Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка технологии получения, исследование свойств сульфатированного арабиногалактана и создание таблетированной лекарственной формы препарата атикоагулянтного и гиполипидемического действия

На правах рукописи

КОСТЫРО ЯНА АНТОНОВНА

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ, ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ СУЛЬФАТИРОВАННОГО АРАБИНОГАЛАКТАНА И СОЗДАНИЕ ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРЕПАРАТА АНТИКОАГУЛЯНТНОГО И ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

15 00 01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела 15 00 02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

"-■«-"О 1ььи 14

Москва-2008

003165014

Диссертационная работа выполнена в государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Иркутский государственный институт усовершенствования врачей Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Иркутском институте химии им А Е Фаворского Сибирского отделения Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор

Ковальская Галина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук Акашкина Людмила Владимировна ЗАО "ТТ-Стандард"

кандидат фармацевтических наук, доцент Суслина Светлана Николаевна -Российский университет дружбы народов

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 21 марта 2008 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212 203.19 при Российском университете дружбы народов по адресу 117198, г. Москва, ул Миклухо-Маклая, д 8, к 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов (117198, г. Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6)

Автореферат разослан 21 февраля 2008 г

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.203 19

доктор фармацевтических наук, доцент ««^к в в Дорофеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Атеросклероз - болезнь XXI века, лежащая в основе различной сердечно-сосудистой патологии, являющейся наиболее частой причиной смертности в индустриально-развитых странах Возможным подходом к решению вопросов профилактики и лечения атеросклероза является использование средств, направленных как на снижение общего уровня липидов, так и на изменение отдельных составляющих липидного спектра крови (Базисная и клиническая фармакология, 1998)

К этому классу потенциальных гиполипидемических средств относятся гепариноиды - природные, синтетические и полусинтетические вещества, действующие подобно гепарину, но отличающиеся от него по химической структуре, молекулярной массе и некоторым фармакологическим свойствам (Баркаган 3 С, 2000) Изучение гиполипидемической активности гепариноидов весьма активно ведется во всем мире, но сегодня на фармацевтическом рынке России этот класс интереснейших биологически активных веществ представлен только препаратом «Сулодексид» (Vessel Due F, Alfa-Wassermann S p A., Italy капсулы 250 ЛЕ, раствор для инъекции 600 JIE/2 мл), являющимся лекарственным средством импортного производства, что объясняет его высокую рыночную стоимость Применение препарата «Сулодексид» в качестве средства для вторичной профилактики коронарного атеросклероза и его осложнений доказано клиническими испытаниями (Аронов ДМ с соавт, 1995, Аронов ДМ, 1997), однако в современной медицине этот препарат применяется только, как антикоагулянт прямого действия - для профилактики и лечения ангиопатий различной локализации (Венгеровский А И , 2006, Клиническая фармакология, 2006) Гиполипидемические средства других групп (статины, производные фиброевой кислоты) на фармацевтическом рынке России также представлены только импортными дорогостоящими препаратами, что в совокупности с длительностью терапии делает их материально недоступными большому числу больных

Поэтому разработка эффективных и доступных гиполипидемических средств является одной из наиболее актуальных проблем современной медицинской и фармацевтической науки, а исследование представителей класса гепариноидов в этом направлении перспективно

В лаборатории природных синтонов и лигандов Иркутского института химии им А Е Фаворского СО РАН впервые методом направленного синтеза с целью создания нового представителя класса полусинтетических гепариноидов нами разработана оригинальная наноструктурированная фармакологически активная субстанция, представляющая собой сульфатированный арабиногалактан в виде калиевой соли (AGSK) и обладающая гиполипидемической и антикоагулянтной активностью

В основе данной работы лежит химическая модификация (сульфатирование) растительного полисахарида - арабиногалактана, получаемого в результате комплексной безотходной переработки древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb) Содержание арабиногалактана в древесине достигает порядка 15%, что свидетельствует об огромных запасах исходного сырья и возможных

перспективах массового производства нового биологически активного средства на основе арабиногалактана

Разработка технологии получения и внедрение оригинальной отечественной наноструктурированной субстанции антикоагулянтного и гиполипидемического действия в медицинскую и фармацевтическую практику соответствует задачам реализации "Среднесрочного плана фундаментальных исследований по приоритетным направлениям развитии науки, технологий и техники Российской Федерации на период 2007-2009 годы"

Целью работы является разработка технологии получения к исследование свойств оригинальной наноструктурированной субстанции - сульфатированного арабиногалактана в виде калиевой соли (АСБК) и разработка на ее основе пероральной таблетированной лекарственной формы препарата гиполипидемического и антикоагулянтного действия

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать технологию получения оригинальной субстанции АОЯК, изучить ее физико-химические и технологические свойства

2 Разработать методики качественного и количественного анализа субстанции Ав8К для ее стандартизации

3 Изучить токсичность, антикоагулянтное и гиполипидемическое действие биологически активной субстанции АС8К

4. Разработать состав и технологию получения таблетированной лекарственной формы субстанции АвБК для перорального применения с высокой фармацевтической и биологической доступностью и изучить ее фармакологическую активность

5 Провести стандартизацию и изучить стабильность разработанной таблетированной лекарственной формы субстанции ЛбБК для перорального применения

6 Разработать и апробировать нормативную документацию на оригинальную субстанцию АвБК и ее таблетированную лекарственную форму

Научная новизна работы. Впервые методом направленного синтеза получена оригинальная наноструктурированная фармакологически активная субстанция, относящаяся к классу полусинтетических гепариноидов, представляющая собой сульфатированный арабиногалактан в виде калиевой соли (АОБК)

Установлена структура, изучены физико-химические и технологические свойства АвБК субстанции

Разработан методический подход к стандартизации А08К в субстанции и таблетированной лекарственной форме, заключающийся в использовании химических реакций (обнаружение органически связанной сульфатной группы, полисахаридных фрагментов и ионов калия) в сочетании с физико-химическими методами (гель-проникающей хроматографии, поляриметрии, потенциометрии, спектрофотометр™ в УФ- и видимой области спектра, ИК-, 13С ЯМР-спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии)

Теоретически обоснована и экспериментально на моделях гиперлипидемии у крыс подтверждена целесообразность использования оригинальной Ай8К

субстанции в качестве гиполипидемического средства и антикоагулянта прямого действия

На основании проведенных комплексных физико-химических, технологических и биофармацевтических исследований теоретически и экспериментально обоснованы оптимальный состав и технология получения лекарственной формы «АвБК таблетки 500 мг» методом прямого прессования, обеспечивающие высокие показатели фармацевтической и биологической доступности при пероральном применении

Установлено, что относительная биологическая доступность таблеток АС8К сравнима с относительной биологической доступностью самой субстанции при пероральном применении (50,0% и 54,4% соответственно), что свидетельствует о рациональном выборе вспомогательных веществ, примененных для таблетирования АС5К

В сравнении с используемым в медицинской практике аналогом -представителем класса гепариноидов (капсулы препарата «Сулодексид») изучены и установлены сопоставимые по эффективности гиполипидемическая и антикоагулянтная активности лекарственной формы «АвБК таблетки 500 мг» при пероральном применении

Практическая значимость. Разработан и запатентован оригинальный метод химической модификации (сульфатирование) полисахарида арабиногалактана, получаемого в результате комплексной безотходной переработки древесины лиственницы сибирской (Ьагис я&тса 1.ейеЬ) (патент 2319707, Костыро Я А с соавт , опубл 20 03.2008, Бюл № 8) По результатам исследований разработаны и внедрены Состав и оценка качества препарата «АОЯК субстанция» (проект ФСП (ИрИХ СО РАН»,

Состав и оценка качества препарата «АвБК таблетки 500 мг» (проект ФСП (ИрИХ СО РАН)),

Технология получения АОБК субстанции (лабораторный регламент на производство утвержден ИрИХ СО РАН)

Технология получения препарата «АОБК таблетки 500 мг» (лабораторный регламент на производство утвержден ИрИХ СО РАН)

