Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Синтез, физико-химические свойства и биологическая активность нитрата ментилового эфира α-оксиизовалериановой кислоты

На правах рукописи

КОЗЛОВСКАЯ Оксана Александровна

СИНТЕЗ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НИТРАТА МЕНТИЛОВОГО ЭФИРА а-ОКСИИЗОВАЛЕРИАНОВОЙ КИСЛОТЫ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Курск 1999

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете.

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Хабаров А. А. кандидат химических наук Луньков В. Д.

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук

Бубенчикова В.Н. доктор химических наук, профессор Ниязи Ф. Ф.

Ведущая организация:

Научно - исследовательский институт фармации

Защита состоится 29 сентября 1999 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета К 084.57.02 при Курском государственном медицинском университете по адресу: 305033, г. Курск, ул. К. Маркса,3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Курского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан » 1999 г

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук, доцент ( E.H. Пашин

/УВД-/ *

С

(

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Возрастающая загрязненность окружающей среды, появление зон с неблагоприятными экологическими условиями, современный темп жизни, постоянное напряжение, стрессовые ситуации, привязанность к вредным привычкам обуславливают рост сердечно-сосудистых заболеваний, среди которых ведущее место занимает ишемическая болезнь сердца (ИБС), и как следствие этого, наблюдается увеличение смертности и инвалидности среди трудоспособного населения (Н.А. Мазур, 1986; В.И. Метелица, 1989; R.M.Gunnar, 1990; R.F. Gillum et al., 1998).

Ассортимент лекарственных средств, применяемых для лечения и профилактики заболеваний сердечно-сосудистой системы включает большое количество препаратов различной структуры и происхождения. Лекарственные средства этого спектра действия получают синтетически, полусинтетически и выделяют из растительного сырья.

Эффективность применения лекарственных препаратов зависит от сочетания таких качеств, как низкая токсичность, оптимальный режим дозирования, высокий терапевтический эффект, удобство применения и возможность использования как для лечения, так и для профилактики заболеваний сердца. Однако, большинство из широко используемых в практической медицине средств, не удовлетворяют в полной мере этим требованиям. В связи с нерегулярными поставками лекарственных средств из-за рубежа актуальна проблема синтеза новых химических соединений, которые можно было бы использовать для создания отечественных лекарственных средств.

В настоящее время в клинической практике широко применяются лекарственные средства, полученные на основе эфиров азотной кислоты, такие как тринитрат глицерина, тетранитрат эринита, изосорбида динитрат (Janicki et al., 1987; С.С. Либерман, 1988; В.И. Метелица и др., 1995). Практический и научный интерес представляет получение новых эфиров азотной кислоты, на основе соединений, уже обладающих известной биологической активностью, прежде всего с действием на сердечно-сосудистую систему.

Используя мировую практику кардиологов и анализ современной доступной литературы, следует отметить повышенный интерес ученых к изысканию новых антиангинальных средств среди нитропроизводных ментола, изовалериановой кислоты и т.п. соединений (X. Итои др., 1984; P. Stoss, 1984; J. Bronet al.,1995).

Цель исследования. Провести направленный синтез нового, малотоксичного соединения, с эффективным терапевтическим действием на сердечно-сосудистую систему, сочетающего в своей структуре функционально значимые фрагменты лекарственных препаратов валидол и нитроглицерин.

Основные задачи исследования: - научно обосновать и разработать методику синтеза планируемого соединения;

- синтезировать вещество заданной структуры;

- подобрать оптимальные условия для выделения и очистки синтезированного продукта;

- доказать строение и изучить физико-химические свойства полученного нитрата;

- разработать методику количественного определения;

- исследовать биологическую активность синтезированного нитрата;

- установить условия хранения и сроки годности полученного соединения.

Научная новизна. Осуществлен направленный синтез нового соединения -

нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты. Разработаны методики выделения и очистки, структура подтверждена современными физико-химическими методами. Изучены некоторые свойства синтезированного соединения и разработаны методики его качественного и количественного определения.

Исследованы антимикробная, кардиотоническая, коронаролитическая и антигипоксическая активность нитрата. Экспериментально установлена его низкая токсичность и положительное влияние на метаболизм изолированных сердец.

В зависимости от условий хранения определена стабильность соединения. Результаты исследований в области синтеза, физико-химических свойств и биологической активности синтезированного нитрата защищены патентом №2086534 от 10.08.97.

Практическая значимость работы. В результате проведенных экспериментов получено новое химическое соединение - нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты, соединение зарегистрировано в ВНЦ БАВ,(№ государственной регистрации 10595694). Синтезированный нитрат обладает низкой токсичностью, антигипоксической, кардиотонической активностью, положительным влиянием на метаболические процессы в изолированном миокарде и может быть рекомендован в практическом здравоохранении для лечения и профилактики ИБС. Работа вносит вклад в химию лекарственных средств, создает теоретические предпосылки для направленного поиска биологически активных соединений.

