Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка методов анализа и оптимизация состава лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

СЕНЧЕНКО СЕРГЕЙ ПЕТРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА И ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

СЕНЧЕНКО СЕРГЕЙ ПЕТРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА И ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ПЯТИГОРСК - 2006 / /

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор фармацевтических наук,

профессор Гаврилин Михаил Витальевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор фармацевтических наук,

Защита состоится 14 февраля 2007 года в 900 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.069.01 при ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава» (357532, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорской ГФА Росздрава».

Автореферат разослан 27 декабря 2006 г.

профессор Оганесян Эдуард Тоникович

кандидат фармацевтических наук, доцент Кичев Дмитрий Геннадьевич

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская ГХФА Росздрава»

к.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор фармацевтических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Современная отечественная промышленность для получения лекарственных препаратов, как правило, использует лекарственное растительное сырье и продукты химического синтеза, и значительно реже для этих целей применяются бактерии. Вместе с тем, использование бактерий в качестве сырья может быть достаточно перспективным ввиду высокого содержания в них важных биологически активных веществ. Кроме того, высокая скорость роста бактерий позволяет культивировать их в больших количествах за достаточно короткое время, что делает использование бактерий в качестве сырья рентабельным.

Пробиотические молочнокислые бактерии находят широкое применение для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний у человека и жившных. Среди многочисленных видов лактобацилл, применяемых в производстве лечебно-профилактических препаратов, ведущая роль принадлежит виду Lactobacillus acidophilus.

Наряду с перечисленными свойствами лактобациллы также обладают иммуностимулирующей активностью.

Среди иммунотропных лекарственных препаратов в последнее время стремительно развивается подгруппа иммуномодуляторов микробного происхождения (ИМП). Это связано, прежде всего, с высокой эффективностью и практически полной безвредностью, подобных лекарственных средств. Их иммуностимулирующий эффект реализуется через воздействие на клетки врожденной иммунной системы нескольких видов химических структур, характерных для многих микроорганизмов. Эти структуры получили название «патоген-ассоциированные молекулярные образы», а соответствующие им рецепторы врожденной иммунной системы -«образраспознающих рецепторов». Наиболее известными «патоген-ассоциированными молекулярными образами» являются бактериальные гликопептиды.

Гликопептиды бактерий являются производными мурамилдипептида и образуются в ходе гидролиза пептидогликана клеточной стенки бактерий.

ИМП применяются как в виде самих лизатов микроорганизмов, это такие лекарственные препараты как: «Бронхо-мунал», «Иммудон», «ИРС-19», «Постеризан», так и в виде минимальных биологически активных фрагментов (гликопептиды мурамилдипептидного ряда), полученных синтетическим путем, например «Ликопид», «Ромуртид», «Мурабутид».

Однако в нашей стране аналогов данным лекарственным препаратам не существует. Это связано с тем, что не разработаны эффективные способы получения гидролизатов бактерий, а также нет валидированных методик оценки их качества.

В связи с этим актуальным является проведение исследований по разработке лекарственного препарата на основе гидролизата лактобактерий, изучение его качественного и количественного состава, стабильности и биологической активности.

Цели и задачи исследования. Разработка методик анализа основных биологически активных веществ гидролизатов молочнокислых бактерий, стандартизация и первичная фармакологическая оценка лекарственного препарата на основе гидролизата бактерий Lactobacillus acidophilus.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие

задачи:

1. Провести сравнительную оценку спектрофотометрических методик количественного анализа общего содержания белков и пептидов на возможность их определения в гидролизатах молочнокислых бактерий.

2. Изучить возможности использования методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и капиллярного электрофореза (КЭ) для качественного и количественного определения глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) в гидролизатах молочнокислых

бактерий, полученных различными способами и использовать данные методы для оценки их стабильности.

3. Изучить факторы, влияющие на разделение фенилизотиокарбамил (ФТК)-производного ГМДП от сопутствующих ФТК-производных других пептидов и аминокислот.

4. Обосновать параметры пригодности системы для электрофоретического разделения ФТК-производного ГМДП от сопутствующих ФТК-производных дру! их пептидов и аминокислот.

