Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Совершенствование способов анализа и обоснование состава лекарственных форм, содержащих ципрофлоксацина гидрохлорид

На правах рукописи

ГОНЯН СМБАТ АРШАМОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ АНАЛИЗА И ОБОСНОВАНИЕ СОСТАВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ СОДЕРЖАЩИХ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА ГИДРОХЛОРИД

15.00.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск-2004

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ПЯТИГОРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ АКАДЕМИИ

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

доктор фармацевтических наук, профессор Гаврилин Михаил Витальевич доктор фармацевтических наук, профессор Денисенко Олег Николаевич кандидат фармацевтических наук Кичев Дмитрий Геннадиевич Институт контроля лекарственных средств ФГУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения"

Защита состоится 2004 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.069.01 при Пятигорской государственной фармацевтической академии (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорской государственной фармацевтической академии

Автореферат разослан "26" апреля 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор

V

Е. В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы: В современном арсенале антимикробных химиотерапевтических средств важное место принадлежит синтетическим лекарственным препаратам фторхинолонового ряда. Чрезвычайно высокая активность и широкий спектр действия фторхинолонов поддерживают постоянный интерес к работам, имеющим своей целью модификацию структуры фторхинолонов или синтез новых хинолоновых производных, способных ингибировать ДНК-гиразу.

С 1983 года в Англии издаётся журнал Quinolones Bulletin, в котором постоянно публикуются результаты исследований только этой группы антимикробных средств.

В настоящее время более 30 производных фторхинолонов либо освоены промышленностью, либо находятся на одной из стадий клинических испытаний. Однако наиболее часто применяемым лекарственным препаратом является цинрофлоксацин, вошедший в число мировых "блокбастеров", объём продаж которого превысил сумму в 1 миллиард долларов.

При этом в литературе имеются данные, что у ципрофлоксацина наиболее эффективно выражена антибактериальная активность по отношению к грамположительным и грамотрицательным штаммам, чем у остальных фторхинолонов (норфлоксацина, перфлоксацина, ломефлоксацина, офлоксацина, дифлоксацина, флерофлоксацина, грепафлоксацина, гатифлоксацина, моксифлоксацина, клинафлоксацина, левофлоксацина, руфлоксацина, эноксацина, спарфлоксацина), а также бактерицидный характер действия, который более продолжительный, по сравнению с другими антимикробными препаратами. Выражено замедление бактериального роста при субингибирующих концентрациях, а также потенцирование фагоцитоза и внутриклеточного разрушения бактерий лейкоцитами человека.

Благодаря высокой антибактериальной активности ципрофлоксацин выпускается за рубежом в виде различных лекарственных форм, таких как растворы для инфузий 0,2%, таблетки, капсулы, капли для офтальмологического применения

Рбс. национальная

БИБЛИОТЕКА СПетсрвург

оа

только в виде таблеток. Проведённый литературный поиск показал, что клиническому изучению ципрофлоксацина посвящено значительное количество работ, в то время как сведения о методах анализа крайне ограничены и не систематизированы.

Поэтому актуальным является создание новых лекарственных форм с ципрофлоксацином и их стандартизация.

Цель и задачи исследования. Разработка методик анализа лекарственных препаратов содержащих ципрофлоксацина гидрохлорид, их стандартизация, установление сроков хранения, оценка антимикробной эффективности, а также оптимизация состава раствора для инфузий и мази для обеспечения максимальной стабильности.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать методики идентификации, количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида и посторонних примесей в лекарственных формах для инфузий:

2. Разработать методику количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида! в мази, в присутствии консервантов и других вспомогательных веществ.

3. Изучить стабильность, ципрофлоксацина в лекарственных формах для инфузий и осуществить выбор эффективных стабилизаторов и буферных веществ для обеспечения стабильности растворов в полимерной и стеклянной упаковке.

4. Разработать методику определения гемолитически активных веществ • и бактериальных эндотоксинов в растворе ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий.

5. Обосновать оптимальный состав мазевой основы для выбора композиции, обеспечивающей максимальную антимикробную активность и стабильность ципрофлоксацина гидрохлорида в мази.

6. Провести сравнительную оценку антимикробной активности новых лекарственных форм, в сравнении с прототипами.

Научная новизна. Изучено хроматографическое поведение ципрофлоксацина гидрохлорида методом ВЭЖХ на различных типах хроматографов. Проведён выбор оптимальных условий хроматографирования для работы в режимах микроколоночной и стандартной ВЭЖХ. Установлено, что для уменьшения ошибки определения целесообразно проводить одну аппроксимационную обработку хроматограммы.

В ходе изучения стабильности инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида установлено, что определение цветности путём визуального сравнения с различными эталонами не отражает качества препарата. С этой целью впервые применено вычисление "условной площади" под спектральной кривой лекарственного препарата в видимой области спектра. Данная методика может широко применяться для оценки качества новых растворов для инфузий.

Выявлены факторы влияющие на течение реакции взаимодействия гемолитически активных веществ и эритроцитов крови. Установлено, что для выполнения данного определения требуется тщательная отмывка эритроцитарной массы, доведение реакционной смеси до нейтральной реакции и добавление буфера.

