Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Активность деструктивно-воспалительных процессов при формировании нестабильной атеросклеротической бляшки

На правах рукописи

Полонская Яна Владимировна

АКТИВНОСТЬ ДЕСТРУКТИВНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ НЕСТАБИЛЬНОЙ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ БЛЯШКИ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

оозхеи { гь>

НОВОСИБИРСК - 2007

003160776

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Рагино Юлия Игоревна

Сафронов Игорь Дмитриевич Гуляева Людмила Федоровна

Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится « 30 » 2007 г в часов на заседа-

нии диссертационного совета Д 001 048 01 в ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу ул Академика Тимакова, 2, г Новосибирск, 630117 Тел/факс 8 (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «_

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Пальчикова Н А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лидирующая позиция сердечно-сосудистых заболеваний атеросклеротического генеза в структуре смертности населения России (Оганов Р Г и др, 2004, Харченко В И и др , 2005) способствует продолжению интенсивного изучения этиопатогенеза атеросклероза В рамках проблемы коронарного атеросклероза особое внимание уделяется инфаркту миокарда, распространенность и смертность от которого высоки в Сибири (Гафаров В В и др , 2004) Патологической основой инфаркта миокарда является тромбообразование на эндотелиальной поверхности атеросклеротического очага, приводящее к окклюзии артерии, ишемии и некрозу Пусковым механизмом тромбообразования является нарушение целостности эндотелия на участке изъязвления или деструкции покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки «со склонностью к изъязвлению» или разрыву (Gidron Y et al, 2002, Schaar JA et al, 2004, Puddu G M et al, 2005) Стабильная атеросклеротическая бляшка характеризуется толстой покрышкой, гомогенным уплотненным липидным ядром, отсутствием воспалительных изменений Нестабильная бляшка, напротив, имеет тонкую покрышку или участок истонченной покрышки с очаговой деструкцией эндотелия, воспалительную клеточную инфильтрацию, рыхлое липидное ядро с участками некроза (Waksman R, Seruys Р W , 2004) Поэтому развитие атеросклеротического очага «неизмененная ткань интимы—»липидное пятно—» стабильная молодая бляшка—» стабильная фиброзная бляшка*-* нестабильная бляшка» не является благоприятным (Schaar JA et al, 2004)

Современные взгляды на ключевые механизмы формирования нестабильной атеросклеротической бляшки не однозначны Установлено, что важную роль в дестабилизации бляшки играет воспаление, поскольку, во-первых, показана значительная инфильтрация атеросклеротических бляшек, особенно нестабильных, макрофагами и Т-лимфоцитами (Шлычкова Т П и др , 2003, 2005, Libby Р , 2002) Во-вторых, при остром коронарном синдроме в крови обнаружены повышенные уровни таких провоспа-лительных цитокинов и маркеров, как интерлейкин-1-бета (ИЛ-lß), ИЛ-б, фактор некроза опухоли альфа (ФНО-а), С-реактивный протеин (СРП) (Uzui Н et al, 2002) и выявлены их ассоциации с развитием атеросклероза (Osterud В et al, 2004) Из указанных цитокинов, синтезируемых моноцит/макрофагами, ИЛ-lß индуцирует экспрессию эндотелиальными клетками адгезивных молекул (Bevilacqua М et al, 1991, Sisson SD et al, 1995), ИЛ-б многими авторами считается одним из ключевых маркеров выраженного воспалительного ответа, в том числе и при атеросклерозе (Hirano Т et al, 1993, Van der Poll T et al, 1999, Davignon J et al, 2004) Одной из главных мишеней ФНО-а является стимуляция образования адгезивных молекул и ИЛ-lß эндотелиальными клетками, вследствие чего снижаются антиадгезивные и антикоагуляционные свойства эндотелия (Aggarwal В В , Natarajan К, 1996, Schreyer SA et al, 2002) В отношении

участия ИЛ-8 в атерогенезе данных меньше, но заслуживают внимания несколько исследований, в которых изучалась роль ИЛ-8 в стимуляции продукции моноцит/макрофагами факторов, активирующих хемотаксис ней-трофилов и лимфоцитов в атеросклеротические очаги (Nakata А, Nakagawa Y, 1999, Whitman S, 2002) Однако, данных об изменениях активности провоспалительных цитокинов в динамике стадийного развития атеросклеротического очага до нестабильной бляшки мало, а об их уровнях в разных типах нестабильных бляшек человека практически нет

Наряду с воспалительными цитокинами макрофагами продуцируются активные ферменты, вызывающие деградацию внеклеточного матрикса (Пальцева Е M , 2005, Gidron Y et al, 2002, Libby P, 2002, Uzui H et al, 2002, Kajiwara К et al, 2004) Проводятся исследования по изучению активности матриксных металлопротеиназ (ММП) в процессе деградации экстрацеллюлярных белков в сосудистой стенке (Intengan H D et al, 1999, O'Callghan С J et al, 2000) Коллагеназы ММП-1, ММП-13 осуществляют ферментативное переваривание фибриллярного коллагена I и III типов, же-латиназы ММП-2 и ММП-9 и стромелизин ММП-3 - расщепление адгезивных молекул, нефибриллярных форм коллагена и протеогликанов (Hem M et al, 1999, Daemen M J A , 2004) Выявлены повышенные уровни ММП в крови у больных с острым коронарным синдромом (Moreau M et al, 2003), однако активность разных типов ММП на стадиях развития атеросклероти-ческого очага до нестабильной бляшки и в разных типах нестабильных бляшек человека не исследовалась

Поскольку одними из патофизиологических компонентов воспаления являются окислительный стресс и окислительно-антиоксидантный дисбаланс (Меныцикова Е Б и соавт, 2006, Osterud В , Bjorklid Е, 2003), представляется важным изучение выраженности и этих процессов в динамике стадийного развития атеросклеротического очага человека до стадии нестабильной бляшки На сегодняшний день, роль факторов окислительного стресса и активности окисления липидов и протеинов в этом процессе оценивается неоднозначно (Carbone G L et al, 2003, Stocker H , 2005) и делает актуальными дальнейшие исследования

Несмотря на проводимые исследования, остаются неясными некоторые вопросы относительно механизмов дестабилизации бляшки, особенностей взаимосвязи многих факторов, индуцирующих этот процесс, что затрудняет разработку эффективных профилактических и терапевтических подходов к стабилизации атеросклеротических очагов В рамках обозначенной проблемы в настоящей работе было проведено исследование воспалительной, в том числе деструктивной и окислительной, активности на этапах последовательного развития атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки и в разных типах нестабильных бляшек коронарных артерий у пациентов с неосложненным коронарным атеросклерозом

Цель исследования:

Изучить особенности активности деструктивно-воспалительного процесса и определить факторы, влияющие на развитие атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки

Задачи исследования:

1 Исследовать активность воспаления на разных последовательных стадиях развития атеросклеротических очагов коронарных артерий («интима», «липидное пятно», «стабильная бляшка», «нестабильная бляшка») по уровню воспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1-рецепторный антагонист, ИЛ-6, ИЛ-8) и уровню С-реактивного протеина в гомогенатах бляшек

2 Оценить активность окислительных процессов и содержание антиок-сидантов на разных этапах формирования атеросклеротического очага по уровням продуктов окисления липидов и белков, а-токоферола, ретинола, р-каротина и исходного уровня активности параоксоназы в гомогенатах бляшек

3 Исследовать активность металлопротеиназ ММП-3, ММП-9 и тканевого ингибитора ММП (ТИМП-1) на разных последовательных стадиях развития атеросклеротических очагов в гомогенатах бляшек

4 Провести сравнительный анализ параметров выраженности деструктивно-воспалительного процесса в разных типах нестабильных бляшек

5 Исследовать характер взаимосвязей показателей активности воспалительных, деструктивных и окислительных изменений при формировании нестабильной бляшки

Научная новизна.

