Адаптация цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов

Шлепцова, Варвара Андреевна

Диссертации по медицине → Восстановительная медицина, спортивная медицина, курортология и физиотерапия

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.51) на тему:Адаптация цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Шлепцова, Варвара Андреевна Москва 2010 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.51

Автореферат диссертации по медицине на тему Адаптация цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов

004600641

На правах рукописи

Шлепцова Варвара Андреевна

АДАПТАЦИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ЗВЕНА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У ВЫСОКОКВАЛИФИЦИРОВАННЫХ СПОРТСМЕНОВ

14.00.51 - восстановительная медицина, лечебная фшкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

8 ДПР 2013

ои

Москва -2010

004600641

Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии Федерального Государственного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Арьков Владимир Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Комолов Игорь Сергеевич

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Алексеев Леонид Петрович

Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы

Защита диссертации состоится «28» апреля 2010 в на заседании диссертационного совета Д.311.002.01 при Федеральном Государственном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта по адресу: 105005, Москва, Елизаветинский пер. 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта

Автореферат разослан « 26 » г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пономарева А. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Исследования последних лет показали, что при систематическом воздействии физических факторов именно иммунная система в первую очередь участвует в формировании адаптации организма, которая опосредуется через активацию клеток иммунной системы, несущих цитотоксический потенциал - цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+) и субпопуляции NK-клеток (CD 16+, CD56+). Первыми под влиянием различных стрессовых воздействий, в том числе и физической нагрузки, активируются NK-клетки.

На сегодняшний день данные о влиянии физической нагрузки на активационные показатели иммунной системы противоречивы. Так, некоторые исследователи обнаружили увеличение фагоцитарной и цитотоксической активности в результате спортивных тренировок, однако в других работах показано, что физическая нагрузка не влияет на цитотоксическую функцию NK-клеток. Поэтому представляется важным выявить особенности механизмов регуляции цитотоксической функции NK-клеток при физической нагрузке. Одним из актуальных направлений поиска маркеров активации является изучение экспрессионного профиля белков как рецепторного аппарата, так и функциональных белков, играющих значительную роль на начальных этапах активации NK-клеток.

Стоит отметить, что большинство работ по спортивной иммунологии направлено на изучение изменения параметров иммунной системы людей под воздействием физической нагрузки вне зависимости от уровня их спортивной квалификации и степени подготовленности. В немногочисленных работах, посвященных сравнительному анализу иммунологических параметров у спортсменов и неподготовленных людей, учеными высказываются различные точки зрения. Так, в одних исследованиях показано, что пролиферация лимфоцитов в ответ на физическую нагрузку не отличалась между этими двумя группами. В ряде других работ отмечается, что активность NK-клеток у более выносливых спортсменов выше, чем у нетренированных людей, хотя в других исследованиях полученные данные не подтверждаются.

Значительное действие на активность цитотоксического потенциала оказывает наличие вирусной инфекции в организме. Наиболее распространены латентные инфекции, вызываемые герпесвирусами, к которым относится вирус Эпштейн-Барр (ВЭБ, EBV) и вирус герпеса человека 6 типа (ВГЧ6, HHV6). В ряде исследований при изучении влияния наличия данных вирусов на показатели клеточного иммунитета отмечается увеличение количества клеток натуральных киллеров (NK-клеток) у спортсменов. С другой стороны, в

некоторых работах описано значительное снижение количества клеток цитотоксического звена под воздействием интенсивных физических нагрузок у спортсменов-носителей ВЭБ. При этом влияние вирусной нагрузки на состояние иммунитета в зависимости от уровня выносливости атлета не изучалось, хотя это является важным моментом для определения степени адаптации и восстановительной способности защитной системы организма спортсмена на протяжении его тренировочной деятельности.

Поэтому изучение состояния иммунной системы и механизмов регуляции цитотоксического потенциала в зависимости от уровня физической выносливости является актуальным для спортивной и восстановительной медицины.

Гипотеза

Уровень физической выносливости влияет на изменение количественных (клеточный состав) и активационных (экспрессия генов) показателей цитотоксического звена (цитотоксические Т-лимфоциты, субпопуляции МК-клеток) у высококвалифицированных спортсменов, что характеризует адаптационные изменения иммунной системы. Мониторинг иммунологических параметров у спортсменов позволит оценить степень их подготовленности к переносимости физических нагрузок и оптимизировать процессы тренировочной и соревновательной деятельности.

Цель исследования

Разработка новых диагностических критериев, характеризующих состояние клеточного иммунитета для оценки адаптационных изменений организма спортсмена в зависимости от уровня физической выносливости.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Выявить количественные показатели клеточного звена иммунной системы, характеризующие уровень физической выносливости у высококвалифицированных спортсменов до воздействия физической нагрузки.

2. Оценить воздействие физической нагрузки на состояние цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов.

3. Исследовать влияние наличия латентных инфекций (ВЭБ и ВГЧ6) на состояние цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов во время физической нагрузки и в период восстановления после неё.

4. Осуществить выбор генов, вызывающих активацию иммунной системы при физической нагрузке. Выявить особенности экспрессии генов, участвующих в

активации цитотоксического звена, в зависимости от уровня физической выносливости для оценки состояния адаптационных процессов иммунной системы.

Объект исследования

Механизмы иммунного реагирования на клеточном и молекулярно-генетическом уровнях у высококвалифицированных спортсменов.

Предмет исследования

Состояние клеточного звена иммунной системы и экспрессии генов белков, регулирующих активацию иммунной системы под воздействием физической нагрузки.

Научная новизна

Впервые описано влияние уровня физической выносливости на состояние иммунной системы. Выявлена прямая зависимость между количеством Т-лимфоцитов и показателем физической выносливости. Установлено, что физическая выносливость влияет на перераспределение клеточного состава - усиление работы лимфоцитарного звена у высококвалифицированных спортсменов. Наибольшей чувствительностью к 30-минутной аэробной физической нагрузке обладают клетки, несущие цитотоксический потенциал. Описано влияние вирусной нагрузки на скорость адаптации к физической нагрузке и степень восстановления после неё в зависимости от уровня физической выносливости.

Впервые изучены особенности иммунного реагирования на молекулярно-генетическом уровне у высококвалифицированных спортсменов до и после физической нагрузки и в период восстановления после неё. Выявлено изменение активности генов иммуноглобулинподобных рецепторов (KIR) и функциональных белков перфорина 1 (PRF1) и гранзима В (GZMB) NK-клеток, играющих роль в развитии цитотоксического потенциала.

Определены прогностически значимые клеточные и молекулярно-генетические параметры иммунной системы, характеризующие физическую выносливость спортсменов.

Теоретическая значимость

Результаты исследования расширяют знания о влиянии уровня физической выносливости на состояние иммунной системы. Показано, что иммунологические показатели являются информативными критериями для оценки влияния физической выносливости на состояние организма атлета. В работе найдены количественные и активационные маркеры иммунной системы в зависимости от степени выносливости спортсмена, что позволяет определить степень адаптации спортсмена к физической

нагрузке, необходимой для поддержания здоровья атлета и повышения результативности спортсменов на соревнованиях.

Практическая значимость

Практическая значимость работы заключается в разработке критериев оценки физической выносливости спортсменов на основании изучения цитотоксического звена иммунной системы. Выявленные параметры позволяют судить о влиянии физической выносливости на степень адаптации иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов.

Оценка экспрессии иммунологических генов необходима при разработке новых подходов к мониторингу состояния организма спортсмена, процессов тренировки и восстановления.

Указанные в работе подходы могут быть использованы для коррекции учебно-тренировочного процесса атлетов и оценки степени подготовленности к соревнованиям.

Материалы исследования могут быть использованы в преподавании медико-биологических дисциплин в высших учебных заведениях, на семинарах и курсах повышения квалификации врачей спортивной медицины, тренеров и врачей команд.

Результаты исследования внедрены в работу кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ и кафедры физического воспитания и спорта МГУ им. М.В. Ломоносова, что подтверждено актами о внедрении.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У высококвалифицированных спортсменов выявлено повышение количественных показателей Т-лимфоцитов по сравнению с нетренированными людьми.

2. Под воздействием физической нагрузки у спортсменов увеличивается количество лейкоцитов за счет лимфатического звена в отличие от нетренированных людей, у которых повышается содержание сегментоядерных нейтрофилов.

3. Наличие латентных инфекций приводит к срыву восстановления функциональных резервов цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов после физической нагрузки.

4. Степень физической выносливости влияет иа уровень активности экспрессии генов KIR, PRF1 и QZMB до и после физической нагрузки и в период восстановления после неё, что может быть использовано для оценки адаптационных изменений организма спортсмена.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 120 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания организации исследования, материалов и методов, 3 глав, итогового заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Последний включает 222 источника, их которых 30 отечественных изданий, 192 - иностранных. Диссертация иллюстрирована 12 рисунками и 9 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОРГАНИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Организация исследования

Диссертационная работа состоит из четырёх этапов.

I этап: Определение антропометрических и физиологических (уровень максимального потребления кислорода - МПК) данных, сбор анамнеза (иммунологического, аллергологического) у всех обследуемых. Разделение на группы по уровню физической выносливости на основании показателя МПК.

II этап: Исследование состояния клеточного иммунитета и, в частности, цитотоксического звена у испытуемых до, после физической нагрузки и в период восстановления.

Ш этап: Исследование профиля иммунологических генов, отбор наиболее активно экспрессирующихся генов под воздействием физической нагрузки. Определение уровня экспрессии отобранных генов в зависимости от уровня физической выносливости под воздействием физической нагрузки и в период восстановления после неё.

IV этап: Проведение статистического анализа данных.

Материалы и методы для I этапа исследования

Для скриннингового исследования экспрессии иммунологических белков, участвующих в развитии цитотоксической функции NK-клеток, был разработан специальный протокол эксперимента. В работе приняли участие 11 высококвалифицированных спортсменов. Возраст 19,3±0,7 лет, рост - 175,0±7,0 см, вес -68,0±4,6 кг, максимальное потребление кислорода (МПК/кг) - 59,8±1,5 мл/кг/мин. Все спортсмены подписали информированное согласие на участие в исследовании, одобренное этическим комитетом ФГУ ВНИИФК.

В качестве модельной нагрузки использовался тест до отказа, со ступенчато повышающейся мощностью. Тестирование проводили на беговой дорожке Venus

(h.p.Cosmos, США). Среднее время работы составило 15 минут. Забор крови производился до начала эксперимента и сразу после окончания тестирования.

Материалы и методы для II этапа исследования

В исследовании приняли участие 12 высококвалифицированных спортсменов, специализирующихся в циклических видах спорта более 5 лет. В качестве контрольной группы выступали 7 юношей с обычным уровнем физической активности. Антропометрические и физиологические данные испытуемых представлены в таблице 1. Перед участием в эксперименте все испытуемые дали информированное согласие. Протокол эксперимента одобрен этическим комитетом ФГУ ВНИИФК.