Лабораторный регламент на производство препарата «АСБК таблетки 500 мг» апробирован в ООО "Сольвей ЭМ" (акт наработки препарата от 20 06 2005 г) Установленная фармакологическая эффективность, доступность исходных ингредиентов, простота и воспроизводимость разработанной технологии производства лекарственного препарата «АОБК таблетки 500 мг» являются обоснованием перспективности ее внедрения в практическую медицину, что позволит после проведения дополнительных доклинических и клинических испытаний пополнить арсенал гиполипидемических средств и антикоагулянтов прямого действия для перорального применения оригинальным препаратом отечественного производства

Основные положения диссертации внедрены в учебном процессе кафедры фармации Иркутского ГИУВа (акт внедрения от 10 09 2007 г) и кафедры фармацевтической и токсикологической химии Алтайского ГМУ (акт внедрения от 14 И 2007 г)

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты создания оригинальной АвЗК субстанции, изучения ее структуры, физико-химических и технологических свойств;

- методики качественного и количественного анализа АОБК,

- результаты разработки таблетированной лекарственной формы АвБК и ее стандартизации,

- результаты изучения токсичности, фармакокинетики при различных путях введения в организм, гиполипидемической и антикоагулянтной активности АСБК субстанции и ее таблетированной лекарственной формы для перорального применения

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на Всероссийском Симпозиуме "Химия органических соединений кремния и серы" (Иркутск, 2001), Конференции молодых ученых ИНЦ СО РАН "Интеграция фундаментальной науки и высшей школы в устойчивом развитии Сибири" (Иркутск, 2001), 59-й, 62-й научных конференциях пю фармации и фармакологии "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (Пятигорск, 2004, 2007), Всероссийской конференции "Актуальные проблемы медицины" (Томск, 2004), III Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Саратов, 2004), III Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья" (Барнаул, 2007), 11-м Международном Конгрессе "Фитофарм 2007" (Лейден (Нидерланды), 2007), Международном междисциплинарном Симпозиуме "От экспериментальной биологии к превентивной и интеграционной медицине" (Судак (Крым, Украина), 2007), II Международной на(учной конференции "Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений" (Алматы (Казахстан), 2007), 43-й Республиканской научной конференции "Создание новых лекарственных препаратов" (Томск, 2007)

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ Иркутского института химии им А Е Фаворского СО РАН по теме "Развитие химии и глубокой переработки древесины получение новых биологически активных и технически ценных продуктов для медицины, сельского хозяйства и критических технологий" (№ государственной регистрации 01 2004 06380), "Наносистемы, нанореагенты и нанореакторы на основе гемицеллюлоз и других полифункциональных полимеров для критических технологий и медицины" (№ государственной регистрации 01 2007 04822) и ГОУ ДПО "Иркутский государственный институт усовершенствования врачей Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" по медико-биологическим проблемам, раздел "Фармация" (№ государственной регистрации 01 2007 06367)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 - в зарубежной печати (Нидерланды, Украина, Казахстан) и 2 статьи в рецензируемых журналах, получен 1 патент на изобретение

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 48 рисунков Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования

(экспериментальная часть), двух глав обсуждения результатов собственных экспериментальных исследований, выводов, библиографического списка и приложения Список литературы включает 158 источников, из них 61 работа зарубежных авторов

Во введении изложены актуальность, цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы

В первой главе представлен обзор литературы по теме диссертации, включающий сведения об основных представителях класса гепариноидов, их химической структуре, физико-химических и биологических свойствах Представлены данные о лекарственных препаратах, разработанных на основе гепариноидов, и их применении в медицинской практике

Во второй главе дана характеристика объекта исследования и вспомогательных веществ, описаны методики, применяемые для разработки технологии получения и стандартизации AGSK субстанции, а также состава и технологии получения её таблетированной лекарственной формы Приведены методики оценки качества, биологической и фармацевтической доступности препарата «AGSK таблетки 500 мг» и экспериментальные модели для определения фармакологической активности субстанции и препарата

В третьей главе приводятся данные по разработке технологии получения, установлению структуры и стандартизации оригинальной наноструктурированной субстанции, представляющей собой сульфатированный арабиногалактан в виде калиевой соли (AGSK) Приведены результаты по изучению "острой" токсичности, фармакокинетики при различных путях введения в организм, фармакологической (антикоагулянтной и гиполипидемической) активности и стабильности AGSK субстанции при хранении в течение 2,5 лет

Четвертая глава посвящена разработке состава и технологии получения таблетированной лекарственной формы AGSK субстанции, а также изучению ее биологической доступности и фармакологической активности при пероральном применении по сравнению с официнальным препаратом класса гепариноидов «Сулодексид» (Vessel Due F, капсулы 250 ЛЕ, Alfa-Wassermann S р А , Italy) Приведены результаты по изучению стабильности препарата «AGSK таблетки 500 мг» при хранении в течение 2,5 лет

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явилась оригинальная биологически активная субстанция, представляющая собой сульфатированный арабиногалактан в виде калиевой соли (AGSK) наноструктурированный функционализированный биополимер со сферической формой частиц, размер крупных агломератов которых находится в интервале 200-600 нм, сульфатные группы в макромолекуле находятся при С-2 и С-4 углеродных атомах основной гапактановой цепи и при С-6 углеродном атоме концевых остатков галактозы основной и боковой цепей полисахарида

Для определения физико-химических свойств AGSK субстанции и технологических характеристик разрабатываемых на ее основе таблеток использовали ИК-, 13С ЯМР -спектроскопию, спектрофотометрию в УФ- и

видимой области спектра, гельпроникающую хроматографию (ГПХ), поляриметрию, потеициометрию, сканирующую электронную микроскопию, а также методики, описанные в ГФ XI (вып 1 и 2).

Оценку безвредности и фармакологической активности AGSK субстанции и ее таблетированной лекарственной формы проводили по унифицированным методикам (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000)

Экспериментальные данные фармакологических исследований в опытах т vitro и ш vivo статистически обработаны, используя непараметрический метод (критерий Манна - Уитни), приведенный в пакете STATISTICA 6 0, экспериментальные данные физико-химических и технологических исследований субстанции AGSK статистически обработаны при помощи критерия Стьюдента по стандартным методикам ГФ XI с использованием для расчетов компьютерной программы MS Excel

ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ОРИГИНАЛЬНОЙ НАНОСТРУКТУРИРОВАННОЙ AGSK СУБСТАНЦИИ

В лаборатории природных синтонов и лигандов Иркутского института химии им А Е Фаворского СО РАН нами разработана и запатентована оригинальная технология получения биологически активной субстанции, представляющей собой сульфатированный арабиногалактан в виде калиевой соли (AGSK)

В основе разработанной технологической схемы производства AGSK (рисунок 1) лежит химическая модификация (сульфатирование) растительного полисахарида - арабиногалакгана (AG), получаемого в результате комплексной безотходной переработки древесины лиственницы сибирской (патент 2256668, Бабкин В А с соавт., опубл 20 07 2005, Бюл. № 20)

Практический выход целевого продукта (AGSK субстанции) согласно представленной схемы ее производства составляет не менее 95% от исходного количества взятого для синтеза арабиногалактана

Структура AGSK (рисунок 2) установлена при помощи данных элементного анализа, исследования молекулярно-массовых характеристик, ИК-, 13С ЯМР-спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии

Расчетным методом получено значение степени замещения макромолекулы биополимера (AGSK) равное 0 4, то есть на одну структурную единицу макромолекулы приходится порядка одной сульфатной группировки Их местоположение было определено на основании данных ИК- и 1 С ЯМР-спектров при сравнении с соответствующими спектрами исходного AG

В ИК-спектре AGSK в отличие от ИК-спектра AG помимо общих полос поглощений для сравниваемых соединений присутствует полоса поглощения высокой интенсивности при 1235,2 см'1, принадлежащая валентным колебаниям S=0 и свидетельствующая о наличии в макромолекуле биополимера сульфатных групп Специфические полосы поглощения при 817,1 см"1 и 849,8 см"1, отсутствующие в ИК-спектре исходного AG, свидетельствуют о наличии в структуре AGSK первичного и вторичного аксиального сульфатов (Lloyd A G et at, 1961)

