Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Бактериофиксирующая активность эритроцитов в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза и обоснование ее роли в патогенезе данных заболеваний

На правах рукописи

С/Г

Оборин Виктор Афанасьевич

БАКТЕРИОФИКСИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ЭРИТРОЦИТОВ В ОТНОШЕНИИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ, СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, ТУЛЯРЕМИИ, БРУЦЕЛЛЕЗА И ОБОСНОВАНИЕ ЕЁ РОЛИ В ПАТОГЕНЕЗЕ ДАННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14.03.03 - патологическая физиология 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

4847265

1 9 МАЙ 2011

Саратов - 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Вятский государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации.

Научный консультант: член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Пименов Евгений Васильевич

Моррисон Виталий Викторович Спицын Анатолий Павлович Игнатов Олег Владимирович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита диссертации состоится « $ » СсЮ!/-^ 2011 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.03 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « ^ » 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Кодочигова А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Чума, сибирская язва, туляремия и бруцеллез относятся к зооантропонозным природно-очаговым особо опасным инфекциям, вспышки которых постоянно регистрируются в России, странах ближнего и дальнего зарубежья (Онищенко Г.Г., 2003; Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2006; Топорков В.П., 2007; Безсмертный В.Е., Горошенко В.В., Попов В.П., 2009; Попов Н.В. Куклев Е.В., Кутырев В.В., 2008; Arbaji A., Kharabsheh S., Al-Azab S., 2005; Daya M., Nakamura Y., 2005; Begier E.M., 2006; Frazier A.A., Franks T.J., Galvin J.R., 2006). В последние годы наблюдается тенденция к увеличению количества заболеваний животных и людей, вызванных данными возбудителями (Покровский В.И., Пак С.Г., 2004; Онищенко Г.Г., 2007; Кутырев В.В., Смирнова Н.И., 2008). Это обусловлено миграционными процессами, развитием индустрии туризма, экологическими проблемами. Не исключена возможность применения возбудителей данных инфекций в качестве агентов биотерроризма (Онищенко Г.Г., 2005; Афанасьева Г.А., Чеснокова Н.П., Дальвадянц С.М., 2008; Lippi D., Conti А., 2002) и появления заболеваний, вызванных измененными формами микроорганизмов (Наумов A.B., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г., 1992; Домарадский И.В., 1998). Несмотря на достигнутые успехи в профилактике указанных выше инфекций эффективность лечения поздних случаев чумы и сибирской язвы остается на низком уровне. Решение этих проблем может быть осуществлено только с учетом расширения знаний об их патогенезе.

Патогенез инфекционных заболеваний представляет собой многокомпонентный и многостадийный процесс, обусловленный как патогенными свойствами возбудителей болезни, так и ответной реакцией организма на их внедрение. На сегодняшний день установлены основные факторы патогенности У. pestis, В. anthracis, F. tularensis, В. melitensis, В. bovis, В. ovis и В. canis (Ерошенко Г.А., Кутырев В.В., 2003; Кутырев В.В., Смирнова Н.И., 2003; Попов Н.В., Безсмертный В.Е., Новиков H.JI., 2006; Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2006). Доказана защитная роль микро- и макрофагов при данных инфекциях (Наумов A.B., Кузмиченко И.А., Тараненко Т.М., 1995; Афанасьева Г.А., Чеснокова Н.П., Дальвадянц С.М., 2008; Бывалов A.A., Гаврилов К.Е., Крупин В.В., 2008; Дентовская C.B., Платонов М.Е., Комбарова Т.Н., 2009; BenGurion R., Shafferman А., 1981). Фагоцитарная функция лейкоцитов имеет важное значение в реализации естественной резистентности и специфического иммунитета при чуме, сибирской язве, туляремии, бруцеллезе. Вместе с тем при попадании в кровь и возникновении бактериемии, которая является необходимым условием эпидемического распространения возбудителей при трансмиссивных инфекциях, велика вероятность контакта возбудителей этих заболеваний с эритроцитами - самой многочисленной популяцией клеток крови.

Общеизвестно, что эритроциты в организме осуществляют транспорт газов. Однако наряду с газотранспортной ролью они выполняют и другие витальные функции, в том числе транспортируют на своей поверхности различные эндо- и экзогенные субстанции, которые находятся в кровеносном русле. Потенциальные возможности эритроцитов для взаимодействия с микробами, попавшими в кровь, очень велики. Это обусловлено тем, что в организме здорового человека находится 2,Зх1013 эритроцитов, что в сотни раз больше, чем количество лейкоцитов, а площадь поверхности всех эритроцитов составляет 3800 м2, что в

2000 раз превышает поверхность тела взрослого человека. Кроме того, скорость движения эритроцитов по кровеносной системе позволяет им совершать один кругооборот за 50 секунд (Баев В.М., 2001; ЗинчукВ.В., Максимович H.A., Борисюк М.В., 2003; Воробьев А.И., 2005).

Косвенным подтверждением того, что возбудители указанных выше инфекционных заболеваний взаимодействуют с эритроцитами, являются клинические наблюдения. У больных чумой, сибирской язвой и туляремией нередко выявляются геморрагические изменения на коже и слизистых оболочках, а также наблюдается снижение количества эритроцитов (Гинсбург H.H., 1976; Наумов A.B., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г., 1992; Домарадский И.В., 1993; Литусов Н.В., Васильев Н.Т., Васильев П.Г., 2002). При патоморфологических исследованиях животных и людей, погибших от чумы и сибирской язвы, обнаруживается выраженный гемолиз эритроцитов в сосудистом русле, печени и селезенке (Лобанов В.Н., 1964; Чалисов И.А., Хазанов А.Т., 1980; Абрамова A.A., Гринберг Л.М., 1993). Результаты исследований гемолитических свойств Y. pestis, В. anthracis и F. tularensis (Олсуфьев Н.Г., 1975; Бургасов П.Н. Рожков Г.И., 1984; Домарадский И.В., 1998) косвенно свидетельствуют о воздействии этих возбудителей на эритроциты. Известно, что чумной, сибиреязвенный и туляремийный микробы лучше растут на плотных питательных средах, в которые предварительно добавляется дефибринированная кровь (Туманский В.М., 1958; Олсуфьев Н.Г., 1975; Арасланова В.А., 2009). В настоящее время у чумного и сибиреязвенного микробов обнаружены белки, относящиеся к сидерофорам, которые позволяют вирулентным штаммам У. pestis и В. anthracis усваивать железо, находящееся в организме хозяина (Ледванов М.Ю., Карниел Э., Тихонов С.Н., 1995; Geoffroy V.A., Fetherston J.D., Perry R.D., 2000; GongS., Bearden S.W., Geoffroy V.A., 2001; Perry R.D., Shah J., Bearden S.W., 2003; Maresso A.W., 2006). В последние годы появились сообщения о том, что чумной микроб способен проникать внутрь эритроцитов и утилизировать из гемоглобина ионы железа (Федорова В.А., Девдариани З.Л., 2007), однако эти данные носят фрагментарный характер. Сведений об изучении фиксирующей активности эритроцитов в отношении возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза в доступной нам литературе не обнаружено. В связи с этим для лучшего понимания патогенеза и оптимизации лечения этих инфекций представляется целесообразным проведение исследований по изучению бактериофиксирующей активности эритроцитов (БФАЭ) в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза в условиях in vitro и in vivo и установление её значения в развитии данных заболеваний.

Цель исследования. Определение механизмов фиксирующей активности эритроцитов человека и других видов млекопитающих в отношении бактерий вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза и обоснование её роли в развитии инфекционных процессов при данных заболеваниях.

Задачи исследования.

1. Изучить способность эритроцитов человека фиксировать на своей поверхности клетки Y. pestis EV НИИЭГ и споры В. anthracis 55 ВНИИВВиМ, а также другие микроорганизмы в условиях in vitro, используя методы В.И. Брилис

соавт. (1986) и С.С. Гизатулиной с соавт. (1991), которые применяются при оценке адгезивных свойств бактерий к эритроцитам.

2. Разработать фотоколориметрический метод количественного определения бактериофиксирующей активности эритроцитов (БФАЭ) человека и животных, применяя в качестве модели микроорганизмов клетки У. pestis EV НИИЭГ.

3. Модифицировать метод гемосканирования для наблюдения за процессом адгезии бактерий на эритроцитах людей и различных видов животных в динамике.

4. Изучить БФАЭ человека, а также лабораторных, сельскохозяйственных и домашних животных в отношении вакцинных штаммов У. pestis EV НИИЭГ, В. anthracis (СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ, II вакцины Ценковского), F. tularensis 15 НИИЭГ и В. abortus 19 ВА, используя фото колориметрический метод и метод гемосканирования.

5. Исследовать механизмы БФАЭ в отношении клеток У. pestis EV НИИЭГ, в том числе роль гидрофобных взаимодействий и электростатических сил.

6. Изучить способность эритроцитов человека фиксировать на своей поверхности клетки вакцинных штаммов возбудителей чумы и сибирской язвы (споровая форма) в условиях in vivo при раздельном введении эритроцитов и микробных клеток в брюшную полость белых мышей.

7. Выдвинуть гипотезу о роли БФАЭ в развитии и реализации инфекционных процессов, обусловленных У. pestis, В. anthracis, F. tularensis и Brucella spp.

8. Обосновать принципиальную возможность патогенетического метода лечения чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза с помощью адресной доставки антибиотиков в эритроцитарных контейнерах.

Научная новизна. Впервые разработан фотоколориметрический метод определения БФАЭ в отношении микроорганизмов бактериальной природы (патент РФ на изобретение № 2360969 от 10.07.2009 г.), который позволяет осуществлять количественную оценку связывания эритроцитами бактерий. Для визуального наблюдения за процессом адгезии модифицирован метод гемосканирования, дающий возможность в динамике исследовать взаимодействие эритроцитов с бактериями. Впервые с помощью данных методов изучена БФАЭ человека и различных видов животных в отношении клеток вакцинных штаммов У. pestis EV НИИЭГ, F. tularensis 15 НИИЭГ и В. abortus 19 В А, а также споровых форм вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и II вакцины Ценковского. Установлено, что эритроциты людей и животных способны фиксировать на своей поверхности клетки вакцинных штаммов чумного, туляремийного микробов, а также споры вакцинных штаммов сибиреязвенных бацилл, в то же время эритроциты человека не фиксируют бактерии вакцинного штамма бруцеллезного микроба. Показано, что БФАЭ человека в отношении бактерий У. pestis EV НИИЭГ зависит от морфофункционального состояния адгезинов микробных клеток, рецепторного аппарата эритроцитов и условий, в которых происходит адгезия. Установлено, что основную роль в фиксирующей способности эритроцитов человека в отношении бактерий У. pestis EV НИИЭГ играют гидрофобные силы, тогда как электрический заряд на поверхности клеток не оказывает существенного влияния на их взаимодействие.

Впервые выявлены существенные различия в БФАЭ у людей и различных видов животных в отношении штамма У. pestis EV НИИЭГ. При этом установлено, что эритроциты человека и высокочувствительных к заражению

возбудителем чумы животных (белая крыса, белая мышь, морская свинка, кролик, свинья) обладают высокой бактериофиксирующей способностью, а эритроциты мало чувствительных к инфицированию возбудителем чумы животных (лошадь, кошка) фиксируют на своей поверхности клетки Y. pestis EV в значительно меньшей степени. Аналогичные данные получены в отношении спор штамма В. anthracis 55 ВНИВВиМ. У чувствительных к инфицированию возбудителем сибирской язвы млекопитающих (человек, корова, кролик, морская свинка) эритроциты обладают более высокой фиксирующей способностью к спорам сибиреязвенного микроба, чем эритроциты резистентных к заражению В. anthracis животных (свинья, белая крыса).

Впервые исследована фиксирующая способность эритроцитов человека в отношении бактерий Y pestis EV НИИЭГ, находящихся непосредственно в крови, а также изучено антиадгезивное действие различных компонентов плазмы крови и ряда антибактериальных препаратов. Установлено, что белки плазмы крови здорового человека (альбумины, глобулины и фибриноген) обладают антиадгезивной активностью в отношении бактерий У. pestis EV НИИЭГ, в то время как изученные антибиотики, используемые при лечении чумы (ампициллин, доксициклин, гентамицин, цефотаксим), в терапевтических концентрациях не влияют на процесс фиксации эритроцитами бактерий.

В условиях in vivo при раздельном введении эритроцитов и бактерий вакцинных штаммов чумного или спор сибиреязвенного микроба в брюшную полость белым мышам подтверждено, что эритроциты сохраняют способность фиксировать на своей поверхности клетки Y. pestis EV НИИЭГ или споры В. anthracis 55 ВНИВВиМ.

Теоретическая значимость. Гипотеза о роли эритроцитов в реализации инфекционного процесса при чуме, сибирской язве, туляремии и бруцеллезе выдвинута нами на основании анализа данных литературы о патоморфологических изменениях при этих заболеваниях, в том числе полученных автором ранее при изучении патоморфогенеза сибирской язвы, а также на основании результатов настоящих исследований по изучению БФАЭ человека и различных видов животных в отношении вакцинных штаммов Y. pestis EV НИИЭГ, В. anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и II вакцины Ценковского, F. tularensis 15 НИИЭГ и В abortus 19 ВА в условиях in vitro и in vivo. Согласно этой гипотезе, клетки Y. pestis, F. tularensis и споры В. anthracis при проникновении в кровяное русло чувствительных к чуме, туляремии и сибирской язве млекопитающих фиксируются на поверхности эритроцитов. Это способствует транспорту микроорганизмов и их поглощению макрофагами селезенки и печени. В этих клетках возбудители становятся недоступными для неспецифических факторов защиты организма и интенсивно пролиферируют, так как в макрофагах создаются все необходимые для этого условия, в том числе достаточное количество ионов железа, поступающих из разрушенных эритроцитов. После интенсивного размножения бактерий макрофаги погибают, а микробные клетки в большом количестве попадают в кровеносное русло, т.е. наступает вторичная бактериемия. Это приводит к септическому состоянию. Массовый лизис эритроцитов вызывает гипоксию тканей и анемию, что способствует гибели организма хозяина. В то же время при бруцеллезе, возбудитель которого не фиксируется на эритроцитах, основным клиническим

симптомом является специфическая аллергическая перестройка организма хозяина.

Данная гипотеза позволила впервые обосновать перспективность и принципиальную возможность адресной доставки антибиотиков с помощью эритроцитарных контейнеров при экстренной профилактике и лечении указанных выше опасных инфекционных заболеваний. Предложенная гипотеза позволяет объяснить скоротечность и высокую летальность особо опасных инфекций (чумы, сибирской язвы, туляремии), а также особенности развития хронических инфекций типа бруцеллеза.

Результаты исследований расширяют представления о функциональных возможностях эритроцитов, а именно, об их способности избирательно фиксировать и транспортировать отдельные виды микроорганизмов в печень и селезенку, что приводит к их дальнейшему фагоцитозу в этих органах. Таким образом, при инфекционных процессах, вызванных заражением вирулентными штаммами У. В. аШИгаш и Р. ш1агеп$1$, эритроциты обеспечивают

развитие заболевания, а при иммунизации - доставляют бактерии живых вакцин в органы иммуногенеза, способствуя формированию специфического иммунитета.

Практическая значимость и внедрение. Разработанный фотоколориметрический метод и модифицированный метод гемосканирования применяются при изучении БФАЭ в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, а также используются при исследовании адгезивных свойств микробных культур, входящих в состав пробиотических препаратов и продуктов функционального питания в ГОУ ВПО «ВятГУ» и ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА».

По результатам исследований получен патент РФ на изобретение № 2360969 «Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов» от 10.07.2009 г.

Результаты исследований отражены в «Методических рекомендациях по изучению адгезии бактерий к эритроцитам людей и животных с помощью фотоколориметрии» (ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА», Киров, 2009), в методических рекомендациях «Фотоколориметрический метод изучения взаимодействия бактерий с эритроцитами людей и животных» (ГОУ ВПО «ВятГУ», Киров, 2010), в учебно-методическом пособии «Методы определения бактериофиксирующей активности эритроцитов и оценки адгезивных свойств микроорганизмов бактериальной природы» (ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА», Киров, 2011), утвержденном в УМО.

Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий со студентами ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА» специальности 310800 - «Ветеринария» по курсу «Ветеринарная микробиология», со студентами ГОУ ВПО «Кировская ГМА» специальностей 060101 «Лечебное дело», 060103 «Педиатрия», 060109 «Сестринское дело», по курсу «Микробиология, вирусология, иммунология», специальности 080401 «Товароведение и экспертиза товаров в сфере производства и обращения сельскохозяйственного сырья и продовольственных товаров» по курсам -«Основы микробиологии», «Микробиология продовольственных товаров, санитария и гигиена», со студентами ГОУ ВПО «ВятГГУ» специальностей 032102.65 «Адаптивная физическая культура», 050720 «Физическая культура» и 010707.65 «Медицинская физика», по курсам - «Общая физиология»,

«Безопасность жизнедеятельности», а также при выполнении дипломных работ студентами ГОУ ВПО «ВятГУ» специальностей 020209 «Микробиология», 240901 «Биотехнология» по курсам - «Микробиология» и «Биотехнология». Это подтверждено актами внедрения, утвержденными руководителями данных высших учебных заведений.

Декларация личного участия автора. Экспериментальные исследования выполнялись лично автором при его непосредственном руководстве научной группой. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Эритроциты человека обладают выраженной способностью фиксировать на своей поверхности клетки вакцинных штаммов У pesíis EV НИИЭГ, F. tularensis 15 НИИЭГ, а также споры вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и II вакцины Ценковского, но не фиксируют клетки В. abortus 19 В А. Это позволяет сделать предположение о том, что наряду с патогенными свойствами возбудителей данных заболеваний БФАЭ млекопитающих играет роль в развитии и реализации патологического инфекционного процесса при чуме, сибирской язве, туляремии и бруцеллезе.

2. Фиксирующая активность эритроцитов в отношении бактерий У. pestis EV НИИЭГ и В. anthracis 55 ВНИИВВиМ зависит от видовой принадлежности эритроцитов. У высокочувствительных к инфицированию возбудителем чумы видов млекопитающих (человек, белая мышь, белая крыса, кролик, свинья) БФАЭ в отношении клеток У. pestis EV НИИЭГ высокая, а у малочувствительных к инфицированию возбудителем чумы животных (лошадь, кошка) - низкая. Эритроциты животных, чувствительных к заражению В. anthracis (человек, морская свинка, кролик, корова), обладают выраженной фиксирующей способностью в отношении спор вакцинного штамма сибиреязвенного микроба, а эритроциты свиньи и белой крысы, резистентных к инфицированию возбудителем сибирской язвы, фиксируют споры В. anthracis 55 ВНИИВВиМ в незначительной степени. Это подтверждает наше предположение и позволяет выдвинуть гипотезу о роли БФАЭ в развитии инфекционного процесса и объясняет чувствительность млекопитающих к чуме и сибирской язве.