Практическая значимость. Впервые предложена лекарственная форма ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузионного применения, мазь для наружного применения, разработаны способы идентификации, количественного определения действующих веществ и оценки степени чистоты, изучена стабильность, определены сроки годности в разных упаковках при различных значениях рН. Впервые изучено влияние упаковочных материалов, концентрации буферных растворов, рН, изотонирующих добавок на стабильность инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида. Для стандартизации раствора ципрофлоксацина гидрохлорида использованы биологические методы анализа: определение бактериальных эндотоксинов и содержание гемолитически активных веществ в растворе лекарственного препарата, выпускаемого в пластиковой упаковке.

Изучена антимикробная активность мази с ципрофлоксацина гидрохлоридом.

Предложена унифицированная спектрофотометрическая методика определения цветности. Модифицирована методика определения препарата в лекарственных формах методом ВЭЖХ с использованием микроколоночных хроматографов. Получено положительное решение на выдачу патента на раствор ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий.

Внедрение результатов исследования в практику совместно с ЗАО "Рестер", г. Ижевск. Подготовлен проект ФСП на раствор ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий 0,2%, находящийся на регистрации в Министерстве здравоохранения РФ. Разработка состава проведена совместно с химико-фармацевтическим предприятием ЗАО Тестер" (г. Ижевск).

Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на региональных конференциях по фармации, фармакологии и подготовке кадров (г. Пятигорск, 2001 - 2004 гг.).

По теме диссертации опубликовано три статьи в центральной печати и четыре публикации на региональном уровне.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно -исследовательских работ ПятГФА (номер государственной регистрации 01.20.0013407) в рамках проблемы "Фармация" секции № 38 Учёного совета МЗ РФ.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, состоит из "Введения", "Обзора литературы" и 3-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 26 рисунками и 63 таблицами. Библиография имеет 156 наименований, из которых 105 на иностранных языках.

В первой главе диссертации обобщены данные литературы по способу получения и физико-химическим свойствам фторхинолонов, а также представлены сведения об их фармакологической активности. Описаны современные методики анализа лекарственных препаратов фторхинолонового ряда с использованием физико - химических методов, а также применение

хроматографических методов для количественного определения и оценки степени чистоты этих соединений.

Во второй главе приведены результаты исследований по разработке методик ВЭЖХ для качественного и количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида на различных типах хроматографов, методика определения посторонних примесей, а также проведена валидационная оценка разработанных методик.

Третья глава посвящена получению инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида 0,2%, разработке методик анализа и его стандартизации. Изложены данные об установлении срока годности методом ускоренного хранения при 40°С.

Четвёртая глава содержит результаты исследования по разработке новой лекарственной формы "Мазь ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5%", обосновании её состава, разработке методик анализа и стандартизации. Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Разработка методики идентификации и количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида и его посторонних примесей в лекарственных препаратах, методом ВЭЖХ.

2. Результаты исследований по оптимизации состава раствора и мази ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий.

3. Унифицированная методика определения гемолитической активности инфузионных растворов в полимерной упаковке, основанная на тщательной подготовке эритроцитарной массы, установление необходимого значения рН реакционной смеси и её поддержании на всём протекании испытания.

4. Методика определения цветности растворов, основанная на определении "условной площади под спектральной кривой".

5. Способ стабилизации раствора ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явился раствор ципрофлоксацина гидрохлорида

0,2% для инфузий. В качестве стабилизаторов нами были использованы

ацетатные и фосфатные буферные растворы. Раствор был изотонирован натрия хлоридом. Субстанция ципрофлоксацина гидрохлорида, использованная в качестве действующего вещества, была произведена фирмой "Чемо Иберика" (Испания). Все использованные вещества соответствовали требованиям нормативной документации.

Для решения поставленных задач первым этапом исследований явилась разработка методик идентификации, количественного определения и оценки степени чистоты ципрофлоксацина гидрохлорида в лекарственных формах. Для этой цели изучили возможность использования фотометрических и хроматографических методов.

Фотометрические и хроматографические методы анализа ципрофлоксацина гидрохлорида Предварительно были изучены спектры поглощения растворов ципрофлоксацина гидрохлорида в воде и в кислоте хлороводородной и определены основные спектральные характеристики в диапазоне длины волн от 220 до 320 нм. При этом установлено, что интенсивность светопоглощения при использовании в качестве растворителя 0,1 М кислоты хлороводородной несколько выше, чем при использовании в качестве растворителя воды, в связи с этим в дальнейших исследованиях в качестве растворителя использовали 0,1М кислоту хлороводородную. В связи с тем, что все посторонние примеси в ципрофлоксацине гидрохлорида содержат в своей структуре фторхинолоновое ядро, использование данного метода для оценки качества препарата не представляется возможным. Полученные результаты в дальнейшем были использованы для определения ципрофлоксацина гидрохлорида в диализатах (глава 4.1), промывных растворах при разработке методики испытания на стерильность (глава 3.2.9).

Учитывая то, что методом спектрофотометрии невозможно определить посторонние примеси в растворе из-за аналогичной структуры молекул примесей, содержащихся в ципрофлоксацина гидрохлориде, была изучена возможность использования различных хроматографических методов для его идентификации и оценки степени чистоты ципрофлоксацина. С этой целью

были проведены исследования методом тонкослойной хроматографии на пластинах Kiselgel (фирмы Merk) в разных системах растворителей. При этом был установлен предел обнаружения 0,1 мкг и величина Rf- 0,4±0,03.