Для оценки степени подготовленности к физической нагрузке определяли уровень максимального потребления кислорода (МПК) каждого участника. За неделю до исследования проводили тест до отказа, со ступенчато повышающейся мощностью на беговой дорожке Venus (h.p.Cosmos, Германия). Группы достоверно (р<0,001) отличались по показателям МПК (Табл. 1).

Таблица 1.

Антропометрические и физиологические данные исследуемых групп (*/?<0,001)

Характеристика Группа спортсменов Группа контроля

Возраст, лет 22,4±0,7 23,5±1,5

Рост, см 172,8±3,8 174,3±5,6

Вес, кг 73,1±1,6 76,4±2,7

Индекс массы тела, кг/м2 23,1±5,8 24,4±4,5

МПК, мл/мин*кг 68,8±4,4* 48,9±8,8*

В качестве модельной нагрузки использовали 30-минутный бег на 80% от МПК.

Забор крови проводили до начала нагрузки (Т1), сразу после окончания теста (Т2) и через час отдыха после окончания теста (ТЗ),

Выявление наличия вирусной инфекции

Определение наличия вирусов проводилось с помощью иммуноферментного метода с определением концентрации антител к вирусам Эшптейн-Барр и герпесу 6 типа: «ВектоВЭБ - NA - IgG»; «ВектоВЭБ - VCA - IgM»; «ВектоВЭБ - ЕА - IgG»; «ВектоВГЧб - IgG» («Вектор-Бест», Россия).

Также проводилось определение наличия ДНК вирусов в крови испытуемых с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Определение популяций лимфоцитов

Выделение периферических мононуклеаров проводили с помощью разделения клеток на градиенте плотности фиколла «Histopaque-1077» (Сигма, США). Осадок лейкоцитов отмывали два раза однократным фосфатно-солевым буфером.

Иммунофенотипирование проводилось на проточном цитофлюориметре FACScan Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием комбинации меченных флуоресциин изотиоцианатом (FITC) и фикоэритрином (РЕ) моноклональных антител к дифферецировочным маркерам («Сорбент», Россия): CD3 (FITC), CD4 (PE), CD8 (РЕ), CD 16 (FITC), CD56 (PE), CD19 (FITC).

Для анализа использовался лимфоцитарный гейт по фронтальному и боковому светорассеиванию. Анализ результатов проводился в программе CELLQuest Pro (Becton Dickinson, США).

Материалы и методы для III этапа исследования

Исследование экспрессии РНК

1. Выделение РНК

Выделение РНК проводили с помощью набора PaxGene Blood RNA kit (PaxGene, США) по протоколу производителя. Выход очищенной нефрагментированной РНК (RIN>8) составил около 100 нг/мкл.

2. Анализ экспрессии при помощи биочипов

Скриннинговый анализ экспрессии генов проводили с использованием биочипов Human GeneChip ST1.0 (Affymetrix, США). Выделенная РНК использовалась в качестве матрицы для синтеза комплиментарной цепочки ДНК, часть которой была использована для синтеза биотин-меченной кДНК. После фрагментации биотинилированная кДНК наносилась на чип HuGene 1.0 ST Array, который инкубировали в течение 16 ч в гибрщщзационной печи при температуре 45°С. Затем проводили отмывку микрочипов от несвязавшейся кРНК и окрашивали стрептавидин-фикоэритрином на станции Fluidics Station 450 (Affymetrix, США). Окрашенные чипы сканировали на сканере GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix, США).

Оценку качества гибридизации, отмывки и окрашивания чипов производили с помощью программного пакета Gene Expression Console (Affymetrix). Все внутренние контроли на чипах соответствовали нормам, указанным производителем.

Данные сканирования, полученные с помощью Gene Expression Console (Affymetrix) и представляющие собой интенсивности флуоресценции проб, были отфильтрованы по двум критериям:

1) интенсивность более чем 25% проб гена превышает 100;

2) межквартильный интервал (IQR) > 0,25.

3. Анализ экспрессии генов с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Первоначально полученную РНК переводили с помощью метода обратной транскрипции в кДНК с использованием специального набора (ДНК-Технология, Россия). В смесь для обратной транскрипции с неспецифическими праймерами вносили примерно 40 нг тотальной нефрагментированной РНК (RIN>8). Реакцию проводили при температуре 40'С в течение 30 мин., с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°С в течение 5 мин. Полученную кДНК разводили в 100 раз и использовали в экспериментах ПЦР в реальном времени.

Для оценки уровня экспрессии РНК использовали метод полуколичественной ПЦР в реальном времени: 1 цикл: 95°С - 5 мин.; 50 циклов: 94'С - 20 сек., 60'С - 1 мин.; 10'С -хранение. Образцы кДНК анализировали в трех повторениях. ПЦР в реальном времени проводили с использованием специфических праймеров к исследуемым генам и двум «housekeeping» генам - бета-2-микроглобулину (В2М) и гипоксантин фосфорибозилтрансферазе 1 (HPRT), экспрессия которых постоянна в разных типах клеток и не зависит от внешних факторов, но их копийность в клетке различна. Количество В2М много в клетке, a HPRT - мало. При нормировании на эти два гена возможно количественно оценить экспрессию исследуемых генов в лейкоцитах. Полученные результаты представлены в относительных единицах (o.e.) после нормировки на В2М и HPRT.

Проведение ПЦР в реальном времени проводили по методике TaqMan, в качестве флуоресцентной метки использовали краситель 6-карбокси флуоресцеин (FAM) и гаситель «Black Hole Quencher 1,2» (BHQ1,2).

Материалы и методы для IV этапа исследования

Статистическая обработка данных

Полученные в работе данные обрабатывали с использованием статистических пакетов STATISTICA 7 (StatSoft, США), Sigma Plot 8.0 (SPSS), а также программных пакетов Affymetrix (Affymetrix, США). Для определения достоверности различий между уровнями

исследуемых параметров использовали V критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными прир<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика группы спортсменов и группы контроля

В исследовании принимали участие спортсмены циклического вида спорта (N=12) (лыжные гонки), ориентированных на развитие выносливости (средний возраст - 22,4±0,7 года). На момент обследования все спортсмены имели специализированный спортивный стаж не менее четырех лет. Также для исследования проводился набор мужчин (N=7) (средний возраст - 23,5±1,5 года) с обычным уровнем физической активности.

В качестве определения показателя физической выносливости использовался показатель максимального потребления кислорода (МПК), по которому испытуемые были разделены на две группы. В группе высококвалифицированных спортсменов среднее значение уровня МПК составило 68,8 мл/мин/кг, тогда как в группе нетренированных людей (группа контроля) - 48,9 мл/мин/кг (Рис. 1). Полученные данные достоверно отличались между группами (р<0,001).

На момент обследования испытуемые находились в удовлетворительном состоянии здоровья и жалоб не предъявляли. Оценку состояния физического здоровья проводили путем опроса и медицинского осмотра. На момент обследования не выявлено наличия острых респираторных заболеваний, инфекционной патологии любой локализации, заболеваний опорно-двигательного аппарата, отклонений со стороны сердечно-сосудистой системы и аллергической патологии в анамнезе.

Группа спортсменов

Группа контроля

Рис. 1 Показатели МПК в группе спортсменов и группе контроля (р<0,001).

1. Оценка исходного состояния иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов

Состояние иммунной системы оценивали по уровню количественных показателей клеточного состава крови: общего числа лейкоцитов и лимфоцитов и их популяций. Также были изучены субпопуляции лимфоцитарного звена: Т- и В-лимфоциты, МС-клетки.

Таблица 2.

Количественные показатели лейкоцитов и их популяций в исходном состоянии (Т1) в группе спортсменов и группе контроля (М±ст).

Лейкоциты, клетки/мкл Лимфоциты, % Сегментоядерные нейтрофилы, % Палочкоядерные нейтрофилы, % Эозинофшш, % Моноциты, %

Группа спортсменов, N=12 5710Ш70 43,8±4,3* 48,1±6,4 5,9±3,1 2,0±0,7 6,0±3,2

Группа кошроля, N=7 5410±1780 35,1±3,2* 54,0±6,8 4,2±2,1 1,3±0,4 3,5±1,2

*р<0,05

При оценке исходного состояния иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов (N=12) и группы контроля, представленной юношами с обычным уровнем физической активности (N=7), относящихся к одной возрастной группе и не отличающихся по половому признаку, выявлено, что общее количество лейкоцитов в обеих группах находилось в одинаковых количественных пределах. При этом в группе спортсменов количество лимфоцитов было повышено, и отмечалось умеренное снижение количества сегментоядерных нейтрофилов по сравнению с группой контроля (выявлено перераспределение клеток в лейкоцитарной формуле за счет повышенного содержания лимфоцитов у спортсменов) (Табл. 2).

При исследовании количества Т-лимфоцитов (СБЗ+) вьивлено увеличение их содержания у высококвалифицированных спортсменов за счет повышенных показателей общего числа лимфоцитов (абсолютное содержание). Также обнаружена тенденция к увеличению количества субпопуляций Ж-клеток и В-лимфоцитов у высококвалифицированных спортсменов по сравнению с группой контроля (Табл. 3).

Баланс иммунорегуляции между исследуемыми группами оценивали по иммунорегуляторному индексу (ИРИ) - соотношение относительных значений клеток (СШ+СО4+)/(С03+СП8+). Достоверных различий по ИРИ между высококвалифицированными спортсменами и группой контроля не обнаружено. ИРИ находится в пределах значений от 1,3 до 2,1.

Таблица 3.

Относительные показатели (%) популяций лимфоцитов до нагрузки (Т1) в двух исследуемых группах (М±о).

Группа спортсменов, N=12 Группа кошроля, N=7

Лимфоциты, клеток/мкл 2387±674 1975±383

CD3+, % 76,1 ±9,0 66,3+16,7

CD3+, клеток/мкл 1816+549* 1309+353*

CD3+CD4+, % 42,7+9,6 34,8+8,0

CD3+CD4+, клеток мкл 1020+413* 687+119»

CD3+CD8+, % 24,9+8,2 20,3+4,7

CD3+CD8+, клеток/мкл 596+265 401+114

ИРИ 1,9+0,8 1,8+0,44

CD 16+, % 20,7+9,5 14,2+6,7

CD 16+, клеток/мкл 494+203 281+142

CD56+, % 16,5+9,4 18,3+7,3

CD56+, клеток/мкл 393+217 362+188

CD 19+, % 9,5+4,3 8,8+2,1

CD19+, клеток/мкл 227+124 174+141

*р< 0,05

В работе была найдена корреляция между уровнем МПК и абсолютным количеством Т-хелперов в крови. Высокие показатели МГЖ (больше 70 мл/мин*кг) соответствуют большему количеству клеток СЭЗ+С04+ (Рис. 2).

(1=0,5; р <0,05).

Таким образом, высокий уровень физической выносливости прямо пропорционален высоким показателям Т-клеточного звена иммунной системы. Наиболее ярко это выражается в количественных изменениях Т-хелперов.

