0,7 Среднее

0,5-0,6 Неудовлетворительное

Для установления точки cut-off проводился пересмотр значений классификационной функции от максимального до минимального значения. Для каждого значения проводили разделение групп с определением чувствительности и специфичности. Критерием определения порога отсечения выбрано требование максимальной суммарной чувствительности и специфичности модели.

Комитет по этике биомедицинских исследований при ФГУ «НЦ АГиП им. академика В.И. Кулакова» пройден 18 июня 2009г, выписка из протокола №39.

Результаты исследования и их обсуждение

Все пациентки, включенные в исследование были сопоставимы по возрасту и соматическому здоровью. Возраст беременных, включенных в исследование, колебался от 22 до 45 лет и составил в среднем 30,2 ±1,2 и 28,2 ± 0,9 лет соответственно по группам. Анализ массо-ростовых отношений у обследованных нами беременных отклонений от популяционных норм не выявил: средняя масса тела составила 60,8+2,14 и 63,3+ 2,15 кг, средний рост 167,1+3,2 и 164,9+ 4,6 см соответственно по группам. Однако у пациенток основной группы отмечались более высокие значения массо-ростового коэффициента 2,9 и 2,7, соответственно, не имеющие статистической значимости. Учитывая мультифакториальность синдрома нДСТ, а также системность поражения при данной патологии, важное значение имеет изучение анамнеза, исходного состояния здоровья матери, в связи с чем, было изучено состояние здоровья исследуемых беременных с анализом особенностей соматического и гинекологического анамнеза.

Различий в частоте перенесенных инфекционных заболеваний в детстве в группах выявлено не было, однако в основной группе чаще отмечались краснуха (54,7%), пневмония (17,6%) и ОРЗ (64,8%) (OR =1,2; С1=0,7-1,6 и OR =4,1; CI=0,9-6,9, OR=l,3; CI=0,6-2,1 -соответственно), в то время как во II - ветряная оспа (20,5%), (OR =0,8; С1=0,4-1,3).

Среди заболеваний JlOP-органов у пациенток основной группы превалировал хронический тонзиллит - 23,3% (OR =2,5; С1=1,7-2,9) и хронический гайморит - 8,9% (OR =2,4; С1=1,1-3,2). Кроме того, в 2,9% случаев в данной группе была произведена тонзилэктомия. В частоте других заболеваний различий выявлено не было. Также у пациенток с нДСТ имела место более высокая частота хронического бронхита -9,0% (OR =1,6; С1=0,5-1,9) и бронхиальной астмы -4,3%(OR =1,4; С1=0,1-1,7), однако вышеуказанные различия также не имели статистической значимости.

Значительный удельный вес в соматическом анамнезе в нашел исследовании у пациенток основной группы среди заболеваний сердечно сосудистой системы составили ПМК 20,9% ((Ж =4,4; С1=2,9-5,8) и ВС£ 46,2%, ((Ж =1,7; С1=1,4-2,6), кроме того, у пациенток данной группы в 2,і раза чаще регистрировали варикозную болезнь. При изучении заболевание желудочно-кишечного тракта нами была установлена более высокая частоте хронического гастрита 22,4% (СЖ =1,6; С1=1,3-2,2) и гастродуоденита -8,1 °А (011 =3,2; С1=2,1-4,9) в основной группе. Также в данной группе в 2 разг чаще диагностировали язвенную болезнь 12-ти перстной кишки і дискинезию желчевыводящих путей (ОЯ =0,3; С1=0,1-1,7). Среде заболеваний мочевыделительной системы у пациенток основной группь чаще диагностировали хронический пиелонефрит - 19,5% (011 =3,3; С1=2,1-4,9), и только в этой группе отмечены нефроптоз (4,3%) и МКБ (5,7%).

По данным Подзолковой Н.М. (2002) и Рочевой С.Л. (2006) к одним и; частых клинических проявлений нДСТ относится миопия. Согласно полученным нами результатам, имела место высокая частота миопии і основной группе (у каждой 3-й пациентки) с превалированием миопие средней 20,5%(ОЯ =1,4; С1=1,1-2,6) и высокой степени 8,6% (011=1,4; С1=1,1-2,9), с хирургической коррекцией в 3,5% случаев. Кроме того, в 4 раза чаще і основной группе выявляли астигматизм. Анализ заболеваний эндокринное системы в группах не выявил достоверных различий в частоте. Вместе с тем в основной группе чаще отмечались узловой зоб - 4,3% (ОЯ =2,0; С1=0,1-2,8" и аутоиммунный тиреоидит- 7,1% (ОЯ =1,4; 0=0,9-2,6). Кроме того, толькс в основной группе отмечалась патология молочных желез (фиброзно-кистозная мастопатия) - 10,0%, из них 2,4 % пациенток указывали нг перенесенные операции на молочной железе в анамнезе. При изучение опорно-двигательного аппарата с целью уточнения степени выраженносте нДСТ, было выявлено преобладание сколиоза и плоскостопия в основное группе. Кроме того, 11,9% (ОЯ =2,3; С1=1,3-3,9) обследованных пациентов основной группы указывали на вывихи в анамнезе.

По данным Левенец С.А. (2006), нДСТ оказывает влияние на состояние репродуктивного здоровья, течение беременности и родов, что обусловило интерес изучения акушерского и гинекологического анамнеза.

Средний возраст наступления менархе в обеих группах был практически одинаков и составил в среднем 13,2±1,2 лет, однако у пациенток основной группы в 2 раза чаще имело место позднее менархе (более 15 лет) и нерегулярный менструальный цикл. Продолжительность менструального цикла составила - 29,7+0,6 и 29,3+0,6 дней соответственно. Подавляющее большинство пациенток обеих групп ранее наблюдались и лечились по поводу различных заболеваний женских половых органов. При изучении структуры гинекологической заболеваемости была отмечена высокая частота цервицита (у каждой 2-й пациентки) в I группе (65,2%) (011=1,4; С1=1,2-2,3) и хронического сальпингоофорита (16,6%) (ОЯ=3,3; С1=2,1-3,8). Дисфункция

яичников встречалась только у пациенток I группы 9,0% (OR=2,4; С1=1,9-3,7). Полученные нами данные согласуются с результатами Клеменова A.B. (2003) и Смольновой Т.Ю. (2003), указывающих на высокую частоту нарушения репродуктивной функции у пациенток с нДСТ. Достоверных различий по другим нозологиям в группах выявлено не было (эндометриоз 8,1% и 5,2% (OR=l,2; С1=0,5-2,0), бесплодие 10,9% и 9,5% (OR=l,2; С1=0,2-2,2) соответственно).

При проведении анализа исходной инфекционно-воспалительной заболеваемости с определением спектра возможных возбудителей у пациенток основной группы преобладали ВПГ 19,5% (OR=l,7; ¿1=0,5-2,4) и ЦМВ 13,8% (OR=2,4; CI=0,2-3,7), а также, уреаплазма 17,6% (OR=l,2; С1=0,3-1,8) и микоплазма 5,2% (OR=2,0; С1=0,1-1,2).

Большинство пациенток, включенных в исследование, были повторнородящими. У каждой 4-й пациентки основной группы и каждой 5-й группы сравнения отмечались искусственные аборты в анамнезе. Однако в основной группе в 4 раза чаще отмечались ранние выкидыши - 10,0% (OR=3,9; 01=2,7-7,0), также только в этой группе отмечены поздние самопроизвольные выкидыши (8,1%). Указанное свидетельствует о неблагоприятном акушерском анамнезе при нДСТ, что необходимо учитывать при планировании беременности у данных пациенток.

Учитывая значимость исходного состояния здоровья, особенностей анамнеза, исходов предыдущих беременностей на течение репаративных процессов при формировании рубца на матке, а также отсутствие данных об особенностях течения беременности при нДСТ и рубце на матке, мы считали целесообразным выделить группу беременных с рубцом на матке. Ввиду того, что работа проведена на клиническом материале, динамическое исследование биопсий миометрия после кесарева сечения невозможно как по этическим, так и техническим причинам.

Возраст беременных колебался от 22 до 45 лет и составил в среднем 32,8 ±3,3 и 31,2 ±4,0 лет соответственно по группам. Проведенный анализ свидетельствовал о том, что в обеих группах преобладали пациентки старше 30 лет, что, по-видимому, было обусловлено повторными родами.

При анализе массо-ростовых отношений у обследованных беременных отклонений от популяционных норм не выявлено, средняя масса тела составила 76,9+2,14 и 79,6+ 2,15 кг, средний рост 166,5+ 4,6 и 165,3+3,2 см соответственно по группам. Различий по частоте перенесенных инфекционных заболеваний в детстве в группах выявлено не было.

В соматическом анамнезе у пациенток основной группы среди заболеваний ССС превалировал ПМК 17,2% (OR =6,4; С1=1,3-10,3) и ВСД 29,7%, (OR =2,6; С1=1,1-6,3), кроме того, только у пациенток данной группы отмечалась гипертоническая болезнь. Среди заболеваний МВС у пациенток основной группы чаще отмечались хронический пиелонефрит 17,2% (OR =2,4; С1=0,9-7,5), хронический цистит 9,3% (OR =2,1; С1=0,5-5,8), и только в

данной группе отмечен нефроптоз (1,6%). Достоверных различий в частот! МКБ в группах не выявлено. Различий в частоте заболеваний JIOP-органо] (хронический тонзиллит, хронический фарингит, ангина) также вьивлено н< было.

Обращала на себя внимание высокая частота миопии в обеих группах, () каждой 3-й пациентки), при этом у пациенток основной группь превалировала миопия высокой степени - 18,7% (OR=3,5; С1=1,1-11,3), в тс время как во II группе - слабой 12,5% (C>R=0,4; С1=0,2-1,6) Анализ заболеваний эндокринной системы в группах не выявил достоверны} различий в частоте. При этом только в основной группе отмечалаа патология молочных желез (ФКМ) 3,8%.

Среди особенностей менструального цикла следует отметить, что j пациенток основной группы в 2 раза чаще регистрировали позднее менарх* (более 15 лет).

При изучении структуры гинекологической заболеваемости был! отмечена высокая частота цервицита (у каждой 3-й пациентки) в перво{ группе 31,3% (0R=1,7; С1=0,3-2,8) и хронического аднексита 12,5% (OR=2,2 С1=0,6-4,5). Во II группе преобладал вагинит 10,9% (OR=0,7; С1=0,2-2,3) Достоверных различий по другим нозологиям в группах выявлено не былс (эндометриоз 7,0% (OR=l,2; С1=0,3-5,2), бесплодие 15,6% (OR=0,7; С1=0,3 1,8) соответственно). Учитывая высокую частоту воспалительны? заболеваний в анамнезе у пациенток обеих групп, был проведен анали: спектра возбудителей. Достоверных различий выявлено не было.

Все пациентки были повторнородящими. В основной группе чащ( отмечались ранние и поздние самопроизвольные выкидыши. При проведенш корреляционного анализа Пирсона была выявлена зависимость междз наличием варикозной болезни с неразвивающейся беременностью в анамнез< и отслойкой хориона.

Таким образом, достоверных различий в клинической характеристик! пациенток с рубцом на матке в отличие от беременных без рубца на мате выявлено не было. Выделенные особенности соматического статуса гинекологического и акушерского анамнеза у пациенток основной группы по-видимому, отражают влияние нДСТ на состояние репродуктивной функции, что обосновывает целесообразность проведения исследований пс изучению особенностей течения беременности, родов, послеродового \ раннего неонатального периодов. Вместе с тем, ряд установлении? особенностей клинической характеристики у пациенток с рубцом на мата послужили основой для проведения корреляционного анализа с целью выделения клинических предикторов неполноценности рубца матки.