При изучении локальных механизмов формирования и развития атеро-склеротической бляшки в сосудистой стенке показано, что основным процессом является деструктивно-воспалительный

Обнаружены особенности изменений и выявлены значимые факторы деструктивно-воспалительной и окислительно-антиоксидантной активности, характерно отличающие нестабильную атеросклеротическую бляшку от стабильных Так, характерными для нестабильных бляшек определены повышенные уровни воспалительных маркеров ИЛ-6, ИЛ-8 и С-реактивного протеина, деструктивных - ММП-9, окислительных - уровень ПОЛ, а также сниженное содержание ретинола

При развитии атеросклеротического очага на стадии стабильной бляшки проявления деструктивной активности в виде повышения ММП-3 и сниженного ТИМП-1 значимо зависят от воспалительно-окислительных изменений, характеризующихся повышенными уровнями ФНО-а, продуктов ПОЛ и сниженным ИЛ-1-РА Далее же, при развитии стадии нестабильной бляшки проявления деструктивной активности в виде повышенной ММП-9 зависят от воспалительных изменений, характеризующихся повышенными уровнями ИЛ-6 и ИЛ-8

Впервые была проанализирована активность деструктивно-воспалительных и окислительно-антиоксидантных изменений в разных типах нестабильных бляшек При воспалительно-эрозивном и при липидном типе нестабильных бляшек воспалительная активность оказалась доминирующей в сравнении с таковой при некротическом типе, где были характерно повышены уровни деструктивных маркеров. Определено, что из изученных факторов окислительно-антиоксидантных нарушений в нестабильных бляшках липидыого типа преобладают повышенные процессы окисления белков и низкое содержание жирорастворимых антиоксидантов, в бляшках с воспалением/эрозией - одинаково повышены процессы окисления белков и ПОЛ, а в бляшках с некрозом/калыданозом - максимально выражена активность процессов перекисного окисления лшшдов Научно-практическая значимость.

Теоретическое значение работы состоит в том, что в ходе анализа разных последовательных стадий развития атеросклеротических очагов коронарных артерий пациентов с неосложненным коронарным атеросклерозом определены особенности и значимые маркеры активности воспалительного процесса, включая деструктивные и окислительно-антиоксидантные параметры, характерные для нестабильной бляшки

Показано, что повышенная активность воспалительного процесса, ассоциированная с окислительными изменениями наблюдается при формировании нестабильных бляшек не только воспалительно-эрозивного, но и ли-пидного типов, в то время как для нестабильных бляшек дистрофически-некротического типа характерна деструктивно-окислительная активность, значимо проявляющаяся повышенными уровнями ФНО-а и продуктов перекисного окисления липидов

Использованный в работе комплекс исследованных маркеров активности воспалительного процесса, включающий воспалительные цитокины (ФНО-а, ИЛ-1-РА, ИЛ-б, ИЛ-8, СРП), окислительно-антиоксидантные параметры (уровни продуктов окисления липидов и белков, содержание а-токоферола, ретинола, ¡З-каротина, исходного уровня активности параоксо-назы), деструктивные металлопротеиназы (ММП-3, ММП-9, ТИМП-1) может быть использован в экспериментальных исследованиях для характеристики стадий развития атеросклеротических бляшек, в том числе разных типов нестабильности

Положения, выносимые на защиту:

1 Деструктивные, воспалительные и окислительные параметры, отражающие повышенную активность воспалительного процесса в стабильных и нестабильных атеросклеротических бляшках различны и характеризуются разнонаправленностью изменений

2 В формировании нестабильных бляшек воспалительно-эрозивного и липидного типов важную роль играет воспаление, активность которого проявляется повышенными уровнями воспалительных цитокинов, окисленных липидов и белков Для формирования нестабильных бляшек дис-

трофически-некротического типа характерны повышенные параметры деструктивно-окислительных изменений

3 При развитии атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки наблюдается корреляционный и ассоциативно зависимый характер взаимосвязи показателей деструктивных и воспалительных изменений

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены и обсуждены на Российских национальных Конгрессах кардиологов (Москва, 2005, 2006 и 2007), 1-м съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2005), международной конференции «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (Новосибирск, 2006, 2007)

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация включает следующие разделы введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, 4 главы результатов исследования, обсуждение, выводы, список используемой литературы Текст изложен на 153 страницах машинописного текста, иллюстрирован 16 таблицами и 29 рисунками Список цитированной литературы включает 300 работ, из них 90 отечественных и 210 зарубежных источников

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено в рамках Программы совместных научно-исследовательских работ ГУ Научно-исследовательского института терапии Сибирского отделения РАМН (ГУ НИИТ СО РАМН) и ФГУ Новосибирского Научно-исследовательского института патологии кровообращения им академика ЕН Мешалкина Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ФГУ ННИИПК Росздрава) на 20042009 гг Проведение исследования одобрено Этическим комитетом ФГУ ННИИПК Росздрава, протокол № 1 от 14 09 2005 г и Этическим комитетом ГУ НИИТ СО РАМН, протокол № 4 от 28 09 2005 г Этапы исследования в ФГУ НИИПК Росздрава выполнялись под руководством д м н , профессора Чернявского А М, в ГУ НИИТ СО РАМН - под руководством д м н, профессора, члена - корр РАМН Воеводы М И

В исследование было включено 48 мужчин (средний возраст 5б,9±5Д лет) с коронароангиографически верифицированным коронарным атеросклерозом, стабильной стенокардией напряжения II—III функционального класса (без острого коронарного синдрома), которые поступили в Клинику ФГУ ННИИПК Росздрава на операцию коронарного шунтирования Всеми пациентами заполнялась форма Информированного согласия на участие в исследовании В ходе операции при наличии интраоперационных показаний у 25 пациентов была проведена эндартериаэктомия из коронарной артерии Каждый из 25 материалов эндартериаэктомии, содержащий интиму/медиа коронарных артерий был продольно и поперечно симметрично

разделен на 3 фрагмента для проведения гистологических и биохимических исследований

Гистологический анализ забранных 75 образцов интима/медии коронарных артерий проводился после макроскопического описания образцов (распространенность бляшки, степень стенозирования просвета артерии, кровоизлияния в структуры бляшки, участки обызвествления, тромбы) и после стандартной окраски гематоксилин-эозином и Ван Гизон Гистологический анализ был выполнен заведующим патоморфологической лаборатории ФГУ ННИИПК Росздрава д м н Волковым A M

Из 75 образцов условно неизмененная ткань интимы была определена в 7 случаях, липидное пятно/полоска - в 8, атероматозная бляшка стабильная молодая - в 14, атероматозная бляшка с фиброзом/кальцинозом стабильная - в 26, атероматозная бляшка нестабильная со склонностью к изъязвлению или разрыву - в 20 Нестабильная атеросклеротическая бляшка определялась согласно современным критериям (Waksman R, Seruys Р W, 2004) как повреждённая бляшка с толщиной фиброзной покрышки менее 65 мкм, инфильтрированная Мф и Т-Лф (более 25 клеток в поле зрения 0,3 мм), с крупным липидным ядром (>40%) Был определен тип нестабильных бляшек (Шлычкова Т П и др , 2005, Waksman R, Seruys Р W, 2004) 1) фиб-роатерома с тонкой фиброзной покрышкой (липидный тип), 2) бляшка с повышенным содержанием протеогликанов или воспалением, приводящим к эрозии и тромбозу (воспалительная и липидная эрозии поверхности бляшек), 3) бляшка с кальцинированным ядром (дистрофически-некротический тип) Из 20 образцов нестабильных бляшек (100%) было 5 фиб-роатером (25%), 7 бляшек с воспалением, эрозией (35%) и 8 бляшек с каль-цинозом, некрозом (40%)

Для проведения биохимических исследований замороженные в жидком азоте образцы интимы/медии были гомогенизированы в растворе фосфатно-солевого буфера Полученные 5% гомогенаты делили на аликвоты для проведения дальнейших биохимических анализов В гомогенатах образцов измерение белка проводили по методу Лоури (Lowry H , Roenbrought N J et al, 1951) Расчёт уровней других биохимических показателей производился относительно белка Измерение холестерина (ХС) проводили ферментативным методом с использованием стандартных реактивов "Biocon"

Уровень процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенатах образцов определяли по концентрации малонового диальдегида (МДА) флуориметрическим методом на спектрофлуориметре "Versafluor", Bio-Rad (Schuh J , Fairclough G F, 1978) при длинах волн Ех 515 нм и Em 553 нм В качестве стандарта использовали 1,1,3,3-тетраметоксипропанол (Sigma) Результаты выражали в нмоль МДА/мг белка

Степень окислительной модификации белков в гомогенатах образцов определяли по концентрации карбонильных групп, используя измерение оптической плотности проб после реакции с ОД M раствором 2,4-ди-нитрофенилгидразина в 2 M растворе HCl спектрофотометрическим мето-

дом при длине волны 363 нм (Дубинина ЕЕ и др , 1995) Результаты выражали в ЕД оптической плотности/мг белка