Оптимальной оказалась система: хлороформ - метанол — раствор аммиака 25% - ацетонитрил в соотношении (4:4:2:1), обладающая наибольшей чувствительностью, хорошей воспроизводимостью и с минимальным временем пробега.

Однако данную методику ТСХ нельзя применять для количественного определения посторонних примесей и оценки степени чистоты, так как для определения степени чистоты лекарственного препарата в этом случае необходимо нанесение на пластинку пробы в объёме 500 мкл, что технически невозможно. Поэтому целесообразнее всего для качественного анализа, количественного определения и оценки степени чистоты ципрофлоксацина гидрохлорида использовать метод ВЭЖХ, являющийся более точным и чувствительным по сравнению с методом ТСХ.

Для этого был проведён поиск оптимальных условий анализа ципрофлоксацина методом ВЭЖХ. Исследования проводили на жидкостном хроматографе "Милихром - 5" в изократическом режиме элюирования на колонке, заполненной диасорбом C16, а также на базе ЗАО "Рестер" на приборе "Hewlett Packard" с длиной колонок более 200 мм, заполненных обращённофазовым сорбентом.

Для выбора оптимального элюента нами были использованы водно -ацетонитрильные смеси в различных соотношениях с добавлением определённого количества кислоты фосфорной. Хроматографирование вели в диапазоне скорости подачи элюента от 30 до 70 мкл/мин. В качестве критериев оптимизации использовали коэффициент асимметрии пика (7), эффективность (Н), коэффициент ёмкости (к) и коэффициент разделения пиков (Ä,) ципрофлоксацина и его основной примеси - этилендиаминового аналога. Зависимость коэффициента разделения и фактора асимметрии от скорости элюирования представлена на рисунках 1-2. Установлено, что оптимальной системой растворителей является система № 2.

2

- система ацетонитрил — вода — кислота фосфорная (6:4:0,01); -система ацетонитрил-вода-кислота фосфорная (5:5:0,01);

- система ацетонитрил - вода - кислота фосфорная - натрия лаурилсульфат (6:4:0,05:0,01);

- система ацетонитрил - вода - кислота фосфорная (6:4:0,05).

Рисунок 1 -График зависимости коэффициента разделения пиков от скорости элюирования

- система ацетонитрил - вода - кислота фосфорная (6.4:0,01); система ацетонитрил - вода - кислота фосфорная (5:5:0,01);

3— система ацетонитрил — вода - кислота фосфорная — натрия лаурилсульфат (6:4:0,05:0,01);

4— система ацетонитрил - вода - кислота фосфорная (6:4:0,05).

4

Рисунок 2 - График зависимости фактора асимметрии от скорости элюирования

Для установления оптимальной скорости подачи элюента изучали зависимость критериев оптимизации от данного параметра, которые представлены в таблице 1.

Таблица 1 Влияние скорости подачи элюента на средние значения критериев оптимизации процесса определения ципрофлоксацина гидрохлорида методом ВЭЖХ (п = 5)__

Из данных таблицы следует, что при элюировании со скоростью 40 -50 мкл/мин все критерии имеют значения, при которых лучше всего проводить процесс хроматографирования ципрофлоксацина гидрохлорида методом ВЭЖХ.

Следует отметить, что значения эффективности достаточно низкие. Это может быть связано с относительно большими размерами молекулы и амфотернымй свойствами ципрофлоксацина, а также в связи с малой длиной колонки. Однако данной эффективности достаточно для разделения пиков ципрофлоксацина и его основной примеси (рис. 3).

1 — пик этилендиаминового аналога ципрофлоксацина;

2- пик ципрофлоксацина;

3- неидентифицированная примесь;

Рисунок 3 - Хроматограмма раствора ципрофлоксацина гидрохлорида

В выбранных условиях коэффициент разделения пиков не менее 1, а продолжительность хроматографирования составляет около 10 минут. С целью уменьшения ошибки при определении площадей несимметричных пиков путём аппроксимации приводили их к гауссовой кривой. Для реализации поставленной задачи аппроксимирование проводили при заданной полуширине пика — 0,7 и коэффициенте асимметрии пика 1,0. Количество шагов аппроксимации (итераций) было от 0 до 20 (табл. 2). Таблица 2 - Результаты влияния аппроксимации на площади пиков

Как следует из представленных данных, более целесообразно проводить одну аппроксимационную обработку, так как при этом площадь пика наиболее близка к оптимальному значению.

Хроматографирование на приборе "Hewlett Packard", с длиной колонок более 200 мм, проводилось в различных режимах работы, в качестве оптимальных были выбраны следующие условия:

Колонка Подвижная фаза

- длиной не менее 200 мм и внутренним диметром 0,4 см.

- 0,025 М раствор кислоты фосфорной (рН 3) -ацетонитрил (87:13)

- 20 -25°С;

- 278 нм;

- 1,0-1,5 мл/мин

Полученные хроматограммы при разных условиях хромаграфирования были идентичны. Разработанные методики хроматографирования позволили проводить разделение ципрофлоксацина и его основной примеси — этилендиаминового аналога при использовании различных типов

Температура колонки Детектор УФ Скорость подачи элюента

хроматографов. Данная методика предложена и для оценки степени чистоты лекарственного препарата. Содержание посторонних примесей проводили по формулам:

Формула расчёта содержания посторонних примесей в растворе ципрофлоксацина гидрохлорида 0,2%

где: S, -площадь пика примеси этилендиаминового аналога на хромато-грамме препарата;

¿■„-площадь основного пика на хроматограмме РСО; Co-содержание ципрофлоксацина основания в растворе РСО,%; 0,7 - фактор пересчёта;

а- навеска РСО ципрофлоксацина гидрохлорида в пересчёте на основание.