ВР-1 1 Подготовка производственных помещений и технологического воздуха

ВР-1 2 Подготовка технологическою оборудования и одежды персонала

ВР-1 3 Подготовка персонала

ВР-2 2 Получение и стандартизация сульфатирующей смеси

ВР-2 3 Получение воды очищенной

ВР-2 4 Приготовление кали едкого раствора

ВР-2 5 Измельчение аоабиногалактана

ВР-2 6 Отвешивание реагентов

ТП-3 1 Сульфатирование

ТП-3 2 Нейтрализация реакционной смеси

ТП-3 3 Выделение сырого продукта

ТП-3 4 Диализ

ТП-3 5 Выделение конечного продукта

ТП-3 6 Сушка в вакууме

УМО-5 1 Фасовка и упаковка субстанции

УМО-5 2 Маркировка готового продукта

ВР-2 1 Очистка органических растворителей

ВР-1 Санитарная

подготовка

производства

Отходы

ВР-2 Подготовка компонентов

Отходы

Потери механические

ТП-3 Получение

субстанции

AGSK

Отходы

Отгон спирта этилового

ТП-4 Оценка качества и бракераж

УМО-5 Упаковка и маркировка готового продукта

Потери механические

Склад готовой продукции

Рисунок I - Технологическая схема получения субстанции AGSK

Наличие и положение сульфатных группировок в AGSK подтверждается и данными |3С ЯМР-спектра (таблица 1) В нем наблюдается закономерный сдвиг на 6-10 мд в слабое поле исходных сигналов С-2 и С-4 атомов основной галактановой цепи и С-6 атома боковых и концевых галактановых фрагментов, несущих сульфатные группы Сигналы атомов С-1, С-3 и С-5 геминальные к атомам углерода, имеющим сульфатный заместитель, испытывают сильнопольный сдвиг на 2-4 м д (Усов А И , 2001)

Рисунок 2 - Фрагмент структуры ЛОЬК

Таблица 1 - Данные 13С ЯМР-спектров исходного АС и АС8К

'"*С ЯМР-спектр (м.д.)

Биополимер С-1 С-2 с-з С-4 С-5 С-6

Ав 103.5 70.7 73.0 82.0 (1—>3 связь) 68.5 75.1 60.9 68.5 (1—>6 связь)

АС8К 103.0 69.5-70.1 71.0-71.9 67.8-68.1 72.7-73.6 60.4

101.0 75.7-76.7 79.2-81.4 74.0-74.4 68.5

(С-О-ЯОзК) (1 —>3 связь) (С-0-503К) (I—>6 связь) 66.2-66.8 (С-О-ЭОзК)

Таким образом, АС8К представляет собой функционализированный биополимер, в котором сульфатные группы находятся при С-2 и С-4 углеродных атомах основной галактановой цепи и при С-6 углеродном атоме концевых остатков галактозы основной и боковой цепей полисахарида.

С целью разработки критериев качества АС8К субстанции были проведены исследования по изучению её физико-химических свойств. Данные этой работы представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Физико-химические характеристики АС и АС8К

Наименование параметра АС АвБК

Молекулярная масса 12,4 кД 15,7 кД

Степень полимеризации макромолекулы 60-70 55-60

Количественное содержание 5 - 11,2 ±0,6%

Растворимость н2о, омво Н20

Удельное вращение +13,5; С=1%, Н20 + 19,5; С=1%, Н20

рКа - 3,16; С-1%, Н20

рН 7,97; С=1%, Н20 5,10; С=1%, Н20

Установлено, что АОЯК субстанция обладает физико-химическими свойствами, схожими с исходным АО. Выявленные различия могут быть использованы для идентификации данных соединений.

При разработке методик качественного анализа АС5К субстанции исходили из полисахаридной природы макромолекулы биополимера (реакция со спиртом

10

этиловым ректификованным - белый аморфный осадок) и наличия в ее составе функциональных групп: органически связанной сульфатной группировки (метахроматическая реакция с толуидиновым голубым - изменение окраски раствора красителя с синей на сиреневую) и ионов калия (реакция с раствором натрия кобальтинитрита - жёлтый кристаллический осадок)

Использование комплекса химических и физико-химических методов позволяет достоверно устанавливать подлинность AGSK субстанции, отличая ее от исходного AG Разработанные методики идентификации AGSK легли в основу ФСП «AGSK субстанция»

Согласно разработанной технологии получения AGSK в качестве возможной посторонней примеси (родственные соединения) может выступать только исходный AG, непрореагировавший с сульфатирующей смесью Для определения его количества была использована различная способность исследуемых соединений к растворению в органических растворителях

Трехкратной экстракцией AGSK диметилсульфоксидом (DMSO) выделили возможную примесь Гравиметрическим методом было определено ее количество При помощи ИК-, 13С ЯМР-спектроскопии, 1'1 IX и поляриметрии выделенное соединение было идентифицировано как исходный AG, содержание которого в AGSK составляет 4,1 ± 0,3 %

Разработанная методика определения родственных соединений (исходного AG) была включена в раздел "Посторонние примеси" ФСП «AGSK субстанция»

Для количественного определения AGSK был применен модифицированный метод количественного определения серы (ГФ XI) - метод осадительного титрования (барийметрия) в водно-органической среде, где в качестве растворителя использован ацетон Конечную точку титрования устанавливали с помощью индикатора 0,2%-ного водного раствора хлорфосфоназо III (Гельман Н Э с соавт., 1987) Метрологическая оценка разработанной методики представлена в таблице 3

Таблица 3 — Метрологическая характеристика оценки методики количественного определения AGSK субстанции

f X S2 S S, Р,% t(P,/) Дх Е,%

4 11,21 % 0,1221 0,3494 0,1563 95 2,78 0,43 3,87

Относительная ошибка разработанной методики количественного определения Ав5К субстанции (по количественному содержанию серы) не превышает ±5,0%, то есть разработанная методика не отягощена систематической ошибкой Это позволяет включить ее в раздел "Количественное определение" ФСП «АС8К субстанция»

При помощи сканирующей электронной микроскопии было установлено, что АС8К является наноструктурированным биополимером со сферической формой частиц, размер крупных агломератов которых находится в интервале 200600 нм

Это обстоятельство придает АСвК массу возможностей и преимуществ по сравнению с другими соединениями наноструктуры способны в низких дозах обеспечивать адекватный и пролонгированный эффект, что снижает риск

11

развития побочных действий, уменьшает их дозировку в лекарственной форме и увеличивает интервал между приемами наноструктурированного лекарственного препарата по сравнению с аналогами, но не являющимися наноструктурами (PresccottJ.H etat., 1995)

Данное утверждение было подтверждено результатами, полученными при проведении работ по изучению "острой" токсичности, фармакокинетики и фармакологической активности наноструюгурированной субстанции AGSK

Определение безвредности которой в виде свободной субстанции и таблеток в опытах in vivo было проведено на белых нелинейных мышах массой 18-20 г по методу Кербера (таблица 4)

При внутрижелудочном введении AGSK субстанции и её таблетированной лекарственной формы значения ЛД50 получить не удалось, так как даже при введении дозы AGSK 6000 мг/кг, гибели животных не наблюдалось Таким образом, субстанция AGSK согласно ГОСТ 12 1 007-76 "Вредные вещества Классификация и общие требования безопасности" относится к IV классу опасности — "вещества малоопасные"

Таблица 4 - "Острая" токсичность АС8К субстанции и ее таблетированной лекарственной формы для перорального применения

Препарат Путь введения ЛД50(мркг)

Гепарин (Doczi J et at, 1953, Розкин M Я с соавт, 1988) Парентеральный 1500-3000

AGSK субстанция Парентеральный >6000

AGSK субстанция Пероральный -

AGSK таблетки 500 мг Пероральный -

При парентеральном введении AGSK субстанции гибель подопытных животных происходила в течение первых трех суток эксперимента, и как было показано патоморфологическими исследованиями, смерть наступала в результате многочисленных точечных кровоизлияний в желудочно-кишечном тракте, поэтому следующим этапом изучения фармакологической активности стало исследование антикоагулянтного действия AGSK

Влияние AGSK субстанции на коагулограмму крови оценивали по тесту АГГГВ (активированное парциальное тромбопдастиновое время) в "терапевтической гипокоагуляционной дозе", при применении которой наблюдается увеличение времени АПТВ не более чем в 2,5 раза по сравнению с исходными значениями (Вавилова Т В , 2005, Явелов, И С , 2005)

Эксперимент, проведённый в опытах иг vitro на сливной плазме здоровых доноров, показал, что использование подобранных "терапевтических гипокоагуляционных доз" гепарина (0,18 ЕД^мл плазмы) и AGSK (0,025 miAm плазмы) вызывает сопоставимый антикоагулянтный эффект - увеличение времени АПТВ по сравнению с исходными значениями в 2,4 раза для гепарина и в 2,2 раза для AGSK

Для более детального изучения антикоагулянтного действия AGSK субстанции были проведены исследования в опытах ш vivo на белых нелинейных крысах-самцах массой 200-250 г (рисунок 3).