3. БФАЭ в отношении бактерий У. pestis EV НИИЭГ зависит от трех составляющих: адгезивных свойств микробных клеток, фиксирующей способности эритроцитов и среды, в которой происходит адгезия. В прикреплении бактерий к эритроцитам, определяющее значение имеют гидрофобные свойства микробных клеток, обусловленных их поверхностными структурами. Фиксирующая способность эритроцитов обусловлена видовыми и индивидуальными особенностями их гликофоринов. Белки плазмы крови (альбумины, глобулины и фибриноген) снижают БФАЭ в отношении вакцинного штамма чумного микроба, в то время как антибактериальные препараты (ампициллин, гентамицин, доксициклин, цефотаксим) не влияют на нее.

4. Эритроциты человека сохраняют фиксирующую активность в отношении клеток У. pestis EV НИИЭГ и спор В. anthracis 55 ВНИИВВиМ в условиях in vivo, что показано при внутрибрюшинном раздельном введении животным эритроцитов и бактерий. Данные о БФАЭ различных видов млекопитающих в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза, полученные в условиях in vitro и in vivo наряду с данными

литературы о геморрагических проявлениях у больных чумой, сибирской язвой, туляремией и патоморфологических исследованиях погибших от чумы и сибирской язвы людей и животных подтверждают рабочую гипотезу о роли БФАЭ в развитии инфекционного процесса при этих заболеваниях. Выдвинутая гипотеза позволяет обосновать перспективность применения эритроцитарных контейнеров для адресной доставки антибиотиков при экстренной профилактике и лечении этих инфекций.

Апробация диссертационной работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены:

- на Всесоюзной конференции «Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов, антибиотиков и антимикробных веществ», 27 - 28 ноября 1990 г., Москва;

- на Межведомственной научной конференции «Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний» 26 - 27 марта 1991 г., Киров;

- на Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций, 22 октября 1991 г., Москва;

- на Научно-практической конференции и школе по инфекционной патологии с международным участием, 20 - 24 октября 2007 г., Москва;

- на Международной конференции «Международное сотрудничество и развитие биотехнологий в Кировской области», 27 - 28 марта 2008 г., Киров;

- на Всероссийской научно-практической конференции «Достижения ветеринарной науки и практики», 17 - 18 апреля 2008 г., Киров;

- на Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора П.Г. Петского «Современные научные достижения в животноводстве», 16 - 17 апреля 2009 г., Киров;

- на Отделении общества физиологов имени И.П. Павлова в Кировской государственной медицинской академии 3 июня 2009 г., Киров;

- на VII Международной конференции по гемореологии и микроциркуляции (от функциональных механизмов - в клинику), 14 июня 2009 г., Ярославль;

- на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 60-летию филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России - ЦБТП БЗ», 16 июля

2009 г., Екатеринбург;

- на Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Вятской государственной сельскохозяйственной академии, 15 апреля

2010 г., Киров;

- на II региональной молодежной конференции «Вопросы фундаментальной и прикладной физиологии в исследованиях студентов», 24 мая 2010 г., Киров;

- на региональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы потребительского рынка товаров и услуг», 26 мая 2010 г., Киров;

- на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», посвященной 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФАБА России» с международным участием, 7 октября 2010 г., Киров;

- на VIII Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биомониторинга и биоиндикации», 1 декабря 2010 г., Киров.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 49 работ, из них 12 статей в журналах, рекомендованных ВАК

Минобрнауки РФ, 1 патент и 2 авторских свидетельства на изобретения, 2 монографии, методические рекомендации и учебно-методическое пособие, утвержденное в УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России.

Исследования выполнялись с 1978 по 1996 годы в 48 ЦНИИ Министерства обороны Российской Федерации в рамках 18 плановых научных тем. С 2006 года исследования проводились в ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА» по теме: «Разработка и оценка лечебно-профилактической эффективности новых антимикробных и биологически активных препаратов, пробиотиков при инфекционных заболеваниях животных». С 2008 года исследования проводятся по теме докторской диссертации «Бактериофиксирующая активность эритроцитов в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза и обоснование её роли в патогенезе данных заболеваний», утвержденной 3 июля 2008 г. на Ученом совете ГОУ ВПО «ВятГУ».

Объем н структура работы. Диссертация изложена на 286 листах машинописного текста, состоит из введения и семи глав, включающих обзор литературы и результаты собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 35 рисунками. Библиографический список включает 584 источника, из них 367 отечественных и 217 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследований

Штаммы. Основными объектами исследований в работе являлись вакцинные штаммы: У. pestis EV линии НИИЭГ, В. anthracis СТИ-1, II вакцины Ценковского и F. tularensis 15 НИИЭГ, полученные из ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ» (г. Киров), а также вакцинные штаммы В. anthracis 55 ВНИИВВиМ и В. abortus 19 ВА, предоставленные ОАО «Агровет» (г. Киров).

В сравнительных исследованиях применяли штамм Е. coli М-17, выделенный из «Колибактерина» (ОАО «Микроген», г. Москва), штамм В. bifidum № 1, выделенный из «Бифидумбактерина» (ОАО «Микроген», г. Москва), производственные штаммы L. plantarum Р4 и L. buhneri Р0, полученные из ОАО «Агровет» (г. Киров), штамм L. casei DN-114001, выделенный из препарата функционального питания «Actimel», штамм L. rhamnosus АТСС 53103, выделенный из препарата функционального питания «Bio Баланс», штамм L. acidophilus, выделенный из пробиотика «Лактобактерин» «Микроген» НПО ФГУП (Иммунопрепарат, г. Уфа), штамм L. bulgaricus, выделенный из кисломолочного продукта «Вятушка», клинические штаммы Е. coli серогрупп 086, 0112, 0124, 0142, 0144 и 0152, полученные из бактериологической лаборатории госпиталя в/ч 1407 ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ», музейные штаммы Е. coli, P. aeruginosa, P. vulgaris, P. mirabilis, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. marcescens, K. pneumoniae из коллекции кафедры морфологии и микробиологии ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА».

Питательные среды. Для выращивания вакцинного штамма У. pestis EV НИИЭГ использовали ГРМ-агар рН 7,2 (ФГУН ГНЦПМБ, г. Оболенск), а также мясо-пептонный агар (МПА) и агар Хоттингера (АХ) рН 7,2, приготовленные в лабораторных условиях. В качестве дополнительных ингредиентов к питательным средам использовали сульфит натрия (Na2S03) и генцианвиолет (ГВ). Культуры бактерий У. pestis EV НИИЭГ выращивали при

температуре (28±1) °С в течение 48 часов. Клинические и музейные штаммы выращивали на ГРМ-агаре рН 7,2 при температуре (37±1) °С в течение 24 часов. Для выращивания лактобацил использовали питательную среду Мозера-Рогоза-Шарпа (MRS). Культуры В. anthracis 55 ВНИИВВиМ выращивали на МПА при температуре (37±1) °С в течение 24 часов. Споры вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1 и II вакцины Ценковского, бактерии F. tularensis 15 НИИЭГ и В. abortus 19 ВА использовали в работе без предварительного культивирования. Выращенные на питательных средах и лиофильно-высушенные культуры суспензировали в стерильном 0,9%-ном растворе хлорида натрия (рН 7,2).

Антибиотики: ампициллин (ОАО «Органика», г. Новокузнецк), гентамицин (РУП «Борисовский завод медпрепаратов», г. Борисов), доксициклин (РУП «Белмедпрепараты», г. Минск), клафоран (цефотаксим) («Авентис фарма лимитед», Великобритания).

Препараты крови: альбумин человеческий нормальный (НПО «Биомед», г. Пермь), иммуноглобулин человеческий нормальный (ОАО «Микроген», г. Москва), сыворотка лошадиная нормальная (ОАО «Микроген», г. Москва).

Гемоконсервирующие растворы: CPDA-1 («Бакстер АГ», США). Состав: лимонной кислоты моногидрат - 3,27 г, натрия цитрата дигидрат - 26,3 г, натрия фосфата одноосновного моногидрат - 2,22 г, декстрозы моногидрат - 31,9 г, аденин - 0,275 г, вода для инъекций - 1000,0 мл.

Глюгицир (ОАО «Биосинтез», г. Пенза). Состав: натрия гидроцитрат (двузамещенный) - 20 г, глюкоза - 30 г (в пересчете на безводную глюкозу), вода для инъекций - 1000,0 мл.

Материалом для получения эритроцитов служила венозная кровь клинически здоровых людей и животных. Пробы крови людей получали из ФГЛУ «Кировская областная станция переливания крови», пробы крови животных - из вивария ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА» (белые мыши, кролики), питомника ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ» (белые крысы, морские свинки, золотистые хомячки), ФГУ «Кировская областная станция по борьбе с болезнями животных» (собаки, кошки), ветеринарной клиники и лаборатории коневодства ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА» (коровы, лошади), ОАО «Кировский мясокомбинат» (свиньи), а также хозяйств частного сектора Кировской области (бараны). В качестве антикоагулянтов использовали 3,8%-ный раствор лимоннокислого натрия (1:10) или гепарин (3,0 ЕД/мл крови).

Оборудование. Стерилизацию питательных сред проводили в паровом стерилизаторе ВК-75-01 (ОАО «Тюменский завод медицинского оборудования», г. Тюмень) в режиме: рабочее давление 150 кПа, температура 110±5 "С, время стерилизации - 30 мин.

Измерение рН растворов и сред проводили с помощью рН метра рН-150М (РУП «Гомельский завод измерительных приборов», г. Гомель) в соответствии с инструкцией к прибору.

Разделение неоднородных жидкостей (суспензий) выполняли на центрифуге типа УЛМН-Р10-01 (ООО «Элекон-М»).

Микроскопию объектов проводили, пользуясь световым микроскопом «Миктрон-400М» (ООО «Петролазер», г. С.-Петербург).

Фотографирование микрообъектов выполняли с помощью цифровой видеокамеры DCE-1, установленной на световом микроскопе.

Определение концентрации эритроцитов в суспензии производили в счетной камере Горяева по методике, описанной А.Я. Любиной, Л.П. Ильичевой, Т.В. Котосовой (1984).

Определение оптической плотности (ОП) суспензий микробных клеток осуществляли на колориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2 (ЗОМЗ, г. Загорск) при длине волны проходящего света 540 нм, рабочем объеме кюветы 2,3 мл и длине оптического пути кюветы 5 мм.

Оценку электрофоретической активности эритроцитов и микробных клеток осуществляли с помощью автоматизированного приборного комплекса «Цито-Эксперт» (НТУ «Инженерно-технический центр», г. Ижевск, по методике Е.П. Сухенко (2009).

Методы

Микробные культуры, выращенные на плотных питательных средах, а также лиофилизированные культуры суспензировали в 0,9%-ном растворе хлорида натрия. Концентрацию бактерий в суспензии определяли методом высева на плотные питательные среды.

Эритроцитарную массу, плазму и сыворотку крови получали по методике, описанной А.Я. Любиной, Л.П. Ильичевой, Т.В. Котосовой (1984).

Обработку эритроцитов формалином проводили по методике, рекомендованной Т.В. Колгановой, А.В. Ермолаева, Р. Дж. Дойла (2002). Танизированные эритроциты готовили по методике В.М. Бондаренко, М.М. Баркус, В.И. Брилис (1987).

Определение уровня адгезии бактерий к эритроцитам осуществляли методами В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Л.А. Левкова (1986) и С.С. Гизатулиной, М.О. Биргер, Л.И. Кулинич (1991).

Гидрофобные свойства бактерий определяли по методике Е.В. Серебряковой, И.В. Дармова, Н.П. Медведева (2002).

Гемагтлютинирующую способность микробов оценивали по методике, описанной Ю.М. Ломовым, Н.Р. Телесманич, А.В. Колякиной (2007).

Трипсинизацию бактерий выполняли по методике К.Б Грабовской, А.А. Тотоляна (1977).

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли при помощи компьютерной программы «Biostat», версия 4.03. с вычислением значений средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (ш), коэффициента достоверности (р) и корреляционной зависимости (г). Достоверность различий между группами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Графическая обработка исследований проводилась с использованием программы «Microsoft Office Excel 2003».

2. Результаты исследований

2.1. Изучение фиксирующей активности эритроцитов в отношении микроорганизмов бактериальной природы с помощью традиционных методов

На сегодняшний день в литературе отсутствует описание методик, которые позволяют определять БФАЭ в отношении микроорганизмов бактериальной природы, поэтому на первом этапе исследований при изучении БФАЭ использовали методы, которые применяются при определении адгезивных свойств микробных клеток к эритроцитам. В нашей стране для этих целей

используют метод В.И. Брилис Т.А., Брилене, Л.А. Левкова (1986) и способ С.С. Гизатулиной, М.О. Биргер, Л.И. Кулинич (1991), которые позволяют в первом случае оценивать взаимодействие бактериальных клеток с эритроцитами по индексу адгезии микроорганизмов (НАМ), а во втором - выявлять адгезивно-активные колонии (ААК) микроорганизмов. При определении НАМ устанавливают количество бактерий, прикрепившихся к одному эритроциту, участвующему в процессе адгезии. По этому показателю микроорганизмы подразделяются на высокоадгезивные - НАМ более 4,0, среднеадгезивные - НАМ от 2,51 до 4,0, низкоадгезивные - НАМ от 1,75 до 2,50. При ИАМ ниже 1,75 бактерии считают неадгезивными. Метод С.С. Гизатулиной с соавт. (1991) позволяет выявлять процент микробных колоний, вокруг которых образуется ободок из эритроцитов. По этому показателю можно судить о взаимодействии эритроцитов с бактериями, находящимися в колонии.

Первоначально провели сравнительное изучение фиксирующей активности эритроцитов человека 0(1) 11Ь+ группы крови в отношении клеток У. резШ ЕУ НИИЭГ, спор и вегетативных клеток В. апЛгасгх 55 ВНИИВВиМ, а также ряда других микроорганизмов бактериальной природы, при помощи методов, приведенных в табл. 1.

Таблица 1

Показатели адгезии различных видов бактерий к эритроцитам человека, определенные при помощи методов В.И. Брилис с соавт. (1986) (ИАМ) и С.С. Гизатулиной с соавт. (1991) (ААК, %) (М±т; п=5)_

Бактерии Показатель

ИАМ AAK, %

Вакцинные штаммы B. anthracis 55 BHHHBBhM 4,91 ±0,67 10,91±1,58

Y. pestis EV HHH3r 7,02±0,95 0

Пробиотические E. coli M-17 2,67±0,28 0

штаммы L. plantarum P4 2,07±0,41 0

B. bifidum H'i 1 1,93±0,51 0

Штаммы, выделенные E. coli 0151 3,53±0,44 9,33±4,49

из кишечника людей E. coli 0124 3,15±0,18 0

E. coli 0142 2,14±0,41 8,33±2,41

E. coli 0144 3,09±0,20 21,33±6,39

E. coli 0186 2,99±0,36 0

E. coli 0112 1,85±0,16 10,01±1,53

Музейные цггаммы P. aeruginosa 2,22±0,19 0

K. pneumoniae 1,65±0,24 0

E. coli 2,11±0,32 7,33±1,86

P. vulgaris 1,87±0,18 0

P. mirabilis 1,68±0,25 0

S. epidermidis 1,73±0,24 0

S. saprophytics 1,84±0,18 0

S. marcescens 1,72±0,19 0

M. luteus 1,46±0,20 0

Адгезивно-активные колонии выделялись в небольшом количестве лишь у 6 из 20 исследуемых микробных культур, чаще у клинических штаммов кишечной палочки, выделенных из кишечника людей. Вакцинный штамм ЕУ НИИЭГ чумного микроба адгезивно-активных колоний не образовывал (рис. 1 А). В то

же время вакцинный штамм 55 ВНИИВВиМ сибиреязвенного микроба формировал колонии, вокруг которых в 10% случаев образовывался незначительно выраженный ободок из эритроцитов (рис. 1 Б). Вокруг колоний штаммов кишечной палочки, выделенных из кишечника людей, формировался выраженный ореол из эритроцитов (рис. 1 В). Учитывая полученные результаты и принимая во внимание, что методом С.С. Гизатулиной с соавт. (1991) изучается взаимодействие эритроцитов не с отдельными микробными клетками, а с колониями бактерий, был сделан вывод о том, что данный метод не может быть использован при изучении БФАЭ в отношении вакцинных штаммов чумного и сибиреязвенного микробов.

Рис. I. Микроскопическая картина взаимодействия эритроцитов с микробными колониями по методу С.С. Гизатулиной с соавт. (1991): А -адгезивно-неактивная колония У. pestis EV НИИЭГ; Б - адгезивно-активная колония В. anthracis №55 ВНИИВВиМ; В - адгезивно-активная колония Е. coli 0144. Микрофотосъемка в падающем свете. *80. 1 - микробная колония; 2 -эритроциты вокруг колонии

При определении ИАМ в отношении эритроцитов человека по методу В.И. Брилис с соавт. (1986) выявлено, что вакцинные штаммы возбудителей чумы и сибирской язвы являются высокоадгезивными (табл. 1). ИАМ для вакцинного штамма У. pestis EV НИИЭГ составил 7,02±0,95, для вакцинного штамма В. anthracis 55 ВНИИВВиМ - 4,91±0,67. Установлено, что большинство штаммов музейных микробных культур являются низкоадгезивными и только пять штаммов кишечной палочки проявили среднеадгезивные свойства, из которых четыре были выделены из кишечника людей. Следовательно, метод

В.И. Брилис с соавт. (1986) позволял изучать БФАЭ человека в отношении микроорганизмов бактериальной природы, в том числе вакцинных штаммов возбудителей чумы и сибирской язвы. Однако при определении показателя ИАМ возникли следующие затруднения.

Во-первых, с помощью метода В.И. Брилис с соавт. (1986) практически невозможно установить факт фиксации бактерий на эритроцитах (рис. 2). Бактерии могут находиться рядом с эритроцитом, не прикрепившись к нему. Во-вторых, данным методом исследуется взаимодействие бактерий всего с 50 эритроцитами. В-третьих, в разных полях зрения микроскопических препаратов

Рис. 2. Микроскопическая картина взаимодействия эритроцитов человека с бактериями Y. pestis EV НИИЭГ (А) и S. epidermidis по методу В.И. Брилис с соавт. (1986). Окраска по Граму. xlOOO. 1 - эритроциты; 2 - микробные клетки

Кроме того, при сопоставлении показателей ИАМ и ААК не обнаружено какой-либо зависимости. Так, высокоадгезивный вакцинный штамм чумного микроба не образовывал ААК, а низкоадгезивный штамм Е. coli 0112, выделенный из кишечника человека, в 10% случаев формировал ААК.