Одним из частых осложнений I триместра у беременных с нДСТ является ранний токсикоз, который достигает 48,6% (Летучих A.A., 2000). При этом наблюдается прямая, достоверная корреляция между степенью тяжести клинической картины и частотой развития и тяжестью раннего

токсикоза (Козинова О.В., 2009). В нашем исследовании также отмечена высокая частота раннего токсикоза. Так, течение настоящей беременности в I триместре у пациенток основной группы осложнялось ранним токсикозом в 57,6% (OR=l,4; С1=1,2-3,9). Кроме того, отслойка хориона имела место в 8,1% (OR=l,6; С1=1,2-4,9), а угроза прерывания в 49,0% (OR=l,5; С1=1,2-2,7). Последнее согласуется с данными Гурбановой С.Р. (2007), указывающей на высокую частоту угрозы прерывания беременности (до 50%) у женщин с нДСТ.

Также было установлено осложненное течение II триместра в виде угрозы прерывания в 42,4% (OR=3,l; С1=1,3-8,6), с формированием ИЦН в 8,6% случаев (OR=3,l; С1=1,6-8,9), потребовавшей проведения хирургической коррекции у пациенток основной группы. Следует отметить, что у подавляющего большинства пациенток хирургическую коррекцию проводили и в предыдущей беременности. Также, в основной группе чаще отмечены: преэклампсия (4,3%) и гиперандрогения (5,2%).

Из особенностей течения III триместра беременности следует отметить высокую частоту угрозы преждевременных родов — 20,9% (OR=2,l; С1=1,6-4,5), плацентарной недостаточности - 34,8% (OR=3,7; С1=2,1-7,9), и гипоксии плода-17,1% (OR=2,7; С1=1,8-5,3). Также у пациенток основной группы чаще регистрировали патологию околоплодных вод в виде много- и маловодия, однако данные различия не имели статистической значимости.

Большинство пациенток были родоразрешены через естественные родовые пути 79,2% и 84,6%, соответственно. Следует отметить, что основными показаниями к оперативному родоразрешению являлись: преждевременное излитие околоплодных вод при отсутствии эффекта от родовозбуждения - 9,3% и 4,8% (OR=2,0; С1=1,2-4,5); слабость родовой деятельности - 9,1% и 1,3% (OR=l,6; С1=1,9- 6,2); гипоксия плода - 5,0% и 2,5%, соответственно (OR=l,5;CI= 1,2-6,3).

По данным Летучих A.A. (2000) у пациенток с ДСТ отмечается более высокая частота аномалий родовой деятельности, и, как следствие, более продолжительные роды. В нашем исследовании длительность I периода родов составила 9 ч 31 мин и 8 ч 53 мин, II - 22 мин и 19 мин, а III - 16 мин и 9 мин соответственно в I и II группах. Таким образом, несмотря на отсутствие достоверных различий было установлено, что у пациенток с нДСТ отмечается более длительное течение родов, обусловленное, по-видимому, особенностями структурной организации соединительной ткани. В основной группе во время родов достоверно чаще диагностировали слабость родовой деятельности - 12,4%. Также чаще отмечались слабость потуг и дискоординация родовой деятельности, не имеющие статистической значимости, однако явившиеся показаниями к экстренному оперативному родоразрешению в родах. Кроме того, течение родов у пациенток основной группы чаще осложнялось разрывами влагалища - 11,4% (OR=l,6; С1=1,2-2,9) и шейки матки - 17,1% (OR=l,3; С1=1,1-3,6). При этом у 5,2% пациенток

основной группы отмечено образование гематом, потребовавши* хирургического лечения. Течение последового периода у пациенток с более выраженными симптомами нДСТ чаще осложнялось плотные прикреплением плаценты 5,7% (СЖ.=1,2; С1=0,9-3,6), в связи с чем, былг проведена операция ручного отделения плаценты и выделения последа Средняя кровопотеря при родоразрешении составила 363,6±24,5 мл V 312,7±22,9 мл в I и II группах соответственно.

Изучение особенностей течения послеродового периода не выявило статистически значимых различий, однако у пациенток основной группы чаще диагностировали эндометит 2,8% (СЖ.=1,2; С1=0,2-3,7), субинволюцик 6,2% (011=1,4; С1=0,3-6,3), также только в основной группе имели месте случаи позднего послеродового кровотечения, потребовавши* хирургического лечения.

Нами также изучен исход родов для плода и течение раннегс неонатального периода у новорожденных. Анализ данных показал, что дети матерей основной группы имели более высокие показатели массо-ростовогс коэффициента и более низкую оценку состояния по шкале Апгар при рождении, однако данные результаты не имели статистической значимости В раннем неонатальном периоде у новорожденных основной группы чаще отмечалась неонатальная желтуха - 19,5% (0Я=1,8; С1=1,3-3,7), недостаточность питания - 10,5% (011=1,8; С1=1,1-3,2), кровоизлияния е склеры - 17,6% (СЖ=3,4; С1=2,2-8,7). Также у этих детей чаще диагностировали синдром срыгивания 4,3% (СЖ=1,4; С1=0,2-3,7).

Из особенностей течения беременности у женщин с рубцом на матке в I триместре следует отметить высокую частоту раннего токсикоза 45,0% (011=1,6; С1=1,1-2,8). Во II триместре у пациенток основной группы чаще отмечалась угроза прерывания беременности 36,3% (СЖ=1,8; С1=1,3-3,3) и ИЦН 13,8%(011=3,1; С1=2,1-8,6), в связи с чем, в большинстве случаев проводилась хирургическая коррекция. Однако зависимости между ИЦН и наличием искусственного прерывания беременности в анамнезе выявлено не было. Указанное, по-видимому, свидетельствует о функциональном характере ИЦН у пациенток с неполноценными рубцами на матке при нДСТ. В III триместре течение беременности у пациенток основной группы также чаще осложнялось угрозой прерывания беременности 21,8% (011=1,4; С1=1,2-3,9), плацентарной недостаточностью, сопровождающейся ЗРП 19,1% (011=3,7; 0=1,6-9,0).

Учитывая наличие рубца на матке, пациенткам обеих групп перед родоразрешением проводили УЗИ, при этом в обеих группах были выявлены признаки неполноценности в виде истончения рубца матки до 1 мм у 42,4% и 28,6% (ОЯ=1,6; С1=1,2-6,2) соответственно (рис. 3). Кроме того, при УЗИ у пациенток основной группы чаще регистрировали патологию околоплодных вод в виде много- и маловодия, однако данные различия не имели статистической значимости.

Рисунок 3, Ультразвуковая картина рубца на матко: а) признаки неполноценности в виде истончения рубца матки до 1мм; б) толщина рубца 4мм.

Рисунок 4. Макроскопическая картина нижнего маточного сегмента (слева -неполноценный рубец матки; справа -полноценный рубец матки)

Все пациентки были родоразрешены путем операции КС. При этом частота экстренного КС превалировала в основной группе (66,2%). Следует отметить, что основными показаниями к родоразрешению являлись: начало родовой деятельности (17,3% и 7,5%), подозрение на неполноценность рубца на матке (6,4% и 2,5%) и преждевременное излитие околоплодных вод (8,8% и 2,5%). Показания к экстренному родоразрешению со стороны плода в I и II группах составили 5,0% и 2,5% соответственно. Средняя кровопотеря при родоразрешении составила 768,4±43,2 мл и 684,5±38,1 мл в I и П группах соответственно.

Интраоперационно неполноценность рубца на матке у пациенток основной группы была выявлена в 63,6% случаев, в то время как в группе сравнения 47,6% (рис.4). Кроме того, дефект рубца в виде формирования втяжения, ниши встретился только в основной группе (12,5%). Обращает на себя внимание высокая частота варикозного расширения вен нижнего маточного сегмента в основной группе 37,9% и 10,6% (011=3,3; С1=1,7-5,9) и спаечного процесса 12,5% и 7,5% соответственно (011=1,7; С1=1,2-4,6). В одном случае потребовалась резекция сальника (1,3%).

Изучение особенностей течения послеродового периода не выявило статистически значимых различий у пациенток обеих групп. Изучение исхода родов для плода и течение раннего неонатального периода > новорожденных установило, что в основной группе чаще диагностировали неонатальную желтуху, транзиторное тахипноэ, а также только в этой группе выявлено внутричерепное кровоизлияние. Кроме того, в I группе чаще встречалась ЗРП. Однако у ряда пациенток с нДСТ дети также при рождении имели признаки нДСТ разной степени выраженности.

Таким образом, течение беременности, родов и послеродового периода при нДСТ сопровождается высокой частотой развития осложнений. В ходе проведенного исследования получены данные о высокой частоте раннегс токсикоза, угрозы прерывания в различные сроки. Кроме того, былг отмечена высокая частота ПН и несвоевременного излитая околоплодных вод и др. По мнению Милованова А.П. (1999) и Баркова Л.А. (2000' указанное может происходить вследствие нарушения маточно-плацентарной и плодовой гемодинамики и, как следствие, транспортной, трофической, эндокринной, метаболической функции плаценты, морфологическим субстратом которых являются различные формы нарушения созревания плаценты (Летучих A.A. и соавт., 2000). Помимо высокой частоты акушерских осложнений у беременных с нДСТ, анализ течения раннегс неонатального периода у их новорожденных также выявил высокую частоту развития осложнений. Указанное свидетельствует о значимом вкладе нДСТ в развитие акушерских и перинатальных осложнений и обусловливает необходимость проведения комплексных исследований по изучении] взаимосвязи выраженности фенотипических проявлений данной патологии с неблагоприятными исходами для матери, плода и новорожденного. Неблагоприятное влияние нДСТ на течение репаративных процессов в миометрии, приводящее к формированию HP, по-видимому, объясняет более высокую частоту осложнений при наличии рубца на матке у беременных с нДСТ. Так как наибольший интерес в настоящее время представляет поиск неблагоприятных прогностических факторов, был проведен корреляционный анализ, установивший зависимость между наличием варикозной болезни с неразвивающейся беременностью в анамнезе и отслойкой хориона. Также была установлена взаимосвязь между формированием HP с миопией высокой степени и ПМК, которые могут рассматриваться как клинические предикторы формирования HP.

Учитывая изменения, претерпеваемые маткой во время беременности (максимальные гиперплазия и гипертрофия миометрия), системность поражения при нДСТ и отсутствие данных об особенностях строения миометрия при нДСТ, было проведено морфологическое и иммуногистохимическое изучение миометрия у пациенток с нДСТ различной степени выраженности.

При морфологическом исследовании ткани миометрия, полученной при первичном кесаревом сечении у женщин без признаков нДСТ было обнаружено упорядоченное расположение гипертрофированных мышечных волокон, отек лейомиоцитов, наличие в строме большого количества соединительнотканных фибрилл, располагавшихся в экстрацеллюлярном матриксе вдоль гладкомышечных клеток. Сосудистое русло было представлено в основном сосудами капиллярного и синусоидного типа. Воспалительный инфильтрат отсутствовал. В группе женщин со слабой степенью выраженности нДСТ обнаружили схожие изменения: лейомиоциты с отеком, соединительнотканные волокна в большом количестве и неравномерное их распределение. Сосудистое русло также было преимущественно представлено сосудами капиллярного и синусоидного типа, но вдоль некоторых из них определялась слабая лимфогистиоцитарная воспалительная инфильтрация. Отсутсвие выраженных различий в контрольной группе и группе с минимальными проявлениями нДСТ позволило в дальнейшем объединить их в одну группу.