Способ синтеза 2'-изопропил-5Ччетидциклогексилового эфира-З-метил-2-нитроксибутановой кислоты используется в научной и учебной работе кафедры общей химии Воронежской медицинской академии (акт внедрения № 25 от 22.03.99г.) и кафедры неорганической химии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения № 16 от 20.03.99г). На кафедре фармакологии Курского государственного медицинского университета внедрены методические указания для студентов по теме: «Органические нитраты -синтетические лекарственные средства для лечения заболеваний сердечно-

в виде хорошо кристаллизуемой массы. Перекристаллизацию проводили в хлороформе.

Таблица 1

Сравнительная оценка проведения гидролиза бромизовала для синтеза а-оксиизовалериановой кислоты

Метрологические характеристики Известный метод Разработанный метод

Х,% 41,0 58,0

ДХ 4,0 1,6

Э 3,2 0,7

1,6 0,4

8,% 4,7 2,7

х±дх 41 ±4,0 58±1,6

Синтезированную кислоту использовали как исходный продукт для синтеза нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты по схеме:

НзС СНз \/

СНз О ^ ^>СН-СН-<^-

СНз Вг Ш-С-МШ

II

О

кипячение СНз НС1(с ук);6ензол.

.КОН гн-С02

НзС СНз \/

О СН

СНз

-Н20

►/СН-СН-С / I \

СНз

гексан НМОзсдым.);^ 0°

СНз

а-оксиизовалериановая кислота содержит карбоксил и гидроксил, поэтому для нее характерны все реакции, свойственные карбоксильной группе и спиртовому гидроксилу. При взаимодействии а-оксиизовалериановой кислоты с ментолом (спирт), происходит замещение гидроксила в карбоксиле на остаток спирта и отщепление молекулы воды, группа -ОН отрывается от молекулы кислоты, а атом водорода - от спирта. В результате реакции образуется сложный эфир - ментиловый эфир а-оксиизовалериановой кислоты.

Реакция этерификации обратима, поэтому для перемещения равновесного процесса реакции в сторону образования сложного эфира, выделившуюся воду удаляли в виде азеотропной смеси с бензолом, а ментол брали в избытке. Для успешного прохождения реакции в качестве катализатора мы использовали сухой хлористый водород. Газ легко удаляется после завершения этерификации и не вступает в реакцию с компонентами смеси. Функция кислотного катализатора заключается в протонировании карбонильного кислорода, карбонильный атом углерода становится при этом более электрофильным и более «уязвимым» к атаке нуклеофильного агента, которым в данном случае является молекула спирта.

После выделения теоретически рассчитанного количества воды этерификацию считали завершенной, бензол удаляли при атмосферном давлении, а остаток - при давлении 1 мм.рт.ст. В итоге получили не растворимую в воде, хорошо растворимую в органических неполярных растворителях и этиловом спирте, вязкую темно-желтую многокомпонентную смесь, предположительно содержащую ментиловый эфир а-оксиизовалериановой кислоты.

Идентификацию синтезированного эфира проводили методом ТСХ со «свидетелем». Для проведения хроматографии нами была разработана методика и проанализированы различные системы растворителей. Лучшее разделение компонентов смеси наблюдалось в системе гексан-хлороформ в соотношении 1:4. ТСХ проводили на пластинках силуфола с закрепленным слоем сорбента «8ПиГо1 иУ-254», в качестве свидетелей использовали исходные компоненты реакции (ментол и а-оксиизовалериановую кислоту). Подсушенные хроматографические пластинки проявляли в йодной камере. В результате проведения хроматографии синтезированный эфир разделялся на три пятна с тянущимися «хвостами». Пятно №1 (Яг=0,1) соответствовало а-оксиизовалериановой кислоте, пятно №2 (11^0,4) -ментолу, а пятно №3 было значительно больших размеров и соответствовало ментиловому эфиру а-оксиизовалериановой кислоты (11г=0,8), что мы подтвердили функциональным анализом. Как известно, индикатором на ментол или его фрагмент в сложных эфирах, является раствор ванилина в концентрированной серной кислоте. При анализе пятна №3 на пластинках силуфола появляется малиново - красное окрашивание, что подтверждает наличие фрагмента ментола в синтезированном соединении. Так как синтезированный эфир трудно разделим

от исходных компонентов реакции, то для проведения второго этапа синтеза использовали реакционную смесь без выделения эфира в чистом виде, чтобы избежать его потери.