Определение содержания жирорастворимых антиоксидантов а-токо-ферола и ретинола в гомогенатах образцов проводили флуориметрическим методом на спектрофлуориметре "Versafluor", Bio-Rad (Taylor S L et al, 1976) при длинах волн для а-токоферола Ex 290 нм и Em 334 нм, для ретинола Ех 340 нм и Em 490 нм Результаты выражали в мг/мг белка и мкг/мг белка, соответственно Определение содержания жирорастворимого анти-оксиданта ß-каротина в гомогенатах образцов проводили спектрофотомет-рическим методом (Taylor S L et al, 1976) при длинах волн 450 нм и 475 нм Результаты выражали в ЕД оптической плотности/мг белка В качестве стандартов использовали калибровочные растворы а -токоферола, ретинола и ß-каротина (Sigma)

Исходный уровень активности параоксоназы (ПО) в гомогенатах образцов определяли в трис-HCl буфере, содержащем 2 ммоль/л СаС12 и 5,5 ммоль/л параоксона (Sigma) спектрофотометрическим методом (Mackness В , Mackness MI et al, 1998) Результаты выражали в ЕД/мг белка

Методом иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов (ELISAs) в гомогенатах определяли уровень ФНО-сс (Biosource набор), ИЛ-1-рецепторного антагониста, ИЛ-1-РА (Biosource набор), ИЛ-6 и ИЛ-8 (Cytimmune наборы), СРП (Вютепса набор), ТИМП-1 (Biosource набор), ММП-9 (RD набор), ММП-3 (Biosource набор) В качестве контролен использовали контрольные сыворотки с высоким и низким значением исследуемых показателей, поставляемые с наборами ELISAs

Статистическая обработка результатов выполнена с использованием программы SPSS for Windows Значения в таблицах представлены как М±т, где М - среднее арифметическое значение, m - ошибка среднего Достоверность различий между средними значениями оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (для признаков с нормальным распределением) или критерия Манна-Уитни Корелляционные связи оценивали с помощью критериев Пирсона и Кендалла Множественное сравнение между группами проводили методом дисперсионного анализа (One-Way-ANOVA) с использованием критерия Даннета дня множественного сравнения Ассоциативные связи оценивали в системе линейного регрессионного анализа Критерием статистической значимости был уровень р<0,05

Биохимические исследования, статистическая обработка и анализ результатов выполнены лично автором

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Параметры воспалительной активности на разных стадиях развития атеросклеротического очага

Для оценки активности воспаления в гомогенатах образцов разных стадий формирования атероматозных очагов были исследованы уровни некоторых воспалительных цитокинов и С-реактивного белка (табл 1)

Содержание ИЛ-1-РА в образцах стабильных молодых и фиброзно-кальцинозных бляшек было ниже, как и ожидалось, чем в образцах неизмененной ткани интимы и образцах липидных пятен (в 1,8 и 1,6 раз, соответственно) Однако уровень ИЛ-1-РА в образцах нестабильных бляшек значимо не отличался от такового в образцах неизмененной ткани интимы и образцах липидных пятен Поскольку ИЛ-1-РА является антагонистом и конкурентом ИЛ-1 в процессе взаимодействия со специфическими рецепторами к ИЛ-1, то полученные результаты указывают на отсутствие повышенного уровня ИЛ-1 в нестабильных бляшках

При анализе результатов исследования содержания ФНО-а в образцах отмечена та же особенность уровень ФНО-а в образцах стабильных молодых и фиброзно-кальцинозных бляшек был выше в сравнении с образцами неизмененной ткани интимы (в 1,5 и 2,1 раза, соответственно), образцами липидных пятен (в 1,8 и 2,5 раза, соответственно) и образцами нестабильных бляшек (в 1,6 и 2,2 раза, соответственно) Полученные результаты не полностью согласуются с данными других авторов (Hayden MR, Tyagi S С, 2000, Shah PK et al, 2006), согласно которым у пациентов с острым коронарным синдромом в атеросклеротических бляшках повышена секреция макрофагами и Т-лимфоцитами воспалительных цитокинов ИЛ-1 и ФНО-а Тем не менее, основываясь на полученных результатах и учитывая, что забор биологического материала проводился у мужчин со стабильной стенокардией напряжения без острого коронарного синдрома, можно предположить, что активность ИЛ-1 и ФНО-а повышена и играет одну из ключевых ролей в развитии атеросклеротического очага на стадии стабильной бляшки (или молодой или фиброзно-кальцинозной), индуцируя пролиферацию Т-лимфоцитов, гладкомышечных клеток и экспрессию эндотелиаль-ными клетками молекул адгезии (Пальцева Е M , 2005, Libby Р , 2002), но не является значимой и доминирующей на стадии нестабильной бляшки

Исследование других воспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 (см табл 1) показало преобладание их активности в образцах нестабильных бляшек Так, уровень ИЛ-6 - индуктора острофазовых реакций воспалительного ответа и тканевого повреждения (Libby Р, 2002, Schaar JA et al, 2004) - в нестабильных бляшках был выше в сравнении с образцами неизмененной ткани интимы, липидных пятен, стабильных молодых и фиброз-но-калыданозных бляшек в 2, 2,5, 2,7 и 1,6 раз, соответственно В образцах нестабильных бляшек уровень ИЛ-8 оказался наибольшим, выше, чем в образцах неизмененной ткани интимы, липидных пятен и стабильных молодых бляшек в 7,1, 5,6 и 6,7 раз, соответственно Уровень ИЛ-8 в образцах фиброзно-кальцинозных бляшек был также выше в сравнении с образцами неизмененной ткани интимы, липидных пятен и стабильных молодых бляшек в 5,2, 4,1 и 5,0 раз, соответственно Известно, что ИЛ-1 и ФНО-а стимулируют секрецию макрофагами и эндотелиальными клетками ИЛ-8 (Libby Р, 2002), поэтому можно предположить, что именно преобладание активности ИЛ-1 и ФНО-сс на более ранних стадиях формирования атеро-

склеротического очага потенцирует последующее увеличение секреции ИЛ-8, ярко проявляющееся на стадии нестабильной бляшки

Таблица 1

Содержание воспалительных цитокинов в атеросклеротических очагах разных стадий формирования (М±т)

Образцы ИЛ-1-РА, пг/мг белка ИЛ-6, нг/мг белка ИЛ-8, пг/мг белка ФНО-а, пг/мг белка СРП, нг/мг белка

1 Неизмененная ткань интимы (и = 7) 1307,1 ± 126,1 3,9 ± 0,5 3,8 ± 0,8 2,7 + 0,4 6,9+1,0

2 Липидное пятно/полоска (п = 8) 1275,9 ± 124,4 3,1 + 0,4 4,8 + 0,7 2,2 + 0,5 11,1 + 1,7

3 Бляшка стабильная молодая (п = 14) 712,4 ±57,0 2,9 ± 0,3 4,0 ± 0,7 4,0 ±0,5 12,1 ±0,8

4 Бляшка стабильная фиброзная (п = 26) 796,0 + 69,5 4,7 ± 0,6 19,9 ±2,8 5,6 ± 0,6 22,5 ±2,5

5 Бляшка нестабильная (и = 20) 990,7 ±96,1 7,8 ±1,0 27,0 ±2,8 2,5 ± 0,4 28,4 ±2,3

р < 0,05 3-1,2 4-1,2 3-4,5-1, 2,3,4 4-1,2,3 5-1,2,3 3-1,2,5 4-1,2,5 4-1,2,3 5-1,2,3

Исследование содержания С-реактивного белка (СРП) на разных стадиях формирования атеросклеротического очага продемонстрировало его постепенное нарастание от неизмененной ткани интимы до стадии нестабильной бляшки В образцах нестабильных бляшек уровень СРП оказался наибольшим, выше, чем в образцах неизмененной ткани интимы, липидных пятен и стабильных молодых бляшек в 4,1, 2,5 и 2,3 раза, соответственно Уровень СРП в образцах фиброзно-кальцинозных бляшек был также выше в сравнении с образцами неизмененной ткани интимы, липидных пятен и стабильных молодых бляшек в 3,3, 2,0 и 1,8 раз, соответственно Таким образом, полученные результаты продемонстрировали воспалительную активность в нестабильных бляшках, проявляющуюся повышенными уровнями ИЛ-6, ИЛ-8 и СРП

Параметры окислительно-антиоксвдантных изменений на разных стадиях развития атеросклеротического очага