У женщин с высокой степенью выраженности нДСТ был выявлен более широкий спектр морфологических изменений. Основные структурные изменения диффузно-очагового характера были обнаружены в ЭЦМ. Имелись очаги мукоидного набухания с феноменом метахромазии при окраске толуидиновым синим, которые располагались как в периваскулярной ткани, так и независимо от близости сосудов. В периваскулярной ткани обнаружены очаговые скопления лимфо-гистиоцитарных элементов. Соединительнотканные волокна определялись в умеренном количестве и при окраске по Ван Гизону имели бледно-розовый цвет, располагались неравномерно и хаотично и имели разрывы. Встречались лейомиоциты с выраженным отеком и развитием гидропической дистрофии вплоть до фибриноидного некроза отдельных гладкомышечных клеток. Сосуды были представлены капиллярами и синусоидами в большом количестве, обнаруживались также венулы с дилатированными просветами, вокруг которых, нередко располагались диапедезные кровоизлияния. По периферии кровоизлияний и очагов фибриноидного некроза определялась лимфогистиоцитарная инфильтрация с небольшой примесью лейкоцитов. Следует отметить, что мы не встретили в литературе данных по изучению зависимости особенностей строения миометрия от степени выраженности нДСТ.

Учитывая выявленные изменения в содержании миоцитов и компонентов ЭЦМ, было проведено определение коэффициента соотношения паренхиматозно-стромальных (0,6 и 1,1 соответственно) компонентов, который, как мы установили, был значительно ниже при выраженных симптомах нДСТ. Особенности сосудистого компонента миометрия послужили основой для оценки кровоснабжения миометрия. Был вычислен коэффициент васкуляризации (отношение объемной плотности

сосудов в миометриии к суммарной объемной плотности миоцитов), который составил соответственно по группам 1,3 и 1,7, что отражает снижение васкуляризации при нДСТ.

При морфологическом исследовании миометрия было установлено нарушение паренхиматозно-стромальных отношений при нДСТ, которое выражалось в снижении содержания стромального компонента и снижении васкуляризации. Также следует отметить повреждение миоцитов в виде гидропической дистрофии при низкой степени нДСТ и апоптоз гладкомышечных клеток при высокой степени нДСТ.что может быть причиной нарушения гемодинамики в микроциркуляторном русле и развития тканевой гипоксии. Таким образом, при нДСТ имеются морфологические признаки дезорганизации соединительной ткани с воспалительными реакциями и дистрофическими изменениями лейомиоцитов, отражающие нарушение процессов репарации в миометриии. Учитывая результаты морфологического исследования миометрия, интерес представляло изучение структуры ЭЦМ, в частности, содержания коллагеновых волокон, ламинина и др.

Содержание ламинина в ЭЦМ, который часто связывают с генезом пролапса гениталий, было снижено. По-видимому, уменьшеное содержание ламинина обусловливает «слабость» миометрия и может являться основой развития таких осложнений, как угроза прерывания беременности, ИЦН, аномалии родовой деятельности.

При анализе спектра коллагенов нами было выявлено преобладание коллагена Ш типа, являющегося эмбриональным типом коллагена, характерным для рубцовой ткани. При нормальном течении репаративных процессов данный коллаген должен замещаться на коллаген I типа. По-видимому, преобладание эмбрионального коллагена является фактором дезорганизации СТ. Было обнаружено увеличение содержания Col IV типа в интерстициальной ткани, являющегося основным коллагеном базальных мембран сосудов, что может быть обусловлено как генетическими дефектами коллагенов, так и нарушениями катаболизма белков (ММР, ТШР).

На следующем этапе был проведен анализ баланса ММР и TIMP, который выявил увеличение содержания ММР 2 как в ЭЦМ, так и в гладкомышечных клетках при нДСТ. При этом в I группе максимальная экспрессия маркера в фибробластах была выше, чем в группе сравнения. Учитывая влияние TIMP на активность ММР была определена экспрессия TIMP1 и установлено увеличение последней в ГМК при нДСТ, менее значимое в сравнении с ММР.

Таким образом, в группе сравнения отмечается сбалансированное однонаправленное увеличение ММР и TIMP, тогда как при нДСТ матриксные металлопротеиназы превалировали над ингибиторами, что может приводить к дезорганизации соединительной ткани.

Как известно, одним из возможных факторов, влияющих на катаболизм коллагенов, может быть дефицит магния, который, стабилизирует некодирующие РНК. Согласно полученных нами данных, при нДСТ имеет место достоверное снижение содержания магниевых каналов в ГМК до 2,9 баллов (5,6 баллов в группе сравнения), что приводит к дестабилизации РНК и, как следствие, увеличению активности ММР. В работах Громовой O.A., Торшина И.Ю. (2009) описаны возможные механизмы магниевой недостаточности при нДСТ, в нашем исследовании показан один из возможных путей формирования магниевого дефицита при нДСТ в миометрии.

Следует отметить, что в подавляющем большинстве случаев в группе сранения отмечалось максимальное содержание магниевых каналов ГМК, в то время как в основной группе только в 1/3.

Центральная роль в регуляции ангиогенеза принадлежит семейству структурно близких между собой белков - факторов роста эндотелия сосудов. Наиболее изученным представителем этого семейства является VEGF-A, который контролирует морфогенез кровеносных сосудов, в то время как, VEGF-C и VEGF-D ответственны за образование лимфатических сосудов (Adams R.H., Alitalo К., 2007; Otrock Z.K., 2007). Учитывая результаты морфологического исследования миометрия, свидетельствующие о нарушении неоангиогенеза мы определили содержание VEGF. Было установлено снижение содержания VEGF в миометрии при нДСТ (не имеющее статистической значимости), что возможно отражает развитие компенсаторных реакций, возможным пусковым механизмом которых может являться тканевая гипоксия.

Кроме того, было проведено определение содержание ERa и ERß, характеризующиеся обратнопропорциональными взаимомотношениями. Следует отметить минимальную экспрессию ERa в обеих группах, что, по-видимому, обусловлено снижением количества данных рецепторов к концу беременности под влиянием прогестерона. Однако у пациенток с нДСТ выявлено снижение содержания ERß в ГМК и фибробластах в 2 раза в отличие от группы сравнения. Снижение содержания ERß в свою очередь может служить одним из факторов развития цитокинового дисбаланса.

Изменение спектра коллагенов ЭЦМ миометрия является проявлением нДСТ и может быть обусловлено как генетическими дефектами, так и нарушениями их метаболизма, что подтверждается увеличением содержание ММР2 в ЭЦМ и ГМК. Дополнительным фактором может служить снижение экспрессии магниевых каналов при нДСТ, так как в эксперименте Pages N. (2003) показано повышение общей активности ММР 2 и ММР 9 при дефиците магния. Активация ММР в свою очередь приводит к усилению деградации коллагенов и усилению процессов дезорганизации соединительной ткани. Значимый вклад вносит и развивающаяся тканевая гипоксия, индуцирующая неоангиогенез, несовершенный при нДСТ. Можно

предположить, что предрасположенность к недостаточной экспрессии VEGF в ответ на повреждение у женщин с нДСТ, приводит к неадекватному воспалительному ответу и недостаточному ангиогенезу с нарушением репарации ткани. Описанные изменения могут быть причиной относительной ишемии ткани при нДСТ, индуцирующей в свою очередь процессы дезорганизации соединительной ткани.

Таким образом, характерными морфологическими признаками нДСТ являются обнаружение очагов дезорганизации соединительной ткани со снижением ее васкуляризации, развитием очагов мукоидного и фибриноидного набухания, проявлением отека стромы, очаговых кровоизлияний и интерстициальным склерозом. Наличие лимфогистеоцитарного инфильтрата стромы.

К иммуногистохимическим проявлениям дезорганизации СТ миометрия при нДСТ относится накопление Col III, снижение васкуляризации с увеличением содержания Col IV и снижением ламинина в ЭЦМ.

Принимая во внимание результаты исследования миометрия, свидетельствующие о нарушении процессов репарации при нДСТ, особый интерес представляло изучение морфологических и

иммуногистохимических особенностей рубца матки при данной патологии, как исхода течения репаративных процессов. Для оценки морфологических изменений миометрия НСМ у беременных, перенесших кесарево сечение, мы производили исследование биоптата области предполагаемого или визуализируемого рубца и прилегающего миометрия, полученного во время повторного кесарева сечения.

На I этапе у пациенток обеих групп проводилась визуальная, интраоперационная оценка области нижнего маточного сегмента (рис.6). Анализ клинических данных выявил, что частота формирования НР матки в основной группе значительно превышала таковую в группе сравнения. При проведении макроскопического исследования толщина ПР колебалась от 3 мм до 5 мм, в то время как у подавляющего большинства НР его толщина не превышала 2 мм, а в ряде случаев рубцовая ткань подвергалась атрофии и истончению с формированием тонкой пленки (висцеральная брюшина), прикрывающей дефект в стенке матки.

Ткань рубца у пациенток с ПР была представлена в основном гладкомышечными клетками, занимавшими более 90% площади исследованной ткани в области предполагаемого рубца (92,0±2,7%), доля соединительной ткани была значительно меньше (8,0±1,6%) и характеризовалась наличием разнообразных фибробластических элементов, располагающихся среди пучков грубых коллагеновых волокон и полнокровных капилляров и сосудов мелкого калибра со склерозированными стенками. В прилежащих лейомиоцитах имелись признаки регенерационной гипертрофии и дистрофических изменений в виде набухания и гидропической дистрофии. В рубцах матки пациенток с нДСТ было

обнаружено увеличение содержания фиброзной ткани (15,0±1,6%), с наличием очагов мукоидного набухания и гиалиноза и сосудами с утолщенными склерозированными стенками и гиалинозом базальных мембран. У пациенток с нДСТ микроскопически даже в ПР были обнаружены очаги фибриноидных изменений вплоть до некроза с клеточными реакциям в виде лимфогистиоцитарной инфильтрации.

НР были представлены на 23,4±5,6% из фиброзной и на 76,6±4,2% из мышечной ткани. В НР у пациенток группы сравнения ткань матки была отечная, содержала отечные пучки грубых коллагеновых волокон с очагами мукоидного и фибриноидного набухания, сосудистый компонент был представлен толстостенными сосудами со склерозированными стенками, а также новообразованными полнокровными сосудами капиллярного типа с периваскулярными лимфоидными инфильтратами с примесью ПЯЛ. Граница рубцовой ткани была неровной, за счет распространения ее в виде грубых септ в мышечную ткань, которая была построена из гипертрофированных лейомиоцитов с выраженными дистрофическими изменениями в виде набухания и гидропических изменений, а также очагами некроза. На границе с рубцовой тканью были обнаружены новообразованные полнокровные сосуды капиллярного типа с периваскулярными лимфоидными инфильтратами с примесью ПЯЛ. Отдельные группы лейомиоцитов замурованы в рубцовую ткань с дистрофическими изменениями и некрозом.

При нДСТ в НР мы обнаружили более широкий спектр морфологических изменений: рубцовая ткань подверглась атрофии и истончению с формированием тонкой фиброзной пленки, прикрывающей дефект стенки матки. Кроме того, были выявлены поля дезорганизации соединительной ткани в виде мукоидного набухания и фибриноидного некроза с лимфогистиоцитарной инфильтрацией. Сосуды микроциркуляторного русла с набухшим эндотелием содержали обтурирующие микротромбы и сладжированные эритроциты.