2. Состояние клеточного звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов под воздействием 30-минутной аэробной физической нагрузки.

Для оценки влияния 30-минутной аэробной физической нагрузки проводили сравнительный анализ показателей клеточного иммунитета непосредственно после нагрузки у высококвалифицированных спортсменов (N=12) и в группе контроля, представленной юношами с обычным уровнем физической активности (N=7), относящихся к одной возрастной группе и не отличающихся по половому признаку.

Таблица 4.

Количественные показатели лейкоцитов и их популяций под воздействием 30-минутной аэробной физической нагрузки в группе спортсменов и группе контроля (М±а).

Лейкоциты, Лимфоциты, Сегментоядерные Палочкоядерные Эозинофилы, Моноциты,

__клетки/мкл__%__нейтрофилы, % нейтрофилы, %__%__%

Группа

спортсменов, 7705±2000 51,9±12,1* 37,4±11,8* 5,8±3,7 1,1±0,7 2,8±2,1

N=12_______

Группа

кошроля, 7440±1198 38,6±15,1* 53,0±13,9* 3,3±1,8 1,0±0,4 3,7±3,4

N=7 ______J___

*р< 0,05

В ответ на физическую нагрузку выявлено повышение количества лейкоцитов и их популяций (Табл. 4). В отличие от группы контроля у высококвалифицированных спортсменов наблюдается преобладание относительного количества лимфоцитов над уровнем сегментоядерных нейтрофилов. (Табл. 4).

При оценке клеточного звена иммунной системы при физической нагрузки выявлено повышение количества субпопуляций лимфоцитов, обеспечивающих цитотоксический потенциал (CD3+CD8+), (CD16+), (CD56+) в обеих группах. Наибольшее изменение наблюдается в субпопуляциях NK-клеток. Их количество увеличивается более чем в три раза, тогда как показатели Т-хелперов и B-лимфоцитов повышалось только в 1,3 раза под воздействием 30-минутной аэробной физической нагрузки. Данная закономерность выявлена в обеих группах исследуемых, то есть она не зависит от уровня спортивной выносливости (Рис. 3).

Рис. 3. Изменение количества лимфоцитов после 30-минутной аэробной нагрузки в исследуемых группах.

30-минутная аэробная физическая нагрузка способствует сдвигу иммунорегуляции по Т-1 хелперному типу иммунного ответа (ИРИ<1,5) в обеих исследуемых группах. При этом наиболее глубокое снижение ИРИ отмечено в группе контроля (Рис. 4).

Рис. 4. Изменение ИРИ в ответ на физическую нагрузку в исследуемых группах (*р<0,05).

Под воздействием физической нагрузки (Т2) среди высококвалифицированных спортсменов выделилась группа из 4 человек (25%) (I группа), характеризующаяся более высокими значениями абсолютных показателей субпопуляций 1МК.-клеток (Рис. 5), по

сравнению с основной группой спортсменов (N=8, 75%) (II группа). Выявлено, что в I группе спортсменов отсутствуют антитела к ВЭБ и ВГЧ6, а также не обнаружена ДНК этих вирусов в крови спортсменов. При этом во II группе спортсменов определяются титры антител от 5,1-13,3 у.е. (наличие лерсистенции вирусов), ДНК вирусов не выявлена (отсутствие острой фазы инфицирования). В I группе спортсменов физическая нагрузка увеличивает количество субпопуляций 1Ж-клеток в 3,4 раза для (СБ16+) и 3,6 раза для (СБ56+) по сравнению с исходным уровнем, тогда как во II группе спортсменов наблюдается только незначительное увеличение количества (СЭ16+) в 1,7 и (С056+) в 1,6 раза. |

Через 1 час отдыха после физической нагрузки в I группе наблюдается полное восстановление показателей клеточного состава периферической крови до исходного уровня, в том числе и се стороны всех субпопуляций №С-клеток (Рис. 5). Во II группе спортсменов наблюдается практически полное истощение субпопуляций Ж-клеток: (СО 16+) до 177±130 клеток/мкл; (С056+) до 227±149 клеток/мкл. Это приводит к удлинению процессов восстановления при наличии ВЭБ и ВГЧ6 в латентной форме (отсутствие проявлений симптомов заболеваний и диагностических критериев налитая острого процесса инфицирования) (Рис. 5).

в период восстановления в двух группах спортсменов (*р<0,05).

Таким образом, физическая нагрузки приводит к увеличению количества клеток лимфоцитарного ряда у высококвалифицированных спортсменов, тогда как у нетренированных людей наблюдается увеличение нейтрофильного звена. Наибольшей

чувствительностью к 30-минутной аэробной физической нагрузке обладают клетки, обеспечивающие цитотоксический потенциал. Влияние вирусной нагрузки на показатели цитотоксического звена иммунной системы проявляется только при наличии высоких показателей физической выносливости (МПК>65,5 л/мин/кг). Наличие персистенции вирусов вызывает срыв адаптационных резервов цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов и проявляется снижением их показателей в ответ на физическую нагрузку и в период восстановления.

3. Экспрессия иммунологических генов под воздействием физической нагрузки

С помощью алгоритма I/NI из имеющихся на чипе 28869 РНК была отобрана 761, вариация которых обусловлена влиянием физической нагрузки. Для поиска дифференциально экспрессированных генов с помощью библиотеки limma была рассчитана моделируемая t-статистика. При FDR=0,05 (поправка Бенжамини-Хохберга) и изменении люминесценции не менее чем в 1.3 раза были получены 104 дифференциально экспрессируемых РНК.

В результате статистической обработки данных отобрали 8 дифференциально экспрессированных иммунологических генов, наиболее сильно изменяющихся под действием физической нагрузки (Табл. 5). Это гены, кодирующие иммуноглобулиноподобные рецепторы NK-клеток (killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR: KIR2DL1, 2DL2, 2DL3, 3DL1, 2DS4, 2DS1), гены субъединиц рецепторов IL2 (Interleukín 2 receptor P chain) и IL18 (IL18RAP, interleukin 18 receptor accessory protein) и гены функциональных белков - гранзим В (granzyme В, GZMB) и перфорин 1 (perforin, PRF1).

Среди представленных генов наиболее сильные изменения замечены в группе «Взаимодействие с клеткой-мишенью», которая представлена генами поверхностных рецепторов NK-клеток - KIR. По данным литературы выявлено, что в зависимости от длины цитоплазматического домена KIR обладают ингибиторными (длинный цитоплазматический домен - KIR2DL1, 2DL3, 2DL2, 3DL1) или активационными (короткий домен - KIR2DS4,2DS2) свойствами. Уровень их экспрессии изменяется в среднем в 2 раза. Характерно, что транскрипционная активность усиливается как у ингибиторных, так и у активационных генов.

Гены функциональных белков PRF1 и GZMB NK-клеток также значительно меняются.

Известно, что гранзимы проникают с помощью перфоринов в клетку-мишень, где запускают реакцию апоптоза (запрограммированная гибель клетки).

Таким образом, физическая нагрузка приводит к значительному усилению активационных маркеров НК-клеток, которые принимают участие в развитии цитотоксического потенциала. Это свидетельствует о запуске в иммунных клетках адаптационных процессов в ответ на физическую нагрузку.

Поэтому для дальнейшей работы были отобраны 5 генов, наиболее сильно изменяющихся под действием физической нагрузки и отражающие работу Ж-клеток: КШ20ЬЗ, КШ2БЬ2, КИШШ, РШ и вШВ.

Таблица 5.

Изменение экспрессии иммунологических генов при физической нагрузке (РП11=0.05)

Ген Полное название гена Уровень изменения экспрессии Функция в ИК-клетке

Взаимодействие с клеткой-мишенью

КШБЬЗ 2-доменный ^-подобный рецептор, длинный цитоплазматический домен 3 2,2 Ингибиторная

КШОЫ 2-доменный ^-подобный рецептор, длинный цитоплазматический домен 1 2,07 Ингибиторная

КШБЬ2 2-доменный ^-подобный рецептор, длинный цитоплазматический домен 2 1,93 Ингибиторная

КШ084 2-доменный ^-подобный рецептор, короткий цитоплазматический домен 4 1,9 Активационная

кшовг 2-доменный ^-подобный рецептор, короткий цитоплазматический домен 2 1,9 Акгивационная

КЖЗОЫ 3-доменный ^-подобный рецептор, длинный цитоплазматический домен 1 1,84 Ингибиторная

Цитотоксическое действие

РШЧ Перфорин 1 1,81 Запуск киллерного ответа

вгмв Гранзим В 1,65 Запуск киллерного ответа

4. Изменение экспрессии генов активации NK-клеток под воздействием физической нагрузки у высококвалифицированных спортсменов В работе проводился сравнительный анализ экспрессии генов KIR, PRF1 и GZMB NK-клеток в покое (Т1) и её изменение под воздействием 30-минутной аэробной физической нагрузки между группой спортсменов (N=12) и группой контроля (N=7).

Изучение исходного уровня экспрессии исследуемых генов показало, что относительный уровень экспрессии в генах KIR2DL2, PRF1, GZMB значительно отличается между группами (Рис. 8). У спортсменов транскрипционная активность ниже, чем в группе контроля. Так, для гена KIR2DL2 транскрипционная активность различается между группами в 3,9 раза (р<0,001), для гена PRF1 -в 7,8 раза (р<0,001) и для гена GZMB - в 4,8 раза (р<0,001) (Рис. 6). Наиболее существенные отличия обнаружены в активности экспрессии генов функциональных белков PRF1 и GZMB, что свидетельствует о развитии сниженного уровня цитотоксической активации NK-клеток в покое у спортсменов по сравнению с группой контроля.

4 4,5 -

| 4,0 -§3,5-

1 3,0Л

i 2,50>

& 2,0>>

1 1.5-

q 1.0-

| 0,56 °'°J

pfci

KIR2DL3

KIR2DL2

KIR2DS2

PRF1

GZMB

Рис. 6. Относительный уровень экспрессии генов до воздействия физической нагрузки (Т1)(*р<0,01).

При индивидуальном рассмотрении в группе спортсменов значения относительного уровня экспрессии по гену KIR2DL2 находятся в пределах от 0,02 до 0,3 o.e., тогда как в группе контроля уровень экспрессии колеблется в диапазоне 0,4-0,73 o.e. Также выявлены индивидуальные различия по транскрипционной активности гена PRF1: в группе

спортсменов разброс значений составил от 0,22 до 0,59 o.e., в группе контроля 1,34 - 4,14 o.e. Для гена GZMB: в группе спортсменов диапазон составил от 0,05 до 0,15 o.e., в группе контроля 0,32-0,78 o.e. Полученные данные позволяют разработать диагностические критерии активности цитотоксического звена иммунной системы до воздействия физической нагрузки, характеризующие уровень физической выносливости, представленные в таблице 6.

Таблица 6.