Для оценки окислительных изменений липидов и протеинов на разных стадиях развития атеросклеротических очагов были исследованы уровни продуктов процесса ПОЛ и карбонильных групп белков, а также предварительно определено содержание ХС в гомогенатах образцов (табл 2)

Содержание ХС в условно неизмененной ткани интимы/медии было минимальным и на порядок ниже, чем в других образцах, поэтому в сравнительные расчеты включено не было Наибольшее количество ХС было в

образцах стабильных молодых бляшек - в 7,3, 5,8 и 6,8 раз выше в сравнении с липидными пятнами, стабильными фиброзными бляшками и нестабильными бляшками, соответственно Различий в содержании ХС между образцами литтидных пятен, стабильных фиброзных бляшек и нестабильных бляшек выявлено не было

Уровень продуктов процессов ПОЛ в нестабильных бляшках был, как и ожидалось, наибольшим, выше в 3,3, 4, 2,2 и 2 раза, чем в образцах неизмененной ткани интимы, липидных пятен, молодых и фиброзных стабильных бляшек, соответственно При исследовании окислительно модифицированных протеинов такой особенности выявлено не было Содержание карбонильных групп белков - маркеров окислительной модификации белков - в условно неизмененной ткани интимы/медии было минимальным и значительно ниже, чем в других образцах В образцах липидных пятен содержание карбонильных групп белков было в 3 раза выше, чем в неизмененной ткани интимы В образцах же молодых стабильных, фиброзных стабильных и нестабильных бляшек окисленных белков было в 3,8, 4,4 и 2,5 раз больше в сравнении с образцами липидных пятен, причем наибольшим содержанием окисленных белков характеризовались образцы стабильных молодых и фиброзных бляшек Таким образом, в нестабильных бляшках выявлена повышенная активность процессов ПОЛ в сравнении со стабильными бляшками, в то время как по уровню окислительной модификации белков образцы нестабильных и стабильных бляшек не различались

Таблица 2

Липидные и окислительные показатели в атеросклеротических очагах разных стадий формирования (М±т)

Образцы ХС, мг/мг белка Продукты ПОЛ, нмоль МДА/мг белка Окисленные протеины, ЕД/мг белка

1 Неизмененная ткань интимы (п = 7) 3,9 ±0,8 0,6 ±0,1 16,1 ± 1,8

2 Липидное пятно/полоска (п = 8) 24,2 + 2,2 0,5+0,1 47,8 + 3,3

3 Бляшка стабильная молодая (п = 14) 177,5 ± 20,4 0,9 ± 0,2 180,4 ±20,1

4 Бляшка стабильная фиброзная (п = 26) 30,7 ±3,1 1,0 ±0,2 209,5 ±21,7

5 Бляшка нестабильная (п = 20) 26,1 ±2,1 2,0 + 0,3 120,6 + 13,1

р < 0,05 1-2,3,4,5 3-1,2,4,5 5-1,2,3,4 1-2,3,4,5 2-1,3,4,5

Для оценки антиоксидантной защиты сосудистой стенки исследовались показатели содержания жирорастворимых антиоксидантов альфа-токоферола, ретинола, бета-каротина и исходный уровень активности ПО в атеросклеротических очагах разной стадии развития Показатель исходного уровня активности ПО сосудистой стенки свидетельствует о степени функциональной активности этого фермента в организме на момент забора фрагментов интимы/медии Высокий уровень активности ПО в образцах интима/медии отражает повышенную востребованность антиоксидантной активности фермента в нейтрализации окислительных процессов в сосудистой стенке В настоящем исследовании зафиксирован повышенный уровень активности ПО в стабильных молодых и фиброзных и в нестабильных атеросклеротических очагах в 4,7, 3,1 и 3,3 раза, соответственно, в сравнении с образцами неизмененной ткани интимы и липидных пятен, где исследуемый показатель был не высоким (табл 3)

В процессе развития атеросклеротического очага от стадии липидного пятна до нестабильной бляшки выявлено постепенное снижение содержание ретинола (см табл 3) Наименьший уровень ретинола отмечен в образцах нестабильных бляшек - в 1,4 и 2,6 раз ниже, чем в стабильных бляшках и в липидных пятнах, соответственно В образцах стабильных бляшек уровень ретинола также был ниже, чем в образцах липидных пятен в 1,8 раз Изменений в содержании альфа-токоферола и бета-каротина между последовательными стадиями развития атероматозного очага не выявлено

Таблица 3

Антиоксидантные параметры в атеросклеротических очагах разных стадий формирования (М±т)

Образцы Альфа-токоферол, мкг/мг белка Ретинол, мкг/мг белка Бета-каротин, ЕД/мг белка Исходная активность параоксоназы, мкг/мг белка

1 Неизмененная ткань интимы (п = 7) 330,9 ± 36,4 9,5 ±0,7 92,6 ± 10,1 21,3+1,4

2 Лихщцное пятно/ полоска (п = 8) 357,0 + 35,2 11,3 ±1,1 98,1 ± 10,3 22,1 + 2,2

3 Бляшка стабильная молодая(п = 14) 383,0 ±31,4 6,4 ±0,4 108,3 ±11,9 103,2 ±11,6

4 Бляшка стабильная фиброзная (п = 26) 387,0 ±32,6 6,1 ±0,7 102,1 ± 11,4 68,0 ±6,1

5 Бляшка нестабильная (и = 20) 346,9 + 31,0 4,3 ±0,5 96,4 +10,7 72,9 +10,7

р < 0,05 3-1,2, 4-1,2 5-1,2,3,4 1-3,4,5 2-3,4,5

Показаны корреляционные связи активности процессов ПОЛ с содержанием жирорастворимых антиоксидантов альфа-токоферола, ретинола и бета-каротина в сосудистой стенке коэффициенты Пирсона -0,316, -0,364 и -0,405, р < 0,05, соответственно, коэффициенты Кеыдалла -0,276, -0,232 и -0,256, р < 0,05, соответственно Выявлены корреляционный связи степени окислительной модификации белков с уровнями ИЛ-1-РА и исходной активности ПО коэффициенты Пирсона -0,259 и -0,228, р < 0,01, соответственно, коэффициенты Кецдалла -0,288 и-0,275, р < 0,01, соответственно Полученные результаты соответствуют ключевым изменениям окисли-тельно-антиоксидантной активности на стадии развития стабильной бляшки, когда имеют место сниженный уровень ИЛ-1-РА, повышенные процессы окислительной модификации белков, но процессы ПОЛ еще не достигли наибольшей активности, поскольку достаточно выражена функция параок-соназы, сдерживающей развитие процессов ПОЛ

Таким образом, по мере развития атеросклеротического очага от литтид-ного пятна до нестабильной бляшки в нем увеличивается уровень продуктов ПОЛ в 4 раза, при этом в нестабильных бляшках этот показатель наибольший, а содержание в нем ретинола снижается в 2,6 раза, при этом в нестабильных бляшках этот показатель наименьший (рис 1) На стадиях формирования стабильных молодых и фиброзных бляшек наблюдается, вероятно, достаточно повышенный уровень активности ПО, сдерживающей бурное развитие процессов ПОЛ, но не влияющей на уже максимально выраженные процессы окислительной модификации белков

Параметры деструктивной активности на разных стадиях развития атеросклеротического очага

Результаты оценки изменения активности деструктивных процессов при формировании атеросклеротического очага от стадии липидного пятна/полоски до стадии нестабильной бляшки представлены в таблице 4 Уровень ТИМП-1 в образцах стабильных молодых бляшек, фиброзно-капьцинозных бляшек и в образцах нестабильных бляшек был ниже, как и ожидалось, чем в образцах неизмененной ткани интимы (в 2,6, 1,9 и 1,2 раза, соответственно) и образцах липидных пятен (в 2,2, 1,6 и 1,8 раз, соответственно) Однако значимых различий в этом показателе между образцами нестабильных и стабильных бляшек нами не обнаружено Известно, что ТИМП-1 является ингибитором ММП-1, ММП-3, ММП-9 и, связываясь с активным каталитическим центром ММП, полностью блокирует их активность, образуя нековаленгные комплексы (например, комплекс ТИМП-1/ММП-3) (К^иёа Б, Ка|1 Т, 2003, Ыеч^Ьу А С, 2005) Поэтому, полученные результаты о сниженном количестве ТИМП-1 в образцах атеросклеротических бляшек свидетельствуют о большей потенциальной возможности проявления ферментативной активности ММП, причем во всех бляшках, не только в нестабильных