5. Выбрать оптимальный способ получения гидролизата с помощью методов термокислотного и ферментативного гидролиза и предложить эффективный консервант.

6. Провести исследования по стандартизации лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий («Биолактон») и обосновать сроки его годности.

7. Провести первичную фармакологическую оценку действия препарата «Биолактон» на показатели клеточного и гуморального иммунитета экспериментальных животных.

Научная новизна. Впервые проведена валидационная оценка фотометрических методик количественного определения белков, низкомолекулярных пептидов и аминокислот. При этом установлено, что максимальную точность и воспроизводимость результатов определения общего содержания белков и пептидов обеспечивает методика с реактивом Бенедикта, а для определения общего содержания аминокислот - методика количественного определения с суспензией меди фосфата (II).

Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены условия электрофоретического определения ФТК-производного ГМДП в присутствии ФТК-производных других пептидов и аминокислот. Показано, что полное разделение может быть достигнуто с использованием мицелярного капиллярного электрофореза, где в качестве

мицеллообразующей добавки использовали натрия додецилсульфат. Установлено, что основными факторами, влияющими на электрофоретическое разделение, являются ионная сила буферного раствора, формирующая ¡¡-потенциал, а также добавка мицеллообразующего компонента.

Изучены показатели для определения пригодности электрофоретической системы. Впервые использована величина диффузного потенциала электролита в качестве критерия пригодности системы.

При проведении выбора условий получения гидролизата молочнокислых бактерий штамма L acidophilus В 2505 установлено, что максимальное накопление биологически активных веществ обеспечивает метод термокислотного гидролиза, который был положен в основу создания лекарственного препарата «Биолактон».

Обоснованы показатели и нормы качества лекарственного препарата «Биолактон». В условиях естественного хранения установлены сроки его годности - 2 года. Предложен эффективный консервант, обеспечивающий микробиологическую стабильность в ходе хранения лекарственного препарата.

В опытах на животных показано положительное влияние разработанного лекарственного препарата на общее физиологическое состояние, а также на показатели клеточного иммунитета.

Практическая значимость. Доказана возможность использования методов количественного определения общего содержания белков, пептидов и аминокислот при их совместном присутствии. Впервые разработана методика количественного определения ГМДП методом капиллярного электрофореза в присутствии других пептидов и аминокислот. Предлагаемые методики могут использоваться в практике анализа любых объектах, содержащих белки пептиды и аминокислоты.

Предложены способы оценки пригодности электрофоретической системы, которые могут быть использованы для анализа других веществ методом капиллярного электрофореза.

Оптимизированы способы ферментативного и термокислотного гидролиза бактериальной массы, которые могут быть широко использованы для глубокой переработки микробиологических объектов. На основании сравнительного изучения указанных способов для практического использования рекомендован термокислотный способ гидролиза.

Внедрение результатов исследований в практику. Разработан проект ФСП на лекарственный препарат «Биолактон», представляющий собой термокислотный гидролизат молочнокислых бактерий, который передан для внедрения на опытном производстве НИИ комплексного использования молочного сырья (НИИКИМ), г. Ставрополь.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты сравнения метрологических характеристик (линейности, прецизионности и точности) методик спектрофотометрического определения суммы белков и пептидов.

2. Итоги разработки методики количественного определения суммы аминокислот в присутствии белков и пептидов.

3. Материалы исследования электрофоретического поведения ГМДП в различных буферных растворах и в присутствии реагентов, модифицирующих электроподвижность аминокислот и пептидов

4. Результаты разработки методики количественного определения ГМДП методом мицелярного электрофореза.

5. Результаты сравнительной оценки качественного и количественного состава гидролизатов молочнокислых бактерий, полученных термокислотным и ферментативным способом.

6. Материалы исследований по стандартизации лекарственного препарата «Биолактон», созданного на основе термокислотного гидролизата молочнокислых бактерий штамма Lactobacillus acidophilus В 2505.

7. Результаты первичной фармакологической оценки лекарственного препарата «Биолактон».