Таким образом, нами показано, что методы С.С. Гизатулиной и В.И. Брилис не способны в полной мере охарактеризовать БФАЭ в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ и спор В. anthracis 55 ВНИИВВиМ. Вакцинный штамм чумного микроба не образует адгезивно-активные колонии, на подсчете которых основана методика С.С. Гизатулиной. Метод В.И. Брилис, наряду с его достаточной трудоемкостью и ограниченным количеством исследуемых эритроцитов, не позволяет установить сам факт фиксации бактерий на эритроцитах и обладает субъективностью при учете результатов исследований.

Следовательно, для изучения механизмов БФАЭ в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза и обоснования её роли в патогенезе данных заболеваний необходимо разработать и использовать более информативные методы, позволяющие более точно определять фиксацию бактерий на эритроцитах и количественно оценивать взаимодействие большого числа эритроцитов с микробными клетками.

2.2. Разработка фотоколориметрического метода определения фиксирующей активности эритроцитов в отношении микроорганизмов бактериальной природы

Приступая к разработке нового метода определения БФАЭ, использовали следующие методические приемы. Во-первых, факт прикрепления бактерий к

эритроцитам устанавливали после центрифугирования суспензии, содержащей микробные клетки и эритроциты. Большинство бактерий легче эритроцитов, поэтому после осаждения последних они оставались в надосадочной жидкости. Если бактерии фиксировались на эритроцитах, то они осаждались вместе с эритроцитами и в надосадочной жидкости отсутствовали или же обнаруживались в небольшом количестве. Во-вторых, определение количества микробных клеток, оставшихся после центрифугирования в надосадочной жидкости, проводили с помощью фотоколориметрии.

При проведении серии экспериментов, основанных на этих методических приемах, использовали две микробные культуры: вакцинный штамм У. резШ ЕУ НИИЭГ, как высокоадгезивный, и музейный штамм 5. ер'^егтхй'к - как неадгезивный (табл. 1). Концентрация бактерий в суспензии соответствовала 1,0 единице оптической плотности (ОП) Для стандартизации экспериментов на данном этапе исследований применяли эритроциты одного и того же донора 0(1) Ют+ группы крови в концентрации 0,1 * 109/мл.

Первоначально изучили принципиальную возможность использования предлагаемых методических приемов для оценки фиксации эритроцитами бактерии. Для этого в пробирках смешивали по 2,5 мл суспензии микробных клеток и 1,0 мл суспензии эритроцитов. В качестве контроля применяли пробы, содержащие 2,5 мл суспензии микробных клеток и 1,0 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия (рН 7,2) (контрольная проба № 1); 1,0 мл суспензии эритроцитов и 2,5 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия (рН 7,2) (контрольная проба № 2). Пробы помещали на вращающуюся платформу, инкубировали при температуре 37±1 °С в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 300 § в течение 1,5 мин для осаждения эритроцитов, после чего измеряли оптическую плотность (ОП) надосадочной жидкости. Оценку взаимодействия эритроцитов с бактериями осуществляли с помощью показателя бактериофиксирующей активности эритроцитов (ПБФАЭ), который рассчитывали по формуле:

ПБФАЭ = х 1 оо%,

д.,

где ПБФАЭ - показатель бактериофиксирующей активности эритроцитов; Д^ - ОП надосадочной жидкости в контрольной пробе № 1; Да - ОП надосадочной жидкости в контрольной пробе № 2; Д>п - ОП надосадочной жидкости в опытной пробе. Результаты определения ПБФАЭ человека в отношении бактерий У реяИ$ ЕУ НИИЭГ и 5. ер1с1егт1сИ$ приведены в табл. 2.

Таблица 2

ПБФАЭ человека в отношении клеток У. резйБ ЕУ НИИЭГ и 5. ер/^елт^и, определяемый фотоколориметрическим методом (М±т, п=5)_

Микроорганизм Показатели

Дол Д«1 Дй ПБФАЭ, %

У. резНя ЕУ НИИЭГ 0,39±0,030 0,50±0,009 0,03±0,003 26,83±6,07

5. ер1<1егт1сИз 0,65±0,020 0,63±0,007 0,03±0,003 1,52±2,99

Установлено, что ПБФАЭ в отношении штамма У. реяШ ЕУ НИИЭГ составил (26,83±6,07)%, что свидетельствовало о прикреплении к эритроцитам соответствующего процента бактерий. В то же время клетки 5. ер1с1егт1сИз к эритроцитам человека практически не фиксировались - ПБФАЭ в их отношении составил (1,52±2,99)%.

Показав принципиальную возможность оценки фиксирующей способности эритроцитов в отношении вакцинного штамма чумного микроба при помощи фотоколориметрического метода, осуществили выбор условий, при которых способность эритроцитов фиксировать клетки У. реяНя ЕУ НИИЭГ проявлялась максимально.

Первоначально изучили влияние на ПБФАЭ различных соотношений эритроцитов и бактериальных клеток. Для этого в эксперименте использовали одну и ту же концентрацию клеток У. ре.у/и ЕУ НИИЭГ и различные концентрации эритроцитов (рис. 3).

70--

60 - -50 -40 -30 -20 +-

0,25 0,5 1

Концентрация эритроцитов, х10э/мл

□ Y.pestis EV НИИЭГ Ш Staph, epidermidis

Рис. 3. ПБФАЭ в отношении бактерий У. реяНя ЕУ НИИЭГ и 5. е/и'й/е/тш'й/« в зависимости от концентрации эритроцитов

Увеличение концентрации эритроцитов в пробах с клетками У. резня ЕУ НИИЭГ приводило к существенному повышению ПБФАЭ, в то время как при увеличении количества эритроцитов в пробах, содержащих культуру 5. ерШегтШ^я, данный показатель оставался без изменения. В дальнейших исследованиях применяли концентрацию эритроцитов 1,0х109/мл. При её использовании ПБФАЭ в отношении клеток У. реэНз ЕУ НИИЭГ был достаточно высоким - на уровне 80%, но в то же время в пробах оставались бактерии, не связанные с эритроцитами (около 20% от общего количества).

Из данных литературы (Зайцева Е.А., Сомов Г.П., 2006; Ананьева Н.В., Ганина В.И., Ленченко Е.М., 2007) известно, что на уровень адгезии микробных клеток к эритроцитам существенное влияние оказывают температура, рН среды и продолжительность инкубации, поэтому в следующей серии экспериментов изучали влияние на БФАЭ человека в отношении клеток У. реяНя ЕУ НИИЭГ различных условий инкубации эритроцитов с микробными клетками. При этом эритроциты и бактерии инкубировали в статических и динамических (вращающаяся платформа) условиях при температурах 20±1 °С и 37±1 °С в течение различного времени (рис. 4).

Установлено, что эритроциты человека максимально фиксируют бактерии вакцинного штамма чумного микроба уже после 5 мин их совместной инкубации. Температурный фактор в изученном диапазоне и динамические условия не оказывали выраженного влияния на фиксирующую способность эритроцитов в отношении клеток У. реяНв ЕУ НИИЭГ.

5 10 20 30 40

Продолжите/ъностъ инкубации, мин

- - Статические

условия,

температура

(20±1)°С

- Статические усговия, температура (37±1)°С

- Враи^юц^яся платформа, температура (37±1)°С

Рис. 4. ПБФАЭ человека в отношении клеток У. рейИй ЕУ НИИЭГ при различных условиях инкубации проб

Однако при изучении БФАЭ кошки в отношении этого же штамма было выявлено, что уровень фиксации бактерий эритроцитами зависит от температуры и условий инкубации (рис. 5). Более выраженная способность фиксировать микробные клетки у эритроцитов кошки проявляется при инкубации проб на вращающейся платформе при температуре 37±1 °С в течение 30 мин.

5 10 20 зо

Продолжительность инкубации, мин

■ Статические условия, температура 20±1°С - Статические условия, температура 37+1 °С -Вращающаяся платформа, температура 37±1°С

Рис. 5. ПБФАЭ кошки в отношении клеток У. рея//.? ЕУ НИИЭГ при различных условиях инкубации проб

Полученные данные свидетельствуют о том, что эритроциты человека и кошки отличаются по способности фиксировать на своей поверхности микробные клетки вакцинного штамма чумного микроба не только в количественном отношении, но и по условиям инкубации. Это, вероятно, связано с особенностями структур, находящихся на поверхности эритроцитов и отвечающих за процесс прикрепления бактерий. Для получения сопоставимых результатов определения ПБФАЭ необходимо проводить эксперименты по изучению фиксирующей способности эритроцитов разных видов млекопитающих в стандартных условиях, поэтому в дальнейшем при изучении БФАЭ человека и животных пробы инкубировали при температуре 37±1 °С на вращающейся платформе в течение 30 мин.

При изучении влияния рН инкубационной среды на уровень фиксирующей способности эритроцитов человека в отношении клеток вакцинного штамма чумного микроба было установлено, что самый высокий ПБФАЭ проявляется при рН среды 7,2 (рис. 6). Смещение рН среды инкубации как в кислую, так и в

щелочную стороны, приводило к снижению ПБФАЭ. По-видимому, адгезины У. реШз ЕУ НИИЭГ и рецепторы эритроцитов человека при значении рН инкубационной среды, близком к физиологическому значению крови, находятся в более активном состоянии. В связи с этим в дальнейших исследованиях использовали рН среды инкубации 7,2.

* 90 -

(О < 80

с 70

60-

50 40

30-

20-

10—

о , -

4,2 5,2 6,2 7,2 8.2 9,2

рН среды инкубации

Рис. 6. ПБФАЭ человека в отношении клеток У. ре^и ЕУ НИИЭГ при различных рН среды инкубации проб

Далее изучили влияние состава среды инкубации на ПБФАЭ человека в отношении штамма У. резИя ЕУ НИИЭГ. Микробные клетки и эритроциты суспендировали в 0,9%-ном растворе хлорида натрия рН 7,2, 0,1М фосфатном буфере рН 7,2 и 0,05 М трис-НС1 буфере рН 7,2. После совместной инкубации бактерий и эритроцитов в указанных растворах значения ПБФАЭ достоверно друг от друга не отличались (рис. 7). В последующих экспериментах инкубацию бактерий с эритроцитами осуществляли в 0,9%-ном растворе хлорида натрия.

,. !■■;..... -1- ЕяВЯР : КЦ : - т -

111

:: :

0.9% раствор хлорида 0,1М фосфатный буфер 0,05 М трис-НС1 буфер натрия

Рис. 7. ПБФАЭ человека в отношении клеток У. рея^я ЕУ НИИЭГ в различных средах инкубации проб

Для получения воспроизводимых результатов определения БФАЭ было важно не только использовать определенные условия инкубирования проб, но и применять стандартную микробную культуру, поэтому в следующей серии экспериментов изучили влияние на ПБФАЭ функционального состояния микробных культур. Первоначально провели сравнительные исследования показателя БФАЭ человека в отношении культуры К ре.?/« ЕУ НИИЭГ, полученной в результате разведения

чумной живой сухой вакцины 0,9%-ным раствором натрия хлорида, и культуры, выращенной на плотной питательной среде и суспендированной в 0,9%-ном растворе натрия хлорида. В одном варианте эксперимента клетки, приготовленные из лиофилизированного состояния, дважды отмывали от стабилизаторов путем центрифугирования при 2000 g в течение 10 мин, а в другом - применяли без отмывания.

Установили, что значения ГТБФАЭ человека в отношении клеток У. pestis EV НИИЭГ, выращенных на питательной среде и полученных из лиофильно-высушенной формы, статистически значимо друг от друга не отличались (рис. 8). Полученные результаты согласуются с данными H.H. Костюковой и С.Р. Карась (1987), которые показали, что лиофилизация бактерий не влияет на их адгезивную активность, поэтому для определения ПБФАЭ человека и, животных можно использовать как лиофилизированные клетки У. pestis EV НИИЭГ, так и микробные клетки, выращенные на плотной питательной среде.

80

< 70 0

ш 60 50 40 30 20 10 0

Выращивание на питательной среде

Приготовление из лиофилизированного состояния с последующим отмыванием

Способ получения микробной культуры

Приготовление из лиофилизированного состояния

Рис. 8. ПБФАЭ человека в отношении клеток У. рея/и ЕУ НИИЭГ, выращенных на питательной среде и полученных из лиофильного состояния

В дальнейшем провели оценку влияния сроков хранения микробных клеток на их способность фиксироваться на эритроцитах. Свежеприготовленную суспензию бактерий в 0,9%-ном растворе хлорида натрия хранили при температуре 4±2 °С. Через 1, 3, 7, 14, 21 и 28 суток осуществляли определение ПБФАЭ в отношении хранившихся бактерий У. реяйз ЕУ НИИЭГ. Для исследования использовали свежие эритроциты одного и того же донора. Эксперименты показали, что фиксирующая способность эритроцитов в отношении культуры, хранившейся при температуре 4±2 °С до 21 суток, не изменяется. Однако ПБФАЭ человека в отношении микробных клеток, хранившихся в течение 28 суток, резко снижался (рис. 9).

Снижение ПБФАЭ связывали с образованием микробными клетками конгломератов, которые выявлялись при микроскопии содержимого проб. Данное обстоятельство учитывали при дальнейших исследованиях БФАЭ. При определении БФАЭ клетки У. рейи ЕУ НИИЭГ предложили хранить при температуре 4±2 °С не более 21 суток.

90

т 80 <

© 70 | из

с 60 50 40 30 20 10 0

Свежая культура

1 3 7 14 21 28

Срок хранения суспензии микробных клеток, сут

Рис. 9. ПБФАЭ в отношении клеток У. резШ ЕУ НИИЭГ в зависимости от срока их хранения при температуре 4±2 °С

Для стандартизации методики определения БФАЭ важными условиями являлись стабилизация и сохранение способности эритроцитов фиксировать микроорганизмы бактериальной природы, поэтому в следующей серии экспериментов изучили влияние сроков и условий хранения эритроцитов на их фиксирующую активность в отношении клеток К ре^г/'^ ЕУ НИИЭГ. Для этого эритроциты суспендировали в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, 0,1 М фосфатном буфере, 0,05 М трис-НС1 буфере, а также в гемоконсервирующих растворах - «Глюгицире» и СРОА-1 и помещали на хранение при температуре 4±2 °С. Определяли фиксирующую активность эритроцитов, хранившихся в указанных растворах в течение 1, 3, 5 и 7 суток (табл. 3).

Таблица 3

ПБФАЭ человека в отношении бактерий У ЕУ НИИЭГ, хранившихся при

Суспендирующий раствор ПБФАЭ человека в %, хранившихся в течение ... сут:

0 1 и 3 5 7

0,9%-ный раствор хлорида натрия 76,2±3,76 75,28±1,23 71,58±4,81 74,73±4,83 гемолиз

0,1М фосфатный буфер - 81,85±3,41 81,07±1,14 79,49±5,25 гемолиз

0,05М трис-НС1 буфер - 69,83±6,51 77,63±3,96 69,1±4,85 гемолиз

«Глюгицир» - 79,89±2,39 гемолиз гемолиз гемолиз

«СРОА-1» - 80,63±3,99 71,62±3,79 81,72±1,72 гемолиз

I ПБФА эритроцитов, хранившихся в 0,9%-ном растворе хлорида натрия,

буферных растворах и СРОА-1 до 5 суток, не отличался от исходного значения. Однако после 7 суток хранения использовать эритроциты человека для изучения их бактериофиксирующей активности было невозможно, так как при их инкубации с микробными клетками наблюдался гемолиз. Выраженность БФАЭ в отношении клеток V. резИя ЕУ НИИЭГ, хранившихся в «Глюгицире» в течение одних суток, по сравнению со свежими эритроцитами не изменялась. Вместе с

I 21

тем после хранения эритроцитов в данном растворе в течение 3 суток при их инкубации с бактериями проявлялся выраженный гемолиз.

Учитывая относительно короткие сроки хранения нативных эритроцитов, изучили возможность использования в эксперименте эритроцитов, обработанных танином и формалином (рис. 10). Установили, что величина ПБФАЭ человека в отношении бактерий У. рея^я ЕУ НИИЭГ, обработанных танином, снижается в 2,1 раза, а обработанных формалином - в 14,7 раза по сравнению с нативными эритроцитами, поэтому в последующих экспериментах предварительную обработку эритроцитов танином и формалином не проводили. Исследование БФАЭ осуществляли с использованием нативных эритроцитов, хранившихся в 0,9%-ном растворе хлорида натрия при температуре 4±2 °С не более 5 суток.

зг 80

со < 70

е

ш ьи

с

50

40

30

20

10

0

—I—|

—

шшЬш

Нативные эритроциты

Танизированные эритроциты

Ф ормалинизированные эритроциты

Рис. 10. ПБФА нативных и обработанных танином и формалином эритроцитов человека в отношении бактерий У. резШ ЕУ НИИЭГ

Выбрав оптимальные условия взаимодействия эритроцитов человека с бактериями вакцинного штамма чумного микроба, провели тестирование разработанного фотоколориметрического метода. Для этого определили БФАЭ человека в отношении ряда микроорганизмов бактериальной природы (табл. 4).

Установили, что фиксирующая способность эритроцитов человека в отношении изученных микробных культур значительно варьирует. Высокую степень бактериофиксирующей активности эритроциты человека проявили в отношении клеток У. ЕУ НИИЭГ, Ь. сазе! ОМ-114001 и спор В. амИгас1$ № 55 ВНИИВВиМ. Фиксирующая способность эритроцитов человека в отношении микроорганизмов, выделенных из кишечника человека, и музейных штаммов была выражена значительно слабее. Между полученными значениями ПБФАЭ и ИАМ установили сильную положительную корреляционную связь

(1=0,9).

Сопоставление результатов, полученных фотоколориметрическим методом, с данными метода В.И. Брилис с соавт. (1986) позволило ввести шкалу оценки ПБФАЭ. При значениях ПБФАЭ ниже 5% считали, что эритроциты не обладают способностью фиксировать микробные клетки; при ПБФАЭ в диапазоне 5 - 15% фиксирующую способность эритроцитов считали низкой, 15 - 40% - средней, 40 - 60% - высокой, а свыше 60% - очень высокой.