Для нитрования ментолового эфира а-оксиизовалериановой кислоты нами были подобраны оптимальные условия и разработана методика, основанная на реакции непосредственной этерификации спиртовой гидроксильной группы в структуре полученного сложного эфира. В качестве нитрующего агента нами была выбрана «дымящая» азотная кислота в чистом виде. Этерификацию проводили при температуре 0-4°С, реакция является экзотермической, при повышенной температуре идут в большей степени побочные реакции. Следы кислот увеличивают склонность нитратов к разложению, и при нагревании может произойти взрыв. Для равномерного охлаждения содержимое колбы интенсивно перемешивали механической мешалкой и медленно прикалывали реакционную смесь, содержащую ментиловыйэфир а-оксиизовалериановой кислоты. В качестве растворителя использовали гексан, так как он не нитруется сам в этих условиях и хорошо растворяет вещества реакционной смеси. По окончании прикапывания, содержимое колбы перемешивали еще 1,5 часа при той же температуре, для достоверности прохождения реакции нитрования. Затем все перелили в стакан со льдом.

2. Методы выделения, очистки и идентификации синтезированного нитрата

Для подтверждения подлинности получения нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты и доказательства его строения, мы подобрали оптимальные условия его выделения и очистки из реакционной смеси, разработали методики, позволяющие идентифицировать структуру и чистоту соединения. Экстракцию синтезированного нитрата проводили многократно гексаном по 1015мл для максимального извлечения продукта синтеза. Затем гексановыё вытяжки объединяли и тщательно промывали сначала очищенной водой, а затем раствором бикарбоната натрия для удаления азотной кислоты до нейтрального показателя рН. Для удаления остатков воды из смеси гексана и синтезированного продукта, раствор высушили над безводным М^04 в течение суток. Гексан отогнали при атмосферном давлении. Получили бесцветную, с желтоватым оттенком, маслянистую жидкость, имеющую характерный запах.

Идентификацию нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты проводили методом ТСХ со «свидетелем» и функциональным анализом. В качестве подвижной фазы использовали ранее подобранную систему растворителей, в качестве «свидетеля» - нитрат ментола, полученный в лабораторных условиях.

По результатам ТСХ синтезированный продукт разделялся на два пятна различных размеров. Пятно №1 было значительно больших размеров (Кс=0,3), и

при проведении функционального анализа на фрагмент ментола дало положительный результат. Как известно, индикатором на нитратную группу является раствор дифениламина в концентрированной серной кислоте. При обработке пятна №1 этим раствором на пластинке силуфола, появлялось синее окрашивание, что подтверждало наличие нитратной группы.

Пятно №2 (Лг=0,9) было значительно меньших размеров и соответствовало пятну «свидетеля». При функциональном анализе оба пятна давали положительный результат на фрагмент ментола и на нитратную группу. Таким образом, в результате проведённого синтеза получили новое химическое соединение - нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты и побочный продукт синтеза - нитрат ментола. Разработанная нами методика хроматографии позволяет достоверно идентифицировать синтезированный нитрат в чистом виде, и определять возможные примеси исходных продуктов и полупродуктов его синтеза.

С целью разделения и очистки смеси нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты и нитрата ментола нами были подобраны оптимальные условия для проведения жидкостно-адсорбционного варианта колоночной хроматографии. Отношение диаметра колонки к ее высоте составляло 1:10, а количество сорбента в 15 раз больше разделяемой смеси. В качестве неподвижной фазы мы использовали силикагель с размером гранул 100-150мкм. В качестве элюента - ранее подобранную смесь хлороформа и гексана в соотношении 1:4 соответственно. Порядок выхода продуктов синтеза из колонки соответствовал порядку продвижения продуктов на пластинке силуфола при проведении ТСХ. Таким образом, первым из колонки вымывался нитрат ментола, который мы собирали фракциями в пробирки по Юмл, азатем объединяли по ЗО-бОмл. Вторым начал выходить основной продукт синтеза - нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты, который также собирали фракциями по Юмл и объединяли. Контроль разделения и идентификацию продуктов проводили по ранее описанному методу ТСХ и функциональному анализу. Предел обнаружения нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты составил 1мкг в пробе. Из полученных объединённых фракций растворитель испаряли при атмосферном давлении. В результате проведения колоночной хроматографии нами было получено практически чистое химическое соединение, которое представляло собой прозрачную маслянистую жидкость с характерным запахом и было идентифицировано нами как нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты.

Возможность проведения перекристаллизации полученного нитрата выяснилась нами в процессе эксперимента. Объединенные фракции после проведения колоночной хроматографии мы перелили в выпарительные чашки и

оставили в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 3-10 дней для испарения растворителя. По истечении этого времени в чашках начали выпадать единичные белые кристаллы плоскопризматической формы. При охлаждении смеси количество кристаллов заметно увеличилось.