стабильная стабильная бляшка

Рис. 1. Изменения воеиадитслыюй, окислителыю-шгшХсидантной и деструктивной активности и динамике развития атсросклеротичесхого очага до стадии нестабильной бляшки. По оси ординат - за 100% по каждому показателю принято его суммарное значение на всех стадиях развития бляшки; * - при сравнении со стадиями стабильной б ля ш ¿Ей при р < 0.05

Таблица 4

Содержание металлопротеиназ в атеросклеротических очагах разных стадий формирования (М±т)

Образцы ТИМП-1, нг/мг белка ММП-9, нг/мг белка ММП-3, нг/мг белка

1 Неизмененная ткань интимы (п = 7) 232,2 ±25,4 2,4 ±0,4 2,4 ±0,4

2 Липвдное пятно/полоска (и = 8) 196,5 ± 20,3 2,6 ± 0,4 2,4 ±0,3

3 Бляшка стабильная молодая (п = 14) 87,5 ± 8,3 2,6 ±0,4 3,6 ±0,5

4 Бляшка стабильная с фиброзом/ кальцинозом (п = 26) 122,2 ± 20,6 3,5+0,5 3,1 +0,4

5 Бляшка нестабильная (п = 20) 107,2+10,2 5,0 ±0,6 3,1 ±0,2

р < 0,05 3-1,2, 4-1,2 5-1,2 5-1,2,3 3-1,2 5-2

Это подтверждается данными исследования активности ММП-3 уровень ММП-3 в образцах стабильных молодых и нестабильных бляшек был выше в сравнении с образцами липидных пятен/полосок (в 1,5 и 1,3 раза, соответственно) Значимых различий в этом показателе между образцами нестабильных и стабильных бляшек не обнаружено

Исследование далее активности ММП-9 - желатиназы, гидролизующей коллаген базальных мембран - в образцах атеросклеротических очагов разных стадий развития, напротив, выявило ее явное повышение именно в нестабильных бляшках (см рис 1) в сравнении с образцами неизмененной ткани интимы, липидных пятен и молодых стабильных бляшек (в 2,1, 1,9 и 1,9 раз, соответственно)

Проведенный корреляционный анализ выявил наличие выраженной связи исследуемых параметров деструктивных изменений с воспалительно-окислительными изменениями в атеросклеротических очагах (табл 5)

Так, показаны значимые корреляции уровня ММП-9 не только с уровнем ММП-3 (р<0,01), но и ИЛ-1-РА (р<0,01), ФНО-сс (р<0,05), ИЛ-6, ИЛ-8 (р < 0,01) и СРП (р < 0,05) Выявлена значимая средняя корреляционная зависимость уровня ММП-3 от ФНО-ос (р <0,01) Значимая обратная связь показана для ТИМП-1 с такими параметрами активности воспалительного процесса как ФНО-а, ИЛ-6 (р < 0,05), ИЛ-8 (р < 0,01) и прямая - с уровнем ИЛ-1-РА (р < 0,01)

Определены значимые положительные корреляционные связи уровней продуктов ПОЛ с ММП-9 (р < 0,01) и ММП-3 (р < 0,05) и отрицательная с ТИМП-1 (р < 0,01) Как и ожидалось, выявлены корреляционные связи уровней СРП с цитокинами ФНО-а, ИЛ-6 (р < 0,05) и ИЛ-8 (р < 0,01) в атеросклеротических очагах

Таблица 5

Корреляционные связи (коэффициенты Пирсона и Кендалла) параметров

воспалительно-деструктивных изменений в атеросклеротических очагах

ТИМП-1 ММП-9 ММП-3 ИЛ-1-РА ИЛ-8 СРП Ох-белки

ММП-3 0,419 0,228

ИЛ-1-РА 0,502 0,316 -0,458 -0,338 1 -0,417 -0,411 -0,259 -0,288

ФНО-а -ОД 79 0,279 0,177 0,559 0,479 0,175

ИЛ-6 -0,180 0,507 0,352 -0,245 0,283 0,299 0,283 0,297

ИЛ-8 -0,225 0,364 0,288 -0,417 -0,411 0,295

ХС -0,305 -0,185 0,370 0,369

ПОЛ -0,379 -0,377 0,305 0,288 0,289

Примечание приведены коэффициенты корреляции при р < 0,05

Достоверность связей активности деструктивных изменений (уровней матричных ММП и их тканевого ингибитора) с воспалительно-окислительными процессами в атеросклеротических бляшках была оценена методом регрессионного и мультивариантного в модели GLM (General Linear Model) анализов Показатели деструктивной активности были включены в модель в качестве зависимых переменных, а исследуемый спектр воспалительно-окислительных показателей - в качестве независимых (определяющих) Была выявлена статистически значимая зависимость уровня ММП-9 от уровней ИЛ-6 и ИЛ-8 (стандартизованный коэффициент В = 0,343 и 0,329, соответственно, р < 0,05), соответствующая особенностям выявленных воспалительно-деструктивных изменений в нестабильных бляшках Доказана зависимость уровня ММП-3 от уровня ФНО-а (В = 0,517, р< 0,001), соответствующая особенностям выявленных воспалительно-деструктивных изменений в стабильных бляшках Выявлены также зависимости уровня ТИМП-1 от уровней ИЛ-1-РА и продуктов ПОЛ (В = 0,677 и -0,251, р < 0,01), а, в свою очередь, уровня продуктов ПОЛ от ФНО-а (В = 0,355, р < 0,05), подтверждающие особенности выявленных воспалительно-деструктивных изменений в стабильных бляшках

Таким образом, при развитии атеросклеротического очага на стадии стабильной бляшки проявления деструктивной активности в виде повышенного уровня ММП-3 и сниженного содержания ТИМП-1 статистически значимо зависят от воспалительно-окислительных изменений, определяющими показателями которых являются повышение уровней ФНО-а, про-

дуктов ПОЛ и снижение ИЛ-1-РА Далее, при развитии атеросклеротиче-ского очага до стадии нестабильной бляшки проявления деструктивной активности в виде повышенного уровня ММП-9 зависят от воспалительных изменений, определяющими показателями которых являются повышенные ИЛ-6 и ИЛ-8

Активность воспалительных, окислительных и деструктивных изменений в разных типах нестабильных бляшек

Проведено сравнительное исследование деструктивно-воспалительных изменений в разных типах нестабильных бляшек (табл 6) В образцах ли-пидного типа (фиброатеромы) с массивным липидным ядром и тонкой покрышкой (Шлычкова Т П и др , 2005, Waksman R, Serays Р W, 2004) отмечено более высокое содержание воспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8 и СРП (в 2,3, 1,6 и 3,3 раза, соответственно), в сравнении с образцами дистрофически-некротического типа (бляшки с калыданозом, некрозом) с выраженными дистрофическими изменениями и некрозами в покрышках В образцах воспалительно-эрозивного типа с воспалительными или липид-ными эрозивными повреждениями в покрышках отмечены сниженный уровень ИЛ-1-РА в сравнении с липидным (в 1,9 раза) и дистрофически-некротическим типами (в 1,5 раза), а также повышенный СРП (в 3,3 раза) в сравнении с дистрофически-некротическим типом Полученные данные указывают на наличие воспалительной активности в нестабильных бляшках не только воспалительно-эрозивного, но и липидного типа Отличительными особенностями бляшек некротического типа оказались, как и ожидалось, повышенный уровень ФНО-а (в 1,9 раза) в сравнении с фиб-ро атеромами и сниженный уровень ТИМП-1 (в 1,6 раза) в сравнении с воспалительно-эрозивными бляшками По уровням активности деструктивных ММП-3 и ММП-9 нами не выявлено значимых различий между тремя типами нестабильных бляшек

Содержание ХС, как и ожидалось, в нестабильных бляшках липидного типа было в 1,9 раза выше, чем в бляшках с воспалением и/или с эрозией (см табл 6) При проведении сравнительного исследования окислительных изменений в разных типах нестабильных бляшек были, наоборот, отмечены повышенные в 1,8 и 2,9 раз уровни продуктов ПОЛ в бляшках воспалительно-эрозивного и некротического типов, соответственно, чем в нестабильных бляшках липидного типа Степень окислительной модификации белков была одинаково повышена в 1,7 раза в нестабильных бляшках липидного и воспалительно-эрозивного типов в сравнении с бляшками некротического типа