Время, ч

Рисунок 3 - Эффект действия AGSK при подкожном введении крысам в дозе 30 мг/кг по тесту АПТВ

Антикоагулянтный эффект после однократной подкожной инъекции AGSK субстанции постепенно нарастал, достигая своего максимума через 3 часа, когда значение показателя АПТВ превышало исходное в 4 раза И на таком уровне (64,9 ± 0,7 с) сохранялось в течение 3 часов, затем отмечалось плавное снижение силы антикоагулянтного действия, без выраженных пиков гипокоагуляции, когда повышается опасность геморрагических осложнений Полностью антикоагулянтный эффект не угасал и через 24 часа, так как значение показателя АПТВ превышало исходное в 1,3 раза, что свидетельствует об отсутствии у исследуемого соединения "эффекта отдачи" при котором возникает риск тромбообразования

Многие представители класса гепариноидов помимо проявления ими антикоагулянтной активности, способны оказывать влияние на липидный обмен в организме (Schuler W et at, 1957, Jacúes L В , 1980, Окуневич И В. с соавт , 1992, Рыженков В Е с соавт, 1996, Gunay N S et at, 1999)

В связи с этим нами был проведён эксперимент в опытах in vitro на сливной сыворотке крови людей, имеющих различные нарушения липидного обмена Влияние AGSK на показатели липидного обмена по сравнению с гепарином было изучено в "терапевтических гипокоагуляционных дозах", определенных для каждого из них в предыдущем эксперименте В сыворотке крови определяли содержание общего холестерина (ХСобщ) и количество атерогенных липопротеидов (ß-ЛП) AGSK значимо (р<0,05) снижает уровень ХС0бщ сыворотки крови на 9,5% по сравнению с контролем, в то время как гепарин снижает этот показатель всего на 6,8% Гиполипидемическое действие AGSK проявляется также и в значимом (р<0,05) снижении уровня ß-ЛП на 13,5%, снижение же этого показателя под действием гепарина достигает всего 5,6%

Одним из основных требований предъявляемым к современным препаратам для профилактики и лечения атеросклеротического повреждения кровеносных сосудов является их обязательное пероральное применение (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000), так как терапия гиперлипидемических состояний длительна и в большинстве своем проводится в амбулаторных условиях Поэтому при создании

гиполипидемических препаратов встает вопрос разработки их пероральной лекарственной формы

Субстанция АвБК является слабой кислотой (рКа = 3,16, рН ВОДных растворов = 5,1), вследствие чего должна обладать хорошей всасываемостью в желудке (Муравьёв И А и соавт., 1983) Все сульфатные группировки в АйБК являются эфирносвязанными, что затрудняет кислотное расщепление макромолекулы полисахарида, в результате чего возрастает устойчивость субстанции А05К к кислотному гидролизу под действием желудочного сока (Степаненко Б Н, 1978, Лакин КМ с соавт, 1981) Следовательно, по теоретическим расчетам АСБК субстанция должна иметь высокую биологическую доступность при перорапьном применении вследствие своей устойчивости к кислотному гидролизу и хорошей всасываемости в желудке Таким образом, теоретически обоснована возможность перорального применения АвБК субстанции, а, следовательно, и целесообразность разработки на ее основе лекарственных форм для перорального применения

Для доказательства теоретических обоснований разработки пероральной лекарственной формы АвБК субстанции были проведены эксперименты по изучению ее фармакокинетики при различных путях введения в организм

Максимальной концентрации при подкожном (87 мкг/мл) и пероральном (108 мкг/мл) введениях крысам Ав8К субстанция достигает через 3 часа Учитывая это, моделирование фармакокинетики АОБК проводили с использованием одночастевой модели со всасыванием (Соловьев В Н с соавт, 1980) Основные фармакокинетические параметры изучаемой субстанции у крыс при подкожном и пероральном введении представлены в таблице 5

Таблица 5 - Фармакокинетические параметры субстанции АСБК в плазме крови крыс после однократного подкожного и перорального введения в дозах 30 и 90 мг/кг соответственно

Параметры Подкожное введение Пероральное введение

АиСо->24, мкгхч/мл 314,22 613,94

0,21 0,22

Ка,Ч ' 0,50 0,74

1|/2» Ч 3,30 3,15

Ч 1,39 0,94

УАЛ 0,11 0,16

С1,, л/ч 0,02 0,04

МЯТ, ч 4,71 6,30

Р™, % 54,38

Примечание - АиСо-,24 - площадь под фармакокинетической кривой, К^ - константа элиминации, Ка- константа всасывания, Х\п - период полувыведения, х'|/2 - период полувсасывания, У л - объём распределения, СЬ - плазменный клиренс, МЯТ -среднее время удержания, - относительная биодоступность

Анализируя полученные в ходе эксперимента данные, были сделаны следующие выводы

1 При пероральном введении АС8К имеет место "эффект первого

прохождения" субстанции через печень

2 Величина относительной биологической доступности AGSK при

пероральном приёме составляет 54,4% Это достаточно высокий показатель, свидетельствующий об устойчивости исследуемого соединения в желудочно-кишечном тракте, что было подтверждено изучением гиполипидемической активности AGSK субстанции в опытах т vivo при пероральном применении на модели гиперлипидемии у крыс, индуцированной введением детергента твин-80 в дозе 250 мг/100 г веса животного (Полякова Э Д, 1973)

AGSK субстанция в дозе 90 мг/кг веса животного положительно влияет на течение экспериментальной гиперлипидемии у крыс. Она значимо снижает содержание ХСобщ на 13,1% (р<0,05) и уровень триглицеридов (ТГ) на 13,2% (р<0,01) в опытной группе животных по сравнению с модельной

Таким образом, разработанная нами оригинальная наноструктурированная субстанция AGSK при пероральном применении оказывает выраженное гиполипидемическое действие, что является в совокупности с высокой относительной биологической доступностью (54,4%) научно доказанным обоснованием для разработки пероральной лекарственной формы

РАЗРАБОТКА ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ AGSK

Учитывая физико-химические свойства и специфическую фармакологическую активность AGSK субстанции, ее наиболее рациональной пероральной лекарственной формой являются таблетки

Для разработки таблетированной лекарственной формы AGSK были изучены объемно-технологические параметры субстанции И как показали результаты проведенного эксперимента, AGSK субстанция представляет собой мелкодисперсный аморфный порошок, высоко гигроскопичный (20,07%), практически однородный по гранулометрическому составу (фракции- < 0,25 мм 19,8%; 0,25-0,5 мм 59,5%; 0,5-1,0 мм 8,6%; 1,0-2,0 мм 10,5%; 2,0 -3,0 мм 1,4%; > 3,0 мм 0,2%), с удовлетворительной сыпучестью (5,56 г/с) и средней насыпной массой (843,17 кг/м3), обладающий плохой прессуемостью (прочность на излом) (24,5 Н) с высоким коэффициентом уплотнения (7,5)

Известно, что наиболее технологичным и экономически выгодным способом таблетирования порошковых масс является их прямое прессование, так как при этом исключается негативное влияние температуры и влажности окружающей среды на качество получаемых таблеток, что весьма актуально в случае высоко гигроскопичных веществ (Кузнецов А В с соавт., 2003)

Исходя из полученных экспериментальных данных, было принято решение о таблетировании AGSK методом прямого прессования после улучшения объемно-технологических параметров с помощью использования вспомогательных веществ, улучшающих сыпучесть, прессуемость и снижающих гигроскопичность таблетируемой смеси

Из вспомогательных веществ (ВВ), отвечающих этим требованиям, были выбраны микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ), поливинилпирролидон низкомолекулярный (ПВП) (прочносвязывающие ВВ) и глиданты кремний диоксид коллоидный (аэросил) и обезжиренный молочный сахар (лактоза)

Методом прямого прессования при стандартном давлении (120 МПа) с использованием выбранных ВВ были спрессованы плоскоцилиндрические таблетки диаметром 12 мм и проведены исследования по определению показателей их качества таким, как описание, прессуемость (прочность на излом) и высота таблетки.