При формировании «гематом», которые, как правило, локализовались на границе мышечно-рубцовой ткани, мы обнаруживали скопления гемолизированных эритроцитов, а также макрофагов, нагруженных гемосидерином. На границе с кровоизлияниями отмечался склероз стенок и полнокровие сосудов капиллярного типа с периваскулярной лимфогистиоцитарной инфильтрацией и примесью отдельных палочкоядерных лейкоцитов, а также краевое стояние последних в сосудах. В прилежащей мышечной ткани выявляли полнокровные сосуды, а также свежие кровоизлияния и явления лимфостаза, что свидетельствует о более высокой частоте формирования НР с разнообразной морфологической картиной, с превалированием признаков разволокнения, неоангиогенеза и некроза у пациенток с нДСТ. В ходе проведения макроскопического, микроскопического и морфометрического исследований нами было выделено 5 морфологических критериев НР: 1) очаги дезорганизации соединительной

ткани в виде мукоидного набухания, фибриноидного набухания и фибриноидного некроза; 2) некроз лейомиоцитов, замурованных в рубцовую ткань и на границе с рубцом; 3) интрамуральные гематомы и множественные петехиальные кровоизлияния; 4) лимфогистиоцитарная инфильтрация с примесью палочкоядерных лейкоцитов; 5) неоангиогенез (рис. 5).

Рисунок 5. Микрофотография морфологической картины соединительной и мышечной ткани рубца магки у пациенток с выраженными признаками нДСТ; воспалительная инфильтрация (1) и неоангиогенез (2), х200.

Следует отметить, что у подавляющего большинства пациенток имели место одновременно несколько критериев и наиболее часто признаки воспаления и неоангиогенеза. Как следует из проведенного исследования, формирование неполноценных рубцов сопровождается интенсивным разрастанием соединительной ткани, в связи с чем, нами было проведено определение соотношения фиброзной и мышечной ткани. Было установлено, что превышение порогового значения 10% является признаком формирования HP.

На основании проведенного ROC-анализа в качестве диагностического порога доли соединительной ткани в области рубца было принято значение 10%. В качестве отсечки (cut-off) принята доля соединительной ткани, соответствующая максимальной сумме чувствительности и специфичности. Значение cut-off находилось между 8,5% и 12,5%. Для выбранного значения cut-off чувствительность диагностики воспалительного изменения в области рубца составила 97,1%, а специфичность - 80,8%. Чувствительность предсказания истончения рубца составила 85,7%, а специфичность - 48,4%. Следует отметить, что в работе Серова В В., Шехтера А.Б. (1981) показано изменив содержания мышечно-фиброзного компонента при HP, однако нам впервые удалось показать пороговый уровень значимости преобладания фиброзной ткани в формировании HP.

Учитывая нарушения структурной организации соединительной ткани, выявленные при морфологическом исследовании, было проведено ИГХ

исследование ткани рубца матки. Как известно, в рубцовой ткани преобладает коллаген III, в образовании которого принимают участие фибробласты и некоторые стромальные клетки. В нашем исследовании было установлено его максимальное наличие в рубцовой ткани, однако достоверных различий между группами в накоплении данного типа коллагена выявлено не было. При нормальном течении репаративных процессов III коллаген замещается коллагеном I типа, однако у пациенток основной группы было отмечено преобладание эмбрионального коллагена и снижение содержания коллагена I типа.

Коллаген IV типа обнаружен в базальных мембранах сосудов рубца и прилежащей мышечной ткани на одинаковом уровне у пациенток обеих групп. При сравнении уровня коллагена IV типа в рубце мы установили его уменьшение в группе НР, особенно выраженное у пациенток с нДСТ. Хотя в группе ПР у пациенток с нДСТ рубцы характеризовались большим содержанием данного коллагена, по сравнению с аналогичным в группе сравнения. Следовательно, можно предположить, что изначально формирование рубца при нДСТ характеризуется повышенным накоплением коллагена IV типа, подвергающегося более выраженной деструкции, по сравнению со II группой, из-за его неполноценности или же более высокой активности ММР.

Ламинин выявлялся как в базальных мембранах сосудов, так и ЭЦМ рубца и окружающих тканей, при этом у пациенток с нДСТ имелась тенденция к его меньшему содержанию в рубцовой ткани, наиболее выраженное в группе с НР. При этом следует отметить, что изначально содержание ламинина в ЭЦМ рубца ниже в группе с нДСТ, по сравнению со II группой.

Эстрогены, как известно, оказывают важное действие на ткани организма посредством управления различными процессами. На клеточном уровне эстрогены контролируют экспрессию многих генов (геномные эффекты) и индуцируют транзиторные изменения транспорта ионов и фосфорилирования белков (негеномные эффекты).

Рецепторы эстрогенов имеются во многих клетках миометрия, включая эпителий сосудов и некоторые виды клеток соединительной ткани. Количество рецепторов в разных компартаментах матки неодинаково. Показано, что повышенная экспрессия ERa сопровождает процессы трансформации во многих тканях (Bardin А., 2004), тогда как ERJ3 играет ключевую роль в регуляции митотической активности, обеспечивая защиту от ERa-индуцированной пролиферации (Enmark Е., Gustafsson J.A., 1999). Эстрогеновые гормоны влияют на состояние межклеточного вещества стромы эндометрия, где происходит увеличение содержания воды, уменьшается плотность коллагеновых волокон и изменяется структура коллагена (Pastore G., 1992), хондроитин-, дерматан- и кератан-сульфатов (Cidadao А., 1990; Chaves М., 1993). В строме эндометрия изменяется

количество и функциональная активность соединительнотканных клеток и лейкоцитов.

В результате иммуногистохимических реакций с антителами к ЕЯа нами получено слабое окрашивание гладкомышечных клеток в фиброзно-мышечной ткани рубцов матки женщин после кесарева сечения. Продукт реакции обнаруживался как в ядрах, так и в цитоплазме гладкомышечных клеток. Выявлено слабое окрашивание гладкомышечных клеток, как в группе состоятельных рубцов, так и несостоятельных. В большинстве случаев ЕЯа в фиброзно-мышечной ткани рубцов не определялись. Прогестерон является одним из наиболее существенных регуляторов действия эстрогенов в матке. Эффекты прогестерона по отношению к эстрогенам могут обеспечиваться путем индукции синтеза белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста-1, образование которого стимулируется эстрогенами, и который является посредником в реализации их действия (ЯЩапеп Е., 1993).

На протяжении всей беременности в миометрии рецепторы прогестерона преобладают, а к концу их количество в несколько раз превышает число рецепторов эстрогенов. Анализ содержания прогестерона не выявил достоверных различий по содержанию прогестерона в ядрах как гладкомышечных, так и эндотелиальных клеток. В результате иммуногистохимических реакций с антителами к ЕЛр было получено коричневое окрашивание гладкомышечных клеток и эндотелия сосудов миометрия, а также фиброзно-мышечной ткани рубцов матки. Было выявлено более слабое окрашивание ядер гладкомышечных клеток и интенсивное окрашивание цитоплазмы гладкомышечных клеток. Общее количество ЕЛр было максимально у женщин с ПР на матке. Минимальная экспрессия ЕЛР была у пациенток с НР. В группе женщин с признаками нДСТ экспрессия ЕЯр в среднем была ниже, чем в группе без признаков нДСТ. Максимальная экспрессия рецептора нами отмечена в цитоплазме гладкомышечных клеток в группе женщин без признаков нДСТ и с ПР, тогда как минимальная экспрессия ЕЯр - в группе с признаками нДСТ и с НР.

Эстрогены, попадая в клетку, активируют эстрогеновые рецепторы, находящиеся в цитоплазме клетки в неактивном состоянии, что способствует проникновению гормона в ядро. Попав в ядро, этот комплекс стимулирует экспрессию так называемых эстроген-зависимых генов. К ним, прежде всего, относятся рецептор к эпидермальному фактору роста (ЕвР-Я), фактор роста кератиноцитов (КОР), циклин-зависимые киназы (СОК), фактор роста эндотелия сосудов (УЕвР), инсулино-подобный фактор роста (ЮР) и множество других белков. Учитывая сказанное, а также выявленные нарушения неоангиогенеза, по данным морфологического исследования при НР, особенно при наличии нДСТ, было проведено ИГХ исследование УЕОР. УЕОР, как известно, экспрессируется в цитоплазме эндотелия сосудов, макрофагах и фибробластических элементов рубца и окружающей ткани. Нами установлена тенденция к более высокому содержанию фактора роста в

макрофагах и фибробластических элементах рубца у пациентов группы сравнения в отличие от женщин с нДСТ, что особенно выражено при HP. Описанные изменения могут быть причиной нарушенного ангиогенеза и относительной ишемии ткани при нДСТ, индуцирующие процессы дезорганизации соединительной ткани.

Обобщая полученные результаты морфологического и иммуногистохимического исследования, следует отметить, что пациентки с нДСТ отличаются особенностями репарации ткани с формированием фиброзно-мышечных рубцов по механизму субституции с относительным дефицитом ламинина в базальных мембранах сосудов и ЭЦМ, накоплением Col III, а также снижением Col IV типа, экспрессией VEGF клетками стромы. Описанные иммуногистохимические изменения сочетаются с образованием очагов дезорганизации соединительной ткани в виде мукоидного набухания, фибриноидных изменений и гиапиноза, а также патологии микроциркуляторного русла, ведущих к хронической ишемии ткани. Полученные нами данные согласуются с исследованиями, проведенными Макацария А.Д. и соавт. (2005), которые выявили замедленную репарацию раны с образованием неполноценного атрофического рубца при мезенхимальных дисплазиях.

Механизмы дезорганизации соединительной ткани могут быть связаны как с иммунопатологическими процессами, ишемическим фактором, так и гормональной дисрегуляцией на почве генетически детерминированной дефектности ER. По-видимому, для дезорганизации соединительной ткани матки и развития неполной репарации после кесарева сечения, прежде всего, имеют значение дисгормональный и ишемический факторы, что может быть связано, в т.ч. с полиморфизмом генов эстрогеновых рецепторов. Биологическая роль ERP заключается в поддержании синтеза коллагена на высоком уровне, усилении васкуляризации ткани за счет стимуляции роста эндотелия и противовоспалительном действии (Xing D., 2009). Как показало наше исследование, высокое содержание ERf3 характерно для ПР, низкое -для HP. Можно предположить, что высокое содержание ERP в рубце у женщин без нДСТ носит компенсаторный характер, в то время как низкое содержание ERp в рубце у женщин с нДСТ, возможно, запускает механизм формирования его несостоятельности. Среди причин, непосредственно приведших к развитию HP, важную роль играет генетически детерминированная дезорганизация соединительной ткани.

Основная роль в формировании дифференцированных форм дисплазии, как известно, принадлежит нарушению структурных белков соединительной ткани, в связи с чем, в нашей работе были исследованы полиморфизмы генов генов стуктурных белков в ассоциации с фенотипическими проявлениями нДСТ и акушерскими и перинатальными исходами. В ходе исследования не было выявлено статистически значимых ассоциаций между полиморфизмом

гена СОЬЗА! и фенотипическими признаками нДСТ при анализе отдельных локусов.

Основную роль в поддержании гомеостаза соединительной ткани играют матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы.

Был изучен полиморфизм генов матриксной металлопротеиназы 9 типа (ген ММР9) и тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ (ген Т1МРЗ), а также полиморфные варианты гена эндотелина (ЕБШ).