Апробация и публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы доложены на:

1. XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005г.).

2. II конференции по медицинской биотехнологии (Анапа,

2005г.);

3. Научно-практической конференции «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва, 2006г.).

4. Ежегодных научных конференциях ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (Пятигорск, 2005 и 2006г.).

По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с соглашением о взаимодействии по созданию научно-технической продукции и использованию результатов работ научно-технической деятельности между Федеральным агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава», номер 06/1049. ;

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу и 45 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы, включающею 116 источников, из которых 38 на иностранных языках, и приложений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Разработка методик количественного определения основных биологически активных фракций гидролизата молочнокислых бактерий

Одним из этапов анализа лекарственных препаратов, на основе лизатов бактерий, является оценка количественного содержания общего белка и пептидов, отражающих как степень гидролиза субстрата, так и содержание иммунокомпетентных пептидов.

Для количественного определения общего содержания белков и пептидов, в основном, используются спектрофотометрические методы в УФ и видимой областях. Однако непосредственное спектрофотометрическое определение содержания данных веществ является малоспецифичным. Поэтому при выборе методики количественного определения общего содержания белков я пептидов акцент делался, прежде всего, на спектрофотометрические методики в видимой области.

В ГФ XI описан ряд подобных методик, из которых были выбраны три: определение белка с биуретовым реактивом; определение белка с реактивом Бенедикта; определение белка по методу Флореса.

С целью выбора методики, позволяющей достоверно оценивать качество гидролизатов, на примере стандартного образца бычьего сывороточного альбумина (BSA) проведена их сравнительная оценка по следующим показателям: линейность, прецизионность, и точность. Порядок исследований соответствовал указаниям международной конференции по гармонизации (ICH).

В ходе определения линейности было установлено, что график зависимости оптической плотности от концентрации для каждой из методик имеет линейный характер в определенных диапазонах (таблица 1). Коэффициент корреляции для каждой из методик соответствовал предъявляемым нормам.

Далее устанавливали значения прецизионности на уровне сходимости величины относительного стандартного отклонения результатов шести параллельных определений. В результате во всех трех методиках (таблица 1) данная величина не превышала 1 %, что соответствует требованиям ICH.

Заключительным этапом оценки выбранных методик было установление точности полученных определений. Для этого готовили девять модельных растворов на трез уровнях концентраций и подвергали их анализу по выбранным методикам. В качестве критерия точности использовали открываемость. Граничные значения открываемое™ для тестируемых методик представлены в таблице 1.

По рекомендациям ICH для анализа субстанций с содержанием

ПОЙ^ТП\/1А1ПРГЛ ОЛПТОЛТПП UO II0tMO Об ОЛ 1

^VIIV luj IVU^Vl и UWLL^VV 1UU 11V IMVllVV У и /V

обеспечивающая значения открываемое™ в пределах 98 - 102%.

Как следует из полученных результатов (таблица 1), только методика № 2 обеспечивает необходимую точность, что предполагает ее использование в качестве оптимальной для определения общего содержания белка. Таблица 1 - Валидационные характеристики методик количественного

Характеристики Методика №1 (с биуретовым реактивом) Методика №2 (с реактивом Бенедикта) Методика №3 (метод Флореса)

Диапазон линейности, мг/мл 1-10 0,6-12 2-20

Коэффициент корреляции, г 0,9992 0,9997 0,9984

Прецизионность, ИБО (%) 0,86 0,73 0,97

Точность, Я (%) 101,3-116,0 98,1 - 101,7 104,9-110,0

Ввиду того, что иммуномодулирующее действие гидролизатов связано с пептидами низкой молекулярной массы, важным представляется определение общего содержания данной фракции. При разработке методики количественного определения пептидов за основу была взята методика определения общего белка с реактивом Бенедикта. Однако в качестве стандарта был использован ГМДП.

Данная методика также была оценена по показателям: линейность, прецизионность и точность (таблица 2). В ходе работы было установлено, что все изучаемые показатели удовлетворяют требованиям ICH, что предполагает использование данной методики для количественного определения общего содержания низкомолекулярных пептидов.