Для ускорения процесса выделения продукта синтеза в виде кристаллов, нами была разработана методика проведения перекристаллизации нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты. Как установлено ранее, продукт синтеза абсолютно не растворим в воде и хорошо растворим в этиловом спирте. Для проведения перекристаллизации нами был выбран 30% этанол. Выбор этанола обусловлен еще и тем, что для исследования биологической активности препарата в фармакологии используется именно 30% этанол, при большей концентрации спирта в живом организме происходят необратимые процессы. Смесь, полученную после завершения синтеза нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты, мы смешивали с 30% водным этанолом при незначительном нагревании, а затем ее охлаждали до 0-4°С. При комнатной температуре и н.у. спирт испарялся и происходило выпадение кристаллов синтезированного нитрата белого цвета, плоскопризматической формы, которые при фильтровании оставались на фильтре.

В дальнейшем, для очистки больших количеств сиитезированного продукта, мы использовали метод дробной перекристаллизации. Перекристаллизацию проводили из 96% этанола в 3-4 этапа, в зависимости от количества реакционной смеси. Разработанный метод позволяет быстро и эффективно проводить выделение синтезированного нитрата в виде кристаллов. Предложенный способ не требует больших затрат времени, растворителя и специального оборудования. Выход продукта составил 60±2,8 %. При анализе методом ТСХ физико-химические характеристики этих кристаллов соответствовали кристаллам, полученным при проведении колоночной хроматографии.

3. Изучение физико-химических характеристик сиитезированного нитрата

Для определения температуры плавления кристаллов нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты мы использовали общепринятую в химии методику.

В результате проведенных исследований, нами установлено, что значение температуры плавления исследуемых кристаллов значительно отличается от известных значений температур плавления ментола (41 -44°С), ментилового эфира а-оксиизовалерианоаой кислоты (жидкое вещество при н.у.), а-оксиизовалериаковой кислоты (78-80°С) и равно 58-60°С.

Для подтверждения структуры синтезированного нитрата использовали метод ИК-спектроскопии. На основании данных полученной ИК-спектрограммы достоверно подтверждена его структура (табл. 2).

Таблица 2

Физико-химические характеристики нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты.

Соединение Брутго- формула Mr г/моль Выход % Тпл°С Rf* Растворимость ИК-спектр СМ"!

шс снз о V СИЗ / ш >СН-СН-С / 1 1 СНз ON02 О снз C15H27N05 301 60 бесцв. крист. плоско призм. 58-60 0,3 Растворим: бензол, гсксан, пентан, хлороформ, этанол. Нерастворим: вода (V СНЗ)-2970 (v С=0)-1740 (8 С-0)-1200 (vasN02)-1650 (vs N02)-1300

Примечание: кристаллизовали из 30%-ного этанола

*В системе хлороформ: гексан (1:4)

Для идентификации исследуемого нитрата нами были подобраны условия и разработана методика проведения функционального анализа на фрагмент ментола и эфирную нитратную группу. В качестве индикатора использовали растворы ванилина и дифениламина в концентрированной серной кислоте. Изучение проводили в среде гексана. Окрашивание исследуемых растворов соответственно в малиновый и синий цвет подтвердило наличие фрагмента ментола и эфирной нитратной группы в структуре синтезированного нами нитрата. Предел обнаружения -10 мкг нитрата в 1,0мл анализируемого раствора.

Одним из требований, предъявляемых к лекарственному препарату, является его стабильность, также известно, что количественное определение сложных эфиров органических соединений основано на реакции их гидролиза, то есть по наличию нитрогруппы. Поэтому, для изучения реакционной способности синтезированного нитрата нами была разработана методика и выбраны оптимальные условия проведения реакции гидролиза: 1) при кипячении в очищенной воде (рН 5-6). Выбор данных условий обусловлен тем, что вода является основной средой, в которой осуществляются различные химические процессы, в том числе и реакции гидролиза в организме - in vivo; 2) при кипячении в водно-спиртовом растворе (W(C2H50H) =30% или W(no в-ву)=1%). Известно, что нитраты, обладающие коронаро-литическим действием, применяются в медицине в виде 1% спиртового раствора по веществу, поэтому необходимо изучить превращения синтезированного соединения в данных условиях; 3) при комнатной температуре и при кипячении в присутствии НС1(рН-2). В данных условиях нами моделировался гидролиз в желудочном соке. Как известно, желудочный сок, за счет наличия соляной кислоты, имеет рН 1 -2; 4) при комнатной температуре и при кипячении в водно - спиртовом растворе (W(C2H50H) в присутствии НС1(рН-2); 5) при комнатной температуре и при кипячении в водно - спиртовом растворе в присутствии НС1 W(HC1)=17%)

(рН-2); 6) при комнатной температуре и при кипячении в водно - спиртовом растворе в присутствии концентрированной НгБСМ (рН<1); 7) при комнатной температуре в водно - спиртовом растворе в присутствии 0,1н ЫаОН.