При анализе выраженности признаков нДСТ в зависимости от генотипа ММР9: 855 А>в (С1п279А^) было обнаружено, что у женщин с генотипом АА выраженность нДСТ бьша существенно выше, чем у носительниц аллеля в (р=0,003). Медиана балльной оценки выраженности нДСТ составила 8 (611) баллов для генотипа АА по сравнению с 5 (3-9) и 3 (2-11) баллов для генотипов АО и СЮ соответственно (рис. 6). При анализе распределения женщин по степени выраженности нДСТ было обнаружено, что при генотипе АА большая часть женщин имела признаки нДСТ, оцененные на 5-8 баллов, при этом женщин без признаков нДСТ в этой группе не было. Среди носительниц аллеля в в основном были женщины с нДСТ, оцененной на 1-4 баллов, а у 12% женщин этой группы признаки нДСТ отсутствовали.

Выраженность нДСТ, баллы

Рис. 6 Распределение женщин по степени выраженности нДСТ при различных генотипах ММР9: 855 А>в (С1п279Аг§)

Как известно существуют два основных пути образования сосудов: ангиогенез и васкулогенез. Последний имеет место в эмбриогенезе и отвечает, в основном, за рост сосудов de novo из ангиобластов в результате чего формируются первичные капиллярные сплетения эмбриона, тогда как ангиогенез - основной механизм роста уже сформированных сосудов.

VEGFA участвует в процессах репарации тканей, воспалении. Экспрессия гена VEGFA регулируется различными факторами. Так

показано, что гипоксия способна вызывать повышение экспрессии VEGFA (Wang В., 2009), в том числе и в трофобласте (Qian D., 2004).

Нами была изучена частота встречаемости полиморфизма гена VEGFA: -2578 А>С, -634 G>C и 936 ОТ .

Анализ распределения генотипов VEGFA:-634 установил, что наличие аллеля Т достоверно ассоциировано со степенью выраженности нДСТ р=0,052 OR = 2,27 [95% CI: 1,0-5,4].

Изучение распределения генотипов

VEGFA: -2578 А>С (5'-UTR) установило, что аллель С связан с повышенной экспрессией VEGFA. Генотип СС является протективным р=0,012 OR = 0,39 [95% CI: 0,19-0,80], в то время как генотип АА ассоциирован с повышением риска нДСТ (р=0,003 OR = 3,4 [95% CI: 1,5-7,8].

Была выявлена ассоциация полимофизма 936 С>Т со степенью выраженности нДСТ. В группе женщин, где выраженность нДСТ была оценена в пределах 3 баллов, доля носителей аллеля VEGFA: 936Т составляла 19,4%, тогда как среди женщин с выраженной нДСТ (9 баллов и более) доля носителей указанного аллеля составила 38,9% (OR=2,27 (0,965,36)). Несмотря на отсутствие статистической значимости (р=0,052), полученные данные свидетельствуют о том, что особенности ангиогенеза являются одним из патогенетических звеньев формирования нДСТ.

В ходе проведенного исследования была установлена достоверно более высокая частота угрозы прерывания беременности, ПН и слабости родовой деятельности при нДСТ, в связи с чем, был проведен поиск клинических ассоциаций с генетическими полиморфизмами.

Анализ различных гаплотипов гена COL3A1 установил, что генотипическая частота наиболее распространенного гаплотипа GT составила 77% в группе с нормальным течением родов и в 55% при слабости родовой деятельности (р=0,013). Распределение гаплотипов AT и GC не различалось между группами. Учитывая близкое расположение этих полиморфизмов в гене, был проведен анализ сцепления, в результате которого выявлено неравновесное сцепление D'=1,0 (0,72-1,00), LOD=5,64.

При анализе полиморфизма гена LAMC было установлено, что наличие аллеля Т достоверно ассоциировано со слабостью родовой деятельности (р=0,036). У 38,5% носительниц аллеля Т наблюдалась слабость родовой деятельности, в то время, как среди женщин с генотипом СС встречалась только в 12,8% случаев (OR=4,25 (1,21-14,98)).

Интерес представлял также поиск молекулярно-генетических маркеров HP матки, ввиду возможности использования их в качестве предикторов.

Был проведен анализ распределения аллелей и генотипов ряда полиморфизмов гена ESRa, расположенного на 6 хромосоме (6q25.1) (рис.9). Исследованные полиморфизмы находились в разных участках гена. При анализе отдельных локусов не было выявлено статистически значимой

ассоциации между состоянием рубца и распределением генотипов исследованных полиморфизмов гена ЕЗЛа.

Необходимо отметить, что исследованные полиморфизмы гена Е8Ла расположены очень близко друг к другу, что давало основание предположить возможность сцепленного наследования определенных аллелей.

Нами был проведен анализ сцепления выбранных полиморфизмов (рис.7). Наиболее значимой была неравновесность сцепления между полиморфизмами -397 Т>С (РуиИ) и -35Ю>А (ХЬа1): 0'=0,991 (0,95-1,00), ЬСЮ= 16,98. На основании полученных результатов был проведен поиск ассоциаций клинических признаков и носительства гаплотипов по полиморфизмам Е8Яа -397 Т>С (РуцИ) и -35 Ю>А (ХЬа1) (рис.8).

Хромосома 6

'"¡s&ük'"

ИЙооіГ"

3DT>C (£»rl0s»r;fij07754?

і -ЗЭ70Т (Pvuü) rs2234693 -351A>G<Xbal) «8340799

І И

—£

(3UTR) ге3790577 20U е^АПЫбаЛТЪО lrs222848D).

ESR1. estrogen receptor 1 (alpha)

Рисунок 7. Расположение исследованных полиморфизмов

ESR1_30_8er103er

ESR1_3-UTP

Рисунок 8. Блоки сцепления исследуемых полиморфизмов гена эстрогенового рецептора альфа (ЕвИо)

Наиболее часто встречались гаплотипы ТА (52,0%) и СО (33,1%). Для этих гаплотипов не было обнаружено статистически значимой ассоциации с признаками дезорганизации СТ в рубце. Частота встречаемости гаплотипа СА была существенно выше у женщин с признаками воспаления в ткани рубца: (17,2% против 5,4%. р=0,046). Отношение шансов при неполноценности рубца при носительстве данного гаплотипа составило 3,7 (1,0-14,0). Среди женщин, у которых доля фиброзной ткани в рубце превышала 10%, также наблюдалась тенденция к увеличению частоты этого

гаплотипа (14,9% против 8,3%), но различия не были статистически значимыми.

Для уточнения клинической значимости выявления гаплотипа CA была оценена его распространенность в популяции и среди женщин, имеющих рубец на матке, а также в группе женщин с рубцом на матке и успешными СР. Было обнаружено, что в целом в популяции распространенность данного гаплотипа достаточно высокая и практически не отличается от таковой у женщин с HP (20,1% и 17,2% соответственно). В то же время среди женщин, имеющих рубец на матке и успешные самопроизвольные роды доля исследуемого гаплотипа составила всего 2,2%, что соответствовало таковой среди женщин с ПР (5,4%).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что полиморфизм ESRa играет значимую роль в дезорганизации соединительной ткани либо напрямую, управляя процессами ремоделирования соединительной ткани, либо через регуляцию процессов воспаления и репарации. Носительство гаплотипа CA по полиморфизмам ESRa -397 Т>С (Pvull) и -351G>A (Xbal) является фактором риска неполноценности рубца, а высокая частота встречаемости этого фактора риска в популяции обусловливает целесообразность проведения генетического скрининга среди женщин с рубцом на матке для определения тактики родоразрешения.

В связи с выявленными признаками воспаления в ткани неполноценного рубца, был проведен анализ полиморфизмов генов провоспалительных цитокинов. При анализе связи между интегральной морфологической оценкой состоятельности рубца и генотипом ILIb не было выявлено статистически значимой ассоциации. Наличие признаков воспалительной реакции в рубцовой ткани также не было связано с аллельными вариантами гена ILIb. Однако была выявлена ассоциация с частотой возникновения гематом в рубце, по данным морфологического исследования. Наличие аллеля -511Т является фактором риска развития гематомы в рубце согласно аутосомно-доминантной модели (OR=13,4 (1,6-114,3), р=0,011).

Согласно данным литературы полиморфизмы ILIb -511 ОТ [rsl6944] и -31 Т>С [rsl 143627] образуют гаплотип (CT), близкий к полному неравновесному сцеплению.

При анализе двух полиморфизмов гена ILIO (-592 ОА и -819 ОТ), локализующихся в промоторной области, выявлено полное неравновесное сцепление данных локусов (D'=l (0,98-1,0), LOD=104,84). Генотипическая частота встречаемости гаплотипа СС составила 77,2%, AT - 22,8%. Распределение генотипов в популяции и в целом в группе женщин с рубцом на матке были идентичны, что свидетельствует о репрезентативности данной группы. Аллель Т статистически значимо ассоциирован с развитием воспаления при дезорганизации соединительной ткани. Учитывая важную роль воспаления в процессах репарации соединительной ткани, указанные

генетические особенности являются существенным фактором формирована неполноценного рубца на матке.

При анализе морфологических и молекулярно-генетических параллеле! была продемонстрирована роль гена УЕйРА в формировании гематом ] ткани рубца. У80% пациенток с генотипом УЕОРА -634 С/С обнаружены Н1 с гематомами, в то время как среди пациенток с генотипами -634 в/С и -63< ас частота выявления НР с гематомой была значительно ниже (40% и 22°/ соответственно). Отношение шансов возникновения НР с гематомами дл) пациенток с генотипом -634 С/С по сравнению с другими генотипам! составило 10,0 (1,03-96,99), р=0,047. По данным морфолологическоп исследования ни у одной носительницы генотипа 936Т/Т в ткани рубца н< были обнаружены гематомы, тогда как у носительниц аллеля 936С НР < гематомами выявили в 38,7% случаев. Из-за низкой частоты встречаемосп генотипа 936Т/Т данные различия не были статистически значимыми Распределения генотипов -2578 А>С не различались среди пациенток < гематомами и без гематом. Полученные данные свидетельствуют, чтс особенности ангиогенеза в рубце после предыдущего кесарева сечения ) женщин с нДСТ являются независимым фактором риска ег< несостоятельности. Показана патогенетическая роль аллельных варианте! гена УЕОРА в нарушении ангиогенеза, приводящего к локальной ишемии ! дезорганизации соединительной ткани.

Редкий аллель Т полиморфизма гена ЬАМС1 (-2204 С>Т) встречало только в гетерозиготном состоянии. Фенотипическая частота аллеля Т сред! женщин с полноценным рубцом составила 18%, в то время как пр! неполноценном рубце всего 5% (р=0,004 011=0,23 (0,05-0,99)).

В ходе исследования были получены молекулярно-генетическис маркеры нДСТ, которые с одной стороны объясняют некоторые патогенетические механизмы формирования данной патологии, с другой, могут использоваться в качестве диагностических критериев. Было показано, что при нДСТ наибольшее клиническое значение имеет изучение полиморфизма генов, участвующих в регуляции гомеостаза соединительной ткани. Полиморфизмы структурных белков участвуют в формировании отдельных клинических проявлений нДСТ и играют существенную роль в патогенезе нДСТ. Молекулярной основой нДСТ является нарушение баланса между процессами синтеза СТ, регулируемыми, в т.ч. эстрогеновыми рецепторами, и интенсивностью процессов деградации, связанных с активностью матриксных металлопротеиназ. Установлено, что важной составляющей патогенеза неполноценности рубца на матке является нарушение процессов репарации, молекулярным фактором которого являются особенности цитокиновой регуляции воспалительного ответа и нео ангиогенеза. Проведение молекулярно-генетического исследования наряду с фенотипической оценкой выраженности нДСТ позволяет сформировать группу риска по развитию акушерских осложнений.