Таблица 4

ИАМ и ПБФАЭ человека в отношении различных микроорганизмов бактериальной природы (М±ш; п=5)___

Микроорганизмы ИАМ ПБФАЭ, %

Вакцинные штаммы B. anthracis № 55 BHHHBBhM 4,91±0,67 46,69±2,77

Y. pestis EV HHH3r 7,00±0,95 77,41±5,29

Пробиотические штаммы E. coli M-17 2,67±0,28 6,11±0,91

L. plantarum P4 2,07±0,41 7,34±2,19

L. buchneri PO 2,21±0,17 32,13±3,11

L. casei DN-114001 4,23±0,62 55,25±4,17

L. rhamnosus ATCC 53103 1,12±0,07 14,72±1,25

L. acidophilus 0,12±0,02 0,25±0,04

L. bulgaricus 2,64±0,12 гемолиз

B. biftdum №1 1,93±0,51 0,66±2,54

Штаммы, выделенные из кишечника людей E. coli 0151 3,53±0,44 20,74±2,19

E. coli 0124 3,15±0,18 17,94±1,68

E. coli 0142 2,14±0,41 2,49±1,75

E. coli 0144 3,09±0,20 2,72± 2,15

E. coli 086 2,99±0,36 28,26±2,23

E. coli 0112 1,85±0,16 3,11±5,34

Музейные штаммы P. aeruginosa 2,22±0,19 12,05±1,64

K. pneumoniae 1,65±0,24 2.42±2,02

E. coli 2,11±0,32 9,47±1,53

P. vulgaris 1,87±0,18 0,81±2,69

P. mirabilis 1,68±0,25 2,56±3,68

S. epidermidis 1,73±0,24 1,46±3,61

S. saprophyticus 1,84±0,18 0,34±2,69

S. marcescens 1,72±0,19 3,83±9,29

M. luteus 1,46±0,20 0,28±1,81

Согласно предложенной шкале оценки фиксирующая способность эритроцитов в отношении бактерий У. pestis EV НИИЭГ была очень высокой, в отношении спор В. anthracis № 55 ВНИИВВиМ, а также бактерий L. casei DN-114001 - высокой, в отношении клеток клинических штаммов Е. coli 0151, 0124, 0124 и лактобацилл L. buchneri PO - средней, в отношении бактерий пробиотических штаммов Е. coli М17, L. plantarum Р4, L. rhamnosus АТСС и музейного штамма Е. coli - низкой; бактерии других штаммов к эритроцитам человека не фиксировались.

Таким образом, нами был разработан фотоколориметрический метод определения БФАЭ, который имел значительные преимущества перед традиционным методом определения адгезивных свойств бактерий. Во-первых, разработанный метод позволял устанавливать процент бактерий, прочно фиксированных на эритроцитах; во-вторых, давал возможность оценивать взаимодействие миллионов микробных клеток и эритроцитов; в-третьих, регистрация прикрепившихся бактерий к эритроцитам осуществлялась с помощью прибора, что исключало субъективность в оценке результатов исследования.

2.3. Модификация метода гемосканирования для изучения фиксирующей активности эритроцитов в отношении бактерий

В последние годы в клинической и лабораторной практике используются методы, основанные на современных технологиях. Одним из таких методов является гемосканирование, предложенное К. Грейджем (2002). При гемосканировании исследуется капля капиллярной крови. Она анализируется сразу после взятия крови под большим увеличением светового микроскопа (1000 - 1500 раз). При этом изображение передается через видеокамеру на монитор и может сохраняться в виде фотографий или динамических изображений (видеороликов). Данных об использовании гемосканирования при изучении взаимодействия эритроцитов с бактериями в доступной нам литературе не обнаружено.

Первоначально нами была исследована принципиальная возможность применения метода гемосканирования для изучения процесса фиксации эритроцитами бактерий У. pestis EV НИИЭГ и Е. coli М17. Выбор микроорганизмов, основанный на проведенных ранее исследованиях (табл. 4), обусловлен тем, что в первом случае фиксирующая способность эритроцитов человека в отношении У. pestis EV НИИЭГ является высокой, а по отношению Е. coli М17 - низкой. В предварительных исследованиях было установлено, что для оценки взаимодействия эритроцитов с бактериями при помощи гемосканирования пробы следует инкубировать при температуре 37±1 °С в течение 30 мин на вращающейся платформе. По окончанию инкубации проб каплю смеси эритроцитов и бактерий наносили на предметное стекло, закрывали покровным стеклом и исследовали в иммерсионной системе. В ходе экспериментов были выбраны оптимальные концентрации эритроцитов и бактерий, а также их соотношение. Применение равных объёмов суспензий эритроцитов и бактерий в концентрациях 0,1*10|2/л и 1,0х10'2/л соответственно позволяло выявлять взаимодействие микробов с эритроцитами. При соблюдении данных условий при микроскопии наблюдали бактерии У. pestis EV НИИЭГ, прикрепившиеся к эритроцитам. В то же время клетки Е. coli М 17 находились в межэритроцитарном пространстве и на эритроцитах не фиксировались (рис. 11).

Рис. И. Микроскопическая картина при гемосканировании эритроцитов человека с. нативными клетками У. pestis EV НИИЭГ (А) и Е. coli М 17 (Б). хЮОО. 1 - эритроциты; 2 - микробные клетки

Для лучшей визуализации процесса взаимодействия эритроцитов с бактериями последние предварительно окрашивали. При выборе красителя и его оптимальной концентрации соблюдали два условия: во-первых, чтобы микробы хорошо были видны при микроскопировании, во-вторых, чтобы испытуемый краситель не влиял на процесс прикрепления бактерий к эритроцитам. Из трех испытанных красителей (конго-рот, малахитовый зеленый, метиленовый синий) наилучшие показатели в данном отношении проявил метиленовый синий. Бактерии У. pestis EV НИИЭГ и Е. coli Ml7, обработанные метиленовым синим, в оптимальной концентрации были хорошо видны при микроскопии и сохраняли свойство взаимодействовать с эритроцитами, оставаясь жизнеспособными (рис 12).

; у \ у

% < , ; 1 п

\ - J9:

• K'V- - w^rn^1- т ''

V j : ■ .Jfr

ы..............^ тш.шмжг^т

Ä:,--1 Л:. .

А Б

Рис. 12. Микроскопическая картина при гемосканировании эритроцитов человека с окрашенными метиленовой синью бактериями Е. coli М 17 (А) и У. pestis EV НИИЭГ (Б), х 1000. 1 - эритроциты; 2 - микробные клетки

Как видно из микрофотографий, представленных на рис. 11 и 12, с помощью модифицированного метода гемосканирования удалось выявить ряд закономерностей взаимодействия эритроцитов с бактериями. При гемосканировании бактерий К coli Ml7 с эритроцитами микробные клетки находятся в межэритроцитарном пространстве и не фиксируются на поверхности эритроцитов, в то время как при исследовании пробы, в которой предварительно инкубировались эритроциты и бактерии У pestis EV НИИЭГ, наблюдается фиксация микробных клеток на эритроцитах, в межэритроцитарном пространстве бактерии практически отсутствуют. Прикрепление клеток вакцинного штамма чумного микроба к эритроцитам происходит достаточно прочно. Это определяется при незначительном вращении микровинта микроскопа, в результате чего происходит смещение эритроцита вместе с микробной клеткой. Кроме того, обнаружено, что как только бактерия фиксируется на эритроците, она становится неподвижной. В том случае, если фиксированной микробной клетки касается другая бактерия, она сразу же прикрепляется к ней и также становится неподвижной. Преимущество модифицированного метода гемосканирования перед другими методами изучения БФАЭ заключается в том, что для его использования необходимы минимальные объемы крови, которые можно получить из капилляров пальца человека или из хвостовой вены лабораторных животных. Метод прост в исполнении, позволяет в динамике изучать взаимодействие эритроцитов с

микробными клетками и их функциональное состояние, а результаты исследований могут сохраняться на электронных носителях и анализироваться в дальнейшей работе. Усовершенствованный метод гемосканирования использовали для подтверждения фиксации бактерий на эритроцитах после фотоколориметрической оценки их взаимодействия.

Таким образом, нами модифицирован метод гемосканирования, позволяющий проводить исследование БФАЭ в капле крови, что приближает условия эксперимента к условиям in vivo. Данным методом подтверждается факт фиксации эритроцитами клеток Y.pestis EV НИИЭГ. Метод может применяться при изучении бактериофиксирующей активности эритроцитов человека и разных видов животных в отношении вакцинных штаммов сибиреязвенного, туляремийного, бруцеллезного микробов, а также для качественной оценки фиксирующей активности эритроцитов в отношении различных микроорганизмов бактериальной природы, находящихся в споровой или вегетативной форме.

2.4. Фиксирующая активность эритроцитов людей и животных в отношении клеток вакцинных штаммов возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза и споровых форм вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы

Разработка информативного фотоколориметрического метода количественного определения БФАЭ и модификация метода гемосканирования в дальнейшем помогли провести исследования по определению БФАЭ в отношении клеток вакцинных штаммов чумного, туляремийного и бруцеллезного микробов, а также спор вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба (табл. 5). Как показали исследования, эритроцить, человека обладали способностью фиксировать на своей поверхности клетки вакцинных штаммов возбудителей чумы, туляремии и споры вакцинных штаммов возбудителя сибирской язвы. При этом в показателях БФАЭ человека в отношении исследуемых штаммов выявлялись существенные различия.

Таблица 5

ПБФАЭ человека в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза (М±т, п=5)__

Виды микроорганизмов Штаммы ПБФАЭ, %

У. pesíis EV линии НИИЭГ 77,41±5,29

В. anthracis (споровые формы) № 55 ВНИИВВиМ 46,69±2,77

СТИ-1 46Д9±2,72

II вакцина Ценковского 5б,69±2,77

F. tularensis 15 линии НИИЭГ 64, 52±3,37

В. abortus 19 ВА 0,86±0,42

Высокий уровень фиксирующей активности вьивлен у эритроцитов человека в отношении вакцинных штаммов чумного и туляремийного микробов. Показано, что ПБФАЭ человека в отношении спор сибиреязвенного микроба зависит от штамма. Эритроциты человека в большей степени фиксируют на своей поверхности споры В. апЛгаск II вакцины Ценковского, чем споры штаммов СТИ-1 и № 55 ВНИИВВиМ. Установлено, что эритроциты человека не фиксируют на своей поверхности бактерии вакцинного штамма 19 ВА бруцеллезного микроба.

Результаты фотоколориметрической оценки БФАЭ были подтверждены данными гемосканирования суспензии микробных клеток и спор с эритроцитами

человека. При микроскопии капли эритроцитов со спорами В. anthracis 55 ВНИИВВиМ и бактериями Y. pestis EV НИИЭГ и F. tularensis 15 НИИЭГ наблюдали фиксацию спор и клеток к эритроцитам. В то же время клетки В. abortus 19 ВА находились в межэритроцитарном пространстве и к эритроцитам не прикреплялись.

Таким образом, нами было установлено, что эритроциты человека в условиях in vitro обладают выраженной фиксирующей активностью в отношении клеток К pestis EV линии НИИЭГ, F. tularensis 15 линии НИИЭГ, а также спор В. anthracis № 55 ВНИИВВиМ, СТИ-1 и II вакцины Ценковского. В то же время эритроциты человека не фиксируют на своей поверхности бактерии В. abortus 19 В А. Полученные результаты позволили предположить, что наряду с патогенными свойствами возбудителей БФАЭ, вероятно, влияет на развитие и реализацию инфекционных процессов при чуме, сибирской язве, туляремии и бруцеллезе. При первых трех заболеваниях, протекающих у людей в острой форме, эритроциты обладают способностью фиксировать на своей поверхности возбудителей заболеваний, а при бруцеллезе, характеризующемся хроническим течением, эритроциты людей не фиксируют патогены.

На следующем этапе исследований изучили взаимодействие эритроцитов различных видов животных с бактериями Y. pestis EV НИИЭГ. Результаты определения БФАЭ млекопитающих в отношении вакцинного штамма чумного микроба представлены в табл. 6.

Таблица 6

ПБФАЭ разных видов млекопитающих в отношении клеток У. pestis EV НИИЭГ и данные литературы по их чувствительности « к инфицированию

возбудителем чумы

Группа Эритроциты млекопитающих Количество обследованных ПБФАЭ, % (М±га) Чувствительность к инфицированию

1 Белой мыши 12 70,70±3,61 Высокая

Белой крысы 8 83,97±5,01 Высокая

Свиньи 6 76,94±4,01 Высокая

Кролика 8 74,52±4,63 Высокая

Человека 12 76,37±7,15 Высокая

Морской свинки 12 61,12±2,82 Высокая

2 Золотистого хомячка 10 47,09±4,36' Низкая

Козы 8 51,28±7,36' Средняя

Коровы 8 45,31±3,12' Средняя

Овцы 5 43,38±3,74' Средняя

Собаки 6 57,08±3,88' Низкая

3 Лошади 6 30,59±1,88и Низкая

Кошки 6 22,11±5,53и Низкая

Примечание: -различия с группой 1; - различия с группами 1 и 2 достоверны (<0,05) по критерию Стьюдента.

Эксперименты показали зависимость фиксирующей активности эритроцитов в отношении вакцинного штамма чумного микроба от их видовой принадлежности. Высокие показатели БФА в отношении клеток К /р«/« ЕV НИИЭГ установлены у эритроцитов белой мыши, белой крысы, человека,

морской свинки, кролика, свиньи. Низкие показатели БФА в отношении этого микроба выявлены у эритроцитов кошки и лошади. Полученные данные о различной БФАЭ разных видов животных в отношении бактерий У. pestis EV НИИЭГ во многом совпадали с результатами исследований, отображенными в научной литературе, о чувствительности животных к инфицированию возбудителем чумы (Домарадский И.В., 1998; Туманский В.М., 1958; Watson R.L., Fullner K.J., Kolter R., 2001). Это подтвердило предыдущее предположение и позволило выдвинуть гипотезу об определенной роли эритроцитов в развитии и реализации инфекционного процесса при данном заболевании. Животные, обладающие высокими показателями БФАЭ в отношении чумных бактерий, более чувствительны к инфицированию У. pestis, а виды животных с низким ПБФАЭ менее восприимчивы к заражению возбудителем чумы.

Для подтверждения выдвинутой гипотезы были проведены исследования по изучению фиксирующей активности эритроцитов различных видов животных в отношении спор вакцинного штамма № 55 ВНИИВВиМ сибиреязвенного микроба. Для этого использовали эритроциты человека и животных, обладающих различной чувствительностью к инфицированию возбудителем сибирской язвы. Из данных литературы известно, что свиньи и белые крысы обладают естественной резистентностью к заражению В. anthracis, а коровы, кролики и морские свинки, как и человек, чувствительны к инфицированию данным возбудителем (Литусов Н.В., Васильев Н.Т., Васильев П.Г., 2002; Онищенко Г.Г., Кожухов В.В., 2010; Peters С.J., Calson S., Pierson D.E., 2002). В связи с этим представляло интерес изучение БФАЭ именно этих видов млекопитающих в отношении спор В. anthracis 55 ВНИИВВиМ (табл. 7).

Таблица 7

БФАЭ разных видов млекопитающих в отношении спор В. anthracis 55 ВНИИВВиМ и данные литературы по их чувствительности к инфицированию

возбудителем сибирской язвы

Груп- Эритроциты Количество ПБФАЭ, % Чувствительность к

па млекопитающих обследованных (М±щ) инфицированию

1 Коровы 5 39,18±2,24 Высокая

Кролика 5 46,24±3,18 Высокая

Человека 5 46,69±2,77 Высокая

Морской свинки 6 41,21±2,16 Высокая

2 Белой крысы 6 4,52±1,08 Низкая

Свиньи 5 4,23±0,31 Низкая

Примечание: - различия с группой 1 достоверны (<0,05) по критерию Стьюдента.

Установлено, что фиксирующая активность в отношении спор В. ашЬ-аы № 55 ВНИИВВиМ выражена у эритроцитов коровы, кролика, морской свинки и человека, в то время как эритроциты свиньи и белой крысы фиксируют споры сибиреязвенного микроба в очень незначительной степени. Таким образом, исследования показали такую же закономерность, что и при изучении фиксирующей активности эритроцитов млекопитающих в отношении вакцинного штамма чумного микроба.

Из анализа данных табл. 6 и 7 следует, что фиксирующая активность эритроцитов в отношении спор В. ап1ИгаЫя 55 ВНИИВВиМ значительно ниже, чем

бактерий Y. pestis EV НИИЭГ. В дальнейших исследованиях было установлено, что при прорастании спор их способность прикрепляться к эритроцитам усиливается. В то же время изучить взаимодействие вегетативных клеток сибиреязвенного микроба с помощью существующих в настоящее время методов невозможно, так как они находятся в виде цепочек и при центрифугировании оседают вместе с эритроцитами, а при гемосканировании очень сложно установить факт прикрепления клеток к эритроцитам.

2.5. Изучение механизмов взаимодействия эритроцитов человека с бактериями Y. pestis EV НИИЭГ

Как известно, взаимодействие про- и эукариотических клеток представляет собой сложные физико-химический и биологический процессы. На первой стадии адгезивного процесса происходят приближение бактерий (до 100 нм) и удержание их на поверхности клеток хозяина. По мнению В.В. Федоровича, C.B. Калюжного, Ван дер Мирена (2002) и Н.Ф. Дмитриевой, Ю.М. Тимофеевой, Н.И. Брико (2007), основную роль в этом процессе играют гидрофобно-гидрофильные свойства поверхностей.

Для подтверждения данного положения были проведены сравнительные исследования адгезивной активности и гидрофобных свойств культур Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на ГРМ-агаре при различных температурных режимах (рис. 13). Микробные клетки, культивируемые при температурах 20±1 °С и 28±1 °С и обладающие выраженными адгезивными свойствами, проявляли достаточно высокую гидрофобность (значения ПГ составляли 38—44%). У культуры, выращенной при температуре 37±1 °С и характеризующейся низкой адгезивностыо, гидрофобные свойства были выражены относительно слабо - ПГ находился на уровне 8%.