Диагностические критерии оценки относительного уровня экспрессии генов функциональных белков PRF1, GZMB и ингибиторного рецептора KIR2DL2 в зависимости

от степени физической выносливости до воздействия физической нагрузки.

Ген Относительный уровень экспрессии у высококвалифицированных спортсменов, o.e. Относительный уровень экспрессии у нетренированных людей, o.e.

KIR2DL2 <0,3 >0,4

PRF1 <0,6 >1,0

GZMB <0,15 >0,3

Под воздействием 30-минутной аэробной физической нагрузки замечено усиление уровня экспрессии генов KIR, PRF1 и GZMB. При этом транскрипционная активность всех изучаемых генов у спортсменов увеличивается значительнее, чем в группе контроля (Рис. 7). Достоверные различия (р<0,01) между группой высококвалифицированных спортсменов и группой контроля выявлены для генов KIR2DL3 (2,5 раза), KIR2DS2 (2,1 раза), PRF1 (3,8 раза), тогда как для генов KIR2DL2, GZMB изменение экспрессии не отличалось между группами.

Характерной особенностью транскрипционной активности при физической нагрузки является усиление экспрессии генов, кодирующих различные по функциональной активности поверхностные рецепторы NK-клеток - KIR2DL3 - ингибиторный и KIR2DS2 -активационный, Данная закономерность связана с неспецифической стимуляцией NK-клеток под воздействием физической нагрузки.

I ,

Рис. 7. Изменение уровня экспрессии генов под воздействием физической нагрузки (*р<0,01)

Таким образом, уровень физической выносливости отражается на степени активности генов, участвующих в регуляции работы №С-клеток. Данные изменения характеризуют состояние резервных возможностей организма спортсмена, а также уровень адаптации к физическим нагрузкам, связанных с выработкой выносливости.

ВЫВОДЫ

1. Маркером уровня физической выносливости (МПК>65 л/мин/кг) является повышенное содержание клеток Т-лимфоцитов (181б±549 клеток/мкл) у высококвалифицированных спортсменов до воздействия физической нагрузки по сравнению с группой контроля (МПК<50 л/мин/кг) (1309+353 клеток/мкл).

2. Под воздействием физической нагрузки выявлено перераспределение клеточного состава с преобладанием клеток лимфоцитарного звена (51,9%) над нейтрофильным (37,4%) у высококвалифицированных спортсменов в отличие от группы контроля. Наибольшей чувствительностью к влиянию физической нагрузки обладают клетки лимфоцитарного звена (СОЗ+СЭ8+), (СБ16+), (С056+), несущие цитотоксический потенциал, вне зависимости от уровня физической выносливости.

3. Установлено влияние латентных инфекций на абсолютные показатели субпопуляций Ж-клеток (СБ 16+, СБ56+), несущих цитотоксический потенциал, только в группе высококвалифицированных спортсменов. Наличие ВЭБ и ВГЧ6 способствуют более

низкому увеличению количества NK-клеток (CD 16+ - в 1,7 раза; CD56+ - в 1,6 раза) после физической нагрузки по сравнению с их отсутствием (CD 16+ - в 3,4 раза; CD56+ - в 3,6 раза). При наличии вирусов происходит значительное снижение количества NK-клеток ниже исходного уровня на 33% для (CD16+) и на 47,5% для (CD56+) в течение восстановительного периода после нагрузки.

4. При исследовании экспрессионного профиля иммунологических генов наибольшие изменения активности обнаружены в генах KIR, PRF1 и GZMB, регулирующих работу NK-клеток.

5. Уровень экспрессии генов функциональных белков - PRF1 и GZMB, а также гена KIR2DL2 у высококвалифицированных спортсменов до физической нагрузки снижен (в 7,8 раза; в 4,8 раза и в 3,9 раза соответственно) по сравнению с группой контроля, что характеризует адаптационные изменения при высоком уровне физической выносливости.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении врачебного контроля следует оценивать состояние лимфоцитарного звена иммунной системы, особенно количественных показателей Т-клеток, служащих чувствительными маркёрами адаптации иммунитета у спортсменов с высоким уровнем физической выносливости.

2. Необходимо исследовать наличие латентных инфекций, влияющих на уровень цитотоксического потенциала у высококвалифицированных спортсменов и на скорость его восстановления после физической нагрузки.

3. Мониторинг экспрессии генов, играющих роль в активации NK-клеток, является диагностическим критерием состояния иммунной системы для определения степени физической выносливости спортсмена к физическим нагрузкам. При интерпретации уровня экспрессии регуляторных генов NK-клеток врачам команд следует учитывать, что базальный уровень экспрессии для гена KIR2DL2 ниже 0,3 o.e., для гена PRF1-ниже 0,6 o.e. и для гена GZMB - ниже 0,15 o.e. у высококвалифицированных спортсменов. При этом наибольшая активация экспрессии генов свойственна спортсменам с высокими показателями физической выносливости.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шлепцова, В.А. Оценка иммунного статуса спортсменов на разных этапах тренировочного процесса / Н.В. Малюченко, М.А. Куликова, М.А. Тимофеева, A.M. Ведаков, А.Г. Тоневицкий И Вестник спортивной науки. - 2006. - №3. - С. 23-28.

2. Шлепцова, В.А. Изучение реактивации латентных инфекций у спортсменов в зависимости от этапа тренировочного процесса / Н.В. Малюченко, М.А. Куликова, М.А. Тимофеева, A.M. Ведяков, А.Г. Тоневицкий // Вестник спортивной науки. - 2006. - №4. - С. 28-33.

3. Шлепцова, В.А. Использование некоторых маркеров срочной адаптации иммунной системы для оценки переносимости физической нагрузки: методическое пособие / А.Е. Донников, В.А. Шлепцова; - М.: Издательство ВНИИФК, 2009. - 14с.

4. Шлепцова, В.А. Экспрессионное профилирование и предполагаемые механизмы устойчивости к доксорубицину клеток рака легкого человека. / Кашкин, К.Н., Е.А. Мусаткина, A.B. Комельков, И.А. Фаворская, Е.В. Трушкин, Д.А. Сахаров, Т.В Виноградова, Е.П. Копанцев, М.В. Зиновьева, О.В. Ковалёва, И.Б. Зборовская, А.Г. Тоневицкий, Е.Д. Свердлов // Доклады академии наук. - 2010. - №430(3). - С.412-415.

5. Шлепцова, В.А., Экспрессия ранних генов иммунного ответа при физической нагрузке / Е.В.Трушкин, O.A. Быстрых, Я.И. Давыдов, Н.П. Образцова, Е.С. Гребенюк, А.Г. Тоневицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - №148 (1). - С.97-100.

Подписано в печать 24.03.2010 Сдано в производство 25.03.

Формат бумаги 60x90/16 Бум.офсетная

Усл.печ.л. 0,8 Усл.-изд.л. 0,9

Тираж 100 Заказ № 641

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва ул. Палиха - 2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Оглавление диссертации Шлепцова, Варвара Андреевна :: 2010 :: Москва

Введение.

Глава I. Влияние физических нагрузок на состояние иммунной системы

1.1. Эффект регулярных интенсивных тренировок на клеточный состав иммунной системы.

1.2. Семейство герпесвирусов.

Глава II. Материалы, методы и организация исследования.

Собственные результаты

ГЛАВА III. Оценка состояния клеточного звена иммунной системы в зависимости от уровня физической выносливости.

3.1. Исследование исходного состояния клеточного звена иммунной системы в зависимости от уровня физической выносливости.

3.2. Состояние клеточного звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов под воздействием физической нагрузки.

3.3. Состояние клеточного звена иммунитета в период восстановления после физической нагрузки.

ГЛАВА IV. Поиск иммунологических генов, активирующихся под воздействием физической нагрузки.

Глава V. Изменение экспрессии генов активации цитотоксических клеток под воздействием физической нагрузки у высококвалифицированных спортсменов.

Введение диссертации по теме "Восстановительная медицина, спортивная медицина, курортология и физиотерапия", Шлепцова, Варвара Андреевна, автореферат

Актуальность

Исследования последних лет показали, что при систематическом воздействии физических факторов именно иммунная система в первую очередь участвует в формировании адаптации организма (Суздальницкий Р.С. Левандо В.А., 1998), которая опосредуется через активацию клеток иммунной системы, несущих цитотоксический потенциал — цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+) и субпопуляции NK-клеток (CD 16+, CD56+). Первыми под влиянием различных стрессовых воздействий, в том числе и физической нагрузки, активируются NK-клетки.

На сегодняшний день данные о влиянии физической нагрузки на активационные показатели иммунной системы противоречивы. Так, некоторые исследователи обнаружили увеличение фагоцитарной и цитотоксической активности в результате спортивных тренировок (Tvede N.J., 1991) (Nieman D.C., 2000), однако в других работах показано, что физическая нагрузка не влияет на цитотоксическую функцию NK-клеток (Суздальницкий Р.С. 2003) (Nieman D.C., 1993) (Nieman D.C., 1998) (Nieman D.C., 1990). Поэтому представляется важным выявить особенности механизмов регуляции цитотоксической функции NK-клеток при физической нагрузке. Одним из актуальных направлений поиска маркеров активации является изучение экспрессионного профиля белков как рецепторного аппарата, так и функциональных белков, играющих значительную роль на начальных этапах активации NK-клеток.

Стоит отметить, что большинство работ по спортивной иммунологии направлено на изучение изменения параметров иммунной системы людей под воздействием физической нагрузки вне зависимости от уровня их спортивной квалификации и степени подготовленности. В немногочисленных работах, посвященных сравнительному анализу иммунологических параметров у спортсменов и неподготовленных людей, учеными высказываются различные точки зрения. Так, в одних исследованиях показано, что пролиферация лимфоцитов в ответ на физическую нагрузку не отличается между этими двумя группами (Nieman D.C., 1995). В ряде других работ отмечается, что активность NK-клеток у более выносливых спортсменов выше, чем у нетренированных людей (Tvede N.J., 1991), хотя в других исследованиях полученные данные не подтверждаются (Baj Z., 1994) (Tvede N.J., 1991).

Значительное действие на активность цитотоксического потенциала оказывает наличие вирусной инфекции в организме (Lusso Р., 1993). Наиболее распространены латентные инфекции, вызываемые герпесвирусами, к которым относится вирус Эпштейн-Барр (ВЭБ, EBV) и вирус герпеса человека 6 типа (ВГЧ6, HHV6). В ряде исследований при изучении влияния наличия данных вирусов на показатели клеточного иммунитета отмечается увеличение количества клеток натуральных киллеров (NK-клеток) у спортсменов. С другой стороны, в некоторых работах описано значительное снижение количества клеток цитотоксического звена под воздействием интенсивных физических нагрузок у спортсменов-носителей ВЭБ (Gabriel Н.Н., 1998). При этом влияние вирусной нагрузки на состояние иммунитета в зависимости от уровня выносливости атлета не изучалось, хотя это является важным моментом для определения степени адаптации и восстановительной способности защитной системы организма спортсмена на протяжении его тренировочной деятельности.