По исходному уровню активности ПО различий между разными типами нестабильных бляшек не было выявлено (см табл 6) Наоборот, по содержанию жирорастворимых антиоксидантов бляшки липидного типа отличались от двух других В нестабильных фиброатеромах были снижены уровни альфа-токоферола в 2,4 раза, ретинола в 1,7 раза и бета-каротина в 2,4

раза в сравнении с бляшками воспалительно-эрозивного типа и в 2,6 раза, в 2,0 раза и в 3,2 раза, соответственно, в сравнении с бляшками некротического типа

Таблица б

Содержание воспалительных цитокинов, металлопротеиназ и окислительные изменения в разных типах нестабильных бляшек (Mim)

Показатели 1 Фибро-атерома, п = 5 2 Бляшка с воспалением, эрозией, п = 7 3 Бляшка с каль-цинозом, некрозом, п = 8 р < 0,05

ИЛ-1-РА, пг/мг белка 1225,3 ± 124,2 656,4+58,7 1011,1±116,6 2-1,3

ФНО-а, пг/мг белка 1,6 + 0,1 2,5 ± 0,2 3,0 ±0,4 3-1

ИЛ-6, пг/мг белка 12,4 ± 1,7 6,9 ± 0,7 5,3 ± 0,6 1-3

ИЛ-8, пг/мг белка 36,8 ±3,7 24,5 ± 3,6 23,1 ±2,4 1-3

СРП, нг/мг белка 39,4 ±14,2 39,5 + 3,5 11,8 ±1,0 3-1,2

ТИМП-1, нг/мг белка 107,0 + 9,8 143,2+13,4 89,4 ±11,1 3-2

ММП-3, нг/мг белка 2,9 + 0,2 3,6 + 0,4 3,0 + 0,2

ММП-9, нг/мг бежа 5,4 ±0,5 3,9 ±0,4 5,2 ±0,6

ХС, мг/мг белка 34,0 ±3,4 18,2 ±2,3 28,1 + 3,3 1-2

Продукты ПОЛ, нМ МДА/мг белка 1,0 ±0,1 1,8 ±0,2 2,9 ±0,7 1-2,3

Окисленные бел- 145,3 ± 15,5 143,6 ±17,1 85,1 ±7,3 3-1,2

ЕД/мг белка

Активность пара-оксоназы, ЕД/мг белка 79,2 ±12,1 88,8 ± 9,5 44,4 ±5,4

Альфа-токоферол, мкг/мг белка 170,0 + 21,4 410,0 ±40,5 448,0 + 35,9 1-2,3

Ретинол, мкг/мг белка 2,7 + 0,3 4,7 + 0,2 5,3 + 0,6 1-2,3

Бета-каротин, ЕД /мг белка 43,2 ±5,8 105,6 ± 10,9 138,6 ± 16,2 1-2,3

Таким образом, для нестабильных бляшек с воспалением/эрозией характерны повышенные окислительные изменения липидного и белкового компонентов, в то время как для нестабильных бляшек с некро-

зом/капьцинозом - преимущественно выраженные процессы ПОЛ, а для фиброатером - наиболее повышенные уровни ХС, окислительной модификации белков и сниженные содержания всех исследованных нами жирорастворимых антиоксидантов Несмотря на более, чем 2-кратно увеличенное содержание альфа-токоферола, ретинола и бета-каротина в нестабильных бляшках воспалительно-эрозивного и некротического типов по сравнению с фиброатеромами, тем не менее, оно является недостаточным для адекватного ингибирования процессов ПОЛ, высокий уровень активности которых отмечен в бляшках этих типов

Заключая в целом полученные результаты, необходимо отметить, что исследование изменений активности воспалительных, окислительных и деструктивных процессов в динамике последовательных стадий развития атеросклеротического очага - «неизмененная ткань интимы —* липидное пятно/полоска —* бляшка стабильная молодая —» бляшка нестабильная уязвимая со склонностью к изъязвлению или разрыву <-> бляшка с фибро-зом/кальцинозом стабильная» - выявило их особенности, характерные для нестабильной бляшки А именно, из изученного ряда воспалительных ци-токинов (ИЛ-1-РА, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8) и маркера воспаления СРП характерными и доминирующими именно в нестабильных бляшках выявились повышенные ИЛ-6, ИЛ-8 и СРБ, из окислительно-антиоксидантных параметров (уровни продуктов ПОЛ, окисленные белки, уровень ПО активности, альфа-токоферол, ретинол, бета-каротин) -повышенный уровень ПОЛ и сниженный ретинол, а из деструктивных ферментов и их ингибитора (ТИМП-1, ММП-3 и ММП-9) - повышенная ММП-9 Из 3-х типов нестабильных бляшек - липидного, воспалительно-эрозивного и дистрофически-некротического - не только при воспалительно-эрозивном (сниженный ИЛ-1-РА и повышенный СРП), но и при липидном типе (повышенные ИЛ-6, ИЛ-8 и СРП) воспалительная активность оказалась доминирующей в сравнении с таковой при некротическом типе, где доминирующей была деструктивная активность (повышенный ФНО-а и сниженный ТИМП-1) Характерными окислительно-антиоксидантными изменениями для фиброатером являются повышенные процессы окисления белков и низкое содержание жирорастворимых антиоксидантов, для бляшек с воспалением/эрозией - одинаково повышенные процессы окисления белков и ПОЛ, а для бляшек с ыекрозом/кальцинозом - максимально выраженная активность процессов ПОЛ

ВЫВОДЫ:

1 В процессе стадийного развития атеросклеротического очага от липидного пятна через стабильную бляшку до нестабильной повышаются уровни воспалительных цитокинов ИЛ-6 в 2,5 раза, ИЛ-8 в 5,6 раз, С-реактивного белка в 2,5 раза, в то время как уровень ИЛ-1-РА снижен, а ФНО-а повышен на стадиях формирования стабильных молодых и фиброзных бляшек

2 По мере развития атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки увеличивается уровень продуктов перекисного окисления ли-пидов в 4 раза, при этом в нестабильных бляшках этот показатель наибольший, а содержание ретинола снижается в 2,6 раза, при этом в нестабильных бляшках этот показатель наименьший Наиболее повышенное содержание окисленных белков отмечено на стадиях стабильных молодых и фиброзных бляшек

3 Из маркеров деструкции по мере развития атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки активность ММП-9 увеличивается в 2 раза, в то время как активность ММП-3 наиболее повышена на стадии стабильной бляшки Снижение уровня ТИМП-1 наблюдается и в стабильных и в нестабильных бляшках в сравнении с неизмененной тканью интимы и липидными пятнами

4 Активность деструктивно-воспалительных процессов различна в разных типах нестабильных бляшек Повышенная воспалительная активность выявлена в нестабильных бляшках воспалительно-эрозивного и липидного типа (повышенные ИЛ-6, ИЛ-8 и С-реактивный протеин), повышенная деструктивная активность - в бляшках дистрофически-некротического типа (повышенный ФНО-а и сниженный ТИМП-1) Различий в уровнях ММП-3 и ММП-9 между 3-мя типами нестабильных бляшек не выявлено При воспалительно-эрозивном типе повышены окислительные изменения и липи-дов и белков, при липидном типе повышена окислительная модификация белков и низкий уровень антиоксидантов, а в бляшках с кальцино-зом/некрозом наблюдается наиболее высокий уровень продуктов перекисного окисления липидов, выше в 2,9 раза, чем в фиброатеромах

5 Отмечены корреляционные связи параметров деструктивных изменений в атеросклеротических очагах с воспалительными изменениями, а именно корреляции уровней ММП-9 с ММП-3, ИЛ-1-РА, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8, корреляция уровня ММП-3 с ФНО-а и корреляция уровня ТИМП-1 с ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8 По мере развития атеросклеротического очага от липидного пятна до бляшки выявлена зависимость проявлений деструктивной активности от воспалительно-окислительных изменений, определяющими показателями которых в стабильной бляшке являются повышенные ФНО-а, продукты перекисного окисления липидов и сниженный ИЛ-1-РА, а в нестабильной - повышенные уровни ИЛ-6 и ИЛ-8

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Полонская Я В Параметры окислительного стресса и эндотелиаль-ной дисфункции у мужчин с коронарным атеросклерозом / Я В Полонская, Е В Садовский Е В , Ю И Рагино // Мат-лы I съезда терапевтов Сибири и Дальнего Востока - 2005 - Новосибирск - С 572-575