Контроль прохождения гидролиза осуществляли по обнаружению исходного нитрата ранее разработанным методом ТСХ со «свидетелем» и функциональным анализом. В результате проведенных исследований нами установлено, что синтезированный нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты является достаточно устойчивым соединением, его гидролиз возможен при кипячении в водно-спиртовом растворе в присутствии концентрированной ШБСМ (рН<1), и при комнатной температуре в водно-спиртовом растворе в присутствии 0,1н ЫаОН. В остальных описанных условиях эксперимента исследуемый нитрат не гидролизовался. Устойчивость сложноэфирной связи, возможно, связана со стереохимической затрудненностью реакции.

4. Количественное определение нитрата ментилового эфира а - оксиизовалериановой кислоты

Фотометрический метод количественного определения эфиров азотной кислоты используется на протяжении многих лет (И.М. Коренман, 1975). Метод основан на реакции гидролиза эфиров азотной кислоты, под действием концентрированной серной кислоты.

Н+

СН2(0Ы02)-СН(0М)2)-СН2((Ж02)+ЗН20 -►

-► СНгОН-СНОН-СНгОН+ЗНИОз

Освободившаяся азотная кислота взаимодействует с фенолом, растворенным в концентрированной серной кислоте, с образованием 6-нитрофенол-2,4-дисульфокислоты, аммиачный раствор которой окрашен в желтый цвет.

Нами была предпринята попытка применить выше названный метод для количественного определения синтезированного нитрата. Оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра СФ-26 при длине волны 406нм, в кювете толщиной 10мм.

Нами была исследована зависимость величины оптической плотности окрашенных растворов синтезированного нитрата от его количества, взятого на выполнение реакции. Относительная ошибка определения препарата в субстанции при доверительной вероятности 0,95 составила 1,33%. Установлено, что зависимость светопоглощения окрашенных растворов от концентрации анализируемого нитрата подчиняется основному закону фотометрии в пределах от 1 до 12* 10"3 мг/мл в 100мл конечного фотометрируемого раствора. При увеличении концентрации нитрата в измерении оптической плотности не наблюдается логической зависимости.

Экспериментальные исследования по разработке методики количественного определения нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты методом

ГЖХ проводились нами на базе центральной химической лаборатории Курского комбината «ISN Лексредства» на хроматографе «Хром-5» с пламенно-ионизационным детектором, газ носитель - водород. Как нами выявлено ранее, нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты является мало полярным соединением, поэтому для проведения анализа нами были экспериментально установлены следующие условия:

в качестве сорбента использовали «Метилсиликон» и стеклянную колонку «OV-lOl» диаметром 2мм и длинной 2,5м. Температура детектора 160°, время удерживания пробы 11 минут. Водород подавался со скоростью 50см3/мин, чувствительность прибора (Range*Attenuator) 100*4=400. Для анализа исследуемого нитрата готовили его раствор в гексане (ч.д.а.) и серию разведении в пробирках с концентрацией от 1 до 10 мг/мл в 10мл раствора. Из каждой пробирки пробы объемом 3 мкл вводили в хроматографическую колонку. На полученных хроматограммах изучали зависимости величины площади хроматографического пика от количества вещества в пробе. Площади пиков измеряли по формуле: S=h*yo,5; где S -площадь пика; h - высота пика; уо,5 - ширина пика на половине его высоты. На основании полученных данных построили калибровочный график и произвели расчет линейной зависимости:_

S = 4,82 С + 2,07

Разработанную нами методику мы использовали для количественного определения содержания синтезированного нитрата в субстанции. Для этого брали раствор исследуемого нитрата с концентрацией 10 мг/мл в 100мл гексана и готовили серию разведений (табл. 3).

Таблица 3

Статистическая обработка результатов количественного определения нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты методом ГЖХ.

Исследуемый нитрат Метрологические характеристики

Х,% ДХ S Sx е,% х±дх

Кристаллы 98,8 2,9 2,8 1,1 2,9 98,8±2,9

Относительная ошибка количественного определения синтезированного нитрата методом ГЖХ при доверительной вероятности 0,95 равна 2,9 %. Разработанный метод является селективным, чувствительным и высокоэффективным.