Гипотеза

Адаптация к физическим нагрузкам у высококвалифицированных спортсменов приводит к изменению количественных и активационных показателей клеток цитотоксического звена иммунной системы.

Цель исследования

Разработка молекулярно-генетических диагностических критериев, характеризующих состояние цитотоксического звена иммунитета, для оценки адаптационных изменений организма высококвалифицированного спортсмена.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Оценить степень адаптационных изменений клеточного состава иммунной системы под воздействием физической нагрузки у высококвалифицированных спортсменов по сравнению с нетренированными людьми.

2. Осуществить выбор генов, вызывающих активацию иммунной системы при физической нагрузке у спортсменов. Сравнить особенности динамики экспрессии генов, участвующих в активации цитотоксического звена иммунитета, у высококвалифицированных спортсменов и неподготовленных людей до и после физической нагрузки, а также в период восстановления после нее.

3. Разработать диагностические маркеры адаптации цитотоксического звена иммунной системы на молекулярно-генетическом уровне у высококвалифицированных спортсменов на основании полученных данных.

Объект исследования

Предмет исследования

Состояние клеточного звена иммунной системы и экспрессии генов белков, регулирующих активацию цитотоксического звена иммунной системы под воздействием физической нагрузки.

Научная новизна

В работе изучены различия состояния цитотоксического звена иммунной системы между высококвалифицированными спортсменами и нетренированными людьми. Выявлено, что увеличение содержания цитотоксических клеток (цитотоксические Т-лимфоциты и NK-клетки) при физической нагрузке не зависит от уровня физической подготовленности. Описано влияние вирусной нагрузки на адаптацию цитотоксического звена иммунной системы при физической нагрузке и степень восстановления после нее у высококвалифицированных спортсменов.

Впервые изучены особенности иммунного реагирования на молекулярно-генетическом уровне у высококвалифицированных спортсменов до, после физической нагрузки и в период восстановления после нее. Выявлены изменения активности генов иммуноглобулинподобных рецепторов (KIR), функциональных белков перфорина 1 (PRF1) и гранзима В (GZMB) клеток, играющих значительную роль в развитии цитотоксического потенциала.

Определены прогностически значимые параметры цитотоксического звена иммунной системы, характеризующие высокую степень адаптации к физическим нагрузкам спортсменов.

Теоретическая значимость

Результаты исследования расширяют знания о влиянии интенсивной физической деятельности на протяжении нескольких лет на состояние иммунной системы. Показано, что иммунологические показатели являются информативными критериями для оценки физической подготовленности спортсмена. В работе найдены количественные и активационные маркеры цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированного спортсмена, что позволяет определить степень его адаптации к физической нагрузке, необходимой для поддержания здоровья атлета и повышения результативности спортсменов на соревнованиях.

Практическая значимость

Практическая значимость работы заключается в разработке молекулярно-генетических диагностических маркеров, характеризующих адаптационные изменения цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов.

Оценка экспрессии иммунологических генов необходима при разработке новых подходов к мониторингу состояния организма спортсмена в процессе тренировки и периода восстановления после нее.

Указанные в работе подходы могут быть использованы для коррекции учебно-тренировочного процесса атлетов и оценки степени их подготовленности к соревнованиям.

Результаты исследования внедрены в работу кафедры физического воспитания и спорта Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и ООО «Союз биатлонистов России», что подтверждено актами о внедрении.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Под воздействием физической нагрузки у спортсменов увеличивается количество лейкоцитов за счет лимфатического звена в отличие от нетренированных людей, у которых повышается содержание сегментоядерных нейтрофилов.

2. Высококвалифицированные спортсмены демонстрируют низкий базальный уровень экспрессии генов иммуноглобулинподобных рецепторов (KIR), перфорина 1(PRF1) и гранзима В (GZMB), ответственных за развитие цитотоксического ответа, по сравнению с нетренированными людьми.

3. Физическая нагрузка приводит к усиленной активации экспрессии генов KIR, PRF1 и GZMB. Выявлены достоверные различия в усилении экспрессии генов KIR2DL3, KIR2DS2, PRF1 между группой высококвалифицированных спортсменов и группой неподготовленных людей.

4. В период восстановления у высококвалифицированных спортсменов продолжается активация цитотоксического звена иммунной системы по генам KIR, PRF1 и GZMB, а у нетренированных людей стремится к исходному уровню, кроме генов рецепторов KIR2DL2 и KIR2DS2.

Заключение диссертационного исследования на тему "Адаптация цитотоксического звена иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов"

Выводы

1. Маркером уровня физической выносливости (МПК>65 л/мин/кг) является повышенное содержание клеток Т-лимфоцитов (1816+549 клеток/мкл) у высококвалифицированных спортсменов до воздействия физической нагрузки по сравнению с группой контроля (МПК<50 л/мин/кг) (1309+353 клеток/мкл).

2. Под воздействием физической нагрузки выявлено перераспределение клеточного состава с преобладанием клеток лимфоцитарного звена (51,9%) над нейтрофильным (37,4%) у высококвалифицированных спортсменов в отличие от группы контроля. Наибольшей чувствительностью к влиянию физической нагрузки обладают клетки лимфоцитарного звена (CD3+CD8+), (CD16+), (CD56+), несущие цитотоксический потенциал, вне зависимости от уровня физической выносливости.

3. Установлено влияние латентных инфекций на абсолютные показатели субпопуляций NK-клеток (CD 16+, CD56+), несущих цитотоксический потенциал, только в группе высококвалифицированных спортсменов. Наличие ВЭБ и ВГЧ6 способствуют более низкому увеличению количества NK-клеток (CD16+ - в 1,7 раза; CD56+ - в 1,6 раза) после физической нагрузки по сравнению с их отсутствием (CD 16+ - в 3,4 раза; CD56+ - в 3,6 раза). При наличии вирусов происходит значительное снижение количества NK-клеток ниже исходного уровня на 33% для (CD 16+) и на 47,5% для (CD56+) в течение восстановительного периода после нагрузки.

5. Уровень экспрессии генов функциональных белков — PRF1 и GZMB, а также гена KIR2DL2 у высококвалифицированных спортсменов до физической нагрузки снижен (в 9,5 раза; в 5,7 раза и в 5 раза соответственно) по сравнению с группой контроля, что характеризует адаптационные изменения при высоком уровне физической выносливости.

6. Состояние функциональных резервов организма у высококвалифицированных спортсменов характеризуется большим усилением экспрессии генов KIR2DL3, KIR2DS2, PRF1 (в 2,5 раза, 2,4 раза и 4,1 раза соответственно), чем в группе контроля. Восстановительный период у высококвалифицированных спортсменов характеризуется продолжением активации экспрессии генов KIR, PRF1 и GZMB.

Практические рекомендации

3. Мониторинг экспрессии генов, играющих роль в активации цитотоксических клеток, позволяет оценить степень адаптации иммунной системы к воздействию длительной физической деятельности. При интерпретации уровня экспрессии регуляторных генов цитотоксических клеток врачам команд следует учитывать, что базальный уровень экспрессии для гена KIR2DL2 0,8 о.е., для гена PRF1- 2,3 о.е. и для гена GZMB — 0,5 о.е. у высококвалифицированных спортсменов. Физическая нагрузка приводит к усилению активности генов KIR2DL3 в 2,5 раза,

KIR2DS2 в 2,4 раза и PRF1 в 4,1 раза. В период восстановления в течение 60 минут экспрессия генов KIR, PRF1 и GZMB продолжает расти спортсменов, что является проявлением адаптационных изменений в цитотоксическом звене иммунной системы у высококвалифицированных спортсменов.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Шлепцова, Варвара Андреевна

1. Афанасьева, И.А. Показатели Т-системы иммунитета у спортсменов при интенсивных тренировках./ И.А. Афанасьева // Ученые записки. 2007. -№1. - С.19-23.

2. Блохина, Е.Б. Роль латентной инфекции, вызванной вирусом Эпштейн-Барр, в развитии лимфопролиферативных заболеваний. / Е.Б. Блохина // Иммунология и иммунопатология. 2003. - №2. - С.65-70.

3. Бухарин, О-В. Характеристика иммунологической реактивности спортсменов / О.В. Бухарин, М.Я.Левин, А.П.Луда // теория и практика физической культуры. 1970. - №9. — С.26-27.

4. Воробьев, А.А. Иммунология и аллергология. / А.А.Воробьева, А.С.Быкова, А.В. Караулова М.: Изд. Практическая медицина, 2006. — 288с.

5. Галактионов, В.Г. Иммунология. М.: РИЦ МДК - 2000. - 488 с.

6. Гурцевич, В.Э., гены латентной инфекции Эпштейн-Барр (ВЭБ) и их роль в возникновение неоплазий. / В.Э. Гурцевич., Т.А. Афанасьева // Русский журнал. 1998. - №2. - С.68-75.

7. Данилюк, Н.К. Вирус Эпштейн-Барр и серодиагностика связанных с ним заболеваний // Информационный бюллетень "Новости "Вектор-Бест" — 2000. №4. - С.18.

8. Долгих, М.С. Вирус герпеса-6 (HHV-6) у иммунодефицитных пациентов. Часть 1. / М.С. Долгих // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001. - №1. - С.51-55.

9. Долгих, М.С. Вирус герпеса-6 (HHV-6) у иммунодефицитных пациентов. Часть 2. / М.С. Долгих // Вестник трансплантологии иискусственных органов. 2002. - №2. - С.50-55.

10. Жибурт, Е.Б. Метод диагностики инфекции вирусом Эпштейна-Барр / Е.Б. Жибурт, Н.Б. Серебряная, А.И. Ионова // Вопр. вирусологии.- 1996.-№4.- С.185-187.

11. Заблоцкая, С.Г. Лабораторная диагностика инфекций, вызванной вирусом Эпштейн-Барр. / С.Г. Заблоцкая, Н.М. Шевченко, И.А. Ольховский // Бюллетень лабораторной службы. 2002. - №10. - С.10-15.

12. Зарецкая, Ю.М. Система киллеро-иммуноглобулинподобных рецепторов на натуральных киллерах / Ю.М. Зарецкая, Ю.А. Леднев // Гематология и трансфузиология. 2008. - №1. - С.28-32.

13. Зуева, Е.Е. Иммунофенотипипрование в диагностике острых лейкозов. // Российский биомедицинский журнал. 2003. - №132. - С.471-478.

14. Лыков, А. П. Цитотоксическая активность клеток крови у больных раком желудка с различной активностью нервной системы. //Иммунология, 2000 №6. - С.5-9.

15. Масленникова, Ю.Л. Состояние иммунного статуса лиц с разным уровнем физической работоспособности. / Ю.Л. Масленникова, П.В. Михайлов, И.А Осетров // ярославский педагогический вестник. Серия Естественные науки. 2009. - №1. - С.84-87.