Результаты эксперимента показали, что монокомпонентное использование выбранных ВВ для таблетирования субстанции АйБК прямым прессованием оказалось не достаточным, так как прессуемость таблетируемых смесей (рисунок 4) так и не достигла средних значений 40-70 Н (Борзунов Е.Е., 1972).

■ А <ЙК субстанция 500 мг

Прессуемость 25 / (прочность на 20 излом), Н 15 10

п AG.SK субстанция 500 мг +

МКЦ 100 мг □ А (ЗЭК суб станция 500 мг +

лактоза 100 мг В А05К субстанция 500 мг +

ПВЛ 100 мг о АС5К субстанция 500 мг + аэросил 100 мг

Рисунок 4 - Прочность таблеток «АС8К 500 мг» различного состава

Применение в качестве ВВ аэросила привело к получению таблеток не соответствующих требованиям ОСТ 64-072-89 "Средства лекарственные. Таблетки. Типы и размеры" по высоте таблетки, а при использовании МКЦ были получены таблетки, не соответствующие требованиям ОФС "Таблетки" ГФ XI по описанию.

Поэтому для дальнейших исследований методом прямого прессования были спрессованы таблетки «АОЯК 500 мг», где в качестве ВВ использованы комбинации из выбранных образцов, а именно пропись № I: АОБК субстанция 500 мг, лактоза 80 мг и аэросил 20 мг и № 2: АввК субстанция 500 мг, ПВП 80 мг и аэросил 20 мг; их сравнительная оценка приведена в таблице 6.

Таблица 6 - Характеристика экспериментальных таблеток «АС 8 К 500 мг» с комбинированным составом вспомогательных веществ

Состав таблетируемой массы Гигроскопичность Показатели качества полученных таблеток

Прессуемость Распадаемость, мин. Растворение через 45 мин., %

АйЯК субстанция 500 мг 20,07 % 24,5 Н - -

Пропись № 1 17.65% 49,0 II 9,17 ± 1,63 96,50 ±5,61

Пропись № 2 19,73% 41,7 Н 10,92 ±0,58 88,57 ±8,49

По результатам исследования установлено, что наилучшими показателями качества обладают таблетки «АйЗК 500 мг», полученные согласно прописи № I.

Они по таким показателям качества, как прессуемость (прочность на излом) и фармацевтическая доступность (распадаемость и растворение через 45 минут) значительно превосходят таблетки, спрессованные по прописи № 2 К тому же гигроскопичность таблетируемой массы, приготовленной согласно прописи № 1 значительно (на 12,1%) ниже по сравнению с аналогичным показателем исходной субстанции, использование же вспомогательных веществ согласно прописи № 2 изменяет данный показатель всего на 1,7%

Учитывая способность гепариноидов образовывать метахроматический комплекс с основными красителями, для количественного определения содержания AGSK в таблетированной лекарственной форме была разработана методика, основанная на методе Макинтош (Macintosh F С , 1941, Андреенко Г В с соавт, 1965), являющимся специфичным и высокочувствительным спектрофотометрическим методом определения гепариноидов Разработанная методика количественного анализа лекарственной формы характеризуется высокой точностью и воспроизводимостью В результате предварительных испытаний было установлено, что вспомогательные вещества, входящие в состав лекарственной формы не мешают определению Метрологическая оценка разработанной методики представлена в таблице 7

Таблица 7 - Метрологическая характеристика оценки методики количественного определения AGSK субстанции в таблетированной лекарственной форме

/ X S2 S S, Р,% UP,/) Дх е, %

4 0,495 0,003 0,0160 0,0072 95 2,78 0,020 4,02

Относительная ошибка методики количественного определения А08К субстанции в таблетированной лекарственной форме не превышает ±5,0 %, то есть разработанная методика не отягощена систематической ошибкой Это позволяет включить ее в раздел "Количественное определение" ФСП «АвБК таблетки 500 мг»

Таким образом, в результате проведенных экспериментов в качестве оптимального состава для получения таблеток «АвЗК 500 мг» методом прямого прессования была выбрана пропись № 1

По указанной прописи были спрессованы три серии таблеток, стандартизацию которых проводили по следующим показателям описание, подлинность, средняя масса, прочность на истирание, распадаемость, растворение, количественное определение АС8К, определение аэросила, микробиологическая чисто га таблеток

Для установления сроков годности лекарственной формы образцы таблеток хранили в естественных условиях в течение 2,5 лет

Как показали результаты проведенных экспериментов (таблица 8) исходное значение распадаемости таблеток для всех серий, находящееся в пределах 10-11 минут, увеличивается к концу испытательного срока до 14,5 минут Прочность на истирание таблеток уменьшается во всех сериях с 0,5% в начале опыта до 0,3% по окончании хранения Это связано с развитием процессов цементации, что подтверждается и увеличением средней массы таблеток в каждой серии к концу испытательного срока до 5% от первоначального значения

17

Таблица 8 - Изучение стабильности препарата «АСвК таблетки 500 мг» в процессе хранения

№ серии Срок хранения Средняя масса, г Прочность на истирание,% Растворение; % Распадаемость, мин Содержание ЛввК, г

1 До 0,596±0,002 0,48 98,2±1,8 10,0±0,4 0,488±0,010

хранения 2,5 года 0,625±0,004 0,36 91,7±1Д 14,2±0,4 0,476±0,002

2 До 0,605±0,004 0,45 98,5±1,2 10,1±0,3 0,511 ±0,016

хранения 2,5 года 0,620±0,003 0,39 93,2±1,7 14,2±0,3 0,488±0,005

3 До 0,619±0,002 0,42 97,9±0,6 10,8±0,3 0,498±0,012

хранения 2,5 года 0,630±0,002 0,34 91,9±1,3 14,3±0,2 0,477±0,002

Вероятнее всего, цементация таблеток связана с физико-химическими свойствами самой АйБК субстанции, которая является гигроскопичным веществом и способна в процессе хранения поглощагь пары воды из воздуха, однако это явление существенно не повлияло на показатели качества экспериментальных таблеток Все серии изготовленных таблеток отвечали требованиям, предъявляемым к этому виду лекарственной формы.

Величина показателей, характеризующих фармацевтическую доступность таблеток распадаемость (10,0 ± 0,4 - 14,3 ± 0,2) и растворение (91,7 ± 1,2 - 98,5 ± 1,2), свидетельствует о рациональном выборе вспомогательных веществ и способа прессования таблетируемой массы

Таким образом, «АвБК таблетки 500 мг», полученые согласно прописи № 1 АОБК субстанция 500 мг, лактоза 80 мг, аэросил 20 мг, являются качественной и рациональной лекарственной фррмой для перорального применения

На основании результатов проведенных экспериментов были сделаны выводы о стабильности препарата «АвБК таблетки 500 мг» при хранении в естественных условиях в течение 2,5 лет В качестве упаковки для разработанной таблетированной лекарственной формы АйЯК субстанции по результатам проведенных экспериментов были предложены ячейковая контурная упаковка или трехслойная упаковка из алюминиевой фольги

Полученные данные положены в основу технологической схемы получения препарата «АвБК таблетки 500 мг» (рисунок 5) и лабораторного регламента на производство препарата «АОБК таблетки 500 мг»

Важным этапом при разработке лекарственной формы является комплекс ее биологических исследований, включающий определение биологической доступности и фармакологической активности на лабораторных животных

Изучение биологической доступности препарата «АОБК таблетки 500 мг» показало, что относительная биодоступность разработанной лекарственной формы (Ь'отн = 50,0%) сопоставима с относительной биодоступностью самой субстанции (РОТ1| = 54,4%) при пероральном применении, что свидетельствует о рациональном выборе, как самого вида лекарственной формы, так и комбинации ВВ, которые существенно не повлияли на физико-химические свойства АйЯК субстанции и ее устойчивость в желудочно-кишечном гракте.