Формула расчёта других родственных соединений

где: 5, -площадь пиков родственных соединений на хроматограмме препарата;

-площадь основного пика на хроматограмме РСО, %; -содержание ципрофлоксацина основания в растворе РСО, %.

При оценке степени чистоты лекарственного препарата было установлено, что суммарное значение посторонних примесей в растворе ципрофлоксацина гидрохлорида включая и этилендиаминовый аналог ципрофлоксацина не превышало 0,5%. Разработанная методика позволила одновременно проводить и количественное определение ципрофлоксацина в лекарственных формах.

Данная методика количественного определения на основе ВЭЖХ была подвергнута валидационной оценке по следующим параметрам: линейная зависимость, аналитическая область методики, величина систематической ошибки, число необходимых параллельных определений, предел количественного определения, коэффициент вариации и степень робастности, которая выражена в получении одинаковых результатов при использовании различных типов однотипных сорбентов и растворителей разного качества. Линейная зависимость площади пика от концентрации раствора ципрофлоксацина наиболее выражена в интервале 0,001 — 0,15%. Полученные результаты методом ВЭЖХ не отягощены систематической ошибкой. При

oпределении необходимого числа параллельных определений установлено, что для получения результатов с относительной ошибкой не более 2,2%, достаточно одного определения. Сравнительная оценка методик количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида, а также полученные результаты коэффициента вариации, значения ошибки метода, возможность использования ВЭЖХ при количественном определении примеси одновременно с основным веществом, подтверждают целесообразность использования метода ВЭЖХ в микроколоночном варианте для количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида.

Так как раствор ципрофлоксацина гидрохлорида в ходе производства будет подвергаться стерилизации, а затем должен сохранять стабильность не менее чем в течение 2 лет и 3-х месяцев необходимо применить стабилизаторы. Для установления термоустойчивости ципрофлоксацина гидрохлорида предварительно было проведено дериватографическое исследование субстанции. При этом установлено, что лекарственное вещество начинает разлагаться при температуре от 270°С, что показывает достаточную термостабильность ципрофлоксацина гидрохлорида.

Следующим этапом разработки лекарственного препарата стал выбор оптимального буфера, так как в ходе предварительных исследований было установлено, что после стерилизации и в ходе процесса хранения происходит изменение рН. При использовании стеклянной, тары происходит выщелачивание стекла, а при использовании полимерной тары рН среды становится кислой. В качестве буфера использовали фосфатные и ацетатные буферные растворы с различными величинами рН. Критериями оптимизации для выбора состава служило значение рН до и после стерилизации. Наиболее стабильным явилась композиция следующего состава:

Ципрофлоксацина

гидрохлорида

Натрия хлорида

Кислоты лимонной

Натрия гидрофосфата

Воды для инъекций до 100 мл

0,2345 0,9 0,06 0,12

В нормативных документах на зарубежные лекарственные препараты для инфузий рекомендуется проводить расчет теоретической осмолярности, нами был рассчитан этот показатель для раствора ципрофлоксацина гидрохлорида. Суммарное значение теоретической осмолярности составило 331 мОсм/л, что соответствовало требованиям, предъявляемым к растворам для инфузий (239376 мОсм/л). На приборе "Миллиостмометр - Криоскоп термоэлектрический МТ 5-02" проанализировали фактическую осмолярность, которая составила 329+1 мОсм/л, что подтвердило значения теоретической осмолярности.

Стандартизация лекарственной формы "Ципрофлоксацина гидрохлорид, раствор для инфузий 0,2%"

Стандартизацию лекарственного препарата проводили по всем требованиям предъявляемым к растворам для инфузий.

Идентификацию, количественное определение и оценку степени чистоты проводили методом ВЭЖХ по разработанной нами методике. При оценке качества раствора для инфузий применяли показатель "Бактериальные эндотоксины", как альтернативный способ показателя "Пирогенность" с помощью гель-тромб теста. Определение проводили с помощью ЛАЛ реактива. При проведении эксперимента, чтобы избежать ингибирования ЛАЛ реакции, было необходимо проводить разведение лекарственного препарата, а также предварительное доведение рН до нейтрального значения. При этом из раствора в виде осадка выпадает основание ципрофлоксацина, но это не мешает проведению теста. Установлено, что содержание эндотоксинов в растворе ципрофлоксацина гидрохлорида не более 0,35 э.ед/мл, что не превышает допустимую норму по данному показателю.

При проведении испытания на стерильность применяли метод мембранной фильтрации. Для полного удаления- ципрофлоксацина гидрохлорида из раствора предварительно определили количество промывок мембраны. Полноту отмывания мембраны устанавливали спектрофотометрически. Установили, что для полного исключения присутствия лекарственного вещества на мембране достаточно пяти промывок фосфатным буферным раствором (табл. 3).