(18±1)°С (28±1)°С (37±1)°С ВШ! ПБФАЭ ПГ

Рис. 13. ПБФАЭ и ПГ культур У. ре5№ ЕУ НИИЭГ, выращенных при различных температурных режимах

Последующие эксперименты показали, что БФАЭ человека в отношении бактерий У. рез№ ЕУ НИИЭГ и гидрофобность микробных культур этого штамма зависят не только от температуры культивирования, но и от состава питательной среды (табл. 8). При выращивании бактерий на АХ их адгезивные и гидрофобные свойства были значительно выше, чем при выращивании на МПА. При этом добавление в состав МПА сульфата натрия и генцианвиолета не оказывало значительного влияния на адгезивность и гидрофобность микробных клеток; в то же

29

время внесение этих ингредиентов в АХ приводило к значительному повышению уровня адгезии и в меньшей степени - к повышению гидрофобности испытуемой культуры. Между значениями ПБФАЭ и ПГ микробных культур выявили высокую степень корреляционной связи (г=0,9), что позволило высказать предположение о важной роли гидрофобных сил в процессе фиксации эритроцитами человека клеток У. реяПя ЕУ НИИЭГ.

Таблица 8

ПБФАЭ человека в отношении бактерий У. peslis EV НИИЭГ и ПГ микробных культур, выращенных при 28±1 °С на питательных средах различного состава (М±т,

п=5)_

Дополнительные ингредиенты в питательной среде Питательная среда

МПА АХ

ПБФАЭ, % ПГ,% ПБФАЭ, % ПГ,%

Отсутствуют 35,93±3,87 15,26±3,34 59,67±3,81 27,44±3,32

Сульфит натрия 29,24±4,75 13,52±3,02 74,48±2,71 30,48±3,48

Генцианвиолет 34,26±4,48 16,95±3,75 78,21 ±3,21 29,15±3,57

Сульфит натрия и генцианвиолет 38,97±9,19 15,72±3,96 76,63±2,97 32,26±0,77

В то же время при изучении электрофоретической подвижности микробных культур У. pestis EV НИИЭГ, выращенных при разных температурах и на различных по составу питательных средах, существенных различий не выявлено. Следовательно, в сближении эритроцитов с клетками У. pestis EV НИИЭГ основную роль играют гидрофобные взаимодействия.

После приближения бактерий к клеткам-мишеням на расстояние менее 100 нм начинают проявлять действие ван-дер-ваальсовы и водородные силы, которые обеспечивают лиганд-рецепторное взаимодействие бактерий с клеткой хозяина (Езепчук Ю.В., 1985; Дмитриева Н.Ф., Тимофеев Ю.М., Брико Н.И., 2007). При этом происходит узнавание адгезинами бактерий рецепторов эукариотических клеток. Первоначально нами были проведены исследования по изучению влияния на процесс фиксации к эритроцитам адгезинов микробных клеток У. pestis EV НИИЭГ. Для этого оценивали адгезивную способность микробных культур, выращенных на различных по составу питательных средах. Эксперименты показали, что микробные клетки, культивируемые на АХ и ГРМ-агаре, обладают более выраженной способностью фиксироваться на эритроцитах, чем бактерии, выращенные на МПА. Кроме того, было установлено, что дополнительные ингредиенты (сульфит натрия и генцианвиолет) повышают адгезивные свойства культур при добавлении их в АХ и ГРМ-агар (табл. 9).

Как показали исследования, в наибольшей степени эритроциты человека фиксировали клетки У. pestis EV НИИЭГ, выращенные при температуре 28±1 °С. При этом у 24- и 48-часовых культур величина ПБФАЭ имела наибольшие значения (78 -81%). В то же время у 72-часовых культур, выращенных при данной температуре, отмечали достоверное (Р<0,05) снижение ПБФАЭ по сравнению с 24- и 48-часовой культурами. ПБФАЭ в отношении микробных клеток, культивируемых при температуре 20±1 °С, находился на уровне 60%. При этом значения БФАЭ в отношении культур с различными сроками выращивания статистически значимо друг от друга не отличались. Бактерии, выращенные при температуре 37±1 °С, фиксировались на эритроцитах в значительно меньшей степени. Значения ПБФАЭ для

них находились в пределах 10 - 20% и достоверно не отличались у 24-, 48- и 72-часовых культур.

Таблица 9

ПБФАЭ человека в отношении клеток У. резШ ЕУ НИИЭГ, выращенных на различных питательных средах (М±т; п=5)_

Дополнительные ингредиенты ПБФАЭ, %

МПА ГРМ-агар АХ

Отсутствуют 35,93±3,87 55,73±2,62 59,67±3,81

Сульфит натрия 29,24±4,75 71,42±2,85* 74,48±2,71*

Генцианвиолет 34,26±4,48 78,91±2,17** 78,21±3,21*

Сульфит натрия и генцианвиолет 38,97±9,19 73,88±2,31** 76,63±2,97*

Примечание: * Р<0,05; ** Р<0,01 - по сравнению с уровнем БФАЭ в отношении бактерий, выращенных на питательной среде без дополнительных ингредиентов.

Далее изучили ПБФАЭ в отношении 24-, 48- и 72-часовых микробных культур, выращенных при температурах 20±1,28±1 и 37±1 °С на ГРМ-агаре с генцианвиолетом (рис. 14).

-Ъ-

□ (2011 )°С

□ (28±1)°С

□ (37±1)"С

24 48 72

Возраст микробной культуры, чао

Рис. 14. ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ в зависимости от температуры выращивания и возраста микробной культуры

Согласно данным Г.Я. Ценевой, Н.Ю. Солодовниковай и Е.А. Воскресенской (2002), охарактеризованный ранее адгезин Y. pestis (белок рН6 антиген) экспрессируется только в диапазоне температур 35...41 °С в кислых условиях среды. Наши результаты, показывающие высокую адгезивную активность клеток Y. pestis EV НИИЭГ при относительно низких температурах, свидетельствовали о наличии у чумного микроба и других адгезинов, что совпадало с данными, полученными И.В. Бахтеевой (2008).

На следующей стадии исследований оценивали взаимодействие микробных культур, подвергнутых обработке трипсином и прогреванию при температуре 56±1°С. Результаты проведенных экспериментов отражены на рис. 15 и 16. Установили, что величина ПБФАЭ, после обработки микробных клеток трипсином в течение 1 - 3 часов, а также после прогревания суспензии бактерий в течение 10 - 30 минут, значительно снижалась.

* 80

С) < 70

в

ш с 60

50

40

30

20

10

0

Контроль

1 2 Продолжительность обработки, час

Рис. 15. Зависимость ПБФАЭ человека в отношении бактерий У. резНя ЕУ НИИЭГ от продолжительности обработки бактерий трипсином

Контроль

10 20 30

Продолжительность прогревания, мин

Рис. 16. Зависимость ПБФАЭ человека в отношении бактерий У. раИэ ЕУ НИИЭГ от продолжительности прогревания микробной культуры при температуре 56±1 °С

Проведенные исследования позволяют предположить, что структуры бактерий У. ре^/и ЕУ НИИЭГ, отвечающие за прикрепление к эритроцитам человека, имеют белковую природу, однако при воздействии высокой температуры и ферментативной обработки бактерий их способность связываться с эритроцитами полностью не исчезала. Следовательно, в фиксации бактерий на эритроцитах, помимо поверхностных белков, участвуют и другие субстанции. Учитывая высокую корреляционную связь гидрофобности и адгезивности клеток У. рея/« ЕУ НИИЭГ, можно предположить, что структуры, ответственные за связывание бактерий эритроцитами, являются липопротеидами.

Для оценки влияния экстрацеллюлярных метаболитов на способность бактерий фиксироваться на эритроцитах человека провели сравнительные исследования БФАЭ в отношении микробных культур, трижды отмытых 0,9%-ным раствором хлорида натрия, и культур, полученных, минуя стадию отмывания. Уровень БФАЭ в отношении микроорганизмов, выращенных на различных по составу средах после отмывания достоверно не отличался от контроля, следовательно, внеклеточные продукты метаболизма бактерий не влияли на их способность фиксироваться на эритроцитах человека.

Далее изучали БФАЭ в отношении культур У. ре.чИ.'; ЕУ НИИЭГ, которые пассировали через питательную среду и организм белых мышей (рис. 17, 18).

i

а во 2

5 70 —I

С

60 • 50 ■ 40 • 30 • 20 — 10

1 2 3 4 6 8 10 12

Количество пер«с*вов

Рис. 17. ПБФАЭ человека в отношении клеток У. резИя ЕУ НИИЭГ после различного количества пассажей бактерий через питательную среду

— гir гЬ гЬ

~±Г —

Контроль 1 2 3 4 6

Количество пассажей

Рис. 18. ПБФАЭ человека в отношении клеток У. pestis EV НИИЭГ после различного количества пассажей бактерий через организм белых мышей

Данные рис. 17 и 18 свидетельствуют о том, что уровень БФАЭ в отношении бактерий достоверно не отличался от исходного после 12 пересевов через среду выращивания (ГРМ-агар с генцианвиолетом), а также после 5 пассажей через организм белых мышей. Следовательно, пассажи и пересевы бактерий У. pestis EV НИИЭГ не оказывают влияния на состояние структур микробных клеток, которые ответственны за взаимодействие с рецепторами эритроцитов, но имеется тенденция к снижению ПБФАЭ в зависимости от количества пассажей и пересевов.

Таким образом, установлено, что уровень бактериофиксирующей активности эритроцитов зависит от адгезинов микробных клеток. Показано, что эритроциты человека обладают более выраженной фиксирующей способностью в отношении микробных клеток, выращенных при температуре 28±1 "С в течение 1 - 2 суток на АХ и ГРМ-агаре. Известно, что именно эти условия используются при приготовлении живой чумной вакцины (Коробкова Е.И., 1956; Наумов A.B., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г., 1992; Наумов A.B., Самойлова Л.В., 1992). Вероятно, высокая фиксирующая активность эритроцитов в отношении бактерий У. pestis EV НИИЭГ, выращенных в оптимальных условиях, играет определенную роль в формировании специфического иммунитета при чуме.

Считается, что уровень адгезии бактерий к эритроцитам зависит не только от лигандов бактерий, но и от рецепторов эукариотических клеток (Езепчук Ю.В., 1985; Дмитриева Н.Ф. Тимофеев Ю.М., Брико Н.И., 2007), поэтому на следующем этапе исследований изучили влияние на БФАЭ в отношении Y. pestis EV НИИЭГ рецепторов эритроцитов людей, отвечающих за групповую принадлежность по системе ABO и Rh. Как показали результаты экспериментов, значения БФАЭ доноров 0(1), А(Н), В(Ш), AB(IV) в отношении штамма Y. pestis EV НИИЭГ статистически значимо друг от друга не отличались (рис. 19). Достоверных различий между ПБФАЭ при использовании эритроцитов резус-положительных (Rh+) и резус-отрицательных (Rh-) доноров также не было выявлено (рис. 20).

т T -ь.

1 r-tn

— --

0(11 А (I) В (II) АВ (IV)

Группа крови

Рис. 19. ПБФАЭ людей с различными группами крови по системе ABO в отношении штамма Y. pestis EV НИИЭГ

т

—1—

Резус фактор

Рис. 20. ПБФАЭ людей с различными группами крови по системе 11Ь в отношении штамма К рез/м ЕУ НИИЭГ

Вместе с тем, уровень связывания микробных клеток эритроцитами отдельных доноров значительно варьировал. Минимальная величина ПБФАЭ была зарегистрирована в отношении эритроцитов донора В., В(Ш) ЯЬ+ группы крови -35,6±2,79%, максимальная - в отношении эритроцитов донора С., АВ(1У) группы крови - 90,61±2,62%. Однако для эритроцитов большей части доноров -43 человека (77,79% от общего количества) - значения ПБФАЭ находились в пределах 60-90% (рис. 21).

16 14

% 12

I Ю

ч

I '

Ч 6

X

с;

£ 4

2 О

<40 40-50 50-60 60-70 70-60 60-90 >90 пбфаэ,%

Рис. 21. ПБФАЭ различных доноров (N=56) в отношении штамма У. рехМз ЕУ НИИЭГ

Полученные результаты свидетельствуют о том, что БФАЭ здоровых доноров не зависит от их групповой принадлежности и резус-фактора, но при этом отмечаются значительные индивидуальные колебания данного показателя, причины которых не установлены. Вероятно, БФАЭ в отношении штамма У. ЕУ НИИЭГ обусловлена генетическими особенностями эритроцитов людей, которые не связаны с антигенами, отвечающими за групповую принадлежность и резус-фактор. Известно, что при возникновении эпидемий чумы часть людей выживала, однако объяснений этому нет. Выявленной особенностью колебаний ПБФАЭ в отношении клеток У. реШ$ ЕУ НИИЭГ можно объяснить индивидуальную чувствительность млекопитающих одного вида к заражению возбудителем чумы.

На следующем этапе исследований определяли влияние на величину БФАЭ человека в отношении бактерий У. рея/и ЕУ НИИЭГ нативной плазмы и сыворотки крови человека, а также альбумина и нормального иммуноглобулина человека Для этого в суспензию отмытых эритроцитов человека добавляли испытуемые препараты и суспензию бактерий. ПБФАЭ определяли через 30 мин инкубации проб в динамических условиях при температуре 37±1 °С (табл. 10).

Таблица 10

ПБФАЭ в отношении бактерий У. реэШ ЕУ НИИЭГ в присутствии препаратов плазмы и сыворотки крови (М±т; п = 5)__

Препарат ПБФАЭ (в %) при ... степени разведения препарата Контроль

Б/р 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

Сыворотка крови 10,0± 1,4*** 12,8± 2,4*** 23,1± 2,7*** 33,9± 3,9*** 43,2± 4,7*** 53,8± 4,6** 66,0± 2,1** 76,4± 3,0 77,6± 2,1

Плазма крови 4,9± 1,3*** 18,0± 2,3*** 20,9± 3,6*** 35,1± 2,8*** 43,7± 2,7*** 58,9± 3,1** 65,3± 3,4* 72,2± 4,8

Альбумин 31,0± 2,2*** 48,3± 3,7*** 53,5± 1,8*** 67,8± 2,9* 77,1± 2,9 77,6± 2,1 71,3± 3,5 76,8± 4,6

Иммуноглобулин 39,7± 2,3*** 52,6± 3,8*** 55,5± 3,4*** 69,4± 2,1* 76,4± 3,0 74,6± 2,3 81,5± 2,6 72,2± 5,4

/

У

/ У

/

У

/ — — —

УаЧЭч

Примечание: *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001 различия статистически достоверны по сравнению с контролем; б/р - без разведения.

Анализ экспериментов показал, что все тестируемые препараты оказывали выраженное ингибирующее действие на процесс прикрепления микробных клеток к эритроцитам. Наибольшей антиадгезивной активностью обладали плазма и сыворотка крови, которые при использовании в цельном виде снижали величину ПБФАЭ в 15,9 и 7,8 раза соответственно. Их ингибиторный эффект проявлялся до разведения 1:64 и исчезал при разведении 1:128. Цельный альбумин и иммуноглобулин снижали ПБФАЭ в 2,5 и 2,0 раза соответственно. Антиадгезивное действие данных препаратов регистрировали до разведения 1:8. Более выраженную ингибиторную активность цельной плазмы по сравнению с цельной сывороткой связывали с антиадгезивными свойствами фибриногена, входящего в её состав. Полученные результаты свидетельствовали о наличии у плазмы и сыворотки крови собственного защитного антимикробного действия, направленного на снижение прикрепления чумных бактерий к эритроцитам, и вовлечении целого ряда их компонентов в данный процесс.

В следующей серии экспериментов было выявлено, что предварительная инкубация эритроцитов или бактерий с сывороткой крови, альбумином и иммуноглобулином перед их соединением с необработанными клетками обеспечивала более значительное снижение ПБФАЭ по сравнению с добавлением соответствующих компонентов в пробы непосредственно перед смешиванием микробных клеток с эритроцитами (рис. 22). Следовательно, подавление фиксирующей активности эритроцитов в отношении клеток У. рел7й ЕУ НИИЭГ испытуемыми препаратами может объясняться блокированием как адгезинов бактерий, так и рецепторов эритроцитов.

Сыворотка Альбумин Иммуноглобулин

■ Добавление препарата в суспензию бактерий непосредственно перед её инкубацией с эритроцитами (контроль)

■ Предварительная 30-минутная обработка препаратом эритроцитов с послед рощей инкубацией с бактериями

□ Предварительная 30-минутная обработка препаратом бактерий с последрощей инкубацией с эритроцитами

Рис. 22. ПБФАЭ человека в отношении штамма У. реяШ ЕУ НИИЭГ при различных вариантах добавления препаратов сыворотки крови в систему «бактерии-эритроциты»

Далее исследовали возможность воздействия сыворотки крови, альбумина и глобулина на бактерии, уже прикрепившиеся к эритроцитам (рис. 23).

Для этого препараты добавляли в суспензию предварительно инкубированных бактерий с эритроцитами. Было установлено, что при добавлении в пробы сыворотки крови величина ПБФАЭ снижалась на 30,95% (Р<0,05) по сравнению с контролем. Альбумин и иммуноглобулин при аналогичном способе внесения снижали уровень фиксации бактерий на эритроцитах на 16,04% (Р<0,05) и 23,08% (Р<0,05). Следовательно, сыворотка крови, альбумин и иммуноглобулин человека способны «отрывать» часть клеток исследуемого штамма, фиксированных на эритроцитах.

Контроль Сыворотка Альбумин Иммуноглобулин

Рис. 23. ПБФАЭ человека в отношении штамма У. pestis EV НИИЭГ при добавлении препаратов сыворотки крови в пробы после инкубации бактерий с эритроцитами человека

Анализ полученных результатов позволил сделать вывод о том, что белковые компоненты плазмы крови обладают выраженной антиадгезивной активностью в отношении штамма У. pestis EV НИИЭГ. При этом установлено, что снижение фиксации бактерий на эритроцитах осуществляют все изученные белки: альбумины, иммуноглобулины и фибриноген. Показано, что указанные белки одновременно блокируют как рецепторы эритроцитов, так и адгезины бактериальных клеток. Кроме того, выявлено, что компоненты сыворотки крови способны «отрывать» клетки чумного микроба, прикрепившиеся к эритроцитам. Следовательно, организм человека обладает естественной белковой защитой, препятствующей контакту эритроцитов с попавшими в кровь клетками чумного микроба, которые стремятся к гемоглобину - источнику ионов железа.

На следующем этапе исследований провели изучение влияния на фиксирующую способность эритроцитов человека в отношении бактерий штамма Y. pestis EV НИИЭГ различных антибиотиков. Для этого к эритроцитам и бактериям в различных вариациях добавляли субтерапевтические и терапевтические концентрации антибиотиков: гентамицин и доксициклин - 3,0 и 6,0 мкг/мл, ампициллин - 10,0 и 20,0 мкг/мл, цефотаксим - 40,0 и 100,0 мкг/мл. Установили, что применяемые препараты в испытанных дозах не оказывали влияния на процесс фиксации бактерий на эритроцитах. Следовательно, данные антибиотики не обладают антиадгезивным действием в отношении клеток вакцинного штамма чумного микроба.