5. Изучение биологической активности и условий хранения синтезированного нитрата Острая токсичность синтезированного соединения с расчетом летальных доз по методу Б.М. Штабского с соавт. (1980) исследована в опытах на 37 белых мышах массой тела20±2г при внутрибрюшинном введении в объемах, не

превышающих 1мл. Полученные данные оценивали относительно валидола и нитроглицерина. Острое отравление животных характеризовалось снижением двигательной активности, глубины и частоты дыханий. Летальный исход в основном наступал через 85-160 минут.Острая токсичность нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты по показателю ЬО50, составила 57634±6852мг/кг и, в отличии от нитроглицерина, (1Л}50 9±3) достоверно не отличалась от известного своей нетоксичностью валидола(ЫЭ50 5501014787). Несмотря на широкое применение валидола в здравоохранении, случаев отравления этим препаратом в медицинской литературе не описано. В соответствии с классификацией К. К. Сидорова (1977), синтезированный нитрат является не токсичным соединением.

Антигипоксическая активность нами изучена в дозе 100 мг/кг в опытах на 24 белых мышах массой 20±2г при температуре окружающей среды 18-21°С при моделировании: 1) асфиксии с регистрацией на ЭКГ времени сохранения биоэлектрической активности сердца(А1апо с соавт.,1961); 2) гипоксии с нормокапнией при помещении животных в термокамеру с адсорбентом (натронная известь); 3) при «подъеме на высоту» 30м/с с определением времени выживаемости животных по тесту «смертельной площадки» (М.В. Кораблев, П.И. Лукиенко, 1976). Исследуемый нитрат вводили внутрибрюшинно за 30 минут до моделирования гипоксии.

Результаты опытов обрабатывали разностным методом вариационной статистики с определением средних величин и ошибки средней арифметической с учетом вероятности возможной ошибки по таблицам Стьюдента. Достоверными оценивали различия при р<0,05.

Продолжительность жизни животных в условиях термокамеры под влиянием нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты составляла 41,6± 1,7 минут, а в контроле 29,4± 1,3 минут, что в 1,4 раза больше контроля и превышало также значения, полученные на фоне валидола и нитроглицерина. Длительность биоэлектрической активности сердца при асфиксии у мышей в контрольной серии опытов составляла 7,4±0,4 минуты, а под влиянием нитрата возросла до 12,3 ±0,7 минут, что в 1,7 раза больше контроля и превышала значения, полученные от валидола и нитроглицерина.

По тесту «смертельной площадки» изучаемый нитрат увеличивал продолжительность жизни мышей до 8,7±0,4 минут при контрольных значениях 6,0 ±0,3 минуты.

Таким образом, антигипоксическая активность нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты статистически достоверна на трех моделях гипоксической гипоксии.

Кардиотропное действие оценивали при окклюзии коронарной артерии на изолированных по Лангендорфу сердцах крыс, лигировали нисходящую ветвь

левой коронарной артерии в месте ее бифуркации от венечной артерии (А.Х. Коган, 1979). В перфузате, полученном от изолированных сердец определяли уровни глюкозы, пирувата и лактата. Исследуемые показатели регистрировали синхронно на 5; 15; 30; 45 и 60 минутах эксперимента.

При перфузии изолированных сердец раствором Кребса-Генселейта, содержащим нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты в концентрации 1:5000, величина левожелудочкового давления снижалась. Нитроглицерин способствовал стабилизации левожелудочкового давления на уровне, близком к исходному. Валидол на указанный показатель практически не влиял. Максимальная скорость сокращения и расслабления левого желудочка, под влиянием исследуемого нитрата с 5-й минуты перфузии превышал не только исходные значения, но и зарегистрированные в экспериментах с нитроглицерином и валидолом.

Коронаролитическое действие изучали по методу Лангендорфа. При разведении 1 : 5000 в опытах на изолированных сердцах крыс. В ходе опытов регистрировали объемную скорость оттока перфузата из полостей изолированного сердца, частоту и амплитуду сокращений на 5;15;30;45 и 60 минутах. В оттекающем перфузате определяли динамику потребления глюкозы и выделения лактата и пирувата сердца. Объёмная скорость оттока перфузата из полостей изолированных сердец по Лангендорфу под влиянием нитрата первые пять минут эксперимента превышала исходный, а с 30-й по 60-ю минуты и контрольный уровни. В экспериментах с нитроглицерином отмечены также повышение объемов скорости оттока перфузата относительно исхода первые 30 минут наблюдения. Амплитуда и частота сердечных сокращений под влиянием изучаемого нитрата во всех сериях экспериментов не отличались от контрольных значений.

Положительное влияние на метаболизм изолированного сердца крысы нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты нами оценивалось по динамике: потребления глюкозы из перфузата (раствор Кребса-Генселейта), на 5;15;30;45 и 60-й минуте исследования.