Таблица 3 - Содержание ципрофлоксацина гидрохлорида в фосфатном буферном растворе после промывок мембраны

Количество промывок 0 1 2 3 4 5

Объём промывной жидкости, мл 0 100 200 300 400 500

Концентрация ципрофлоксацина мкг/мл 4,18 ±0,25 0,76 ±0,04 0,077 ±0,005 0,049 ±0,004 0,038 ±0,006 менее 0,02

Так как лекарственный препарат будет выпускаться в пластиковой упаковке, было необходимо установить её влияние на стабильность действующего вещества. Это отражает гемолитическая активность лекарственного препарата. Для этих целей нами была использована фотометрическая методика, основанная на реакции взаимодействия компонентов упаковки, находящийся в анализируемом препарате с эритроцитами крови человека При этом установлено, что известная методика не позволяет получать достоверные результаты и нуждается в оптимизации. В связи с этим нами была разработана методика, позволяющая контролировать содержание гемолитически активных веществ лекарственного препарата, выпускаемых в пластиковой упаковке. Установлено, что для определения гемолитической активности инфузионного раствора в полимерной упаковке необходима не менее чем трёхкратная отмывка эритроцитов, доведение рН до значений близкого к нейтральному, при этом, чтобы избежать закисления лекарственного препарата в ходе гемолиза необходимо создать буферную ёмкость реакционной смеси. При высокой гемолитической активности можно применять разведение препарата изотоническим раствором натрия хлорида.

Для определения примесей тяжёлых металлов в лекарственном препарате использовали фармакопейный метод. Можно было предположить, что ионы тяжёлых металлов будут вступать в реакцию с ципрофлоксацином. Для определения условий проведения реакции на тяжёлые металлы изучили возможность взаимодействия ионов свинца с ципрофлоксацином в присутствии

сульфида натрия. В ходе эксперимента было установлено, что ципрофлоксацин в реакцию с ионами свинца в присутствии сульфида натрия не вступает, а аналитический эффект наблюдаемый при определении примесей тяжёлых металлов, обусловлен только примесью.

Согласно ГФ XI издания, определение цветности проводят визуально, что не всегда позволяет объективно оценивать качество растворов по данному показателю. Мы попытались разработать унифицированную методику определения окраски раствора по интегральной интенсивности светопоглощения, выраженной в виде площади под спектральной кривой. Предварительно были изучены спектры поглощения всех 28 эталонных растворов предлагаемых Государственной фармакопеи XI издания, в диапазоне от 380 до 700 нм. В результате было установлено, что используемые растворы наиболее интенсивно поглощают в области от 380 до 440 нм. Одновременно были измерены УФ спектры поглощения анализируемого раствора в этой области, а также проведено сравнение с эталонами сравнения по фармакопее США 26 издания и по Европейской фармакопее III издания на аналогичные лекарственные препараты. Для полученных данных рассчитывали условное значение площади под спектральной кривой. С этой целью использовали упрощённую форму расчёта.

Формула расчёта условного значения площади под спектральной кривой

А - значения оптических плотностей при разных длинах волн;

К — кратность разведений анализируемого раствора.

Полученные данные представлены в таблице 5.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что значение площади под спектральной кривой раствора лекарственного препарата, соответствует эталону сравнения 3б и эталону сравнения по фармакопее США 26 издания, однако превышает эталон Европейской фармакопеи III издания.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности более объективного нормирования цветности не по эталонным растворам, а по предлагаемой методике.

Таблица 5 - Значения условных значений площади под спектральной кривой эталонов и растворов сравнения

№ эталонов а б в г Ципрофлоксацин, раствор д/инфузий 0,2% Эталон ШР 26 Эталон ЕРШ

I 403,1 156,2 139,7 156,2

2 189,7 80,6 77,2 50,3

3 105,3 31,1 38,6 16,2

4 25,1 10,3 13,2 9,6 29,7±0,5 34,5+0,5 18,7±0,5

5 123 4,0 4,9 4,1

6 5,6 1,8 4,4 1,7

7 2,7 0,7 1,2 0,8

В результате стандартизации нами учтены все требования к растворам для инфузий, а также требования НД аналогичных лекарственных препаратов зарубежного производства. В ходе ускоренного хранения при 40°С, установлено, что лекарственный препарат остаётся стабильным в течении 3-х лет.

Разработка состава, методик анализа и стандартизация мази ципрофлоксацина гидрохлорида для наружного применения.

В связи с тем, что лечение большинства инфекционных поражений кожи осложняется невосприимчивостью микроорганизмов ко многим антимикробным средствам, актуальной является создание новых лекарственных форм с высокоактивными химиотерапевтическими веществами, из которых ведущее место занимают фторхинолоны, в частности, ципрофлоксацина гидрохлорид. В настоящее время нет лекарственных форм ципрофлоксацина гидрохлорида для наружного применения, целью настоящей работы явилось обоснование состава и стандартизация мази, содержащей ципрофлоксацина гидрохлорид.

Для выбора мазевой основы исходили из имеющихся литературных данных на мазь офлоксацина. Поскольку ципрофлоксацина гидрохлорид растворим в воде, мы использовали гидрофильные основы. Кроме того, данные литературы подтверждают то, что фторхинолоны наиболее фармакологически активны именно при использовании эмульсионных и гидрофильных основ.

Концентрация ципрофлоксацина основания в мази составляла 0,5% (в пересчёте на основание ципрофлоксацина). В связи с тем, что

ципрофлоксацина гидрохлорид не обладает антигрибковой активностью, для подавления роста грибов во все мазевые основы вводили нипагин в концентрации 0,1%.