Последнее особенно актуально ввиду разнообразия фенотипических проявлений нДСТ. Обнаруженные взаимосвязи между генетическим полиморфизмом с развитием акушерских и перинатальных осложнений позволяют использовать вышеуказанные полиморфизмы в качестве неблагоприятных предикторов для выделения группы риска, и в дальнейшем возможного проведения профилактических мероприятий.

ВЫВОДЫ:

1. Течение беременности у пациенток с недифференцированной дисплазией соединительной ткани сопровождается высокой частотой угрозы прерывания беременности - 42,4%, плацентарной недостаточности -34,8%, истмико-цервикальной недостаточности-8,6%, родов: слабостью родовой деятельности -12,4%. Для новорожденных от матерей с недифференцированной дисплазией соединительной ткани в раннем неонатальном периоде характерна более высокая частота неонатальной желтухи -19,5%, недостаточности питания -10,5% и кожно-геморрагического синдрома -8,6%

2. Частота развития осложнений в течение беременности и родов коррелирует со степенью выраженности недифференцированной дисплазией соединительной ткани. Наиболее значимыми в акушерской практике следует считать такие проявления недифференцированной дисплазии соединительной ткани, как варикозная болезнь, миопия высокой степени и пролапс митрального клапана.

3. Слабость родовой деятельности ассоциирована с накоплением коллагена IV типа в миометрии. Морфологическим проявлением недифференцированной дисплазии соединительной ткани в миометрии является дезорганизация соединительной ткани, выражающаяся в нарушении стромально-паренхиматозных соотношений, снижение васкуляризации и развитии воспалительной реакции в интактном миометрии.

4. Формирование неполноценного рубца матки является следствием преобладания процессов субституции. Основными морфологическими признаками неполноценного рубца следует считать: увеличение доли фиброзной ткани более 10%; наличие очагов дезорганизации соединительной ткани в виде мукоидного, фибриноидного набухания и фибриноидного некроза; некроз лейомиоцитов на границе с рубцом; интрамуральные гематомы и множественные петехиальные кровоизлияния; воспалительная реакция и неоангиогенез.

5. Важным звеном патогенеза неполноценного рубца матки является нарушение процессов репарации, молекулярным механизмом которого являются особенности цитокиновой и гормональной регуляции

воспалительного ответа и неоангиогенеза. Молекулярно-генетическим* факторами, определяющими формирование неполноценного рубца матет являются полиморфизмы генов LAMC1: -2204 С>Т [rsl0911193], VEGFA: -63t G>C (rs2010963J, VEGFA: -2578 A>C [rs699947). Оценка одиночны? полиморфизмов гена ESR1 малоинформативна Для оценки рискг формирования неполноценного рубца обязательно генотипирование по двум точкам ESR1: -397 Т>С (Pvull) [rs2234693] и -351G>A (Xbal) [rs9340799] < учетом сцепления.

6. Факторами риска слабости родовой деятельности являютс5 полиморфизмы генов структурных белков LAMC1: -2204 С>Т [rsl0911193] i COL3AI: 2094 A>G (A698T) и 2244T>C (Gly748GIy) .

7. Генные полиморфизмы играют значимую роль в патогенез« недифференцированной дисплазии соединительной ткани. Полиморфизм генов ММР9: 855 A>G [rsl7576], VEGFA: -634 G>C [rs2010963] и -2578 АХ [rs699947], ESR2: -12214 G>T[rsl271572] являются факторами риска развитш недифференцированной дисплазии соединительной ткани.

8. Клиническими предикторами формирования неполноценного рубцг матки являются миопия высокой степени и пролапс митрального клапана, молекулярно-генетическими - полиморфизмы генов ESR1: -397 Т>С (Pvull) [rs2234693] и -351G>A (Xbal) [rs9340799] LAMC1: -2204 C>T [rsl0911193], VEGFA: -634 G>C[rs2010963], VEGFA: -2578 A>C[rs699947].

9. Недифференцированная дисплазия соединительной ткани сопровождается нарушением магниевого обмена одним из возможных патогенетических механизмов которого может служить снижение содержания магниевых каналов TRPM-7, обусловливающих дифференцированный подход к терапии магнием во время беременности.

10. Разработанный алгоритм ведения беременных с недифференцированной дисплазией соединительной ткани, включающий клинические и молекулярно-генетические методы исследования направлен на своевременное выявление предикторов наиболее значимых акушерских осложнений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Пациентки с наличием выраженности симптомов недифференцированной дисплазии соединительной ткани > 6 баллов (по шкале Кадуриной Т.И., 2009) следует относить в группу высокого риска развития акушерских осложнений для проведения динамического наблюдения.

2. Для уточнения диагноза недифференцированной дисплазии соединительной ткани целесообразно определение полиморфизма гена ММР9: 855 А>в и (-634 в>С) [Г52010963], \ZEGFA: -2578 А>С [к699947] и ЕБЯ2: -12214 ОТ [п1271572]. Проведение молекулярно-генетического исследования наряду с фенотипической оценкой выраженности недифференцированной дисплазии соединительной ткани позволяет сформировать группу риска по развитию акушерских осложнений.

3. Наличие аллеля Т полиморфизма 1АМС1:-2204 С>Т [г510911193] и/или гаплотипа вТ полиморфизмов СОЬЗА1: 2094 А>в (А698Т) и 2244Т>С (С1у74801у) являются факторами риска развития слабости родовой деятельности, в связи с чем, показано их определение в группе риска.

4. К группе высокого риска по формированию неполноценного рубца относятся пациентки с ПМК и миопией высокой степени, которым целесообразно проведение генотипирования по полиморфизмам гена ЕБЯа: -397 Т>С (Руи11) и -35Ю>А (ХЬа1). Гаплотип СА является дополнительным фактором риска несостоятельности рубца. При сочетании клинических предикторов формирования неполноценного рубца матки с носительством гаплотипа СА гена Е5Яа: -397 Т>С (РуиИ) и -35Ю>А (ХЬа1) рекомендуется оперативное родоразрешение.

5. Беременным с нДСТ целесообразно применение препаратов магния ввиду снижения содержания магниевых каналов в миометрии .

6. Ведение беременных с недифференцированной дисплазии соединительной ткани целесообразно согласно разработанному алгоритму.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Col III - коллагена III

Col IV- Коллаген IV

ERa - эстрогеновый рецептор альфа

ERp - эстрогеновый рецептор бета

IL (interleikin) - интерлейкины

LAMC - ламинин

MMPs (matrix metalloproteinases) - матриксные металлопротеиназы PGR - прогестерон

SNP (single-nucleotide polymorphism) — однонуклеотидные генные полиморфизмы

TIMP - тканевой ингибитор металлопротеиназ TRPM - магниевые каналы

VEGF (vascular endothelial growth factor) - сосудистый эндотелиальный фактор роста

ВПГ - вирус простого герпеса ГМК - гладкомышечные клетки

дДСТ - дифференцированные дисплазии соединительной ткани

ДСТ - дисплазия соединительной ткани

ЗРП - задержка развития плода

ИГХ - иммуногистохимия

ИЦН - истмико-цервикальная недостаточность

KB — коллагеновые волокна

КС - кесарево сечение

нДСТ - недифференцированная дисплазия соединительной ткани

НИОВ — несвоевременное излитие околоплодных вод

НМС - нижний маточный сегмент

HP — неполноценный рубец

ПМК - пролапс митрального клапана

ПН - плацентарная недостаточность

ПН - плацентарная недостаточность

ПР - полноценный рубец

ПЯЛ - палочкоядерные лейкоциты

СТ - соединительная ткань

ЦМВ - цитомегаповирус

ЭКС — экстренное кесарево сечение

ЭЦМ -экстрацелтолярный матрикс

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Перспективы изучения состояния рубца на матке после кесарева сечения / Кесова М.И., Болотова О.В., Файзуллин Л.З.,Орджоникидзе Н.В., Кан Н.Е.// «Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России»: сборник тезисов.- М., 2008. - с. 114.

2. Акушерские и перинатальные исходы у пациенток с рубцом на матке и фенотипическими проявлениями дисплазии соединительной ткани / Кесова М.И., Болотова О.В., Мартынов А.И., Санникова М.В., Климанцев И.В., Амирасланов Э.Ю., Кан Н.Е., Касабулатов Н.М.// «Амбулаторно-поликлиническая практика - платформа женского здоровья»: сборник тезисов.- М., 2009. - с.99-100.

3. Недифференцированная дисплазия соединительной ткани: акушерские и перинатальные исходы / Кесова М.И., Болотова О.В., Мартынов А.И., Санникова М.В., Климанцев И.В., Амирасланов Э.Ю., Кан Н.Е., Орджоникидзе Н.В. // «Мать и дитя»: материалы III Регионального научного форума. - Саратов, 2009. - с. 124.

4. Течение беременности и родов у пациенток с рубцом на матке и недифференцированной дисплазией соединительной ткани / Кесова М.И., Климанцев И.В., Мартынов А.И., Болотова О.В., Санникова М.В., Амирасланов Э.Ю., Кан Н.Е. // «Мать и Дитя»: материалы X юбилейного Всероссийского форума. - М. - 2009. - с.87-88.

5. Недифференцированная дисплазия соединительной ткани и плацентарная недостаточность / Климанцев И.В., Кесова М.И., Болотова О.В., Мартынов А.И., Кан Н.Е. // «Мать и Дитя»: материалы X юбилейного Всероссийского форума. - М. - 2009. - с.90-91.

6. Прогностические критерии оценки состояния рубца на матке после кесарева сечения / Кесова М.И., Болотова О.В., Кан Н.Е., Орджоникидзе Н.В. // Вестник Российского Университета Дружбы Народов. - 2009. - №5. - с.175-180.

7. Беременность, роды и послеродовый период у женщин после операций на матке при недифференцированных формах дисплазии соединительной ткани / Сухих Г.Т., Кесова М.И., Кан Н.Е., Коган Е.А., Демура Т.А., Мартынов А.И., Болотова О.В., Орджоникидзе Н.В., Амирасланов Э.Ю., II Акушерство и гинекология. - 2010. - №2. - с. 26-29.

8. Uterine Scar Connective Tissue Disorganization and Receptor Alpha Polymorphism in Women with Undifferentiated Connective Tissue Disordes / Sukhih G., Kogan E., Demura T., Kesova M., Kan N. Bolotova O., Martinov A., Ordgonikidze N. // Scientific Program and Abstracts 57th Annual Meeting.-Orlando, Florida.- 2010,-p.49.

9. Дезорганизация соединительной ткани в рубцах матки и полиморфизм гена эстрогенового рецептора а у пациенток с недифференцированными формами дисплазии соединительной ткани / Сухих Г.Т., Коган Е.А., Демура

Т.А., Трофимов Д.Ю., Донников А.Е., Кесова М.И., Мартынов А.И. Болотова О.В., Кан Н.Е., Орджоникидзе Н.В.// Акушерство и гинекология - 2010. - №3. - с. 27-31.

10. Дисплазия соединительной ткани и плацентарная недостаточность Климанцев И.В., Санникова М.В., Кесова М.И., Кан Н.Е. // АГ-инфо,- 2009. №1.-с.21-24.

11. Морфологические особенности рубца матки у пациенток i недифференцированными формами дисплазии соединительной ткани Кесова М.И., Коган Е.А., Демура Т.А., Мартынов А.И., Болотова О.В., Kai Н.Е., Орджоникидзе Н.В., Амирасланов Э.Ю. // «IV международный конгресс по репродуктивной медицине» - М. - 2010 . -с .77-78.