2.6. Исследование фиксирующей активности эритроцитов человека в отношении вакцинного штамма К pestis EV НИИЭГ и спор вакцинного штамма В. anthracis 55 ВНИИВВиМ в условиях ¡n vivo

На следующем этапе исследований изучили способность эритроцитов фиксировать клетки У. pestis EV НИИЭГ и споры В. anthracis 55 ВНИИВВиМ в организме высокочувствительных к чуме и сибирской язве животных. С этой целью белым мышам внутрибрюшинно, с интервалом 10 мин, сначала вводили взвесь эритроцитов человека, а затем взвесь бактерий (спор). Через 30 мин после введения бактерий осуществляли отбор содержимого брюшной полости и подвергали его микроскопии (рис. 24).

Рис. 24. Микрокартина содержимого брюшной полости белых мышей через 30 минут после раздельного введения эритроцитов человека с клетками Y. pestis EV НИИЭГ (А) и спорами В. anthracis 55 ВНИИВВиМ (В). xlOOO. 1 - эритроцит; 2 -бактерии, фиксированные на эритроците; 3 - спора, фиксированная эритроцитом

Установлено, что в брюшной полости белых мышей эритроциты человека сохраняют способность фиксировать на своей поверхности бактерии вакцинного штамма чумного микроба и споры вакцинного штамма сибиреязвенного микроба

Далее провели исследования фиксирующей активности эритроцитов белых мышей при экспериментальной чумной инфекции. Для моделирования инфекционного процесса использовали метод, который применялся нами для экспрессной оценки антибактериальных препаратов при ряде инфекционных заболеваний, в том числе при экспериментальной чуме у белых мышей (Оборин В.А., Васильев Н.Т., Васильев П.Г., 1990; Романов В.Е., Оборин В.А., Ежов A.B., 1991). Белым мышам в брюшную полость одновременно вводили бактерии вакцинного штамма чумного микроба в дозе 200 млн микробных клеток и 5 мг сернокисло-закисного железа в объеме 0,5 мл. За животными наблюдали в течение трех суток. Погибших животных подвергали вскрытию и патоморфологическому исследованию. Особое внимание обращали на изменения, происходящие в печени и селезенке.

Исследования показали, что микроскопически обнаружить бактерии Y. pestis EV НИИЭГ в крови белых мышей не удается. В то же время при посеве проб крови и содержимого внутренних органов от погибших животных выделяли микробные культуры с характерными для чумного микроба типичным ростом и тинкториально-морфологическими свойствами. У погибших животных наблюдали увеличение в размерах печени и селезенки, а при разрезе данных органов выявили полнокровие с обильным кровянистым отделяемым. При микроскопии отпечатков органов (печень, селезенка) обнаружили большое скопление микробных клеток и эритроцитов. Бактерии находились около эритроцитов, которые имели измененную форму и были частично разрушены, что косвенно подтверждало воздействие микробных клеток на эритроциты.

На следующем этапе провели сравнительные исследования по оценке фиксирующей активности отмытых эритроцитов и эритроцитов дефибринированной крови человека и различных видов животных в отношении вакцинного штамма чумного микроба. Результаты исследований представлены в таблице 11.

Таблица 11

ПБФАЭ и ПБФАЭК человека и различных видов животных в отношении

бактерий вакцинного штамма К pestis EV НИИЭГ

Принадлежность Количество ПБФАЭ, % ПБФАЭК, %

эритроцитов обследованных

Белая мышь 10 70,70±3,61 15,32±0,98

Белая крыса 8 83,97±5,01 18,73±1,16

Свинья 6 76,94±4,01 17,38±0,82

Кролик 8 74,52±4,63 16,39±1,35

Человек 25 69,37±2,15 14,84±1,26

Морская свинка 12 61,23±2,82 11,57±0,62

Собака 10 57,09±4,36' 6,01±0,09

Коза 8 57,08±3,88 4,14±0,03

Корова 8 51,28±7,3б 1,03±0,01

Золотистый хомячок 6 47,09±4,36 0

Лошадь 6 30,59±1,88 0

Кошка 6 22,11±5,53 0

Данные табл. 11 свидетельствуют о том, что в дефибринированной крови фиксирующая активность эритроцитов значительно снижается по сравнению с отмытыми эритроцитами. Эритроциты животных резистентных к заражению чумой (золотистый хомячок, лошадь и кошка), находящиеся в дефибринированной крови, не способны фиксировать на своей поверхности бактерии вакцинного штамма возбудителя чумы, в то время как у млекопитающих, высокочувствительных к чуме, эритроциты сохраняют эту способность.

Таким образом, в условиях in vivo при раздельном введении в брюшную полость эритроцитов человека и бактерий У. pestis EV НИИЭГ и спор В. anthracis 55 ВНИИВВиМ подтверждена БФАЭ в отношении данных штаммов. При экспериментальной инфекции у белых мышей, обусловленной заражением У. pestis EV НИИЭГ и одновременным введением сернокисло-закисного железа установлено, что в печени и селезенке бактерии находятся около эритроцитов. Исследования с использованием дефибринированной крови человека и животных показали, что БФАЭ, находящихся непосредственно в крови, значительно снижается, но в то же время сохраняется у восприимчивых к чуме млекопитающих. Следовательно, можно предполагать, что и в организме животных, восприимчивых к заражению возбудителями чумы, сибирской язвы и туляремии, эритроциты обладают способностью фиксировать патогены.

На основании доказательства фиксации бактерий У. pestis EV НИИЭГ, F. tularensis 15 НИИЭГ и спор В. anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и II вакцины Ценковского на эритроцитах человека и животных в условиях in vitro и in vivo выдвинута следующая гипотеза: возбудители чумы, сибирской язвы, туляремии при попадании в кровь восприимчивых и чувствительных к инфицированию животных фиксируются на эритроцитах и транспортируются ими в печень и селезенку, где поглощаются макрофагами. В макрофагах клетки У. pestis, F. tularensis и споры В. anthracis становятся недоступными для неспецифических факторов защиты организма и интенсивно пролиферируют. Для этого в макрофагах создаются все необходимые условия, в том числе достаточное количество ионов железа, поступающее из разрушенных эритроцитов, и ацидоз, который

способствует экспрессии микробами белков, ответственных за патогенность. После интенсивного размножения бактерий макрофаги погибают, микробные клетки в большом количестве попадают в кровеносное русло, т.е. наступает вторичная бактериемия. Это приводит к развитию септического состояния. Массовый лизис эритроцитов и образование патологических форм гемоглобина вызывают гипоксию тканей и анемию, что способствует гибели организма хозяина.

2.7. Теоретическое и экспериментальное обоснование перспективности адресной доставки антибактериальных препаратов с помощью эритроцитарных контейнеров при экстренной профилактике и лечении опасных инфекционных заболеваний

Выдвинутая гипотеза позволяет открыть новое направление в экстренной профилактике и лечении опасных инфекционных заболеваний, возбудители которых способны к внутриклеточному существованию и размножению. Для адресной доставки антимикробных препаратов в макрофаги, где локализуются возбудители, целесообразно использовать экстракорпоральный способ введения антибиотиков с помощью эритроцитарных контейнеров. Это позволит не только осуществить адресную доставку препаратов и эффективно воздействовать на бактерии, расположенные в макрофагах, но и уменьшит побочное действие антибиотиков на организм хозяина.

Обоснованием адресной доставки антибиотиков при чуме, сибирской язве и туляремии являются данные, представленные в научной литературе, о том, что физиологическая утилизация старых и измененных форм эритроцитов осуществляется в основном селезеночными макрофагами (Пухова Я.И., 1979; Шишкин A.B., 1986; Козлов В.А., 2001), поэтому эритроцитарные контейнеры с антибиотиками будут поглощаться макрофагами селезенки. В то же время при развитии инфекционных процессов при чуме, сибирской язве и туляремии возбудители находятся и размножаются в этих же макрофагах. Следовательно, эритроцитарные контейнеры с антибиотиками будут доставлены в места локализации и пролиферации бактерий. При этом влияние антибиотиков на другие органы и ткани макроорганизма будет минимальным, а действие антибактериальных препаратов будет более длительным, чем при других способах их введения.

Экспериментальными исследованиями показано, что эритроциты человека, подвергшиеся гипоосмотическому шоку, способны нагружаться гентамицином и превращаться в эритроцитарные контейнеры. Это свидетельствует о перспективности и возможности введения антибактериальных препаратов с помощью эритроцитарных контейнеров при экстренной профилактике и лечении опасных инфекционных заболеваний, что позволит осуществлять адресную доставку антибиотиков в печень и селезенку, пролонгировать действие и минимизировать вредные последствия антибактериальных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что методы С.С. Гизатулиной с соавт. (1991) и В.И. Брилис с соавт. (1986) не способны в полной мере охарактеризовать БФАЭ человека в отношении клеток У. pestis EV НИИЭГ и спор В. anthracis 55 ВНИИВВиМ, так как вакцинный штамм чумного микроба не образует адгезивно-активные колонии, наличие которых необходимо в методе С.С. Гизатулиной с соавт. (1991); метод же

В.И. Брилис с соавт. (1986), наряду с его трудоемкостью и субъективностью, не позволяет установить сам факт фиксации бактерий на эритроцитах.

2. На модели вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ разработан фотоколориметрический метод количественного определения БФАЭ, позволяющий оценивать взаимодействие миллионов микробных клеток с эритроцитами (патент РФ на изобретение № 2360969 от 10.07.2009 г.). В его основу положена фотоколориметрическая регистрация содержания микробных клеток в надосадочной жидкости после осаждения смеси эритроцитов и микробов при центрифугировании - чем меньше ее оптическая плотность, тем выше БФАЭ по отношению к исследуемому виду бактерий.

3. Модифицирован метод гемосканирования, позволяющий осуществлять наблюдение за процессом адгезии бактерий на эритроцитах вегетативных и споровых форм бактерий путем микроскопии. Этот метод дает возможность исследовать БФАЭ человека и различных видов животных в условиях, близких к in vivo.

4. Фотометрическим методом и методом гемосканирования установлено, что эритроциты человека и животных фиксируют на своей поверхности клетки Y. pestis EV НИИЭГ и F. tularensis 15 НИИЭГ, а также споры штаммов В. anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и II вакцины Ценковского. В то же время эритроциты человека с бактериями В. abortus 19 ВА и микробными клетками сапрофитной микрофлоры не взаимодействуют.

5. Фиксация эритроцитами бактерий вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ зависит от их видовой принадлежности - у человека, белых мышей, морских свинок, белых крыс, кроликов, свиней БФАЭ высокая, а у лошадей и кошек -низкая. Аналогичная тенденция выявлена при изучении БФАЭ млекопитающих в отношении спор вакцинного штамма В. anthracis 55 ВНИИВВиМ. ПБФАЭ в отношении спор штамма 55 ВНИИВВиМ у млекопитающих, восприимчивых к сибирской язве, находится на высоком уровне, а у устойчивых к заражению В. anthracis - на низком уровне.

6. БФАЭ человека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ обусловлена гидрофобными свойствами микробных клеток; морфофункциональным состоянием поверхностных структур бактерий, и рецепторного аппарата эритроцитов. БФАЭ человека снижается под влиянием белков плазмы крови (альбумина, глобулинов и фибриногена), но не зависит от антибактериальных препаратов (ампициллин, гентамицин, доксициклин, цефотаксим), используемых в терапевтических концентрациях.

7. Эритроциты человека сохраняют способность фиксировать на своей поверхности бактерии Y. pestis EV НИИЭГ и споры В. anthracis 55 ВНИИВВиМ в брюшной полости у белых мышей, а также во внутренних органах (печень, селезенка) при экспериментальной чумной инфекции у данных животных, обусловленной внутрибрюшинным введением вакцинного штамма возбудителя чумы на фоне сернокисло-закисного железа. Это подтверждает способность эритроцитов взаимодействовать с бактериями или спорами в условиях in vivo.

8. На основании полученных результатов и данных литературы выдвинута гипотеза о роли эритроцитов в реализации инфекционных процессов при чуме, туляремии и сибирской язве, согласно которой возбудители данных заболеваний, попав в кровяное русло, фиксируются эритроцитами и доставляются в печень и селезенку, где поглощаются макрофагами. В макрофагах микробы интенсивно

размножаются. После гибели и разрушения макрофагов бактерии в массовом количестве выходят в кровеносное русло, что способствует развитию септического состояния, а гемолиз эритроцитов и образование метгемоглобина приводят к анемии и гипоксии, усугубляющих течение инфекционных процессов при данных заболеваниях.

9. Эритроциты человека, подвергшиеся гипоосмотическому шоку, способны нагружаться антибиотиком гентамицином, т.е. превращаться в эритроцитарные контейнеры. Это свидетельствует о перспективности применения экстракорпорального способа введения антибактериальных препаратов при экстренной профилактике и лечении опасных инфекционных заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный фотоколориметрический метод определения бактериофиксирующей активности эритроцитов и модифицированный метод гемосканирования рекомендуется применять при отборе микробных штаммов для создания пробиотических препаратов, используемых при лечении дисбиотических состояний у человека и животных.

2. С целью повышения эффективности антибиотиков при экстренной профилактике и лечении инфекционных заболеваний целесообразно разрабатывать и использовать адресную доставку препаратов с помощью эритроцитарных контейнеров.

3. Предлагаемые методы фотоколориметрии и гемосканирования рекомендуется применять при изучении процесса адгезии между про- и эукариотическими клетками в учебном процессе при прохождении студентами высших учебных заведений учебных дисциплин - нормальной и патологической физиологии, микробиологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Специфические и неспецифические факторы противоинфекционной защиты у свиней при сибирской язве / В.С. Смирнов, Л.И. Маринин, В.А. Оборин и др. И Иммунология. - 1985. - № 5. - С. 80 - 81.

2. Спектр чувствительности Francisella tularensis к антибиотикам и синтетическим антибактериальным препаратам / В.А. Оборин, Н.Т. Васильев, П.Г. Васильев и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 1989. - № 9. - С. 662 - 665.

3. Оборин, В.А. Ускоренная оценка эффективности антибактериальных препаратов при экспериментальной туляремии / Н.Т. Васильев, П.Г. Васильев В.А. Оборин // Антибиотики и химиотерапия. - 1990. - № 8. - С. 37 - 38.

4. Экспрессный метод оценки эффективности антибактериальных препаратов in vivo / В.А. Оборин, И.Д. Кравец, Н.Т. Васильев и др. // Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ: Тезисы докладов Всесоюзной конференции. - М., 1990.-С. 192.

5. Изучение антимикробной активности аминогликозидов при экспериментальном сапе и мелиоидозе / В.А. Оборин, И.Д. Кравец, М.Н. Корнилов и др. // Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций: Тезисы докладов Всесоюзной конференции. - М., 1991. - С. 470-471.

6. Использование вакцинного штамма ЕВ для разработки безопасного метода экспрессной оценки эффективности антибактериальных препаратов в отношении

возбудителя чумы / В.Е. Романов, В.А. Оборин, А.В. Ежов и др. // Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний: Тезисы докладов Межведомственной научной конференции. - Киров, 1991. - С. 86 - 87.

7. Изучение возможности использования показателя фагоцитарной активности лейкоцитов крови для оценки состояния противочумного иммунитета / С.Н. Чигринов, И.Д. Кравец, В.А. Оборин и др. // Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний: Тезисы докладов Межведомственной научной конференции. - Киров, 1991. - С. 116 - 117.

8. Ускоренный метод оценки эффективности антибактериальных лекарственных препаратов / В.А. Оборин, И.Д. Кравец, Н.Т. Васильев, и др. // Антибиотики и химиотерапия. - 1992. - Т. 37, № 3. - С. 6-9.

9. Обоснование подходов к ранней диагностике чумы / С.Н. Чигринов,

B.Б. Калининский, В.А. Оборин // Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998. - С. 107 - 108.

10. Выбор методов, перспективных для ранней диагностики чумы /

C.Н. Чигринов, В.А. Оборин, В.Б. Калининский и др. // Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. -Киров, 1998.-С. 269.

11. Патоморфогенез сибирской язвы монография / Н.В. Литусов, П.Г. Васильев, В.А. Оборин и др. - М.: Медицина, 2002. - 240 с.

12. Фотометрический метод определения бактериофиксирующей активности эритроцитов в отношении возбудителей бактериальных инфекций / В.А. Оборин, А.Л. Бондаренко, В.Е. Романов и др. // Материалы научно-практической конференции и школы по инфекционной патологии с международным участием. -М.: МДВ, 2007. - С. 76.

13. Оборин, В.А. Разработка и перспективы применения фотометрического метода определения бактериофиксирующей активности эритроцитов (БФАЭ) в ветеринарии / А.Г. Ивонин, В.А. Оборин // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2008. - № 3. - С. 80 - 82.

14. Оборин, В.А. Разработка и применение фотометрического метода определения бактериофиксирующей активности эритроцитов в отношении возбудителей бактериальных инфекций / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин // Международное сотрудничество и развитие биотехнологий в Кировской области: Тезисы докладов международной конференции. - Киров, 2008. - С. 79 - 85.

15. Оборин, В.А. Методы изучения адгезивных свойств микроорганизмов / А.Г. Ивонин, В.А. Оборин // Науке нового века - знания молодых: Сборник статей 8-й научной конференции аспирантов и соискателей. - Киров: Вятская ГСХА, 2008.-С. 12-14.

16. Фотоколориметрический метод определения бактериофиксирующей активности эритроцитов / А.Г. Ивонин, В.Е. Романов, В.А. Оборин, Е.Л. Нехорошкина // Достижения ветеринарной науки и практики: Сборник статей Всероссийской научно-практической конференции. - Киров: Вятская ГСХА, 2008. -С. 63-69.

17. Изучение взаимодействия эритроцитов крови людей, имеющих различную групповую принадлежность, в отношении вакцинного штамма ЕВ чумного микроба / В.А. Оборин, И.В. Предеина, А.Г. Ивонин и др. // Актуальные проблемы физической культуры и спорта и пути их решения: Сборник научно-методических статей. - Киров: Изд-во ВятГГУ, 2008. - С. 59 - 62.

18. Перспективы применения антиадгезивной терапии при инфекционных заболеваниях, обусловленных возбудителями чумы, сибирской язвы и сальмонеллеза / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин, В.Е. Романов // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». -Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России», 2008. - С. 99 - 103.

19. Оборин, В.А. Изучение адгезивных свойств вакцинного штамма EV чумного микроба с помощью различных методов / В.А. Оборин, Е.В. Пименов,

A.Г. Ивонин // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России», 2008. -С. 198-202.