16. Перминова, Н.Г. Вирус герпеса 6-го типа (HHV6): современное состояние вопроса / Н.Г. Перминова, И. В. Тимофеев, Т.Ф. Палецкая, Ф.З. Максытов, Е.М. Кожина // Вестник РАМН. 1998. - № 4. - С.21-24.

17. Пинегин, Б. В. NK-клетки: свойства и функции / Пинегин, С. В. Дамбаева // Иммунология. 2007. - №2. - С. 105-113.

18. Потемкина, Е.Е. Пособие по лабораторной клинической иммунологии с курсом практических занятий. / Потемкина Е.Е, Р.З. Позднякова, JI.M. Манукян М.:Изд. Российского университета дружбы народов, 2003. 24 с.

19. Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Л.Мейл М.: Мир, 2000. - 592 с.

20. Семенков, В.Ф. Иммуногеронтология / В.Ф. Семенков, В.И. Карандашов, JI.B. Ковальчук М.: Изд. Медицина, 2005. 208 с.

21. Суздальницкий, Р.С. иммунологические аспекты спортивной деятельности человека. / Р.С. Суздальницкий, В.А.Левандо // Теория и практика физической культуры. 1998. - №10. - С.43-46.

22. Суздальницкий, Р.С. Новые подходы к понимаю спортивных стрессовых иммунодефицитов. / Р.С. Суздальницкий, В.А. Левандо // Теория и практика физической культуры. 2003. - №1. - С. 18.

23. Суркина, И.Д. Стресс и иммунитет у спортсменов // Теория и практика физ. культуры. 1981. - № 3. - С. 18-20.

24. Таймазов, В.А. Спорт и иммунитет / В.А.Таймазов, В.Н.Цыган, Е.Г. Мокеева. СПб.Юлимп СПб, 2003. - 200 с.

25. Футорный, С.М. Иммунологическая реактивность спортсменок как одно из направлений современной спортивной медицины // Научно-технический журнал 2004.- №1. - С.1- 4.

26. Чекнев, С.Б. Популяционная динамика противоопухолевой активности естественных киллеров человека. / С.Б. Чекнев, А .Я. Кульберг // Иммунология. 1995 - №2.- С.9-12.

27. Чередеев, А.Н. CD-маркеры в практикеклинико-диагностических лабораторий / А.Н. Чередеев, Н.К. Горлина, И.Г. Козлов // Клиническая лабораторная диагностика. — 1999. №6. — С.25-31.

28. Шубик В.М. Иммунитет у спортсменов // Теория и практика физ. культуры. 1988. № 7. - С.28-32.

29. Шувалова, Е.П. Инфекционные болезни. М.: Медицина, 1999. - С. 368-373.

30. Abdel-Haq, N.M. Human herpesvirus 6 (HHV6) infection. / N.M. Abdel-Haq B.I Asmar. // Indian J Pediatr. 2004. - 71(1). - P.89-96.

31. Adamson, A.L. Epstein-Barr virus BZLF1 protein binds to mitotic chromosomes. / A.L.Adamson //J Virol. 2005. - 79(12). - P.7899-7904.

32. Baj, Z. Immunological status of competitive cyclists before and after the training season. / Z.Baj, J. Kantorski, E. Majewska, K. Zeman, L. Pokoca, E. Fornalczyk, H. Tcho'rzewski, Z. Sulowska, R. Lewicki // Int J Sports Med. -1994.- 15(6).-P.319-324.

33. Barrow, A.D. You say IT AM and I say ITIM, let's call the whole thing off: the ambiguity of immunoreceptor signalling. / A.D. Barrow, J.Trowsdale // Eur J Immunol . 2006. - 36(7). - P.1646-1653.

34. Bell, G.M. Association of Src-like protein tyrosine kinases with the CD2 cell surface molecule in rat T lymphocytes and natural killer cells. / G.M. Bell, J.B. Bolen, J.B. Imboden // Mol Cell Biol. 1992. - 12(12). - P.5548-5554.

35. Berk, L.S. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. / L.S. Berk, D.C. Nieman, W.S. Youngberg, K. Arabatzis, M. Simpson-Westerberg, J.W. Lee, S.A. Tan, W.C.Eby // Med Sci Sports Exerc. 1990.-22(2). -P.207-212.

36. Blum, K.S. Lymphocyte numbers and subsets in the human blood. Do they mirror the situation in all organs? / K.S. Blum, R. Pabst // Immunol Lett. -2007.-108(1).-P.45-51.

37. Bornkamm, G.W. Molecular virology of Epstein-Barr virus. / G.W.

38. Bornkamm, W.Hammerschmidt // Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci. -2001. 356(1408). - P.437-459.

39. Bouget, M. Relationships among training stress, mood and dehydroepiandrosterone sulphate/cortisol ratio in female cyclists. / M.Bouget, M. Rouveix, O. Michaux, J.M. Pequignot, E.Filaire // J Sports Sci. 2006. -24(12). - P. 1297-1302.

40. Boyton, R.J. Natural killer cells, killer immunoglobulin-like receptors and human leucocyte antigen class I in disease. / RJ.Boyton, D.M. Altmann // Clin Exp Immunol. 2007. - 149(1). - P. 1-8.

41. Bryceson, Y.T. Activation, coactivation, and costimulation of resting human natural killer cells. / Y.T. Bryceson, M.E. March, H.G. Ljunggren. E.O. Long // Immunol Rev. 2006. - 214. - P.73-91.

42. Caligiuri, M.A. Human natural killer cells./M.A. Caligiuri//Blood. -2008. -112(3). -P.461-469.

43. Campbell, K.S. Tyrosine phosphorylation of a human killer inhibitory receptor recruits protein tyrosine phosphatase 1С. / K.S. Campbell, M. Dessing, M. Lopez-Botet, M. Cella, M. Colonna // J Exp Med. 1996. -184(1).-P.93-100.

44. Cerwenka, A. Natural killer cells, viruses and cancer. / A. Cerwenka, L.L Lanier. // Nat Rev Immunol. 2001. - 1(1). - P.41-49.

45. Chan, H.W. Epigenetic control of highly homologous killer Ig-like receptor gene alleles. / H.W. Chan, J.S. Miller, M.B. Moore, C.T. Lutz // J Immunol. -2005. 175(9). - P.5966-5974.

46. Cheent, K. Natural killer cells: integrating diversity with function. / K. Cheent, S.I.Khakoo // Immunology. 2009. - 126(4). - P.449-457.

47. Clayberger, C. Cytolytic molecules in rejection. / C.Clayberger // Curr Op in Organ Transplant. 2009,- 14(1). - P.30-33

48. Cohen, J.I. The biology of Epstein-Barr virus: lessons learned from the virus and the host. / J.L Cohen // Curr Opin Immunol. 1999. - 11(4). - P.365-370.

49. Colonna, M. Cloning of immunoglobulin-superfamily members associated with HLA-C and HLA-B recognition by human natural killer cells. / M. Colonna, J.Samaridis // Science. 1995.-268(5209). - P.405-408.

50. Cooper, M.A. The biology of human natural killer-cell subsets. / M.A. Cooper, T.A. Fehniger, M.A.Caligiuri // Trends Immunol. 2001. - 22(11). -P.633-640.

51. Cooper, M.A NK cell and DC interactions./ M.A. Cooper, T.A. Fehniger, A. Fuchs, M. Colonna, M.A.Caligiuri // Trends Immunol. 2004. - 25(1). - P.47-52.

52. Cooper, M.A. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. / M.A. Cooper, T.A. Fehniger, S.C. Turner, K.S. Chen, B.A. Ghaheri, T. Ghayur, W.E. Carson, MA.Caligiuri // Blood. -2001. 97(10). - P.3146-3151.

53. Cruchley, A.T. Epstein-Barr virus: biology and disease. / A.T. Cruchley, D.M. Williams, G. Niedobitek, L.S.Young // Oral Dis. 1997. - Suppl 1. -P.S156-163.

54. Cullen, S.P. Mechanisms of granule-dependent killing./ S.P. Cullen, Martin SJ. // Cell Death Differ. 2008. - 15(2). - P.251-262.

55. Diefenbach, A. Rael and H60 ligands of the NKG2D receptor stimulate tumour immunity. / A. Diefenbach, E.R. Jensen, A.M. Jamieson, D.H.Raulet // Nature. 2001.-413(6852). - P. 165-171.

56. Djeu, J.Y. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and natural killer-cell phenomenon. / J.Y. Djeu // J Am Vet Med Assoc. 1982. - 181(10). -P. 1043-1048.

57. Dockrell, D.H. Human herpesvirus 6: molecular biology and clinical features. /D.H. Dockrell//J Med Microbiol. 2003. - 52(Ptl).-P.5-18.

58. Doehring, C. Alternatively spliced forms of human killer inhibitory receptors. / C.Doehring, J. Samaridis, M. Colonna // Immunogenetics. 1996. - 44(3). - P.227-230.

59. Ekblom, B. Infectious episodes before and after a marathon race. / B. Ekblom, O. Ekblom, C. Malm // Scand J Med Sci Sports. 2006. - 16(4). - P.287-293.

60. Farag, S.S. Human natural killer cell development and biology. / S.S. Farag, M.A. Caligiuri // Blood Rev. 2006. - 20(3). - P. 123-137.

61. Freud, A.G. Human natural killer cell development. / A.G. Freud, M.A.Caligiuri // Immunol Rev. 2006. - 214. - P.56-72.

62. Gabriel, H.H. Overtraining and immune system: a prospective longitudinal study in endurance athletes. / H.H. Gabriel, A. Urhausen, G. Valet, U. Heidelbach, W. Kindermann // Med Sci Sports Exerc. 1998. - 30(7). -P.1151-1157.

63. Galandrini, R. Tyrosine kinase-dependent activation of human NK cell functions upon triggering through CD44 receptor. / R. Galandrini, M. Piccoli, L. Frati, A. Santoni // Eur J Immunol. 1996. - 26(12). - P.2807-2811.

64. Galy, A. Human T, B, natural killer, and dendritic cells arise from a common bone marrow progenitor cell subset. / A. Galy, M. Travis, D. Cen, B.Chen // Immunity. 1995. -3(4). - P.459-473.

65. Gannon, G.A. Circulating levels of peripheral blood leucocytes and cytokines following competitive cycling. / G.A. Gannon, S.G. Rhind, M. Suzui, P.N. Shek, RJ. Shephard //Can J Appl Physiol. 1997.-22(2). - P.133-147.

66. Gardiner, C.M. Killer cell immunoglobulin-like receptors on NK cells: the how, where and why. / C.M .Gardiner // Int J Immunogenet. 2008. - 35(1). -P.l-8.

67. Gleeson, M. Immune system adaptation in elite athletes. / M. Gleeson // Сип-Орт Clin Nutr Metab Care. 2006. - 9(6). - P.659-665.