Рисунок 5 - Технологическая схема получения препарата «ЛБвК таблетки 500 мг»

Оценка фармакологической активности препарата «АвЗК таблетки 500 мг» при пероральном применении была проведена для одной из серий таблеток в дозе 90 мг/кг (в пересчете на действующее вещество) на модели гиперлипидемии у крыс, индуцированной применением гиперхолестериной диеты (Климов АН с соавт, 1988) В качестве препарата сравнения были использованы капсулы препарата «Сулодексид» в дозе 108 ЛЕ4сг

«АвБК таблетки 500 мг» и капсулы препарата «Сулодексид» при пероральном применении положительно влияют на течение индуцированной атерогенной диетой гиперлипидемии, задерживая ее развитие и значимо снижая содержание ХС 0бщ на 37,2% и на 18,6% (р<0,01), ХС-ЛПНП на 72,7% и 42,4% (р<0,05) соответственно Кроме того, в опытной группе животных, получавших «АО8К таблетки 500 мг», наблюдается выраженный гипотриглицеридемический эффект, при котором уровень ТГ значимо (р<0,01) снижается на 72,4% по сравнению с модельной группой животных и превосходит данный показатель в опытной группе животных, получавших капсулы препарата «Сулодексид» на 26,9%

Известно, что гиперлипидемические состояния сопровождаются нарушением системы гемостаза крови, что приводит к тромбообразованию (Клиническая фармакология, 2006) Это подтверждалось увеличением в

19

модельной группе животных общего количества тромбоцитов (Тг) на 54,5%, сопровождающееся увеличением времени агрегации тромбоцитов (агрескрин-тест) на 29,5% по сравнению с контролем (интактные животные)

Обе исследуемые пероральные формы «AGSK таблетки 500 мг» и капсулы препарата «Сулодексид» оказывают антиагрегантное действие, сопровождающееся снижением уровня тромбоцитов на 15,9% («AGSK таблетки 500 мг») и на 30,6% (капсулы препарата «Сулодексид») по сравнению с уровнем тромбоцитов в гиперлипидемической крови животных модельной группы

Кроме того, пероральное применение исследуемых препаратов оказывает выраженное антикоагулянтное действие (р<0,01), снижение свертываемости крови по тесту АПТВ достигает 54,7% для «AGSK таблетки 500 мг» и 50,5% для капсул препарата «Сулодексид» соответственно по сравнению с этим показателем в модельной группе животных

Таким образом, в результате проведенного эксперимента было выявлено положительное влияние разработанного препарата «AGSK таблетки 500 мг» на течение экспериментальной атерогенной гиперлипидемии у крыс, сопоставимое с влиянием капсул препарата «Сулодексид», что в совокупности с высокой относительной биодоступностью позволяет сделать вывод о том, что вспомогательные вещества, примененные для таблетирования AGSK, являются инертными в фармакологическом плане, а разработанный состав лекарственной формы оптимальным

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1 Впервые методом направленного синтеза, путем химической модификации (сульфатирования) растительного полисахарида древесины лиственницы сибирской (Larix sibirtca Ledeb) - арабиногалактана, получена оригинальная биологически активная субстанция сульфатированного арабиногалактана в виде калиевой соли (AGSK), относящаяся к классу полусинтетических гепариноидов

2 С помощью методов ИК-, |3С ЯМР-спектроскопии и данных сканирующей электронной микроскопии установлена структура AGSK, являющегося наноструктурированным функционализированным биополимером со сферической формой частиц (размер крупных агломератов 200-600 нм), сульфатные группы в макромолекуле находятся при С-2 и С-4 углеродных атомах основной галактановой цепи и при С-6 углеродном атоме концевых остатков галактозы основной и боковой цепей полисахарида

3 Аналитическими методами, поляриметрией, потенциометрией и гельпроникающей хроматографией изучены физико-химические свойства (растворимость, удельное вращение, значения рКа и рН водного раствора, молекулярно-массовые характеристики) AGSK субстанции Установлена возможность использования этих методов для ее идентификации, разработаны методики качественного и количественного определения действующего вещества

4 По результатам исследования безвредности оригинальной AGSK субстанции установлено, что исследуемое соединение согласно ГОСТ 12 1 007-76 относится к классу "вещества малоопасные" - IV класс опасности (LD50 > 6 г/кг) Фармакологическими экспериментами в опытах т vitro и m vivo показана антикоагулянтная и гиполипидемическая активность AGSK субстанции, а также ее высокая относительная биологическая доступность (54,4%) при пероральном применении

5 В результате комплекса технологических и биофармацевтических исследований изучены объёмно-технологические свойства AGSK субстанции, выбран оптимальный состав, разработана рациональная технология, проведена стандартизация, определён срок годности и составлена технологическая схема получения препарата «AGSK таблетки 500 мг» для перорального применения с высокими показателями фармацевтической и биологической доступности На модели атерогенной гиперлипидемии у крыс установлена его специфическая фармакологическая активность, по эффективности не уступающая официнальному лекарственному препарату класса гепариноидов «Сулодексид»

6 Разработаны лабораторные регламенты и проекты ФСП «AGSK субстанция» и «AGSK таблетки 500 мг», которые успешно апробированы в условиях производства

Список опубликованных работ по теме диссертации*

1 Костыро, Я А Синтез сульфированных производных арабиногалактана / Я А Костыро, Г П Александрова, С А Медведева //Химия органических соединений кремния и серы Тез докл Всерос Симпозиума - Иркутск, 2001 - С 203

2 Костыро, Я А Изучение гепариноподобного действия сульфированных производных арабиногалактана /Я А Костыро, Г П Александрова, С А Медведева //Интеграция фундаментальной науки и высшей школы в устойчивом развитии Сибири сб науч тр ИНЦСОРАН - Иркутск, 2001 -С 84-86

3 Костыро, Я А Антиатерогенная активность сульфатированных производных арабиногалактана /Я А Костыро, С А Медведева //Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч тр ПГФА, вып 59 -Пятигорск, 2004 -С 282-283

4 Костыро, Я А Антикоагулянтная активность сульфатированных производных арабиногалактана /Я А Костыро, С А Медведева //Актуальные проблемы медицины сб науч тр СибГМУ, вып 3 -Томск, 2004 -С 279

5 Костыро, Я А Синтез сульфатированных производных арабиногалактана /Я А Костыро, С А Медведева, Б Г Сухов // Техника машиностроения - 2004 - № 3 - С 10-12

6 Костыро, Я А Сульфатированные производные арабиногалактана - новые фармакологически активные соединения /Я А Костыро, С А Медведева //HI Всеросс конф "Химия и технология растительных веществ" материалы - Саратов, 2004 - С 43-44

7 Костыро, Я А Сульфатированный арабиногалакган - потенциальное гиполипидемическое средство /Я А Костыро, Т В Ганенко, Г Н Ковальская, Б Г Сухов //Естествознание и гуманизм - 2006 - ТЗ -№4 -С 27

8 Костыро, Я А Антикоагуляитная активность сульфатированного арабиногалактана /Я А Костыро, Г Н Ковальская, О А Силизерцева, О П Ильина //Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции сб науч тр ПГФА, вып 62 - Пятигорск, 2007 - С 488-489

9 Костыро, Я А Влияние сульфатированного арабиногалактана на липидный спектр крови крыс при экспериментальной гиперлипидемии /Я А Костыро, Г Н Ковальская, О А Силизерцева, О П Ильина, Б Г Сухов //III Всеросс научной конф "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья" материалы /АГУ. -Барнаул, 2007 -Т 2 -С 234-236

10 Kostyro, Ya A EXPERIMENTAL PHARMACOKINETIC OF SULFATED ARABINOGALACTAN /Y A Kostyro, G N Kovalskaya, О A Sihzertseva, О P Il'ma //The 11-th International Congress "PHYTOPHARM 2007" materials - Leiden (The Netherlands), 2007 -P 61

11 Костыро, Я А Сульфатированный арабиногалактан - перспективное средство для профилактики и лечения метаболического синдрома /Я А Костыро, Г Н Ковальская, Б Г Сухов //Международный междисциплинарный симпозиум "От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине" материалы - Судак (Крым, Украина), 2007 -С 65-66