За основу были взяты составы и технологии приготовления мази офлоксацина, разработанные в Пермской государственной фармацевтической академии. Для выбора оптимальной мазевой основы были использованы различные композиции. Приготовленные мази были подвергнуты биофармацевтическим исследованиям методом диализа через

полупроницаемую мембрану. Установлено, что высвобождение ципрофлоксацина из некоторых мазей на эмульсионной и гидрофильной основе практически идентично, поэтому была проведена оценка антимикробной активности. С целью изучения антимикробной активности провели серия экспериментов по исследованию действия мази на штаммы: St. aureus, Ps. aeruginosa и Е. coli, которые наиболее часто вызывают микробные поражения кожи. Исследования проводили методом двукратнвгх серийных разведений Результаты антимикробной активности подтверждали результаты диализа. Для подтверждения данных и получения более обьективнвгх результатов бвша проведена оценка активности методом диффузии в агар. Полученные результаты измерений величины диаметра задержки роста микроорганизмов также свидетельствовали о высокой антимикробной активности исследуемых мазей. В процессе хранения бвшо установлено, что наибольшим сроком годности обладала мазь на эмульсионной основе, поэтому более целесообразным было в дальнейших исследованиях использовать эту мазевую композицию.

Композиция мази на эмульсионной основе:

гидрохлорида 0,586

Пропиленгликоля 22,00

Кислоты стеариновой 6,00

Воды очищенной до 100 мл

Выбрав оптимальный состав мази мы провели . сравнительную оценку антимикробной активности данной мази по сравнению с существующими мазями, применяемыми для лечения инфекционных поражений кожи. В качестве объектов исследования были выбраны: мазь диоксидина 5%, линимент синтомицина 10%, мазь неомициновая 0,5%, мазь эритромициновая 1%, мазь тетрациклиновая 3% и гентамициновая 0,1% (таб.. 6).

Изучение антимикробной активности мазей методом серийных разведений показало, что мазь ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5% по сравнению с существующими мазями, применяемыми для лечения инфекционных поражений кожи, обладает наибольшей антимикробной активностью, что свидетельствует о преимуществах ципрофлоксацина гидрохлорида перед другими антимикробным средствами.

Полученная мазь является новым лекарственным средством, поэтому мы провели исследования по разработке методик её анализа и стандартизации.

С этой целью были выбраны следующие критерии — описание, подлинность, рН водного извлечения, количественное определение ципрофлоксацина гидрохлорида и нипагина и микробиологическая чистота (табл. 7).

Таблица 6 - Значения антимикробной активности мазей определённые методом серийных разведений, мкг/мл (п = 3)

Таблица 7 - Спецификация мази ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5%

Показатели Методы Нормы

Описание Визуально Белая с желтоватым оттенком

Подлинность Ципрофлок- сацин нипагин ВЭЖХ Время удерживания основного пика на хромата грамме испытуемого раствора при 278 нм должно совпадать со временем удерживания основного пика на хромаггограмме PCO ципрофлоксацина гидрохлорида. Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора при 256 нм должно совпадать со временем удерживания основного пика на хроматограмме PCO нипагина

рН водного извлечения Потенциометрически - 5,5-6,5

количествен ное определение ципрофлок-сацин нипагин ВЭЖХ ВЭЖХ 0,045 - 0,055 г 0,009 - 0,011 г

Микробиологическая чистота ГФ XI, изм. №3 Категория 2

Водородный показатель водного извлечения измеряли потенциометрически. Подлинность и количественное определение ципрофлоксацина гидрохлорида и нипагина проводили с использованием метода ВЭЖХ, предложенного для анализа раствора ципрофлоксацина гидрохлорида. Для разделения пиков ципрофлоксацина и нипагина была выбрана система: вода — ацетонитрил, в соотношении (7:3), с добавлением в раствор 0,25 М кислоты фосфорной, до рН 3. Для детекции применяли двухволновой режим детектирования, в максимумах поглощения ципрофлоксацина и нипагина, что позволяет проводить одновременно качественное и количественное определение ципрофлоксацина и нипагина (рис 5).

1 — пик ципрофлоксацина;

2 - пик нипагина.

Рисунок 5 - Хроматограмма мази ципрофлоксацина гвдрохлорида 0,5%

Из представленного рисунка следует, что при двухволновой детекции время удерживания раствора ципрофлоксацина гидрохлорида и нипагина соответствует раствору РСО ципрофлоксацина гидрохлорида и нипагина.

Микробиологическую чистоту мази ципрофлоксацина гидрохлорида устанавливали в соответствии с требованиеми ГФ XI. В связи с тем, что ципрофлоксацина гидрохлорид обладает антимикробным действием, при проведении теста, использовали метод мембранной фильтрации. Установили, что мазь ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5% соответствует категории 2 согласно изменению №3 в ГФ XI.

В естественных условиях и в ходе ускоренного хранения при 40°С, установлено, что лекарственный препарат остаётся стабильным в течении 2-х лет.

Таким образом нами обоснован состав новой лекарственной формы - мазь ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5%, разработаны методики анализа, проведена его стандартизация и установлены сроки хранения.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 1. На основании результатов изучения хроматографического поведения ципрофлоксацина гидрохлорида методом ВЭЖХ в различных условиях

предложена методика его идентификации, количественного определения, и содержания посторонних примесей в инфузионном растворе.