12. Морфологические и молекулярно-генетические особенност] неоангиогенеза в рубцовой ткани матки у пациенток недифференцированной дисплазией соединительной ткани / Сухих Г.Т. Коган Е.А., Кесова М.И., Демура Т.А., Донников А.Е., Мартынов А.И. Трофимов Д.Ю., Климанцев И.В., Санникова М.В., Кан Н.Е., Костин П.А, Орджоникидзе Н.В., Амирасланов Э.Ю. // Акушерство и гинекология. 2010.-№6. -с. 23-27.

13. Патология соединительной ткани в акушерской практике / Демура Т.А. Коган Е.А., Кесова М.И., Кан Н.Е., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю. Орджоникидзе Н.В. // «Мать и дитя»: материалы XI Всероссийской научного форума. - М. - 2010. -с. 59-60.

14. Акушерские проблемы у пациенток с рубцом матки i недифференцированной дисплазией соединительной ткани / Кесова М.И. Кан Н.Е., Коган Е.А., Демура Т.А., Санникова М.В., Климанцев И.В. Болотова О.В., Амирасланов Э.Ю. // «Мать и дитя»: материалы X Всероссийского научного форума. - М. -2010. -с 94-95.

15. Патология соединительной ткани в акушерской практике / Коган Е.А. Демура Т.А., Кесова М.И., Кан Н.Е., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю. Орджоникидзе Н.В., Сухих Г.Т. // XIII Международный конгресс с курсо» эндоскопии. Новые технологии в диагностике и лечении гинекологически; заболеваний. -М. - 2010. - с 260.

16. Клинико-морфологическая и молекулярно-генетическа: характеристика миометрия при несостоятельности рубца матки поел' кесарева сечения у женщин с признаками недифференцированной формь дисплазии соединительной ткани / Сухих Г.Т., Коган Е.А., Демура Т.А., Донников А.Е., Кан Н.Е., Кесова М.И., Мартынов А.И., Болотова О.В. / Архив патологии.- В печати.

17. Течение беременности и родов у пациенток с дисплазией соединительной ткани / Кесова М.И. // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И.Пирогова.-201 l.-т.б, №2.-С81-84.

18. Uterine Scar after Cesarean Section in Women with MASS Syndrome: Clinico-Morphological, Immunohistochemical Characteristics and Estrogen

Receptor alpha and beta Genes Polymorphism / Demura T.A., Kogan E.A., Kesova M.I., Kan N.I., Donnikov A.E., Kostin P.A., Generozov E. V., Sukhikh G.T. // Supplement to Reproductive SCIENCES. The Official Journal of the Society for Gynecologic Investigation. Miami Beach, Florida, USA. -2011. - p. 304A

19. Выбор способа родоразрешения пациенток с рубцом матки/ Кесова М.И. // Вестник Российского Университета Дружбы Народов.- 20Ю.-№6,-С.238-245.

20. Перспективы молекулярно-генетических методов диагностики дисплазии соединительной ткани / Донников А.Е., Кесова М.И. // Уральский медицинский журнал

21. Роль полиморфизма гена эстрогенового рецептора альфа в формировании неполноценного рубца матки после кесарева сечения / Сухих Г.Т., Кесова М.И., Донников А.Е., Кан Н.Е., Болотова О.В.,Коган Е.А., Демура Т.А., Климанцев И.В., Амирасланов Э.Ю., Санникова М.В., Абрамов Д.Д., Кадочникова В.В., Орджоникидзе Н.В., Трофимов Д.Ю. // Акушерство и гинекология. - 2011. - №4. - С. 40-45.

22. Течение беременности и родов при дисплазии соединительной ткани / л.м. Комиссарова, А. Карачаева, М.И. Кесова// Акушерство и гинекология. -2012.-№3,-С.

23. «Взаимосвязь полиморфизма генов цитокинов с состоянием рубца матки после кесарева сечения»/ Сухих Г.Т., Донников А.Е., Кесова М.И., Кан Н.Е., Коган Е.А., Демура Т.А., Климанцев И.В., Амирасланов Э.Ю., Санникова М.В., Ломова H.A., Сергунина O.A., Абрамов Д.Д., Кадочникова В.В., Трофимов Д.Ю. // Акушерство и гинекология. - в печати.

24. Течение репаративных процессов в рубцах матки у пациенток с недифференцированной дисплазией соединительной ткани/

Кесова М.И., Кан Н.Е., Коган Е.А., Демура Т.А., Санникова М.В., Климанцев И.В., Амирасланов Э.Ю., Ломова H.A., Сергунина O.A. VI Международный конгресс по репродуктивной медицине. - 2012. - С.71-72.

Отсутствие зубил * матке

Ст*иаагтчо*

1 V.

Диче4ч«че<л<н> яаблюдеиме с лояодошо* »еип/ггалимакей к

Прс М£«ИИ#« .ЧМСТИ чес к* к

•¿ервтрият** • солаж

Приложение 1. Фрагмент генной сети нДСТ.

| Не обнаэужех^ попимсрфиямы

Группа гисиа д/я днчамичесмко ча бг-яаечля

Определен«« гадимэеф« »»а ЕвРЛ: -59? Т>С <Р*Л1Й) /Г85234693? и -3516>А :ХЬв!| {гг9ЭЛ$?99] . 1АМС2 {-2204 ОТ, 1п!ШП9з]. УебР АГ-634 ею даммф

Дезорганизация соединительной ткани"

Нарушение ангиогенеза

Гипоксия

Приложение 2. Алгоритм ведения беременных с нДСТ.

Бсргям**»*

__Ф

—( Очгнш па |ь<аге Т. И Кадузиной ]—

Гс©в*дм*емол*кугярч«--»н*7ич«-<их исследований:(ИММ; 155 А>б |«17576]; ЕЯ№ 12214 ОТ ¡Ш272572}; УШ* (-634 &>€} 1п20Ю96Я; /578 А>С [п659947]

Формат 60*90 1/16 Подписано в печать: 10.02.12 Тираж: 150 экз. Заказ номер 56/ бп. 2 п.л.

Актуальность проблемы ДСТ в настоящее время обусловлена как высокой распространенностью данной патологии в популяции (частота отдельных ее проявлений по данным разных авторов колебляется от 26 до 80%), так и многообразием и тяжестью ее клинических проявлений [31; 33; 34; 64]. В настоящее время ДСТ трактуется как группа генетически гетерогенных и клинически полиморфных патологических состояний, характеризующихся нарушением формирования СТ в эмбриональном и постнатальном периодах, и как группа объединяющая ряд генных синдромов (Марфана, Элерса-Данлоса) и недифференцированныеформы с мультифакториальными механизмами развития.

Несмотря на высокий риск осложнений при дДСТ, на практике особенно часто приходится сталкиваться с нДСТ. В отличие от синдромных форм проявления, нДСТ не столь манифестны и нередко остаются без должного внимания. Вместе с тем, универсальность соединительнотканогодефекта при нДСТ предполагает разнообразие висцеральных изменений, часть из которых может иметь серьезные клинические последствия.

В акушерской практике проблема нДСТ весьма актуальна, так как распространенность данного синдрома достигает 70-80% среди женщин репродуктивного возраста [31]. Учитывая системность поражения, нДСТ может оказывать отрицательное влияние на течение беременности, перинатальную заболеваемость и смертность. Так, угроза прерывания беременности отмечается у 50% женщин с нДСТ [26], при этом угроза преждевременных родов наблюдается в 6 раз чаще. Также при нДСТ очень часто наблюдается ПН, несвоевременное излитие околоплодных вод и др. [8; 62]. Из особенностей течения родов, связанных с нДСТ, описана взаимосвязь быстрого и стремительного течений родов, причем при тяжелой нДСТ частота быстрых и стремительных родов у первородящих достигает 50%, а при слабовыраженных признаках ДСТ она составляет около 12%. Вместе с тем, сведения об особенностях течения беременности и родов у женщин с нДСТ, противоречивы. Ряд авторов указывает на высокую частоту развития осложнений во время беременности, другие же не отмечают подобной закономерности. Кроме того, по данным Козиновой О.В. (2008), во время беременности отмечается усиление симптоматики нДСТ от первого к третьему триместрам беременности [45].

Несмотря на интерес исследователей к проблеме нДСТ, на настоящий момент отсутствуют работы по комплексной оценке акушерских и перинатальных исходов в зависимости от степени выраженности нДСТ, что определяет актуальность проведения данных исследований. Системность поражения при нДСТ обусловливает сложность диагностики, отсутствие единых диагностических критериев и терминологии. Учитывая, что в развитии ДСТ ведущее значение имеют мутации генов, кодирующих синтез и пространственную организацию коллагена и ответственных за формирование компонентов матрикса, а также ферментов, принимающих участие в процессах фибриллогенеза, перспектива диагностики ДСТ заключается в выявления генных мутаций и сопоставленииих с клиническими проявлениями [33].

Принимая во внимание то, что нДСТ представляет собой аномалию тканевой структуры с уменьшением содержания отдельных видов коллагена или нарушением их соотношения, аномалию, вызывающую снижение механической прочности ткани, что потенциально может приводить к нарушению течения процессов репарации, интерес представляет изучение морфологических и иммуногистохимических особенностей миометрия при нДСТ с выявлением возможных морфологических, имммуногистохимических и молекулярно-генетических предикторов акушерских и перинатальных осложнений.

Цель исследования

Обоснование системы диагностических мероприятий у пациенток с недифференцированной дисплазией соединительной ткани на основании морфологических, молекулярно-генетических методов исследования для снижения акушерских и перинатальных осложнений. Задачи исследования

1. Изучить особенности течения беременности, родов и послеродового периода, состояния плода и новорожденного у пациенток с недифференцированной дисплазией соединительной ткани и выделить факторы риска развития осложнений.

2. Исследовать взаимосвязь клинических проявлений недифференцированной дисплазии соединительной ткани с аллельными вариантами генов, участвующих в формировании соединительной ткани (коллаген III, IV, ламинин, матриксные металлопротеиназы 2 и 9, тканевой ингибитор металлопротеиназы) и регулирующих гомеостаз (сосудисто-эндотелиальный фактор роста, магниевые каналы (ТКРМ-7), эстрогеновые рецепторы альфа и бета).

3. Установить наиболее значимые фенотипические и молекулярно-генетические предикторы развития акушерских и перинатальных осложнений.

4. Изучить морфологические и иммуногистохимические особенности миометрия при недифференцированной дисплазии соединительной ткани с анализом течения репаративных процессов у пациенток с рубцом матки.

5. Уточнить механизмы дезорганизации соединительной ткани во время беременности и сопутствующих осложнений на основании выявления молекулярно-генетических и клинико-морфологических параллелей.

6. Разработать алгоритм ведения беременности, родов и послеродового периода у женщин с недифференцированной дисплазией соединительной ткани.

Научная новизна

Впервые изучена взаимосвязь акушерских и перинатальных осложнений с клиническими проявлениями нДСТ и особенностями генов, кодирующих белки, участвующие в формировании соединительной ткани (CoL III, CoL IV, LAMC1, VEGF, MMP9, TIMP1, TRPM-7, ERa, ERß), и установлена прямая корреляционная связь между степенью выраженности нДСТ и развитием акушерских осложнений. Показано, что течение беременности, родов и послеродового периода сопровождается высокой частотой развития таких осложнений, как угроза прерывания беременности, истмико-цервикальная недостаточность, плацентарная недостаточность, аномалии родовой деятельности. Впервые определена диагностическая ценность выявления полиморфизма генов матриксной металлопротеиназы (ММР9), сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF), эстрогенового рецептора бета (ERß) при нДСТ. Выявлена зависимость между полиморфизмом генов ламинина, сосудисто-эндотелиального фактора роста, эстрогенового рецептора альфа, интерлейкинов (IL1, ILIO) и несостоятельностью рубца на матке. Впервые установлена взаимосвязь развития слабости родовой деятельности с полиморфизмами генов ламинина и коллагенов (III и ГУтипа).