12 Ганенко, ТВ Структура сульфатированного арабиногалактана /ТВ Ганенко, Я А. Костыро, Б Г Сухов //II Междунар науч конф "Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений" материалы - Алматы (Казахстан), 2007 -С 236

13 Костыро, Я А Экспериментальная фармакокинетика сульфатированного арабиногалактана при различных путях введения /Я А Костыро, Г Н Ковальская, О А Силизерцева, О П Ильина //43 Республиканская науч конф "Создание новых лекарственных препаратов" материалы - Томск, 2007 - С 72-73

14 Костыро, Я А Сульфатированный арабиногалактан пути введения и фармакокинетика /Я А Костыро, Г Н Ковальская, О А Силизерцева, О П Ильина //Фармация -2008 -№ 1 -С 45-46

15 Патент 2319707 Россия, МПК С 07 Н 3/02, С 08 В 37/00 Способ получения сульфатированных производных арабиногалактана, обладающих антикоагулянтной и гиполипидемической активностью /Костыро Я А , Ганенко Т В , Медведева С А , Сухов Б Г , Трофимов Б А , Иркутский институт химии им А Е Фаворского СО РАН -№ 2007100464/04, заявл 09 01 2007, опубл 20 03 2008, Бюл № 8

Костыро Яна Антоновна (Россия)

Разработка технологии получения, исследование свойств сульфатированного арабиногалактана и создание таблетированной лекарственной формы препарата антикоагулянтного и гиполипидемического действия

Впервые методом направленного синтеза, путем химической модификации (сульфатирования) растительного полисахарида древесины лиственницы сибирской (Ьаггх иЬхггеа ЬейеЬ) - арабиногалактана, получена оригинальная наноструктурированная фармакологически активная субстанция сульфатированного арабиногалактана в виде калиевой соли (АС8К), относящаяся к классу полусинтетических гепариноидов

В фармакологических экспериментах доказана нетоксичность, антикоагулянтная и гиполипидемическая активность, а также высокая относительная биологическая доступность АС8К субстанции при пероральном применении, что позволило разработать на ее основе препарат «АвБК таблетки 500 мг» с высокими показателями фармацевтической и биологической доступности

Препарат «АвЗК таблетки 500 мг» при пероральном применении обладает выраженной гиполипидемической и антикоагулянтной активностью и по эффективности сопоставим с официнальным лекарственным препаратом класса гепариноидов «Сулодексид»

Разработанная лекарственная форма оригинальной нанострукгурированной субстанции АББК после дополнительных доклинических и клинических испытаний способна пополнить арсенал гиполипидемических средств и антикоагулянтов прямого действия для перорального применения отечественного производства и стать достойной альтернативой дорогостоящему импортному лекарственному препарату «Сулодексид»

Kostyro Yana Antonovna (Russia)

Technology of Sulfated Arabinogalactane Synthesis and Testing for Anticoagulant and Hypolipidemic Preparation Tablet Drug Formulation

For the first time, an original nanostructured pharmacologically active sulfated arabinogalactane substance referring to semisynthetic hepannoid series has been obtained in the form of potassium salt by method of direct synthesis, namely by chemical modification (sulfating) of Siberian larch polysaccharide - arabinogalactane

It has been proved in pharmacological experiments that it is non-toxic and possesses anticoagulant, hypolipidemic activity and high relative biological availability at peroral introduction which has allowed to develop a tablet drug formulation «AGSK tablets 500 mg» on its basis with high pharmaceutical and biological availability

«AGSK tablets 500 mg» at peroral application show evident anticoagulant and hypolipidemic effect that is comparable to the one of an officinal heparinoid preparation «SULODEXIDE»

The tablet drug formulation of original nanostructured AGSK substance, after additional pre-clinical and clinical tests, can find its place among Russian anticoagulant and hypolipidemic agents of direct action for peroral use as an adequate alternative to expensive imported «SULODEXIDE» preparation

Бумага писчая Формат 60х 84/16 Офсетная печать Уел печ л 1 Тираж 100 экз Заказ №

Отпечатано полиграфическим участком ИСЭМ СО РАН 664033, Иркутск, ул Лермонтова, 130

Актуальность темы

Атеросклероз — болезнь XXI века, лежащая в основе различной сердечно-сосудистой патологии, являющейся наиболее частой причиной смертности в индустриально-развитых странах. Возможным подходом к решению вопросов профилактики и лечения атеросклероза является использование средств, направленных как на снижение общего уровня липидов, так и на изменение отдельных составляющих липидного спектра крови [7].

К этому классу потенциальных гиполипидемических средств относятся гепариноиды — природные, синтетические и полусинтетические вещества, действующие подобно гепарину, но отличающиеся от него по химической структуре, молекулярной массе и некоторым фармакологическим свойствам [10]. Изучение гиполипидемической активности гепариноидов весьма., активно ведется во всем мире, но сегодня на фармацевтическом рынке России этот класс интереснейших биологически активных веществ представлен только препаратом «Сулодексид» (Vessel Due F, Alfa-Wassermann S.p.A., Italy: капсулы 250 JIE (липосемические единицы), раствор для инъекции 600 ЛЕ/2 мл), являющимся лекарственным средством импортного производства, что объясняет его высокую рыночную стоимость. Применение препарата «Сулодексид» в качестве средства для вторичной профилактики коронарного атеросклероза и его осложнений доказано клиническими испытаниями [5, 6], однако в современной медицине этот препарат применяется только, как антикоагулянт прямого действия — для профилактики и лечения ангиопатий различной локализации [15, 38]. Гиполипидемические препараты других групп (статины, производные фиброевой кислоты) на современном фармацевтическом рынке России также представлены только импортными дорогостоящими образцами, а терапия гиперлипидемических состояний весьма длительна и потому иной раз материально недоступна большому числу больных.

Поэтому разработка эффективных и доступных гиполипидемических средств является одной из наиболее актуальных проблем современной медицинской и фармацевтической науки, а исследование представителей класса гепариноидов в этом направлении перспективно.

В лаборатории природных синтонов и лигандов Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН впервые методом направленного синтеза с целью создания нового представителя класса полусинтетических гепариноидов нами разработана оригинальная наноструктурированная фармакологически активная субстанция, представляющая собой сульфатированный арабиногалактан в виде калиевой соли (AGSK) и обладающая гиполипидемической и антикоагулянтной активностью.

В основе данной работы лежит химическая модификация (сульфатирование) растительного полисахарида — арабиногалактана, получаемого в результате комплексной безотходной переработки древесины, лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.). Содержание арабиногалактана в древесине достигает порядка 15%, что свидетельствует об огромных запасах исходного сырья и возможных перспективах массового производства нового биологически активного средства на основе арабиногалактана.

Разработка технологии получения и перспектива внедрения оригинальной отечественной наноструктурированной субстанции антикоагулянтного и гиполипидемического действия в медицинскую и фармацевтическую практику соответствует задачам реализации "Среднесрочного плана фундаментальных исследований по приоритетным направлениям развитии науки, технологий и техники Российской Федерации на период 2007-2009 годы".

Целью работы является разработка технологии получения и исследование свойств оригинальной наноструктурированной субстанции — сульфатированного арабиногалактана в виде калиевой соли (AGSK) и разработка на её основе пероральной таблетированной лекарственной формы препарата гиполипидемического и антикоагулянтного действия.

Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать технологию получения оригинальной субстанции AGSK, изучить её физико-химические и технологические свойства.

2. Разработать методы качественного и количественного анализа субстанции AGSK для её стандартизации.

3. Изучить токсичность, антикоагулянтное и гиполипидемическое действие биологически активной субстанции AGSK.

4. Разработать состав и технологию получения таблетированной лекарственной формы субстанции AGSK для перорального применения с высокой фармацевтической и биологической доступностью и изучить её фармакологическую активность.

5. Провести стандартизацию и изучить стабильность разработанной таблетированной лекарственной формы субстанции AGSK для перорального применения.

6. Разработать и апробировать нормативную документацию на оригинальную субстанцию AGSK и её таблетированную лекарственную форму.

Научная новизна работы

Впервые методом направленного синтеза получена оригинальная наноструктурированная фармакологически активная субстанция, относящаяся к классу полусинтетических гепариноидов, представляющая собой сульфатированный арабиногалактан в виде калиевой соли (AGSK).