Следующим этапом работы стала разработка методики количественного определения аминокислот. При ее разработке за основу была взята методика определения аминокислот в препарате «Бронхо-мунал» (Словения), представляющего собой лиофилизированный лизат бактерий. В качестве стандарта использовалась кислота глютаминовая, ввиду того, что ее содержание в гидролизатах лактобактерий является одним из наибольших.

Апробация данной методики также велась по показателям: линейность, прецизионность и точность (таблица 2).

Таблица 2 - Валидационные характеристики методик количественного определения общего содержания пептидов и аминокислот_

Методика Методика

Характеристики определения определения

пептидов аминокислот

Диапазон линейности, мг/мл 0,1-1,5 0,5-4

Коэффициент корреляции, г 0,9999 0,9992

Прецизионность, ЯБО (%) 0,830 0,950

Точность, % 98,9-101,2 98,9-101,1

Результаты данных исследований согласуются с требованиями 1СН, что позволяет использовать данную меюдику для количественного определения аминокислот.

Разработка методики количественного определения ГМДП в гидролизатах молочнокислых бактерий

При разработке подобного лекарственного средства необходимо контролировать количественное содержание гликопептидов, образующихся в ходе лизиса бактериальной массы. Поэтому необходимым представлялась разработка методики количественного определения ГМДП в гидролизатах молочнокислых бактерий.

Для этого на базе НИИ комплексного использования молочного сырья, г. Ставрополь был получен гидролизат молочнокислых бактерий штамма Lactobacillus acidophilus В 2505.

В качестве стандарта использовалась субстанция ГМДП.

Для количественного определения подобных веществ в мировой практике используются хроматографические и электрофоретические методы. Например, для анализа ГМДП в таблетках «Ликопид» используется метод ВЭЖХ. Однако данный метод не дает возможности количественно определить его в гидролизатах. Это связано, прежде всего, с тем, что ВЭЖХ в обращено-фазовом варианте имеет относительно низкую эффективность при анализе сорбатов с высокой полярностью, которая не позволяет разделить ГМДП с другими пептидами и аминокислотами, образующимися в ходе гидролиза. Поэтому, для анализа ГМДП в гидролизатах мы использовали метод капиллярного электрофореза, имеющего, по сравнению с ВЭЖХ, гораздо более высокую эффективность.

За основу была взята методика выполнения измерений массовой доли аминокислот методом капиллярного электрофореза. По данной методике аминокислоты определяют после модифицирования с „ помощью фенилизотиоцианата (ФИТЦ) в форме ФТК-производных.

Первым этапом исследования был выбор оптимального по составу электролита. Для этого использовали буферные растворы различною состава: фосфатный (10мг/мл) с рН=7,7 и боратный (10мг/мл) с рН=9,2. Анализ ФТК-

_ _ г

производного ГМДП вели в модельной смеси с ФТК-производными аминокислот, входящих в состав гидролизатов. В ходе анализа было установлено, что в фосфатном буфере пик ГМДП накладывается на пик пролина, в то время как боратный буферный раствор позволяет провести разделение производного ГМДП от соответствующих производных всех аминокислот, находящихся в модельной смеси.

Далее необходимо было определить данное вещество в гидролизатах. Однако при анализе гидролизатов в боратном электролите (10мг/мл) было установлено, что пик ГМДП не является однородным.

В связи с этим, повышали ионную силу электролита, что приводит к снижению скорости электроосмотического потока и соответственно увеличению коэффициента разделения пиков. Поэтому, концентрацию электролита (в данном случае натрия тетрабората декагидрата) повышали в 2 раза. С увеличением концентрации электролита эффективность разделения улучшается, однако пик ГМДП все равно являлся неоднородным. В этом случае необходимы добавки в ведущий электролит, которые реализуют вторичные равновесия в системе и способствуют разделению веществ, отличающихся либо изомерией, либо степенью гидрофобности.

В мировой практике для улучшения разделения компонентов в пробе используют добавку макроциклических реагентов, которые, образуя комплексы-включения (клатраты) с лекарственными веществами, изменяют их электроподвижность и, соответственно, могут улучшать разделение. В опытах нами использовались 4-е циклодекстрина: а-, Р-, у- и 2-гидроксипропил-р-циклодекстрин.