20. Исследование бактериофиксирующей активности эритроцитов (БФАЭ) крови различных видов животных и человека в отношении вакцинного штамма EV чумного микроба / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин, В.Е. Романов // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». -Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России», 2008. - С. 202 - 205.

21. Роль эритроцитов в генерализации инфекционного процесса при бактериальных инфекциях / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин,

B.Е. Романов // Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология: Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России», 2008. -

C. 205-209.

22. Изучение адгезии клеток вакцинного штамма EV Yersinia peslis к эритроцитам человека фотоколориметрическим методом / В.А. Оборин, А.Г. Ивонин, Е.В. Пименов и др. // Вестник Новосибирского государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина. - 2009. - Т. 7. - Вып. 3. -С. 25-29.

23. Оборин, В.А. Влияние различных условий и сроков хранения эритроцитов на показатель их бактериофиксирующей активности / A.A. Костяев,

A.Г. Ивонин, В.А. Оборин // Гематология и трансфузиология. - 2009. - № 6. - С. 45 -47.

24. Изучение механизмов взаимодействия микробов с эритроцитами /

B.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин и др. // Актуальные проблемы биологической защиты войск и населения. Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология. Микробиология. Биотехнология. Экология: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Екатеринбург, 2009. - С. 62 - 64.

25. Гемосканирование - возможности и перспективы применения при изучении вопросов взаимодействия бактерий с клетками живой крови / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, Ф.И. Абашева и др. // Актуальные проблемы биологической защиты войск и населения. Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология.

Микробиология. Биотехнология. Экология: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Екатеринбург, 2009. - С. 61 - 62.

26. К вопросу о роли эритроцитов в инфекционной патологии / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин и др. // Актуальные проблемы биологической защиты войск и населения. Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология. Микробиология. Биотехнология. Экология: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. -Екатеринбург, 2009. - С. 64 - 66.

27. Оборин, В.А. Роль эритроцитов в реализации инфекционного процесса / В.А. Оборин // Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику): Материалы международной научной конференции. - Ярославль, 2009. -С. 136.

28. Oborin, V.A. Gemoscaning: potentialities and prospects when used studing bacteria interaction with blood cells / F.I. Abasheva, V.A. Oborin // Scientifïc and practical conférence of post-graduates, candidacy applicants, graduates, undergraduates in modem languages «Ex professo». Transactions. - Kirov: Vyatka State University, 2009.-P. 11-13.

29. Оборин, В.А. Изучение адгезии бактерий вакцинного штамма У. pestis EV НИИЭГ к эритроцитам животных фотоколориметрическим методом / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин // Проблемы особо опасных инфекций. - 2010. - Вып. 103.-№ 1.-С. 48-50.

30. Оборин, В.А. Влияние условий культивирования штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ на его адгезивные свойства / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин // Проблемы особо опасных инфекций. - 2010. - Вып. 105. - № 3. - С. 54 - 57.

31. Оборин, В.А. Бактериофиксирующая активность эритроцитов: монография / В.А. Оборин; под научной редакцией чл.-корр. РАН Е.В. Пименова: -Киров: Вятская ГСХА, 2010. - 194 с.

32. Оборин, В.А. Фотоколориметрический метод изучения взаимодействия бактерий с эритроцитами людей и животных / В.А. Оборин, А.Г. Ивонин, Е.В. Пименов // Методические рекомендации. - Киров, 2010. - 20 с.

33. Оборин, В.А. Способы загрузки эритроцитов лекарственными препаратами / О.В. Вылегжанина, В.А. Оборин // Науке нового века - знания молодых: Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых: аспирантов и соискателей, посвященной 80-летию Вятской ГСХА - Киров: Вятская ГСХА, 2010.-Ч. 2.-С. 6-9.

34. Оборин, В.А. Изучение адгезивных свойств бактерий при помощи метода гемосканирования / Ф.И. Лянгасова, В.А. Оборин // Науке нового века - знания молодых. Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и соискателей, посвященной 80-летию Вятской ГСХА Сборник научных трудов. - Киров: Вятская ГСХА, 2010.-Ч. 2.-С. 35-37.

35. Перспективы адресной доставки антибактериальных препаратов с помощью эритроцитов крови в ветеринарии / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, О.В. Вылегжанина и др. // Современные научно-практические достижения в ветеринарии: Сборник статей Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Вятской государственной сельскохозяйственной академии. Выпуск 1,- Киров: Вятская ГСХА, 2010. - С. 141-144.

36. Адгезивные свойства спор вакцинного штамма 55 НИИВВиМ сибиреязвенного микроба в отношении эритроцитов человека и некоторых видов

животных / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин и др. // Современные научно-практические достижения в ветеринарии: Сборник статей Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Вятской государственной сельскохозяйственной академии. Выпуск 1. - Киров: Вятская ГСХА, 2010. - С. 144 -148.

37. Оборин, В.А. Роль железа в патогенезе бактериальных инфекций / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, В.Е. Романов // Современные научно-практические достижения в ветеринарии: Сборник статей Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Вятской государственной сельскохозяйственной академии. Выпуск 1. - Киров: Вятская ГСХА, 2010. - С.148 -151.

38. Бактериофиксирующая активность эритроцитов крови здоровых доноров в отношении вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин и др. // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГУ «КНИИГиПК ФМБА России» с международным участием. - Киров, 2010. - С. 89 - 90.

39. Оборин, В.А. Влияние условий и сроков хранения эритроцитов на показатели их бактериофиксирующей активности в отношении вакцинного штамма Yersinia pestis EV НИИЭГ / А.А. Костяев, В.А. Оборин, А.Г. Ивонин // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГУ «КНИИГиПК ФМБА России» с международным участием. - Киров, 2010. - С. 177 - 178.

40. Обоснование применения эритроцитарных контейнеров для адресной доставки антибиотиков при лечении опасных инфекционных заболеваний / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, О.В. Вылегжанина и др. // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию ФГУ «КНИИГиПК ФМБА России» с международным участием. - Киров, 2010. - С. 346 - 347.

41. Оборин, В.А. Методы изучения адгезивной активности Lactobacillus и их практическое применение / О.В. Смирнова, В.А. Оборин // Общество - наука -инновации: Материалы Всероссийской научно-технической конференции. В 4 т. -Киров: Изд-во ГОУ ВПО «ВятГУ», 2010. - Том 1. БФ, ФАМ, ХФ. - С. 43 - 45.

42. Оборин, В.А. Роль адгезивных свойств лактобацилл при получении эффективных пробиотических препаратов / О.В. Смирнова, В.А. Оборин // Общество - наука — инновации: Материалы Всероссийской научно-технической конференции. В 4 т. - Киров: Изд-во ГОУ ВПО «ВятГУ», 2010. Том 1. БФ, ФАМ, ХФ.-С. 150-152.

43. Методы определения бактериофиксирующей активности эритроцитов и оценки адгезивных свойств микроорганизмов бактериальной природы / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, С.Н. Копылов и др. Учебно-методическое пособие. -Киров: Вятская ГСХА, 2010. - 27 С.

44. Оборин, В.А. Исследование адгезивной активности культур лактобацилл, входящих в состав различных пробиотических препаратов / О.В. Смирнова, В.А. Оборин // Вопросы фундаментальной и прикладной физиологии в исследованиях студентов вузов: Материалы II региональной молодежной научной конференции - Киров, 2010. - С. 39 - 40.

45. Оборин, В.А. Определение электрического потенциала эритроцитов различных видов животных / Ю.О. Данилов, В.А. Оборин // Вопросы фундаментальной и прикладной физиологии в исследованиях студентов вузов: Материалы II региональной молодежной научной конференции. - Киров, 2010. -С. 16-18.

46. Оборин, В.А. Сравнительный анализ информативности методов определения бактериофиксирующей активности эритроцитов / В.А. Оборин, Е.В.Пименов, А.Г. Ивонин // Теоретическая и прикладная экология. - 2011. -№ 1.-С. 22-28.

47. Оборин, В.А. Модификация метода гемосканирования для изучения механизмов адгезии бактерий на эритроцитах / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин // Теоретическая и прикладная экология. - 2011. - № 2. - С. 24 - 29.

48. Пименов, Е.В. Фиксирующая активность эритроцитов человека и сельскохозяйственных животных в отношении бактерий пробиотических штаммов / Е.В. Пименов, В.А.Оборин, А.Г. Ивонин // Ветеринарная медицина. -2011. -№ 1,-С. 36-38.

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пат. RU 2360969 / Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов / В.Е. Романов, А.Г. Ивонин, АЛ. Бондаренко, В.А. Оборин, E.JI. Нехорошкина (РФ ФГУ ВПО Вятская государаственная сельхозакадемия). - № 2007 141246/13; Заявл. 06. 11. 2007; Опубл. 10. 07. 2009. Бюл. № 19. С. 5.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ААК - адгезивно-активная колония АХ - агар Хотгингера

БФАЭ - бактериофиксирующая активность эритроцитов ГВ - генцианвиолет

ГРМ-агар - агар на основе гидролизата рыбной муки

Е - экстинкция раствора (оптические единицы)

ИАМ - индекс адгезии микроорганизма

К - коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе

МПА - мясопептонный агар

ОП - оптическая плотность

ПА - показатель адгезии

ПБФАЭ - показатель бактериофиксирующей активности эритроцитов ПБФАЭК - показатель бактериофиксирующей активности эритроцитов в

крови

ПГ - показатель гидрофобности РГА - реакция гемагглютинации

S-слой — поверхностный (surface) паракристаллический слой клеток прокариот

Выражаю глубокую признательность и благодарность за консультативную помощь в выполнении данной работы, ценные советы и замечания доктору медицинских наук, профессору Циркину Виктору Ивановичу и доктору медицинских наук, профессору Романову Владимиру Евдокимовичу.

Подписано в печать 16.04.2011 г. Формат 60x84/16. Объем 3,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ №111.

Отпечатано в ООО «Издательство «Аверс» 610020, г. Киров, ул. Труда, 70 т.: (833-2)47-42-77, +7(905) 870-88-77 e-mail: avers@kirovnet.ru

Актуальность проблемы. Чума, сибирская язва, туляремия и бруцеллез относятся к зооантропонозным природно-очаговым особо опасным инфекциям, вспышки которых постоянно регистрируются в России, странах ближнего и дальнего зарубежья (Онищенко Г.Г., 2003; Смирнова Н.И.,

Кутырев В.В., 2006; Топорков В.П. с соавт., 2007; Безсмертный В.Е. с соавт., 2009; Попов Н.В: с соавт., 2008; Arbaji A. et al., 2005; Daya M., Nakamura Y. 2005; Begier E.M., 2006; Frazier A.A. et al., 2006). В последние годы наблюдается тенденция к увеличению количества заболеваний животных и людей, вызванных данными возбудителями (Покровский В.И., Черкасский Б.Л., 2003, Онищенко Г.Г. с соавт., 2003; Кутырев В.В. с соавт., 2008). Это обусловлено миграционными процессами, развитием индустрии туризма, экологическими проблемами. Не исключена возможность применения возбудителей данных инфекций в качестве агентов биотерроризма (Онищенко Г.Г., 2003; Афанасьева Г.А. с соавт., 2008; Lippi D., Conti А., 2002) и появления заболеваний, вызванных измененными формами микроорганизмов (Наумов A.B. с соавт., 1992; Домарадский И.В., 1998). Несмотря на достигнутые успехи в профилактике указанных выше инфекций эффективность лечения« поздних случаев чумы и сибирской язвы остается на низком уровне. Решение этих проблем может быть осуществлено только с учетом расширения знаний об их патогенезе.

Патогенез инфекционных заболеваний представляет собой многокомпонентный и многостадийный процесс, обусловленный как патогенными свойствами возбудителей болезни, так и ответной реакцией организма на их внедрение. На сегодняшний день установлены основные факторы патогенности Y. pestis, В. anthracis, F. tularensis, В. melitensis, В. bovis, В. ovis, В. canis (Ерошенко Г.А., Кутырев В.В., 2003; Кутырев В.В., Смирнова Н.И., 2003; Попов Н.В. с соавт., 2007; Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2006). Доказана защитная роль микро- и макрофагов при данных инфекциях (Наумов A.B. с соавт., 1995; Афанасьева Г.А. с соавт., 2008; Бывалов A.A. с соавт., 2008; Дентовская C.B. с соавт., 2009; Ben-Gurion R, Shafferman А., 1981).

Фагоцитарная реакция, бесспорно, играет важную роль в неспецифической резистентности организма и имеет определяющее значение в реализации специфического иммунитета при чуме, сибирской язве, туляремии и бруцеллезе. Вместе с тем при попадании в кровь и возникновении бактериемии, которая является необходимым условием эпидемического распространения возбудителей при трансмиссивных инфекциях, велика вероятность контакта возбудителей этих заболеваний с эритроцитами - самой многочисленной популяцией клеток крови.

Потенциальные возможности эритроцитов для взаимодействия с микробами, попавшими в кровеносное русло, очень велики. Это обусловлено тем, что в организме здорового человека находится 2,Зх1013 эритроцитов, что в сотни раз больше, чем количество лейкоцитов, а площадь поверхности всех эритроцитов составляет 3800 м2, что в 2000 раз превышает поверхность тела взрослого человека. Кроме того, скорость движения эритроцитов по кровеносной системе позволяет им совершать один кругооборот за 50 секунд (Баев В.М., 2001; Зинчук В.В: с соавт., 2003; Воробьев А.И., 2005).

Косвенным подтверждением того, что возбудители указанных выше инфекционных заболеваний взаимодействуют с эритроцитами, являются клинические наблюдения. У больных чумой, сибирской язвой и туляремией нередко выявляются геморрагические изменения на коже и слизистых оболочках, а также наблюдается снижение количества эритроцитов (Гинсбург H.H., 1976; Наумов A.B. с соавт., 1992; Домарадский И.В., 1993; Литусов Н.В. с соавт., 2002). При патоморфологических исследованиях животных и людей, погибших от чумы и сибирской язвы, обнаруживается выраженный гемолиз эритроцитов в сосудистом русле, печени и селезенке (Лобанов В.Н., 1956; Чалисов И.А., Хазанов А.Т., 1964; Абрамова A.A., Гринберг Л.М., 1993). Результаты исследований гемолитических свойств Y.pestis, В. anthracis и F. tiilarensis (Олсуфьев Н.Г., 1975; Бургасов П.Н. с соавт., 1984; Домарадский И.В., 1998) косвенно свидетельствуют о воздействии этих возбудителей на эритроциты. Известно, что чумной, сибиреязвенный и туляремийный микробы лучше растут на плотных питательных средах, в которые предварительно добавляется дефибринированная кровь (Туманский B.MI, 1958; Олсуфьев Н.Г., 1975; Арасланова В.А., 2009). В настоящее время у чумного и сибиреязвенного микробов обнаружены белки, относящиеся к сидеро форам, которые позволяют вирулентным штаммам Y.pestis и В. anthracis усваивать железо, находящееся в организме хозяина (Ледванов М.Ю. с соавт., 1995; Geoffroy V.A. et al., 2000; Gong S. et al., 2001; Perry R.D. et al., 2003; Maresso A.W. et al., 2006). В последние годы появились сообщения о том, что чумной микроб способен проникать внутрь эритроцитов и утилизировать из гемоглобина ионы железа (Булгакова 3.JI. с соавт., 2002; Федорова В.А., Девдариани 3.JL, 2007), однако эти данные носят фрагментарный характер. Сведений об изучении взаимодействия эритроцитов с возбудителями сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза в доступной нам литературе не обнаружено. В связи с этим для лучшего понимания патогенеза и оптимизации лечения этих инфекций представляется целесообразным проведение исследований по изучению бактериофиксирующей активности эритроцитов (БФАЭ) в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза в условиях in vitro и in vivo и установление её значения в развитии данных заболеваний.

Цель исследования. Определение механизмов фиксирующей активности эритроцитов человека и других видов млекопитающих в отношении бактерий вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза и обоснование её роли в развитии инфекционных процессов при данных заболеваниях.

Задачи исследования.

1. Изучить способность эритроцитов фиксировать на своей поверхности клетки Y. pestis EV НИИЭГ, споры В. anthracis 55 ВНИИВВиМ, а также другие микроорганизмы в условиях in vitro, используя метод В.И. Брилис с соавт. (1986) и метод G.C. Гизатулиной с соавт. (1991), которые применяются при оценке адгезивных свойств бактерий к эритроцитам.

2. Разработать фотоколориметрический метод количественного определения1 бактериофиксирующей активности эритроцитов БФАЭ человека и животных в отношении микроорганизмов бактериальной природы, применяя в качестве модели микроорганизмов клетки Y. pestis EV НИИЭГ.

3. Модифицировать метод гемосканирования для1 качественной и визуальной оценки фиксирующей активности эритроцитов людей и различных видов животных в отношении микроорганизмов бактериальной природы.

4. Изучить БФАЭ человека, а также лабораторных, сельскохозяйственных и домашних животных в отношении вакцинных штаммов Y. pestis EV НИИЭГ, В. anthracis (СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ, II вакцины Ценковского), F. tularensis 15 НИИЭГ и В. abortus 19 В А, используя фотоколориметрический метод и метод гемосканирования.

5. Исследовать механизмы БФАЭ в отношении клеток Y pestis EV НИИЭГ, в том числе роль гидрофобных взаимодействий и электростатических сил.

6. Изучить способность эритроцитов человека фиксировать на своей поверхности клетки вакцинных штаммов возбудителей чумы и сибирской язвы (споровая форма) в условиях in vivo при раздельном введении эритроцитов и микробных клеток в брюшную полость белых мышей.

7. Выдвинуть гипотезу о роли БФАЭ в развитии и реализации инфекционных процессов, обусловленных Y. pestis, В. anthracis, F. tularensis и Brucella spp.

8. Обосновать принципиальную возможность патогенетического метода лечения чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза с помощью адресной доставки антибиотиков в эритроцитарных контейнерах.