Установлена структура, изучены физико-химические и технологические свойства AGSK субстанции.

Разработан методический подход к стандартизации AGSK в субстанции и таблетированной лекарственной форме, заключающийся в использовании химических реакций (обнаружение органически связанной сульфатной группы, полисахаридных фрагментов и ионов калия) в сочетании с физико-химическими методами (гель-проникающей хроматографии, поляриметрии, потенциометрии, спектрофотометрии в УФ- и видимой области спектра, ИК-, ,3С ЯМР -спектроскопии, сканирующем электронной микроскопии).

Теоретически обоснована и экспериментально на моделях гиперлипидемии у крыс подтверждена целесообразность использования оригинальной AGSK субстанции в качестве гиполипидемического средства и антикоагулянта прямого действия.

На основании проведённых комплексных физико-химических, технологических и биофармацевтических исследований теоретически и экспериментально обоснованы оптимальный состав и технология получения лекарственной формы «AGSK таблетки 500 мг» методом прямого прессования, обеспечивающие высокие показатели фармацевтической и биологической доступности при пероральном применении.

Установлено, что относительная биологическая доступность таблеток AGSK сравнима с относительной биологической доступностью самой субстанции при пероральном применении (50,0% и 54,4% соответственно), что свидетельствует о рациональном выборе вспомогательных веществ, применённых для таблетирования AGSK.

В сравнении с используемым в медицинской практике аналогом — представителем класса гепариноидов (капсулы препарата «Сулодексид») изучены и установлены сопоставимые по эффективности гиполипидемическая и антикоагулянтная активности лекарственной формы «AGSK таблетки 500 мг» при пероральном применении.

Практическая значимость

Разработан и запатентован оригинальный метод химической модификации (сульфатирование) полисахарида арабиногалактана, получаемого в результате комплексной безотходной переработки древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) (патент 2319707; Костыро Я.А. с соавт.; опубл. 20.03.2008; Бюл.№ 8).

По результатам исследований разработаны и внедрены:

Состав и оценка качества препарата «AGSK субстанция» (проект ФСП (ИрИХ СО РАН));

Состав и оценка качества препарата «AGSK таблетки 500 мг» (проект ФСП (ИрИХ СО РАН));

Технология получения AGSK субстанции (лабораторный регламент на производство утверждён ИрИХ СО РАН)

Технология получения препарата «AGSK таблетки 500 мг» (лабораторный регламент на производство утверждён ИрИХ СО РАН)

Лабораторный регламент на производство препарата «AGSK таблетки 500 мг» апробирован в ООО "Сольвей ЭМ" (акт наработки препарата от 20.06.2005 г)

Установленная фармакологическая эффективность, доступность исходных ингредиентов, простота и воспроизводимость разработанной технологии производства лекарственного препарата «AGSK таблетки 500 мг» являются обоснованием перспективности, её внедрения в практическую медицину, что позволит после проведения дополнительных доклинических и клинических испытаний пополнить арсенал гиполипидемических средств и антикоагулянтов прямого действия для перорального применения оригинальным препаратом отечественного производства.

Основные положения диссертации внедрены в учебном процессе кафедры фармации Иркутского ГИУВа (акт внедрения от 10.09.2007 г) и кафедры фармацевтической химии с курсами органической и токсикологической химии Алтайского ГМУ (акт внедрения от 14.11.2007 г).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты создания оригинальной AGSK субстанции, изучения её структуры, физико-химических и технологических свойств;

- методики качественного и количественного анализа AGSK;

- результаты разработки таблетированной лекарственной формы AGSK и её стандартизации;

- результаты изучения токсичности, фармакокинетики при различных путях введения в организм, гиполипидемической и антикоагулянтной активности AGSK субстанции и её таблетированной лекарственной формы для перорального применения. Апробация работы

Основные положения диссертации обсуждались на Всероссийском Симпозиуме "Химия органических соединений кремния и серы" (Иркутск, 2001); Конференции молодых ученых ИНЦ СО РАН "Интеграция фундаментальной науки и высшей школы в устойчивом развитии Сибири" (Иркутск, 2001); 59-й, 62-й научных конференциях по фармации и фармакологии "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (Пятигорск, 2004, 2007); Всероссийской конференции "Актуальные проблемы медицины" (Томск, 2004); III Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Саратов; 2004); III Всероссийской конференции "Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья" (Барнаул, 2007); 11-м Международном Конгрессе "Фитофарм 2007" (Лейден (Нидерланды), 2007); Международном междисциплинарном Симпозиуме "От экспериментальной биологии к превентивной и интеграционной медицине" (Судак (Крым, Украина), 2007); II Международной научной конференции "Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений" (Алматы (Казахстан), 2007); 43-й Республиканской научной конференции "Создание новых лекарственных препаратов" (Томск, 2007).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Работа выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ Иркутского института химии им. А. Е. Фаворского СО РАН по теме: "Развитие химии и глубокой переработки древесины: получение новых биологически активных и технически ценных продуктов для медицины, сельского хозяйства и критических технологий" (№ государственной регистрации 01.2004 06380), "Наносистемы, нанореагенты и нанореакторы на основе гемицеллюлоз и других полифункциональных полимеров для критических технологий и медицины" (№ государственной регистрации 01.2007 04822) и ГОУ ДПО "Иркутский государственный институт усовершенствования врачей Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" по медико-биологическим проблемам, раздел "Фармация" (№ государственной регистрации 01.2007 06367).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 3 — в зарубежной печати (Нидерланды, Украина, Казахстан) и 2 статьи в-рецензируемых журналах; получен 1 патент на изобретение.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 48 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования (экспериментальная часть), двух глав обсуждения результатов собственных экспериментальных исследований, выводов, библиографического списка и приложения. Список литературы включает 158 источников, из них 61 работа зарубежных авторов.

Выводы по главе:

1. В результате исследования были изучены объёмно-технологические характеристики фармакологически активной субстанции AGSK, которая представляет собой мелкодисперсный аморфный порошок, высоко гигроскопичный (20,07%), практически однородный по гранулометрическому составу (фракции: < 0,25 мм, 19,8%; 0,25-0,5 мм 59,5%; 0,5-1,0 мм 8,6%; 1,0-2,0 мм 10,5%; 2,0 -3,0 мм 1,4%; > 3,0 мм 0,2%), с удовлетворительной сыпучестью (5,56 г/с) и средней насыпной массой (843,17 кг/м3), обладающий плохой прессуемостью (прочность на излом) (24,5 Н) с высоким коэффициентом уплотнения (7,5).

2. Проведён сравнительный анализ вспомогательных веществ из группы прочносвязывающих (микрокристаллическая целлюлоза и поливинилпирролидон) и глидантов (лактоза и аэросил), их комбинаций с целью научно-обоснованного выбора оптимальной прописи таблетируемой массы- для получения таблеток. AGSK методом прямого прессования. В результате чего были спрессованы таблетки, следующего состава:. AGSK субстанция 500 мг, лактоза 80 мг, аэросил 20 мг.

3. Разработана методика количественного определения AGSK субстанции в таблетированной лекарственной форме спектрофотометрическим методом.

4. На основании результатов физико-химических и микробиологических исследований в условиях естественного хранения установлен срок годности препарата «AGSK таблетки 500 мг» (2,5 года).

5. Изучена биологическая доступность (F0TH. = 50,0%) и фармакологическая активность разработанной лекарственной формы для перорального применения «AGSK таблетки 500 мг» сопоставимая по эффективности с официнальным лекарственным препаратом «Сулодексид».

6. На основании результатов исследований разработаны: ФСП «AGSK таблетки 500 мг» и лабораторный регламент на производство препарата «AGSK таблетки 500 мг» субстанции, выбран оптимальный состав, разработана рациональная технология, проведена стандартизация, определён срок годности и составлена технологическая схема получения препарата «AGSK таблетки 500 мг» для перорального применения с высокими показателями фармацевтической и биологической доступности. На модели атерогенной гиперлипидемии у крыс установлена его специфическая фармакологическая активность, по эффективности не уступающая официнальному лекарственному препарату класса гепариноидов «Сулодексид».

6. Разработаны лабораторные регламенты и проекты ФСП «AGSK субстанция» и «AGSK таблетки 500 мг», которые успешно апробированы в условиях производства.