68. Groh, V. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. / V. Groh, R. Rhinehart, J. Randolph

69. Habecker, M.S. Topp, S.R. Riddell, T. Spies // Nat Immunol. 2001. - 2(3). -P.255-260.

70. Hanna, J. Novel insights on human NK cells' immunological modalities revealed by gene expression profiling. / J. Hanna, P. Bechtel, Y. Zhai, F. Youssef, K. McLachlan, O. Mandelboim // J Immunol. 2004. - 173(11). -P.6547-6563.

71. Heath, G.W. Exercise and the incidence of upper respiratory tract infections. / G.W. Heath, E.S. Ford, T.E .Craven, C.A. Macera, K.L. Jackson, R.R. Pate // Med Sci Sports Exerc. 1991. - 23(2). - P. 152-157.

72. Hess, R.D. Routine Epstein-Barr vims diagnostics from the laboratory perspective: still challenging after 35 years. / R.D. Hess // J Clin Microbiol. -2004.-42(8). P.3381-3387.

73. Horn, P.L. Expression of CD94 and 56(bright) on natural killer lymphocytes -the influence of exercise. / P.L. Horn, Leeman К Pyne DB Gore CJ. // Int J Sports Med. 2002. - 23(8). - P.595-599.

74. Hsu, K.C. The killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genomic region: gene-order, haplotypes and allelic polymorphism. / K.C. Hsu, S. Chida, D.E. Geraghty, B. Dupont // Immunol Rev . 2002. - 190. - P.40-52.

75. Huggett, J. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. / K.Dheda, S. Bustin, A. Zumla // Genes Immun. 2005. - 6(4). - P.279-284.

76. Jacobs, R. CD56bright cells differ in their KIR repertoire and cytotoxic features from CD56dim NK cells. / G. Hintzen, A. Kemper, K. Beul, S.Kempf, G. Behrens, K.W. Sykora, R.E. Schmidt // Eur J Immunol. 2001. - 31(10). - P.3121-32-127.

77. Janas, M.L. IL-2 regulates perforin and granzyme gene expression in CD8+ T cells independently of its effects on survival and proliferation. / P. Groves, N. Kienzle, A. Kelso // J Immunol. 2005. - 175(12). - P.8003-8010.

78. Jiang, K. Pivotal role of phosphoinositide-3 kinase in regulation of cytotoxicity in natural killer cells. / B. Zhong., D.L. Gilvary, B.C Corliss, E.Hong-Geller, S. Wei, J.Y Djeu. // Nat Immunol. 2000. - 1(5). - P.419-425.

79. Kaerre, K. Selective rejection of Н-2-deficient lymphoma variants suggests alternative immune defence strategy. 1986./ K. Kaerre, H.G. Ljunggren, G. Piontek, R. Kiessling // J Immunol. 2005. - 174(11). - P.6566-6569.

80. Kiessling, R. "Natural" killer cells in the mouse. II. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Characteristics of the killer cell. / E. Klein, H. Pross, H. Wigzell // Eur J Immunol. 1975. - 5(2). - P.l 17-121.

81. KoelIe, D.M. Markers of viral infection in monozygotic twins discordant for chronic fatigue syndrome./ D.M. Koelle, S. Barcy, M.L. Huang, R.L. Ashley, L.Corey, J. Zeh, S. Ashton, Buchwald D. // Clin Infect Dis. 2002. - 35(5). -P.518-525.

82. Kragsbjerg, P. Chronic active mononucleosis. // Scand J Infect Dis. 1997. — 29(5).-P.517-518.

83. Kroemer, G. The mitochondrion as an integrator/coordinator of cell death pathways. // Cell Death Differ. 1998. - 5(6). - p. 547.

84. Lanier, L.L. Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition. // Nat Immunol. 2008. - 9(5). - P.495-502.

85. Lanier, L.L. Arousal and inhibition of human NK cells. / Corliss В Phillips JH // Immunol Rev. 1997. - 155. - P. 145-154.

86. Lanier, L.L. The relationship of CD 16 (Leu-11) and Leu-19 (NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes. / Le AM Civin CI Loken MR Phillips JH. // J Immunol. 1986. - 136(12). -P.4480-4486.

87. Lanier, L.L. Analysis of Fc gamma RIII (CD16) membrane expression and association with CD3 zeta and Fc epsilon Rl-gamma by site-directed mutation. / Yu G Phillips JH. //J Immunol. 1991. - 146(5). - P.1571-1576.

88. Leandro, C.G. Adaptative mechanisms of the immune system in response to physical training. / C.G. Leandro, de Castro R. M. Nascimento E. Pithon-Curi Т. C. and Curi R. // Rev Bras Med Esporte . 2007. - 13(5). - P.31 le-316e.

89. Lee, N. HLA-E is a major ligand for the natural killer inhibitory receptor CD94/NKG2A. / N. Lee, M.Llano, M.Carretero, A. Ishitani, F. Navarro, M. Lo'pez-Botet, D.E. Geraghty // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. 95(9). -P.5199-5204.

90. Ljunggren, H.G. In search of the 'missing self: MHC molecules and NK cell recognition. / H.G.Ljunggren, K.Karre // Immunol Today. 1990. — 11(7). -P.237-244.

91. Lopez-Botet, M. The CD94/NKG2 C-type lectin receptor complex. / Lopez-Botet M., M. Carretero Bellon, T. Perez-Villar, J.J. Llano, M. Navarro // Curr Top Microbiol Immunol. 1998. - 230. - p. 41-52.

92. Lusso, P. Infection of natural killer cells by human herpesvirus 6. / M.S. Malnati, A. Garzino-Demo, R.W. Crowley, E.O. Long, R.C. Gallo // Nature. -1993. 362(6419). - P.458-462.

93. Mackinnon, L.T. Chronic exercise training effects on immune function. // Med Sci Sports Exerc. 200. - 32(Suppl.7). - P.S369-376.

94. Mathai, E. Fallacies in the interpretation of Paul-Bunnel Davidsohn differential test. / E.Mathai, J.C. Shastry, K.N. Brahmadathan, G. Koshi // Indian J Pathol Microbiol. 1992. - 35(2). - P. 103-107.

95. Middleton, D. Natural killer cells and their receptors. / D. Middleton, M. Curran, L. Maxwell // Transpl Immunol. 2002. - 10(2-3). - P.147-164.

96. Mignini, F. Leucocyte subset redistribution in a human model of physical stress. / F.Mignini, E. Traini, D. Tomassoni, M. Vitali, V. Streccioni // Clin

97. Exp Hypertens. 2008. - 30(8). - P.720-731.

98. Moretta, A. Activating receptors and coreceptors involved in human natural killer cell-mediated cytolysis. / A.Moretta, . Bottino, M. Vitale, D. Pende, C. Cantoni, M.C. Mingari, R. Biassoni, L. Moretta // Annu Rev Immunol. -2001.- 19.-P. 197-223.

99. Moretta, L. Effector and regulatory events during natural killer-dendritic cell interactions. / L.Moretta, G. Ferlazzo, C. Bottino, M. Vitale, D. Pende, M.C. Mingari, A. Moretta//Immunol Rev. 2006. - 214. - P.219-228.

100. Multhoff, G. Activation of natural killer cells by heat shock protein 70. // Int J Hyperthermia. 2009. - 25(3). - P. 169-175.

101. Nagatomi, R. The implication of alterations in leukocyte subset counts on immune function. // Exerc Immunol Rev. 2006. - 12. - P.54-71.

102. Nagler, A. Comparative studies of human FcRIII-positive and negative natural killer cells. / A. Nagler, L.L. Lanier, S. Cwirla, J.H. Phillips // J Immunol. -1989.- 143(10). -P.3183-3191.

103. Nakata, M. Expression of perforin and cytolytic potential of human peripheral blood lymphocyte subpopulations. / M.Nakata, A. Kawasaki, M. Azuma, K.

104. Tsuji, H. Matsuda, Y. Shinkai, H. Yagita, K.Okumura // Int Immunol. 1992. -4(9).-P. 1049-1054.

105. Nandi, D. CD28-mediated costimulation is necessary for optimal proliferation of murine NK cells. / D. Nandi, J.A. Gross, J.P.Allison // J Immunol. 1994. -152(7). - P.3361-3369.

106. Nieman, D.C. Influence of carbohydrate on the immune response to intensive, prolonged exercise. // Exerc Immunol Rev. 1998. - 4. - P.64-67.

107. Nieman, D.C. Special feature for the Olympics: effects of exercise on the immune system: exercise effects on systemic immunity. // Immunol Cell Biol. -2000.-78(5).-P.496-501.

108. Nieman, D.C. Immune function in athletes versus nonathletes. / D.C Nieman, D. Brendle, D.A. Henson, J. Suttles, V.D. Cook, B.J. Warren, D.E. Butterworth, O.R. Fagoaga, S.L. Nehlsen-Cannarella // Int J Sports Med. -1995.- 16(5).-P.329-333.

109. Nieman, D.C. Physical activity and immune function in elderly women. / D.C. Nieman, D.A. Henson, G. Gusewitch, B.J. Warren, R.C. Dotson, D.E. Butterworth, S.L. Nehlsen-Cannarella // Med Sci Sports Exerc. 1993. -25(7).-P.823-831.

110. Nieman, D.C. Infectious episodes in runners before and after the Los Angeles Marathon. / D.C. Nieman, L.M. Johanssen, J.W. Lee, K. Arabatzis // J Sports Med Phys Fitness. 1990. - 30(3). - P.316-328.

111. Nieman, D.C. Immune function in female elite rowers and non-athletes. /

112. D.C. Nieman, S.L. Nehlsen-Cannarella, O.R. Fagoaga, D.A. Henson, M. Shannon, J.M. Hjertman, R.L. Schmitt, M.R. Bolton, M.D. Austin, B.K. Schilling Thorpe R. // Br J Sports Med. 2000. - 34(3). - P. 181-187.

113. Nieman, D.C. Immune response to exercise training and/or energy restriction in obese women. / D.C. Nieman, S.L Nehlsen-Cannarella, D.A. Henson, A.J. Koch, D.E. Butterworth, O.R. Fagoaga, A. Utter // Med Sci Sports Exerc. -1998.-30(5).-P.679-686.

114. Oldham, R.K. Natural killer cells: artifact to reality: an odyssey in biology. // Cancer Metastasis Rev. 1983. - 2(4). - P.323-336.

115. Ouyang, Q. Telomere length in human natural killer cell subsets. / Q.Ouyang, G. Baerlocher, I.Vulto, P.M. Lansdorp // Ann N Y Acad Sci. 2007. - 1106. -P.240-252.

116. Parham, P. Killer cell immunoglobulin-like receptor diversity: balancing signals in the natural killer cell response. // Immunol Lett. 2004. - 92(1-2).1. P.ll-13.

117. Parihar, R. IL-12 enhances the natural killer cell cytokine response to Ab-coated tumor cells. / R. Parihar, J, Dierksheide, Hu Y, W.E. Carson // J Clin Invest. 2002. - 110(7). - P.983-992.