Разница концентраций глюкозы в притекающем и оттекающем растворах отражала уровень ее потребления сердцем. Содержание глюкозы в пробах крови и перфузате определяли ортотолуидиновым методом, где концентрация глюкозы пропорциональна интенсивности ее окрашивания с о-Толуидином в растворе уксусной кислоты («Био-тест», квалификация реактивов х.ч.,Чехия). Уровень пировиноградной кислоты определяли модифицированным методом Умбрайта, где пируват конденсируется с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием гидразона, который со щелочью образует соединение коричнево-красной окраски (квалификация реактивов ч.д.ч) и способом, основанным на взаимодействии пирувата с ванилином в щелочной среде. Концентрацию молочной кислоты определяли по Баркеру и Саммерсону путем ее превращения в уксусный альдегид

и взаимодействия с п-оксидифенидом. Интенсивность окрашивания определяли на Спектрофотометре (СФ-46) и Фотоэлектроколориметре (ФЭК-56). Об утилизации этих метаболитов в зоне ишемии судили по проценту их экстракции, вычисленному на основании артерио-венозной разницы их концентраций в дистальном отрезке лигированной коронарной артерии (ДОКА) и ветви большой вены сердца (ВБВС), а также артериальной (АК) и венозной крови (ВК), расчитанным по формуле:

Концентрация ДОКА - Концентрация ВБВС

- х 100%

Концентрация ДОКА

О характере лактацидемии в зоне ишемии миокарда судили по «избыточному лактату» (ИЛ) окислительно-восстановительному потенциалу (ОВП) системы МК/ПВК, сдвигу окислительного потенциала (ОВП) после прохождения крови через зону ишемии миокарда, определяемым по формулам:

ОВП = - 204 мв- 30,7

Б ПВ1С

ОВП = ОВПВБВС-ОВПдокд; ИЛ=(МКэ-МКи)-(ПВКэ-ПВКи) х ;

ПВКи

где МКи и ПВКи - исходные уровни молочной и пировиноградной кислот, МКэ и ПВКэ - их концентрация на отдельных этапах опыта.

Величина редокс-потенциала системы МК/ПВК зависит от соотношения восстановленных и окисленных пиридиновых нуклеотидов. Сдвиг редокс-потенциала (ОВП) отражает интенсивность поглощения кислорода и характер фосфорилирования: положительные сдвиги указывают, что энергетические потребности обеспечиваются окислительным фосфорилированием, отрицательные - свидетельствуют об анаэробном образовании энергии.

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики. Достоверность динамики показателей глюкозы, пировиноградной и молочной кислоты при лигировании коронароной артерии и действии исследуемых веществ по сравнению с контролем определяли по Вилькоксону-Манну-Уитни. Достоверными оценивали различия при р<0,05. Количество глюкозы в перфузате, оттекающем из полостей изолированных сердец под влиянием нитрата в ходе всего эксперимента было ниже исходного уровня, в отличие от нитроглицерина, где концентрация глюкозы превышала исходные значения в ходе всего эксперимента.

На протяжении всего эксперимента уровень пирувата умеренно превышал значение исхода, но был ниже, чем у валидола. Несмотря на высокую скорость объемного отгока перфузата, уровень пирувата в нем сохраняется на значениях, близких к контрольным. Под влиянием нитроглицерина уровень пирувата в перфузате был ниже исходных значений в ходе всего периода наблюдения.

Уровень лактата в перфузате, оттекающем из полостей изолированного сердца под влиянием изучаемого нитрата в период всего наблюдения был ниже контрольного, а также зарегистрированного при перфузии валидола, что вероятно, обусловлено вымыванием кислых продуктов из миокарда, накопление которых лимитирует процессы гликолиза. В целом динамика лактата в перфузате была схожа со значениями нитроглицерина.

Для определения антимикробной активности исследуемого нитрата использовали бактериальные культуры: St.aureus; E.coli; Bac.antracoides; Candida; Ps.aeruginosa а так же питательные среды - мясо-пептонный бульон (МПБ) и мясо-пептонный агар (МПА). Нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты брали в растворе твина 80 и очищенной воды (соотношение: 1г твина 80 - 200мг нитрата- 10мл очищенной воды).

Определение проводили методом цилиндров и методом последовательных разведении в изотоническом растворе. Для изучения бактерицидного действия делали посев из каждой пробирки с разведениями на чашки Петри с МПА. В каждом случае отмечали задержку роста микроорганизмов. Задержки роста не обнаружили. Полученные нами результаты исследования микробиологической активности нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты свидетельствуют о том, что синтезированный нитрат в растворе твина 80 и очищенной воде не обладает антимикробной активностью.