Научная новизна. Впервые разработан фотоколориметрический метод определения БФАЭ в отношении микроорганизмов бактериальной природы (патент РФ на изобретение № 2360969 от 10.07.2009 г.), который позволяет осуществлять количественную^ оценку связывания эритроцитами; бактериш Для; качественного' визуального изучения? БФАЭ модифицирован метод гемосканирования, дающий возможность, в динамике: наблюдать процесс взаимодействия эритроцитов с:., бактериями. Впервые* с помощью, разработанного* фотоколориметрического и модифицированного^ методов гемосканирования, изучена БФАЭ человека и разных видов животных в отношении клеток вакцинных штаммов Y. pestis EV НИИЭГ, F. tularensis 15 НИИЭГ и В. abortus 19 В А, а также споровых форм вакцинных штаммов В; anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и II вакцины Ценковского. Установлено, что эритроциты* людей; и. животных; способны фиксировать на своей поверхности клетки вакцинных штаммов чумного и туляремийного микробов, а также споры вакцинных штаммов сибиреязвенных бацилл, но в то же время эритроциты человека, не фиксируют бактерии вакцинного .штамма бруцеллезного микроба*. Показано- что БФАЭ человека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ зависит от морфофункционального; состояния адгезинов микробных клеток, рецепторного аппарата эритроцитов и условий, в, которых происходит фиксация. Установлено, что основную роль в фиксирующей способности эритроцитов человека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ играют гидрофобные силы, тогда как электрический заряд поверхности клеток не оказывает существенного влияния на их взаимодействие:

Впервые выявлены существенные различия в БФАЭ у людей и различных видов животных в отношении штамма» Y. pestis EV НИИЭГ. При этом установлено, что эритроциты человека и высокочувствительных к чуме животных(крыса, белая- мышь, морская? свинка^, кролик,, свинья) обладают высокой бактериофиксирующей способностью, :а эритроциты малочувствительных к заражению возбудителем чумы животных (лошадь, кошка) фиксируют на своей поверхности клетки Y. pestis EV в значительно меньшей степени. Аналогичные данные получены в отношении спор штамма В. anthracis 55 ВНИВВиМ. У высоковосприимчивых к инфицированию возбудителем сибирской язвьь млекопитающих (человек, корова, кролик, морская свинка) эритроциты обладают более высокой фиксирующей способностью к спорам сибиреязвенного микроба, чем эритроциты резистентных к заражению В. anthracis животных (свинья, белая крыса).

Впервые исследована фиксирующая способность эритроцитов человека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, находящихся непосредственно в крови, а также изучено антиадгезивное действие различных компонентов плазмы крови и ряда антибактериальных препаратов. Установлено, что белки плазмы крови здорового человека (альбумины, глобулины и фибриноген) обладают выраженной антиадгезивной активностью» в отношении, бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, в то время как антибиотики (ампициллин, доксициклин, гентамицин, цефотаксим) в терапевтических концентрациях не влияют на процесс фиксации эритроцитами бактерий.

В условиях in vivo при раздельном введении эритроцитов и бактерий вакцинных штаммов чумного или спор сибиреязвенного микроба в брюшную полость белым мышам подтверждено, что эритроциты сохраняют способность фиксировать на своей поверхности клетки Y. pestis EV НИИЭГ и споры В. anthracis 55 ВНИВВиМ.

Теоретическая значимость. Гипотеза о роли эритроцитов в реализации инфекционного процесса при чуме, сибирской язве, туляремии и бруцеллезе выдвинута на основании анализа данных литературы о патоморфологических изменениях при этих заболеваниях, в том числе полученных автором ранее при изучении патоморфогенеза сибирской язвы, а также на основании результатов настоящих исследований по изучению БФАЭ человека и различных видов животных в отношении вакцинных штаммов Y. pestis EV НИИЭГ, В. anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и II вакцины Ценковского, F. tular ens is 15 НИИЭГ и В. abortus 19 В А в условиях in vitro и in vivo. Согласно этой гипотезе клетки Y. pestis, F. tularensis и споры В. anthracis при проникновении в кровяное русло чувствительных к чуме, туляремии и сибирской язве млекопитающих фиксируются на поверхности эритроцитов. Это способствует транспорту микроорганизмов и их поглощению макрофагами селезенки и печени. В этих клетках возбудители становятся недоступными для* неспецифических факторов защиты организма и интенсивно пролиферируют, так как в макрофагах создаются все необходимые для этого условия, в том числе-достаточное количество ионов железа, поступающих из разрушенных эритроцитов, и ацидоз, который способствует синтезу микроорганизмами белков, ответственных за патогенность. После интенсивного размножения бактерий макрофаги погибают, микробные клетки в большом количестве попадают в кровеносное русло, т.е. наступает вторичная бактериемия. Это приводит к септическому состоянию. Массовый лизис эритроцитов и образование патологических форм гемоглобина вызывает гипоксию тканей и анемию, что способствует гибели организма хозяина. В то же время при бруцеллезе, возбудитель которого не фиксируется на эритроцитах, основным клиническим симптомом является специфическая аллергическая перестройка организма хозяина.

Данная гипотеза позволила впервые обосновать перспективность и принципиальную возможность адресной доставки антибиотиков с помощью эритроцитарных контейнеров при экстренной профилактике и лечении указанных выше I опасных инфекционных заболеваний. Предложенная гипотеза позволяет объяснить скоротечность и высокую летальность особо опасных инфекций (чумы, сибирской язвы, туляремии), а также особенности развития хронических инфекций типа бруцеллеза.

Результаты исследований расширяют представления о функциях эритроцитов, а именно об их способности избирательно фиксировать и транспортировать отдельные виды микроорганизмов в печень и селезенку, что приводит к их дальнейшему фагоцитозу в этих органах. Таким образом, при инфекционных процессах, вызванных заражением вирулентными штаммами У. реБШ, В. апМгаЫз и К Ы\агеп815 эритроциты обеспечивают развитие заболевания, а при иммунизации - доставляют бактерии живых вакцин в органы иммуногенеза, способствуя формированию специфического иммунитета.

Практическая значимость и! внедрение. Разработанный фотоколориметрический метод и модифицированный метод гемосканирования применяются при изучении роли БФАЭ в развитии инфекционных процессов-при чуме, сибирской язве, туляремии и бруцеллезе, а таюке используются при исследовании адгезивных свойств микробных культур, входящих в состав пробиотических препаратов и продуктов функционального питания в ГОУ ВПО «ВятГУ» и ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА». !

По результатам исследований получен патент РФ на изобретение № 2360969 «Способ определения бактериофиксирующей активности эритроцитов».

Результаты исследований отражены в «Методических рекомендациях по изучению адгезии бактерий к эритроцитам людей и животных с помощью фотоколориметрии» (ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА», 2009), в методических рекомендациях «Фотоколориметрический метод изучения взаимодействия бактерий с эритроцитами людей и животных» (ГОУ ВПО «ВятГУ», 2010), в учебно-методическом пособии «Методы определения бактериофиксирующей активности эритроцитов и оценки адгезивных свойств микроорганизмов бактериальной природы» (ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА», 2011), утвержденным в управлении методического обеспечения (УМО).

Результаты исследований используются при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий со студентами ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА» специальности 310800 - «Ветеринария» по курсу «Ветеринарная микробиология», со студентами ГОУ ВПО «Кировская ГМА» специальностей 060101 «Лечебное дело», 060103 «Педиатрия», 060109'«Сестринское дело», по курсу «Микробиология, вирусология, иммунология», специальности 080401 «Товароведение и экспертиза товаров в сфере производства и обращения сельскохозяйственного сырья и продовольственных товаров» по курсам -«Основы микробиологии», «Микробиология продовольственных товаров, санитария и гигиена», со студентами ГОУ ВПО «ВятГГУ» специальностей 032102.65 «Адаптивная физическая культура», 050720 «Физическая культура» и 010707.65 «Медицинская физика», по курсам - «Общая физиология», «Безопасность жизнедеятельности», а также при выполнении дипломных работ студентами ГОУ ВПО «ВятГУ» специальностей 020209 «Микробиология» и 240901 «Биотехнология» по курсам - «Микробиология» и «Биотехнология». Это подтверждено актами внедрения, утвержденными руководителями данных высших учебных заведений.

Декларация личного участия автора. Экспериментальные исследования выполнялись лично автором при его непосредственном руководстве научной группой. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Эритроциты человека обладают выраженной способностью фиксировать на своей поверхности клетки вакцинных штаммов Y. pestis EV НИИЭГ, F. tularensis 15 НИИЭГ, а также споры вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и II вакцины Ценковского, но не фиксируют клетки В. abortus 19 В А. Это позволяет выдвинуть гипотезу о роли БФАЭ в развитии и реализации патологического процесса при чуме, сибирской язве, туляремии и бруцеллезе.

2. Фиксирующая активность эритроцитов в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ и В. anthracis 55 ВНИИВВиМ зависит от видовой принадлежности эритроцитов. У чувствительных к инфицированию возбудителем чумы видов млекопитающих (человек, белая мышь, белая крыса, кролик, свинья) БФАЭ в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ высокая, а у малочувствительных к инфицированию возбудителем чумы животных (лошадь, кошка) - низкая. Эритроциты животных, чувствительных к заражению В. anthracis (человек, морская свинка, кролик, корова), обладают выраженной фиксирующей способностью в отношении спор вакцинного штамма сибиреязвенного микроба, а эритроциты свиньи и белой крысы, резистентных к инфицированию возбудителем сибирской язвы, фиксируют споры В. anthracis 55 ВНИИВВиМ в незначительном количестве. Это подтверждает гипотезу о роли БФАЭ в развитии инфекционного процесса и объясняет чувствительность млекопитающих к чуме и сибирской язве.

3. БФАЭ в отношении Y. pestis EV НИИЭГ зависит от трех составляющих: адгезивных свойств микробных клеток, фиксирующей способности эритроцитов и среды, в которой происходит адгезия бактерий на эритроцитах. В адгезии бактерий к эритроцитам, определяющее значение имеют гидрофобные свойства микробных клеток, обусловленных их поверхностными структурами. Фиксирующая способность эритроцитов обусловлена видовыми и индивидуальными особенностями их гликофоринов. Белки плазмы крови (альбумины, глобулины-и фибриноген) снижают БФАЭ в отношении вакцинного штамма чумного микроба, в то время как антибактериальные препараты (ампициллин, гентамицин, доксициклин, цефотаксим) не влияют на нее.

4. Эритроциты белых мышей обладают высокой фиксирующей активностью в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ и спор В. anthracis 55 ВНИИВВиМ в условиях in vivo, что показано при внутрибрюшинном раздельном введении животным эритроцитов и бактерий. Данные о БФАЭ' различных видов млекопитающих в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза, полученные в условиях in vitro и in vivo; наряду со сведениями литературы о геморрагических проявлениях у больных чумой, сибирской язвой, туляремией и патоморфологических исследованиях погибших от чумы и сибирской язвы людей и животных подтверждают рабочую гипотезу о роли БФАЭ в развитии инфекционного процесса при данных заболеваниях. Выдвинутая гипотеза позволяет обосновать перспективность применения эритроцитарных контейнеров для адресной доставки , антибиотиков при: экстренной профилактике и лечении этих инфекций.

Апробация диссертационной работы. Результаты исследований. были доложены и ; обсуждены:!

- на Всесоюзной конференции «Современные направления создания и оценки: качества; готовых лекарственных1 препаратов, антибиотиков и антимикробных веществ»; 27 - 2&ноября 1990 г., Москва;:

- на Межведомственной научной конференции «Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний», 26 - 27 марта 1991 г., Киров;

- на Всесоюзной5 конференции «Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций, 22 октября 1991 г., Москва;

- на Научно-практической конференции и школе: по инфекционной патологии (с международным участием),.20 - 24 октября 2007 г., Москва;

- на Международной конференции «Международное сотрудничество и развитие биотехнологий в Кировской области», 27 — 28 марта 2008 г., Киров;

- на Всероссийской научно-практической конференции «Достижения ветеринарной науки и,практики», 17 - 18 апреля 2008 г., Киров;

- на . Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора П.Г. Петского «Современные научные1 достижения в животноводстве», 16-17 апреля 2009 г., Киров;

- на Отделении общества физиологов имени И-П. Павлова в Кировской государственной?медицинской академии, 3 июня 2009 г., Киров;

- на VII Международной конференции по гемореологии и микроциркуляции (от функциональных механизмов в клинику), 14 июня 2009 г., Ярославль;

- на Всероссийской, научно-практической конференции, посвященной? 60-летию филиала ФРУ «48 ЦНИИ Минобороны России - ЦБТП БЗ», 16 июля 2009 г., Екатеринбург;

- на Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию Вятской государственной сельскохозяйственной академии, 15 апреля 2010 г., Киров; на II' региональной молодежной конференции, «Вопросы фундаментальной! и прикладной физиологии в исследованиях студентов», 24 мая 2010т., Киров;

- на региональной- научно-практической' конференции «Актуальные проблемы потребительского рынка товаров и услуг», 26 мая 2010 года, Киров;

- на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины», посвященной 50-летию ФГУ «Кировского научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови'ФАБА России» с международным участием, 6-7 октября 2010 г., Киров;

- на VIII Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биомониторинга и биоиндикации», 1 декабря 2010 г., Киров.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации в открытой печати опубликовано 49 работ, из них 12 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 1 патент и 2 авторских свидетельства на изобретения, 2 монографии, методические рекомендации и учебно-методическое пособие, утвержденное в УМО.

Исследования выполнялись с 1978 по 1996 годы в 48 ЦНИИ Министерства обороны Российской Федерации в рамках 18 плановых научных тем. С 2006 по 2010 годы исследования проводились в ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА» по теме «Разработка и оценка лечебно-профилактической эффективности новых антимикробных и биологически активных препаратов, пробиотиков при инфекционных заболеваниях животных». С 2008 года исследования проводятся по теме докторской диссертации «Бактериофиксирующая активность, эритроцитов в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза и обоснование её роли в патогенезе данных заболеваний»», утвержденной 3 июля 2008 г. на Ученом совете в ГОУ ВПО «ВятГУ».

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 286 листах машинописного текста, состоит из введения и семи глав, включающих обзор литературы и результаты собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 35 рисунками. Библиографический список включает 584 источника, из них 367 отечественных и 217 иностранных авторов.

220 ВЫВОДЫ

1. При изучении БФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ и спор В. anthracis 55 ВНИИВВиМ методами С.С. Гизатулиной с соавт. (1991) и В.И. Брилис с соавт. (1986) показано, что* эти методы не способны в полной мере охарактеризовать эту активность, так как вакцинный' штамм-чумного микроба не образует адгезивно-активные колонии^ наличие которых необходимо в методе С.С. Гизатулиной с соавт. (1991), а также в силу того, что метод В.И. Брилис с соавт. (1986), наряду с его трудоемкостью и субъективностью, не позволяет установить сам факт фиксации бактерий на эритроцитах.

2. На модели вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ разработан фотоколориметрический метод количественного определения БФАЭ, позволяющий оценивать взаимодействие миллионов микробных клеток с эритроцитами (патент РФ на изобретение № 2360969 от 10.07.2009 г.). В его основу положена фотоколориметрическая регистрация содержания микробных клеток в надосадочной жидкости после осаждения смеси эритроцитов и микробов при центрифугировании — чем меньше ее оптическая плотность, тем выше БФАЭ по отношению к исследуемому виду бактерий.

3. Модифицирован метод гемосканирования, позволяющий осуществлять наблюдение за процессом адгезии бактерий на эритроцитах вегетативных и споровых форм бактерий путем микроскопии. Модифицированный метод гемосканирования дает возможность исследовать БФАЭ человека и различных видов животных в условиях близких к in vivo.

4. Фотометрическим методом и методом гемосканирования установлено, что эритроциты человека и животных фиксируют на своей поверхности клетки Y. pestis EV НИИЭГ и F. tularensis 15 НИИЭГ, а также споры, штаммов В. anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и П вакцины Ценковского. В то же время эритроциты человека с бактериями В. abortus 19 В А и микробными клетками сапрофитной микрофлоры не взаимодействуют.

5. Фиксация эритроцитами бактерий вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ зависит от их видовой принадлежности — у человека, белых мышей, морских свинок, белых крыс, кроликов, свиней БФАЭ высокая, а у лошадей и кошек - низкая. Аналогичная тенденция выявлена при изучении БФАЭ млекопитающих в отношении спор вакцинного штамма В. anthracis 55 ВНИИВВиМ. ПБФАЭ у млекопитающих, восприимчивых к сибирской язве, в отношении спор штамма 55 ВНИИВВиМ, находится на высоком уровне, а устойчивых к заражению В. anthracis — на низком уровне.

6. БФАЭ человека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ обусловлена гидрофобными свойствами микробных клеток; морфофункциональным состоянием поверхностных структур бактерий, и рецепторного аппарата эритроцитов. БФАЭ человека снижается под влиянием белков плазмы крови (альбумина, глобулинов и фибриногена), но не зависит от антибактериальных препаратов (ампициллин, гентамицин, доксицикпин, цефотаксим), используемых в терапевтических концентрациях.

7. Эритроциты человека сохраняют способность фиксировать на своей поверхности бактерии Y. pestis EV НИИЭГ и споры В. anthracis 55 ВНИИВВиМ в брюшной полости у белых мышей, а также во внутренних органах (печень, селезенка) при экспериментальной чумной инфекции у данных животных, обусловленной внутрибрюшинным введением вакцинного штамма возбудителя чумы на фоне сернокисло-закисного железа. Это подтверждает способность эритроцитов взаимодействовать с бактериями или спорами в условиях in vivo.

8. На основании полученных результатов и данных литературы выдвинута гипотеза о роли эритроцитов в реализации инфекционных процессов при чуме, туляремии и сибирской язве, согласно которой возбудители данных заболеваний, попав в кровяное русло, фиксируются эритроцитами и доставляются в печень и селезенку, где поглощаются макрофагами. В макрофагах микробы интенсивно размножаются. После гибели и разрушения макрофагов бактерии в массовом количестве выходят в кровеносное русло, что способствует развитию септического состояния, а гемолиз эритроцитов и образование метгемоглобина приводят к анемии и гипоксии, усугубляющих течение инфекционных процессов при данных заболеваниях.

9. Эритроциты человека, подвергшиеся гипоосмотическому шоку, способны нагружаться антибиотиком гентамицином, т.е. превращаться в эритроцитарные контейнеры. Это свидетельствует о перспективности применения экстракорпорального способа введения антибактериальных препаратов при экстренной профилактике и лечении опасных инфекционных заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанный фотоколориметрический метод определения бактериофиксирующей активности эритроцитов и модифицированный метод гемосканирования рекомендуется применять при отборе микробных штаммов для создания пробиотических препаратов, используемых при лечении дисбиотических состояний у человека и животных.

2. С целью повышения эффективности антибиотиков при экстренной профилактике и лечении инфекционных заболеваний целесообразно разрабатывать и использовать адресную доставку препаратов с помощью эритроцитарных контейнеров.

3. Предлагаемые методы фотоколориметрии и гемосканирования рекомендуется применять при изучении процесса адгезии между про- и эукариотическими клетками в учебном процессе при прохождении студентами высших учебных заведений учебных дисциплин - нормальной, патологической физиологии, микробиологии.

223