118. Pedersen, B.K. Exercise and the immune system: regulation, integration, and adaptation. / B.K. Pedersen, L. Hoffman-Goetz // Physiol Rev. 2000. -80(3). -P.1055-1081.

119. Pedersen, B.K. NK cell response to physical activity: possible mechanisms of action. / B.K. Pedersen, H. Ullum // Med Sci Sports Exerc. 1994. - 26(2). -P.140-146.

120. Pegtel, D.M. Epstein-Barr virus infection in ex vivo tonsil epithelial cell cultures of asymptomatic carriers. / D.M. Pegtel, J. Middeldorp, D.A.Thorley-Lawson // J Virol. 2004. - 78(22). - P. 12613-12624.

121. Pereira, C.M. Human herpesvirus 6 in oral fluids from healthy individuals. / C.M.Pereira, P.F. Gasparetto, M.E. Correa, F.F.Costa, O.P. de Almeida, M.L. Barjas-Castro // Arch Oral Biol. 2004.-49(12). - P. 1043-1046.

122. Podack, E.R. Pore formers of the immune system. / E.R. Podack, V. Deyev, M. Shiratsuchi // Adv Exp Med Biol. 2007. - 598. - P.325-341.

123. Poli, A. CD56bright natural killer (NK) cells: an important NK cell subset. / A. Poli, T. Michel, M.Theresine, E. Andres, F. Hentges, J. Zimmer // Immunology. 2009. - 126(4). - P.458-465.

124. Rabson, A. Royt. Really Essential Medical Immunology. /1. Roitt, P. Delves // Blackwell Publishing Ltd., 2005. 224 p.

125. Rhind, S.G. Differential expression of interleukin-2 receptor alpha and beta chains in relation to natural killer cell subsets and aerobic fitness. / S.G. Rhind, P.N. Shek, S. Shinkai, R.J. Shephard. //Int J Sports Med. 1994. - 15(6). -P.311-318.

126. Rickinson, A.B. Epstein-Barr Virus In: Fields. Lippincott-Raven Publishers.: Philadelphia, 1996. -P.2397-2446.

127. Salcedo, T.W. Physical and functional association of p561ck with Fc gamma RIIIA (CD 16) in natural killer cells. / T,W. Salcedo, T. Kurosaki, P. Kanakaraj, J.V. Ravetch, B.Perussia//J Exp Med. 1993. - 177(5). - P.1475-1480.

128. Selvakumar, A. NK cell receptor gene of the KIR family with two IG domains but highest homology to KIR receptors with three IG domains. / A. Selvakumar, U.Steffens, B. Dupont // Tissue Antigens. 1996. - 48(4 Ptl.). - P.285-294.

129. Sewell, W.A. Molecular cloning of the human T-lymphocyte surface CD2 (Til) antigen. / W.A. Sewell, M.H. Brown, J. Dunne, M.J. Owen, M,J. Crumpton. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1986. 83(22). - P.8718-8722.

130. Shah, M.H A phase I study of ultra low dose interleukin-2 and stem cell factor in patients with HIV infection or HIV and cancer. / M.H. Shah, A.G.

131. Freud, D.M. Benson, A.K. Jr Ferkitich, B.J.Dezube, Z.P. Bernstein, M.A. Caligiuri // Clin Cancer Res. 2006. - 12(13). - P.3993-3996.

132. Shilling, H.G. Genetic control of human NK cell repertoire. / H.G. Shilling, N. Young, L.A. Guethlein, N.W. Cheng, C.M. Gardiner, D. Tyan, P. Parham.// J Immunol. 2002. - 169(1). - P.239-247.

133. Shimizu, K. Effect of moderate exercise training on T-helper cell subpopulations in elderly people. / K. Shimizu, F. Kimura, T.Akimoto, T.Akama, K. Tanabe, T. Nishijima, S. Kuno, I.Kono // Exerc Immunol Rev. -2008. 14.-P.24-37.

134. Silver, N. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR. / N. Silver, S.Best, J. Jiang, S.L. Thein // BMC Mol Biol. 2006. - 7. -P.l-9.

135. Smyth, G. K. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. / G. K. Smyth / New York: Springer, 2005. 473 p.

136. Sobanov, Y. Linkage of the NKG2 and CD94 receptor genes to D12S77 in the human natural killer gene complex. / Y. Sobanov, J.Glienke, C. Brostjan, H. Lehrach, F. Francis, E. Hofer // Immunogenetics. 1999. - 49(2). - P.99-105.

137. Solomon, K.R. Expression of GPI-anchored complement regulatory proteins CD55 and CD59 differentiates two subpopulations of human CD56+ CD3-lymphocytes (NK cells). / K.R. Solomon, M. Chan, R.W. Finberg. // Cell Immunol. 1995. - 165(2). - P.294-301.

138. Stone, A.A. Secretory IgA as a measure of immunocompetence / A.A. Stone, D.S.Cox, H. Valdimarsdottir, J.M. Neale // J Human Stress. 1987. - 13(3). -P.136-140.

139. Straus, S.E. NIH conference. Epstein-Barr virus infections: biology, pathogenesis, and management. / S.E. Straus, J.L Cohen, G. Tosato, J. Meier // Ann Intern Med. 1993. - 118(1). - P.45-58.

140. Suzuki, Y. Human herpesvirus 6 infection as a risk factor for the development of severe drug-induced hypersensitivity syndrome. / Y. Suzuki, R.Inagi, T.Aono, K.Yamanishi, T.Shiohara // Arch Dermatol. 1998. - 134(9). -P.1108-1112.

141. Timmons, B.W. Evidence of sex-based differences in natural killer cell responses to exercise and carbohydrate intake in children. / B.W. Timmons, O. Bar-Or // Eur J Appl Physio/. 2007. - 101(2). - P.233-240.

142. Timmons, B.W. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. / B.W. Timmons, T. Cieslak // Exerc Immunol Rev. 2008. - 14. -P.8-23.

143. Timmons, B.W. Sex-based effects on the distribution of NK cell subsets in response to exercise and carbohydrate intake in adolescents. / B.W. Timmons, M.A. Tarnopolsky, O. Bar-Or // J Appl Physiol. 2006. - 100(5). - P.1513-1519.

144. Timmons, B.W. Puberty effects on NK cell responses to exercise and carbohydrate intake in boys. / B.W.Timmons, M.A. Tarnopolsky, D.P. Snider, O. Bar-Or // Med Sci Sports Exerc. 2006. - 38(5). - P.864-874.

145. Trowsdale, J. The genomic context of natural killer receptor extended gene families. / J. Trowsdale, R. Barten, A.Haude, C.A.Stewart, S.Beck, M.J. Wilson. // Immunol Rev . 2001. - 181. - P.20-38.

146. Tvede, N. J. Cellular immunity in highly-trained elite racing cyclists and controls during periods of training with high and low intensity. / N. J. Tvede, B. Steensberg, J. Baslund, H. Kristensen and В. K. Pedersen // 1991. -1(3). -P.163-166

147. Vilches, C. Discovery of two novel variants of KIR2DS5 reveals this gene to be a common component of human KIR 'B' haplotypes. / C. Vilches, M.J. Pando, R. Rajalingam, C.M. Gardiner , P.Parham // Tissue Antigens. 2000. — 56(5). -P.453-456.

148. Vilches, C. KIR: diverse, rapidly evolving receptors of innate and adaptive immunity. / C. Vilches, P. Parham // Annu Rev Immunol. 2002. - 20. -P.217-251.

149. Vilches, C. KIR2DL5, a novel killer-cell receptor with a D0-D2 configuration of Ig-like domains. / C.Vilches, R.Rajalingam, M.Uhrberg, C.M. Gardiner, N.T. Young, P. Parham // J Immunol. 2000. - 164(11). - P.5797-5804.

150. Vivier, E. Natural killer cell signaling pathways. / E.Vivier, J.A. Nunes, F. Ve'ly // Science. 2004. -306(295). - P.1517-1519.

151. Wendt, K. Gene and protein characteristics reflect functional diversity of CD56dim and CD56bright NK cells. / K. Wendt, .E Wilk, S. Buyny, J.Buer, R.E. Schmidt, R. Jacobs // J Leukoc Biol. 2006. - 80(6). - P. 1529-1541.

152. Wilson, M.J. Plasticity in the organization and sequences of human KIR/ILT gene families. / M.J. Wilson, M. Torkar, A. Haude, S. Milne, T. Jones, D.Sheer, S. Beck, J. Trowsdale // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. - 97(9). -P.4778-4783.

153. Wilson, M.J. Genomic organization of a human killer cell inhibitory receptor gene. / M.J. Wilson, M. Torkar. J. Trowsdale // Tissue Antigens. 1997. -49(6). - P.574-579.

154. Wu, J. An activating immunoreceptor complex formed by NKG2D and DAP 10. / J. Wu, Y. Song, A.B. Bakker, S. Bauer, T. Spies, L.L. Lanier, J.H. Phillips // Science. 1999. - 285(5428). - P.730-732.

155. Yao, Q.Y. In vitro analysis of the Epstein-Barr virus: host balance in long-term renal allograft recipients. / Q.Y. Yao, A.B. Rickinson, J.S .Gaston, M.A. Epstein. // Int J Cancer. 1985. - 35(1). - P.43-49.

156. Yoshikawa, T. Fatal acute myocarditis in an infant with human herpesvirus 6 infection. / T. Yoshikawa, M. Ihira, K. Suzuki, S. Suga. H. Kito, T. Iwasaki, T. Kurata, T. Tanaka, Y. Saito, Y. Asano // J Clin Pathol. 2001. - 54(10). -P.792-795.

157. Zhou, F. Perforin: more than just a pore-forming protein. // Int Rev Immunol. 2010. - 29(1). - P.56-76.

158. Внедрения результатов научно-исследовательской работы

159. Объект внедрения: Методика определения наличия латентных инфекций (вирус Эпштейн-Барр, вирус герпеса б типа) для оценки функционального состояния спортсмена.

160. Место внедрения: Кафедра физического воспитания и спорта Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова.

161. Зам. Научного руководителя научно-образовательного центра МГУ, к.п.н./с5?

162. Директор Федерального Государственного Учреждения ^^^^щроссийский научно-исследовательский N '".Т.^.'^дс^^ут физической культуры и спорта» 7^Т0Ш>И0 логических наук,- член-корр. РАНl.COo'H? f Л1. V о ^ Vs л А \о 6 \ ^ ^ря 2009 г.1. А.Г. Тоневицкий

163. Внедрения результатов научно-исследовательской работы

164. Объект внедрения: Методика определения функциональной подготовленности спортсменов на основании изучения соотношения лейкоцитарных популяций при физической нагрузке.

165. Место внедрения: ООО «Союз биатлонистов России».

166. Эффект внедрения: Данная методика дает возможность точно определить уровень адаптационных изменений организма спортсмена к воздействию физической нагрузки, что значительно улучшает производительность тренировок.

167. Исполнительный директор ООО «Союз биатлонистов России»гА РОсЖ1. Кущенко С.В.