Практическая значимость

Использование балльной шкалы оценки степени выраженности нДСТ позволят выделить группу риска по развитию акушерских осложнений, которым целесообразно определение полиморфизмов генов ламинина и коллагенов для прогнозирования акушерских осложнений. Дополнительными критериями диагностики нДСТ являются: полиморфизм

10 гена матриксной металлопротеиназы (ММР9: 855 А>в), сосудисто-эндотелиального фактора роста (УЕОБ (-634 в>С) [^2010963], УЕвРА: -2578 А>С [гб699947]) и эстрогенового рецептора бета (Е8112: -12214 С>Т [гб1271572]). Клиническими предикторами неполноценного рубца на матке являются миопия высокой степени и пролапс митрального клапана. Молекулярно-генетическими критериями неполноценности рубца на матке являются полиморфные локусы генов ЬАМС1: -2204 ОТ [гб1091 1193], УЕОБА: -634 в>С [гв2010963], УЕОБА: -2578 А>С [ге699947], Е8Я1: -397 Т>С (Руи11) [гб2234693] и -3510А (ХЬа1) [ге9340799], 1Ь 1Ь [га 1143627]. Полиморфизм генов ламинина и коллагенов (III и IV) являются предикторами слабости родовой деятельности.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Течение беременности при недифференцированной дисплазии соединительной ткани характеризуется высокой частотой развития акушерских (угроза прерывания - 42,4%, истмико-цервикальная недостаточность - 8,6%, плацентарная недостаточность - 34,8%, слабость родовой деятельности - 12,4%) и перинатальных (неонатальная желтуха -19,5%, кожно-геморрагический синдром - 8,6% и недостаточность питания -10,5%) осложнений. Доля встречаемости данного синдрома по обращаемости в ФГБУ «НЦАГ и П» им.В.И.Кулакова составляет 54,3%. 2. Высокая частота осложнений в течение беременности и родов при недифференцированной дисплазии соединительной ткани сопровождается стромально-паренхиматозными нарушениями и уменьшением васкуляризации, морфологическими проявлениями которых являются признаки дезорганизации соединительной ткани вследствие дефектов пространственной организации структурных белков соединительной ткани (коллаген III и IV типов, ламинин).

3. Течение репаративных процессов в миометрии при недифференцированной дисплазии соединительной ткани характеризуется преобладанием механизмов субституции, приводящих к формированию неполноценного рубца матки, морфологическими критериями которого является увеличение доли фиброзной ткани (более 10%) и признаки дезорганизации соединительной ткани. Возможными молекулярными факторами формирования неполноценного рубца матки является полиморфизм гена эстрогенового рецептора альфа, ламинина и сосудисто-эндотелиального фактора роста.

4. Недифференцированная дисплазия соединительной ткани является многофакторным симптомокомплексом, одним из основных механизмов которого является полиморфизм генов, регулирующих ремоделирование соединительной ткани, таких как: матриксная металлопротеиназа 9, эстрогеновый рецептор бета и сосудисто-эндотелиальный фактор роста. Развитие акушерских осложнений ассоциировано с полиморфизмом генов структурных белков (ламинин, коллаген).

Апробация работы

Основные положения работы доложены на X, XI и XII Всероссийских форумах «Мать и Дитя» (Москва, 2009, 2010, 2011); на IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010), на Всероссийских конгрессах «Амбулаторно-поликлиническая практика - новые горизонты» и «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы» (Москва 2010,2011); на итоговой научно-практической конференции ФГУ НИИФХМ ФМБА РФ (Москва, 2010), а также на 57th и 58thAnnual Meeting (Orlando, Florida, 2010, 2011), а также на научно-практической конференции «Развитие идей академика А.И.Струкова в современной патологической анатомии» (Москва, 2011) и V Региональном научном форуме «Мать и Дитя» (Геленджик, 2011), IV Всероссийском образовательном конгрессе «Анестезия и реанимация в акушерстве и неонатологии» (Москва, 2011), на VI Международном конгрессе по репродуктивной медицине: (Москва, 2012).

Обсуждение диссертации состоялось на конференции сотрудников акушерского обсервационного отделения ФГБУ «НЦ АГ и П им. академика В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России 23 июня 2011 г, заседании апробационной комиссии при Ученом Совете Д208.125.01. ФГБУ «НЦ АГ и П им. академика В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России 05 сентября 2011г. и ученом совете Центра 04 октября 2011.

Внедрение результатов работы в практику

Практические рекомендации, основанные на результатах исследования, используются в работе акушерского обсервационного отделения ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России. Материалы диссертации используются в лекционном материале при обучении клинических ординаторов, аспирантов, повышении квалификации врачей в ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России, на семинарах, симпозиумах, форумах.

Клиническое наблюдение беременных проводилось автором в акушерском обсервационном отделении ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Амбулаторное обследование проводилось в научно-поликлиническом отделении ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России (руководитель -д.м.н., проф. Прилепская В.Н.).

Клинические, гемостазиологические, иммунологические исследования выполнены в лабораториях Центра. Ультразвуковое обследование беременных, послеродовой матки, а также кардиотокография проводились в

13 отделении функциональной диагностики Центра (руководитель - д.м.н., проф. Гус А.И.).

Морфологические, иммуногистохимические исследования проводились в патолого-анатомическом отделении №1 Центра (руководитель - д.м.н., проф. Коган Е.А.).

Молекулярно-генетическое исследование проводилось в лаборатории молекулярно-генетических методов Центра (руководитель - д.б.н. Трофимов Д-Ю.)

Структура и объем диссертации

Выводы

1. Течение беременности у пациенток с недифференцированной дисплазией соединительной ткани сопровождается высокой частотой угрозы прерывания беременности - 42,4%, плацентарной недостаточности -34,8%), истмико-цервикальной недостаточности-8,6%, родов: слабостью родовой деятельности -12,4%). Для новорожденных от матерей с недифференцированной дисплазией соединительной ткани в раннем неонатальном периоде характерна более высокая частота неонатальной желтухи -19,5%), недостаточности питания -10,5%) и кожно-геморрагического синдрома -8,6%)

2. Частота развития осложнений в течение беременности и родов коррелирует со степенью выраженности недифференцированной дисплазией соединительной ткани. Наиболее значимыми в акушерской практике следует считать такие проявления недифференцированной дисплазии соединительной ткани, как варикозная болезнь, миопия высокой степени и пролапс митрального клапана.

3. Слабость родовой деятельности ассоциирована с накоплением коллагена IV типа в миометрии. Морфологическим проявлением недифференцированной дисплазии соединительной ткани в миометрии является дезорганизация соединительной ткани, выражающаяся в нарушении стромально-паренхиматозных соотношений, снижение васкуляризации и развитии воспалительной реакции в интактном миометрии.

4. Формирование неполноценного рубца матки является следствием преобладания процессов субституции. Основными морфологическими признаками неполноценного рубца следует считать: увеличение доли фиброзной ткани более 10%; наличие очагов дезорганизации соединительной ткани в виде мукоидного, фибриноидного набухания и фибриноидного некроза; некроз лейомиоцитов на границе с рубцом; интрамуральные гематомы и множественные петехиальные кровоизлияния; воспалительная реакция и неоангиогенез.

5. Важным звеном патогенеза неполноценного рубца матки является нарушение процессов репарации, молекулярным механизмом которого являются особенности цитокиновой и гормональной регуляции воспалительного ответа и неоангиогенеза. Молекулярно-генетическими факторами, определяющими формирование неполноценного рубца матки являются полиморфизмы генов ЬАМС1: -2204 ОТ [гб10911193], УЕвРА: -634 ОС №2010963], УЕвРА: -2578 А>С №699947]. Оценка одиночных полиморфизмов гена Е8Ю малоинформативна. Для оценки риска формирования неполноценного рубца обязательно генотипирование по двум точкам Е8Ю: -397 Т>С (Руи11) №2234693] и -3510 А (ХЬа1) №9340799] с учетом сцепления.

6. Факторами риска слабости родовой деятельности являются полиморфизмы генов структурных белков ЬАМС1: -2204 ОТ №10911193] и СОЬЗА1: 2094 А>в (А698Т) и 2244Т>С (С1у748С1у) .

7. Генные полиморфизмы играют значимую роль в патогенезе недифференцированной дисплазии соединительной ткани. Полиморфизм генов ММР9: 855 А>С [ге17576], УЕвРА: -634 в>С №2010963] и -2578 А>С №699947], Е8Я2: -12214 ОТ №1271572] являются факторами риска развития недифференцированной дисплазии соединительной ткани.

8. Клиническими предикторами формирования неполноценного рубца матки являются миопия высокой степени и пролапс митрального клапана, молекулярно-генетическими - полиморфизмы генов Е8Ю: -397 Т>С (Руи11) №2234693] и -35Ш>А (ХЬа1) №9340799] ЬАМС1: -2204 ОТ №10911193], УЕвРА: -634 ОС №2010963], УЕвРА: -2578 А>С №699947].

9. Недифференцированная дисплазия соединительной ткани сопровождается нарушением магниевого обмена одним из возможных патогенетических механизмов которого может служить снижение содержания магниевых каналов TRPM-7, обусловливающих дифференцированный подход к терапии магнием во время беременности. 10. Разработанный алгоритм ведения беременных с недифференцированной дисплазией соединительной ткани, включающий клинические и молекулярно-генетические методы исследования направлен на своевременное выявление предикторов наиболее значимых акушерских осложнений.

Практические рекомендации

1. Пациентки с наличием выраженности симптомов недифференцированной дисплазии соединительной ткани > 6 баллов (по шкале Кадуриной Т.И., 2009) следует относить в группу высокого риска развития акушерских осложнений для проведения динамического наблюдения.

2. Для уточнения диагноза недифференцированной дисплазии соединительной ткани целесообразно определение полиморфизма гена ММР9: 855 A>G и VEGF (-634 G>C) [rs2010963], VEGFA: -2578 А>С [rs699947] и ESR2: -12214 G>T [rsl271572]. Проведение молекулярно-генетического исследования наряду с фенотипической оценкой выраженности недифференцированной дисплазии соединительной ткани позволяет сформировать группу риска по развитию акушерских осложнений.

3. Наличие аллеля Т полиморфизма LAMCL-2204 С>Т [rsl0911193] и/или гаплотипа GT полиморфизмов COL3A1: 2094 A>G (А698Т) и 2244Т>С (Gly748Gly) являются факторами риска развития слабости родовой деятельности, в связи с чем, показано их определение в группе риска.

4. К группе высокого риска по формированию неполноценного рубца относятся пациентки с ПМК и миопией высокой степени, которым целесообразно проведение генотипирования по полиморфизмам гена ESR1: -397 Т>С (Pvull) и -351G>A (Xbal). Гаплотип CA является дополнительным фактором риска несостоятельности рубца. При сочетании клинических предикторов формирования неполноценного рубца матки с носительством гаплотипа СА гена ЕБЮ: -397 Т>С (Р\оШ) и -35Ю>А (ХЬа1) рекомендуется оперативное родоразрешение.

5. Беременным с нДСТ целесообразно применение препаратов магния ввиду снижения содержания магниевых каналов в миометрии .

6. Ведение беременных с недифференцированной дисплазии соединительной ткани целесообразно согласно разработанному алгоритму.