2. Проведён поиск оптимальных условий для стабилизации раствора ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий, в результате чего обоснован состав буферной смеси, позволяющий обеспечить стабильность лекарственного препарата в течении 2,5 лет в стеклянной и полимерной упаковке.

3. Предложена оригинальная методика определения окраски растворов, основанная на измерении площади под спектральной кривой в видимой области спектра, которая позволяет количественно оценивать качество

• растворов по данному показателю.

4. Оптимизирована методика определения гемолитической активности инфузионных растворов, в частности раствора ципрофлоксацина гидрохлорида. Установлена необходимая кратность промывки эритроцитов, доказана необходимость добавления буферных компонентов при проведении инкубации эритроцитов с анализируемым раствором.

5. Изучена степень высвобождения ципрофлоксацина гидрохлорида из различных мазевых основ и изучена антимикробная активность мазей, содержащих ципрофлоксацина гидрохлорид. Установлено, что по антибактериальной активности и стабильности целесообразным является использование мази на эмульсионной основе.

6. Разработана методика определения ципрофлоксацина гидрохлорида в мази для наружного применения методом ВЭЖХ в присутствии консерванта нипагина. Для качественного и количественного определения обоих компонентов использован двухволновой режим детектирования.

7. Проведена сравнительная оценка антимикробной активности мази ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5% на эмульсионной основе с мазями содержащими диоксидин, синтомицин, гентамицина сульфат, эритромицин, неомицина сульфат и тетрациклина гидрохлорид. Установлено, что предложенная мазь значительно превосходит по активности прототипы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Способ стабилизации раствора ципрофлоксацина для инфузий / Положительное решение о выдаче патента № 2002105683/15. (Соавт.: Гаврилин М. В., Ушакова Л. С.)

2. Стандартизация раствора ципрофлоксацина для инфузий /Регион, конф. по

фармации, фармакологии и подготовке кадров (57; 2002; Пятигорск): Материалы... - Пятигорск: ПятГФА, 2002. -С. 86.

3. Определение окраски растворов /Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Материалы 58 межрегтон. конф. по фармации и фармакологии.- Пятигорск: ПятГФА, 2003. -С. 199-201.

4. Разработка и изучение стабильности инфузионной формы ципрофлоксацина

гидрохлорида /Хим.-фармац.-журн. 2003. - Т37, №2. -С. 53-56. (Соавт.: М.В. Гаврилин, Л.С. Ушакова)

5. Оптимизация методики определения гемолитической активности инфузионных растворов /Хим.-фармац.-журн. 2003. - Т.37, №5. -С. 45-47. (Соавт.: М.В. Гаврилин, Л.П. Овчаренко, Е.И. Харитонова)

6. Получение и изучение антимикробной активности мази ципрофлоксацина /Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Материалы 58 межрегтон. конф. по фармации и фармакологии.-Пятигорск: ПятГФА, 2003. -С. 197-199. (Соавт.: М.В. Гаврилин, Л.П. Овчаренко, Е.В. Скребцова)

7. Разработка методик анализа и стандартизация мази с ципрофлоксацина гидрохлоридом /Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сборник науч. трудов.- Пятигорск: ПятГФА, 2004.-Вып. 59.-С. 154-156.

ГОНЯН СМБАТ АРШАМОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ АНАЛИЗА И ОБОСНОВАНИЕ СОСТАВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ СОДЕРЖАЩИХ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА ГИДРОХЛОРИД

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 26.04.04 г. Формат 60 х 84/16. Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 80 экз. Заказ : Пятигорская государственная фармацевтическая академия 357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11. Ротапринт ПятГФА