2 Ragino Yu I Parameters of oxidative stress and endothelial dysfunction in coronary atherosclerosis men / Yu I Ragmo, Ya V Polonskaya, E V Sadovski

// Abst of 14th International Symposium on Atherosclerosis -Atherosclerosis -2006 -V 7/3 (Supl) -P 523

3 Активность окислительных и воспалительных изменений в процессе формирования атеросклеротической бляшки / Ю И Рагино, Я В Полонская, Е В Семаева Е В , А М Волков, Е М Аляпкина, А М Чернявский, М И Воевода // Мат-лы Российского национального Конгресса кардиологов - 2006 - Москва - С 308

4 Атеросклероз и окислительные процессы Новые способы оценки окислительной модификации белков / Ю И Рагино, В А Баум, Я В Полонская, М И Воевода, Ю П Никитин // Бюллетень СО РАМН - 2006 -№ 4 (122) - С 67-74

5 Key inflammatory and destructive changes resulting to unstable atherosclerotic plaque formation / Yu I Ragmo, Ya V Polonskaya, A M Chernjavski, E V Semaeva, MI Voevoda // Abstract of International conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine" - Novosibirsk - 2006 - P 99

6 Oxidative stress and myocardial infarction New methods for evaluation of oxidized proteins / Yu I Ragmo, V A Baum, Ya V Polonskaya, S R Baum, E V Sadovski // Abstract of International conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine" - Novosibirsk - 2006 - P 98

7 Activity of inflammatory-destructive changes during of unstable atherosclerotic plaque formation / Yu I Ragmo,A M Chernjavski, Y V Polonskaya, A M Volkov, E V Semaeva, MI Voevoda // Abst of 76th Congress of the European Atherosclerosis Society - Atherosclerosis - 2007 - V 8/1 (Supl) -P 92

8 Рагино Ю И Способ определения окислительной модификации апо-протеинов в липопротеинах низкой плотности / Ю И Рагино, Я В Полонская, Е В Садовский // Клиническая лабораторная диагностика - 2007 -№6 - С 14-17

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКМ - активные кислородные метаболиты

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИЛ - интерлейкин

ИЛ-1-РА - рецепторный антагонист интерлейкина 1

ЛВП - липопротеины высокой плотности

ЛНП - липопротеины низкой плотности

ЛФ - лимфоциты

МДА - малоновый диальдегид

ММП - матриксная металлопротеиназа

МФ - макрофаги

оке - острый коронарный синдром

по - параоксоназа

пол - перекисное окисление липидов

хс - холестерин

СРП - С- реактивный протеин

ТБК - тиобарбитуровая кислота

тг - триглицериды

ТИМП - тканевой ингибитор металлопротеиназ

Т-ЛФ - Т-лимфоциты

ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа

ХС - холестерин

эхе - эфиры холестерина

Соискатель (^У^1^1^ \ Полонская Я В

Подписано в печать 25 09 07 г Формат 60 х 84/16 Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Изд № 39п/07 Заказ № 304п

Оригинал-макет изготовлен издательством «Сибмедиздат» НГМУ г Новосибирск, ул Залесского, 4 Тел (383)225-24-29 E-mail sibmedisdat®rambler ru

Отпечатано в типографии НГМУ г Новосибирск, ул Залесского, 4 Тел (383)225-24-29

Актуальность темы. Лидирующая позиция сердечно-сосудистых заболеваний атеросклеротического генеза в структуре смертности населения России (26, 61) способствует продолжению интенсивного изучения этиопатогенеза атеросклероза. В рамках проблемы коронарного атеросклероза особое внимание уделяется инфаркту миокарда, распространенность и смертность от которого высоки в Сибири (12). Патологической основой инфаркта миокарда является тромбообразование на эндотелиальной поверхности атеросклеротического очага, приводящее к окклюзии артерии, ишемии и некрозу. Пусковым механизмом тромбообразования является нарушение целостности эндотелия на участке изъязвления или деструкции покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки «со склонностью к изъязвлению» или разрыву (218, 219, 283). Стабильная атеросклеротическая бляшка характеризуется толстой покрышкой, гомогенным уплотненным липидным ядром, отсутствием воспалительных изменений. Нестабильная бляшка, напротив, имеет тонкую покрышку или участок истонченной покрышки с очаговой деструкцией эндотелия, воспалительную клеточную инфильтрацию, рыхлое липидное ядро с участками некроза (295). Поэтому развитие атеросклеротического очага «неизмененная ткань интимы^липидное пятно—> стабильная молодая бляшка—> стабильная фиброзная бляшка«-» нестабильная бляшка» не является благоприятным (283).

Современные взгляды на ключевые механизмы формирования нестабильной атеросклеротической бляшки не однозначны. Установлено, что важную роль в дестабилизации бляшки играет воспаление, поскольку, во-первых, показана значительная инфильтрация атеросклеротических бляшек, особенно нестабильных, макрофагами и Т-лимфоцитами (46, 48, 199). Во-вторых, при остром коронарном синдроме в крови обнаружены повышенные уровни таких провоспалительных цитокинов и маркеров, как интерлейкин-1-бета (ИЛ-1Р), ИЛ-6, фактор некроза опухоли альфа (ФНО-а), С-реактивный протеин (СРП) (173) и выявлены их ассоциации с развитием атеросклероза (237). Из указанных цитокинов, синтезируемых моноцит/макрофагами, ИЛ-1(3 индуцирует экспрессию эндотелиальными клетками адгезивных молекул (100, 273), ИЛ-6 многими авторами считается одним из ключевых маркеров выраженного воспалительного ответа, в том числе и при атеросклерозе (124, 164, 292). Одной из главных мишеней ФНО-а является стимуляция образования адгезивных молекул и ИЛ-1(3 эндотелиальными клетками, вследствие чего снижаются антиадгезивные и антикоагуляционные свойства эндотелия (92, 263). В отношении участия ИЛ-8 в атерогенезе данных меньше, но заслуживают внимания несколько исследований, в которых изучалась роль ИЛ-8 в стимуляции продукции моноцит/макрофагами факторов, активирующих хемотаксис нейтрофилов и лимфоцитов в атеросклеротические очаги (113). Однако, данных об изменениях активности провоспалительных цитокинов в динамике стадийного развития атеро склеротического очага до нестабильной бляшки мало, а об их уровнях в разных типах нестабильных бляшек человека практически нет.

Наряду с воспалительными цитокинами макрофагами продуцируются активные ферменты, вызывающие деградацию внеклеточного матрикса (47, 173, 199, 218, 281). Проводятся исследования по изучению активности матриксных металлопротеиназ (ММП) в процессе деградации экстрацеллюлярных белков в сосудистой стенке (179, 235). Коллагеназы ММП-1, ММП-13 осуществляют ферментативное переваривание фибриллярного коллагена I и III типов, желатиназы ММП-2 и ММП-9 и стромелизин ММП-3 - расщепление адгезивных молекул, нефибриллярных форм коллагена и протеогликанов (161). Выявлены повышенные уровни ММП в крови у больных с острым коронарным синдромом (181), однако активность разных типов ММП на стадиях развития атеросклеротического очага до нестабильной бляшки и в разных типах нестабильных бляшек человека не исследовалась.

Поскольку одними из патофизиологических компонентов воспаления являются окислительный стресс и окислительно-антиоксидантный дисбаланс (42, 237), представляется важным изучение выраженности и этих процессов в динамике стадийного развития атеросклеротического очага человека до стадии нестабильной бляшки. На сегодняшний день, роль факторов окислительного стресса и активности окисления липидов и протеинов в этом процессе оценивается неоднозначно (290) и делает актуальными дальнейшие исследования.

Несмотря на проводимые исследования, остаются неясными некоторые вопросы относительно механизмов дестабилизации бляшки, особенностей взаимосвязи многих факторов, индуцирующих этот процесс, что затрудняет разработку эффективных профилактических и терапевтических подходов к стабилизации атеросклеротических очагов. В рамках обозначенной проблемы в настоящей работе было проведено исследование воспалительной, в том числе деструктивной и окислительной, активности на этапах последовательного развития атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки и в разных типах нестабильных бляшек коронарных артерий у пациентов с неосложненным коронарным атеросклерозом.

Цель исследования:

Изучить особенности активности деструктивно-воспалительного процесса и определить факторы, влияющие на развитие атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки.

Задачи исследования:

1. Исследовать активность воспаления на разных последовательных стадиях развития атеросклеротических очагов коронарных артерий интима», «липидное пятно», «стабильная бляшка», «нестабильная бляшка») по уровню воспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1-рецепторный антагонист, ИЛ-6, ИЛ-8) и уровню С-реактивного протеина в гомогенатах бляшек.