Перспектива использования синтезированного нами нитрата в клинической практике для лечения ИБС не вызывает сомнения, а полученные результаты проведенных нами доклинических испытаний создают предпосылки для проведения его клинико-терапевтичекских и клинико-фармакологических испытаний.

Учитывая установленные нами ранее физико-химические характеристики нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты и его структурное сходство с валидолом и нитроглицерином, мы предложили его возможные лекарственные формы, три из которых получили в экспериментальном порядке: таблетки для сублингвального приема, простые порошки, желатиновые капсулы с различными дозами действующего вещества. Возможно получение гранул нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты, суспензии и лекарственной формы в виде спиртового раствора с различным процентным содержанием действующего вешества.

Предлагая возможные лекарственные формы нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты для применения в клинической практике мы параллельно исследовали условия хранения его кристаллов и порошка:

кристаллы исследуемого нитрата в равном количестве (0,5г) поместили в три одинаковых флакона прозрачного стекла, хорошо укупорили пластмассовыми крышками. Затем свернули три капсулы из вощёной бумаги, в которые так же

поместили по 0,5г порошка синтезированного нитрата.

Изучение влияния окружающей среды на изменение физико-химических характеристик синтезированного соединения проводили в условиях: 1) в сухом прохладном темном месте - в холодильнике при 15-10°С; 2) в сухом темном месте при комнатной температуре - в ящике письменного стола; 3) в сухом месте на свету, при Комнатной температуре - открытая книжная полка в лабораторной комнате.

Анализ качества нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты контролировали через каждые шесть месяцев по следующим показателям: внешний вид, средняя масса одной дозы, растворение, наличие примесей (ТСХ). При визуальном осмотре по внешним признакам (цвет, запах, форма кристаллов) изменений не обнаружили. При взвешивании содержимого каждого флакона и капсулы, нами было установлено, что количество вещества в них не изменилось. После этого провели анализ методом ТСХ и функциональный анализ по ранее разработанным методикам. Нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты не подвергся изменениям в течении семи лет (время наблюдения) при его хранении в выше описанных условиях.

ВЫВОДЫ

1. Проведен направленный синтез нового химического соединения - нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты с выходом 60%,Тпл. его кристаллов 58-60°С, соединение хорошо растворимо в органических неполярных растворителях, этаноле и практически не растворимо в воде. Установлена стабильность синтезированного нитрата в течение 7 лет.

2. Разработаны методы выделения, очистки и идентификации нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты, строение подтверждено ИК-спектроскопией, ТСХ и функциональным анализом.

3. Гидролиз нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты протекает только при кипячении в водно-спитровом растворе в присутствии концентрированной серной кислоты (рН< 1) и при комнатной температуре в водно-спиртовом растворе в присутствии 0,1нКаОН.

4. Разработан метод ГЖХ для количественного определения нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты. Относительная ошибка метода составляет 2,9%.

5.При СФ-метрических исследованиях выявлено, что зависимость светопоглощения окрашенных растворов нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты подчиняется основному закону светопоглощения в пределах от 1 до 12*10"3мг/мл в 100мл конечного фотометрируемого раствора. Относительная ошибка метода составляет 1,33%.

6. Острая токсичность синтезированного соединения по показателю 1ЛЗ 50 равна 57634±6852 мг/кг, что значительно отличается от показателей нитроглицерина (ЪО50 9±3мк/кг) и мало отличается от значений валидола(1Х)50

550Ю±4787мк/кг) и по классификации К.К. Сидорова является не токсичным соединением.

7. Нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты в дозе 1 ООмг/кг в опытах на белых мышах увеличивает сохранение биоэлектрической активности сердца при асфиксии в 1,7 раза по сравнению с контролем и нитрогличерином и в 1,5 раза по сравнению с валидолом. Продолжительность жизни животных увеличивается в термокамеры в 1,2 раза в сравнении с нитроглицерином и 1,4 раза в сравнении валидолом и контролем; по тесту «смертельной площадки» в 1,6 раза по сравнению с нитроглицерином и 1,5 раза по сравнению с валидолом и контролем.

8. Нитрат ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты в концентрации 1:5000 на изолированных по Лангендорфу цердцах крыс снижает левожелудочковое давление и увеличивает его максимальные скорости сокращения и расслабления. При перфузии раствором Кребса-Генселейта, содержащим синтезированный нитрат в концентрации 1:5000, значительно увеличивался отток перфузата из полостей изолированного миокарда, в котором понижается уровень потребления глюкозы и возрастает уровень пирувата.

9. Результаты экспериментов свидетельствуют о парспективности дальнейшего исследования нитрата ментилового эфира а-оксиизовалериановой кислоты и его использование в терапии ИБС.