Р- 88 7 6

Актуальность В современном арсенале антимикробных химиотерапевтических средств важное место принадлежит синтетическим лекарственным препаратам фторхинолонового ряда. Чрезвычайно высокая активностьи широкий спектр действия фторхинолонов поддерживают постоянный интерес кработам, имеющим своей целью модификацию структуры фторхинолонов илисинтез новых хинолоновых производных, способных ингибироватьДНК-гиразу. С 1983 года издаётся журнал Quinolones Bulletin, вкотором постоянно публикуются результаты исследований только этой группы антимикробных средств. В настоящее время более 30производных фторхинолонов либо освоены промышленностью, либо находятся на одной из стадий клинических испытаний. Однако наиболее часто применяемым лекарственным препаратом является ципрофлоксацин,вошедший вчисло мировых "блокбастеров", объёмпродаж которого превысил суммув 1миллиард долларов. При этом влитературе имеются данные, чтоу ципрофлоксацина наиболее эффективновыражена антибактериальная активность по отношению к грамположительным и грамотрицательным штаммам, чем у остальных фторхинолонов (норфлоксацина, перфлоксацина, ломефлоксацина, офлоксацина, дифлоксацина, флерофлоксацина, грепафлоксацина, гатифлоксацина,моксифлоксацина, клинафлоксацина,левофлоксацина, руфлоксацина,эноксацина,спарфлоксацина), атакже бактерицидный характер действия,которыйболее продолжительный, по сравнению сдругими антимикробными препаратами. Выражено замедление бактериального роста при субингибирующих концентрациях, атакже потенцирование фагоцитоза и внутриклеточного разрушениябактерий лейкоцитами человека [1-7]. Благодаря высокой антибактериальной активности ципрофлоксацин выпускается зарубежом в виде различных лекарственных форм, таких как растворы для инфузий 0,2%, таблетки, капсулы, капли для офтальмологического применения 0,3%, глазные плёнки, однако в России только в виде таблеток. Проведённый литературный поиск показал,что клиническому изучению ципрофлоксацина посвящено значительное количество работ, в то время как сведения ометодах анализа крайне ограничены инесистематизированы. В связи с этим, актуальным является создание новых лекарственных форм,сципрофлоксациномиих стандартизация. Цель и задачи исследования. Разработка методик анализа лекарственных препаратов содержащих ципрофлоксацинагидрохлорид, вчастности растворов для инфузий имази,ихстандартизация, установление сроков хранения, оценка фармакологической иантимикробной эффективности,атакже оптимизациясостава раствора для инфузий имази дляобеспечения максимальной стабильности. Дляреализации поставленной целинеобходимо решить следующие задачи: 1. Разработать методики идентификации,количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида и посторонних примесей в лекарственных формах дляинфузий. 2. Разработать методику количественного определения ципрофлоксацина гидрохлорида в мази, в присутствии консервантов и других вспомогательных веществ. 3. Изучить стабильность ципрофлоксацинавлекарственных формах дляинфузий и осуществить выбор эффективных стабилизаторов и буферных веществ для обеспечения стабильности растворов в полимерной и стекляннойупаковке. 4. Разработать методику определения гемолитически активных веществ и бактериальных эндотоксинов в растворе ципрофлоксацина гидрохлорида дляинфузий. 5. Провести оценкумазевых основдля выбора композиции обеспечивающей максимальную антимикробную активность и стабильность ципрофлоксацина гидрохлорида вмази.6. Провести сравнительную оценку антимикробной активности новых лекарственных форм,всравненииспрототипами. Научная новизна. Изучено хроматографическое поведение ципрофлоксацина гидрохлорида методом ВЭЖХ на различных типах хроматографов. Проведён выбор оптимальных условий хроматографирования для работы врежимах микроколоночнойи стандартной ВЭЖХ. Установлено, что для уменьшения ошибки определения целесообразно проводить одну аппроксимационную обработку хроматограммы. В ходе изучения стабильности инфузионного раствора ципрофлоксацина гидрохлорида установлено, что определение цветности путём визуального сравнения с различными эталонами не отражает качества препарата. С этой целью впервые применено вычисление "условной площади" под спектральной кривой лекарственного препарата в видимой области спектра.Даннаяметодика может широкоприменятьсядля оценкикачества новых растворовдляинфузий. Выявлены факторы влияющие на течение реакции взаимодействия гемолитически активных веществ и эритроцитов крови. Установлено, что для выполнения данного определения требуется тщательная отмывка эритроцитарной массы, доведение реакционной смеси до нейтральной реакции и добавление буфера. Практическая значимость. Впервые предложена лекарственная форма ципрофлоксацнпагидрохлорида для инфузионного применения,мазь для наружного применения,разработаны способы идентификации,количественного определения действующих веществ и оценки степени чистоты, изучена стабильность, определены сроки годности в разных упаковках при различных значениях рН.Впервые изучено влияниеупаковочных материалов, концентрации буферных растворов, рН, изотонирующих добавок на стабильность инфузионного раствора ципрофлоксацнпа гидрохлорида. Для стандартизации раствора ципрофлоксацина гидрохлорида использованы биологические методы анализа: определение бактериальных эндотоксинов и содержа

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании результатов изучения хроматографического поведения ципрофлоксацина гидрохлорида методом ВЭЖХ в различных условиях предложена методика его идентификации, количественного определения, и содержания посторонних примесей в инфузионном растворе.

2. Проведён поиск оптимальных условий для стабилизации раствора ципрофлоксацина гидрохлорида для инфузий, в результате чего обоснован состав буферной смеси, позволяющий обеспечить стабильность лекарственного препарата в течении 2,5 лет в стеклянной и полимерной упаковке.

3. Предложена оригинальная методика определения окраски растворов, основанная на измерении площади под спектральной кривой в видимой области спектра, которая позволяет количественно оценивать качество растворов по данному показателю.

4. Оптимизирована методика определения гемолитической активности ин-фузионных растворов, в частности раствора ципрофлоксацина гидрохлорида. Установлена необходимая кратность промывки эритроцитов, доказана необходимость добавления буферных компонентов при проведении инкубации эритроцитов с анализируемым раствором.

5. Изучена степень высвобождения ципрофлоксацина гидрохлорида из различных мазевых основ и изучена антимикробная активность мазей, содержащих ципрофлоксацина гидрохлорид. Установлено, что по антибактериальной активности и стабильности целесообразным является исследование мази на эмульсионной основе.

6. Разработана методика определения ципрофлоксацина гидрохлорида в мази для наружного применения методом ВЭЖХ в присутствии консерванта нипагина. Для качественного и количественного определения обоих компонентов использован двух волновой режим детектирования.

7. Проведена сравнительная оценка антимикробной активности мази ципрофлоксацина гидрохлорида 0,5% на эмульсионной основе с мазями содержащими диоксидин, синтомицин, гентамицина сульфат, эритромицин, неомицина сульфат и тетрациклина гидрохлорид. Установлено, что предложенная мазь значительно превосходит по активности прототипы.