2. Оценить активность окислительных процессов и содержание антиоксидантов на разных этапах формирования атеросклеротического очага по уровням продуктов окисления липидов и белков, а-токоферола, ретинола, р-каротина и исходного уровня активности параоксоназы в гомогенатах бляшек.

3. Исследовать активность металлопротеиназ ММП-3, ММП-9 и тканевого ингибитора ММП (ТИМП-1) на разных последовательных стадиях развития атеросклеротических очагов в гомогенатах бляшек.

4. Провести сравнительный анализ параметров выраженности деструктивно-воспалительного процесса в разных типах нестабильных бляшек.

5. Исследовать характер взаимосвязей показателей активности воспалительных, деструктивных и окислительных изменений при формировании нестабильной бляшки.

Научная новизна.

При изучении локальных механизмов формирования и развития атеросклеротической бляшки в сосудистой стенке показано, что основным процессом является деструктивно-воспалительный.

Обнаружены особенности изменений и выявлены значимые факторы деструктивно-воспалительной и окислительно-антиоксидантной активности, характерно отличающие нестабильную атеросклеротическую бляшку от стабильных. Так, характерными для нестабильных бляшек определены повышенные уровни воспалительных маркеров ИЛ-6, ИЛ-8 и С-реактивного протеина, деструктивных - ММП-9, окислительных -уровень ПОЛ, а также сниженное содержание ретинола.

При развитии атеросклеротического очага на стадии стабильной бляшки проявления деструктивной активности в виде повышения ММП-3 и сниженного ТИМГТ-1 значимо зависят от воспалительно-окислительных изменений, характеризующихся повышенными уровнями ФНО-а, продуктов ПОЛ и сниженным ИЛ-1-РА. Далее же, при развитии стадии нестабильной бляшки проявления деструктивной активности в виде повышенной ММП-9 зависят от воспалительных изменений, характеризующихся повышенными уровнями ИЛ-6 и ИЛ-8.

Впервые была проанализирована активность деструктивно-воспалительных и окислительно-антиоксидантных изменений в разных типах нестабильных бляшек. При воспалительно-эрозивном и при липидном типе нестабильных бляшек воспалительная активность оказалась доминирующей в сравнении с таковой при некротическом типе, где были характерно повышены уровни деструктивных маркеров. Определено, что из изученных факторов окислительно-антиоксидантных нарушений в нестабильных бляшках липидного типа преобладают повышенные процессы окисления белков и низкое содержание жирорастворимых антиоксидантов, в бляшках с воспалением/эрозией -одинаково повышены процессы окисления белков и ПОЛ, а в бляшках с некрозом/кальцинозом - максимально выражена активность процессов перекисного окисления липидов.

Научно-практическая значимость.

Теоретическое значение работы состоит в том, что в ходе анализа разных последовательных стадий развития атеросклеротических очагов коронарных артерий пациентов с неосложненным коронарным атеросклерозом определены особенности и значимые маркеры активности воспалительного процесса, включая деструктивные и окислительно-антиоксидантные параметры, характерные для нестабильной бляшки.

Показано, что повышенная активность воспалительного процесса, ассоциированная с окислительными изменениями наблюдается при формировании нестабильных бляшек не только воспалительно-эрозивного, но и липидного типов, в то время как для нестабильных бляшек дистрофически-некротического типа характерна деструктивно-окислительная активность, значимо проявляющаяся повышенными уровнями ФНО-а и продуктов перекисного окисления липидов.

Использованный в работе комплекс исследованных маркеров активности воспалительного процесса, включающий воспалительные цитокины (ФНО-а, ИЛ-1-РА, ИЛ-6, ИЛ-8, СРП), окислительно-антиоксидантные параметры (уровни продуктов окисления липидов и белков, содержание а-токоферола, ретинола, р-каротина, исходного уровня активности параоксоназы), деструктивные металлопротеиназы (ММП-3, ММП-9, ТИМП-1) может быть использован в экспериментальных исследованиях для характеристики стадий развития атеросклеротических бляшек, в том числе разных типов нестабильности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Деструктивные, воспалительные и окислительные параметры, отражающие повышенную активность воспалительного процесса в стабильных и нестабильных атеросклеротических бляшках различны и характеризуются разнонаправленностью изменений.

2. В формировании нестабильных бляшек воспалительно-эрозивного и липидного типов важную роль играет воспаление, активность которого проявляется повышенными уровнями воспалительных цитокинов, окисленных липидов и белков. Для формирования нестабильных бляшек дистрофически-некротического типа характерны повышенные параметры деструктивно-окислительных изменений.

3. При развитии атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки наблюдается корреляционный и ассоциативно зависимый характер взаимосвязи показателей деструктивных и воспалительных изменений.

ВЫВОДЫ:

1. В процессе стадийного развития атеросклеротического очага от липидного пятна через стабильную бляшку до нестабильной повышаются уровни воспалительных цитокинов ИЛ-6 в 2,5 раза, ИЛ-8 в 5,6 раз, С-реактивного белка в 2,5 раза, в то время как уровень ИЛ-1-РА снижен, а ФНО-а повышен на стадиях формирования стабильных молодых и фиброзных бляшек.

2. По мере развития атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки увеличивается уровень продуктов перекисного окисления липидов в 4 раза, при этом в нестабильных бляшках этот показатель наибольший, а содержание ретинола снижается в 2,6 раза, при этом в нестабильных бляшках этот показатель наименьший. Наиболее повышенное содержание окисленных белков отмечено на стадиях стабильных молодых и фиброзных бляшек.

3. Из маркеров деструкции по мере развития атеросклеротического очага до стадии нестабильной бляшки активность ММП-9 увеличивается в 2 раза, в то время как активность ММП-3 наиболее повышена на стадии стабильной бляшки. Снижение уровня ТИМП-1 наблюдается и в стабильных и в нестабильных бляшках в сравнении с неизмененной тканью интимы и липидными пятнами.

4. Активность деструктивно-воспалительных процессов различна в разных типах нестабильных бляшек. Повышенная воспалительная активность выявлена в нестабильных бляшках воспалительноэрозивного и липидного типа (повышенные ИЛ-6, ИЛ-8 и С-реактивный протеин), повышенная деструктивная активность — в бляшках дистрофически-некротического типа (повышенный ФНО-а и сниженный ТИМП-1). Различий в уровнях ММП-3 и ММП-9 между 3-мя типами нестабильных бляшек не выявлено. При воспалительно-эрозивном типе повышены окислительные изменения и липидов и белков, при липидном типе повышена окислительная модификация белков и низкий уровень антиоксидантов, а в бляшках с кальцинозом/некрозом наблюдается наиболее высокий уровень продуктов перекисного окисления липидов, выше в 2,9 раза, чем в фиброатеромах.

5. Отмечены корреляционные связи параметров деструктивных изменений в атеросклеротических очагах с воспалительными изменениями, а именно корреляции уровней ММП-9 с ММП-3, ИЛ-1-РА, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8, корреляция уровня ММП-3 с ФНО-а и корреляция уровня ТИМП-1 с ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8. По мере развития атеросклеротического очага от липидного пятна до бляшки выявлена зависимость проявлений деструктивной активности от воспалительно-окислительных изменений, определяющими показателями которых в стабильной бляшке являются повышенные ФНО-а, продукты перекисного окисления липидов и сниженный ИЛ-1-РА, а в нестабильной - повышенные уровни ИЛ-6 и ИЛ-8.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для снижения риска формирования нестабильных атеросклеротических бляшек со склонностью к изъязвлению/разрыву с последующим тромбообразованием и развитием инфаркта миокарда целесообразным является проведение терапии, направленной на купирование и стабилизацию диструктивно-воспалительных процессов.

Использованный в работе комплекс исследованных маркеров активности воспалительного процесса, включающий воспалительные цитокины (ФНО-а, ИЛ-1-РА, ИЛ-6, ИЛ-8), СРП, окислительно-антиоксидантные параметры (уровни продуктов окисления липидов и белков, содержание а-токоферола, ретинола, р-каротина, исходного уровня активности параоксоназы), деструктивные металлопротеиназы (ММП-3, ММП-9, ТИМП-1) может быть использован в экспериментальных исследованиях для характеристики стадий развития атеросклеротических бляшек, в том числе разных типов нестабильности.