Добавление макроциклического реагента заметно увеличивает разделение компонентов пробы, (наилучшее разделение наблюдается при добавлении 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрина). Однако такое разделение позволит только качественно определять ГМДП в гидролизатах. Для количественного анализа такого разделения не достаточно.

Поэтому на заключительном этапе выбора условий количественного определения ГМДП в гидролизатах был использован мицеллярный вариант электрофореза. Для этого' в состав ведущего электролита вводится додецилсульфат натрия в концентрации превышающей критическую концентрацию мицелообразования. При этом нейтральные компоненты или компоненты с маловыраженной кислотностью, могут взаимодействовать с данными мицеллами. На рисунке 1 представлена электрофореграмма гидролизата, полученная в боратном буферном растворе (20мг/мл) с добавкой додецилсульфата натрия.

Рисунок 1 - Электрофореграмма гидролизата, полученная в боратном буфере с концентрацией 20 мг/мл с добавкой додецилсульфата натрия

Из полученной электрофореграммы следует, что пик ГМДП

полностью разделен с пиками сопутствующих компонентов пробы, что

позволяет использовать данные условия анализа для количественной оценки

содержания ГМДП в гидролизатах молочнокислых бактерий.

Разработанная методика была валидирована согласно рекомендациям

ICH по следующим показателям: линейность, прецизионность,

специфичность и точность (таблица 3). Для определения специфичности

методом добавок было установлено, что площадь пика ГМДП увеличивается

пропорционально количеству добавленного стандарта, в то же время электроподвижность и асимметрия пика остается на прежнем уровне, что служит еще одним подтверждением того, что данный пик принадлежит ГМДП.

Однако, для электрофоретических, как и для хроматографических методов анализа необходимо оценивать еще и пригодность системы, как еще одного критерия валидационной оценки (таблица 3).

Таблица 3 - Валидационные характеристики методики количественного определения ГМДП__

Характеристики Методика определения ГМДП

Диапазон линейности, мг/мл 0,4-4

Коэффициент корреляции, г 0,9989

Прецизионность, ИБО (%) 0,97

Точность, Я (%) 99,7-102,0

Специфичность 1 .Соответствие электрофоретических подвижностей 2.Сохранение асимметрии пика

Параметры пригодности системы Не >1,51; Т0,о5=1,2-1,3 Ы-не менее 60000; 0=3 -10"5-5-10"5;

В методе КЭ в отличие от хроматографических методов, есть свои особенности. Помимо основных показателей, применяемых в хроматографии (коэффициент разделения (Rs), асимметрия пика (T0>os) и эффективность^), в КЭ определяется еще и коэффициент диффузии (D), так как он помимо эффективности определяется длиной капилляра, качеством его поверхности и напряжением в системе. Поэтому данный показатель является наиболее достоверным для оценки пригодности электрофоретической системы.

Таким образом, разработана методика количественного определения ГМДП в микробных гидролизатах. Данная методика была валидирована согласно рекомендациям ICH по 4 основным показателям. Кроме того, были выбраны и нормированы основные показатели пригодности системы.

Выбор оптимального способа получения гидролизата

Для выбора оптимального способа получения гидролизата использовали термокислотный и ферментативный способы гидролиза.

Условия термокислотного гидролиза представлены в таблице 4. Гидролиз проводился в автоклаве, при этом переменными условиями были рН, температура и время гидролиза.

Таблица 4 - Условия для получения гидролизатов молочнокислых бактерий термокислотным способом

Номер гидролизата рН Температура, °С Время гидролиза, час

1 2,0 100 1

2 3,0 100 5

3 2,0 120 1

4 3.0 120 5

5 2,5 110 3

Ферментативный гидролиз (таблица 5) велся различными группами ферментов: группой протеолитических ферментов, представленной трипсином, панкреатином и проназой и группой мурамидазных ферментов, представленной лизоцимом. Предварительно для каждого фермента были выбраны оптимальные соотношения фермент-субстрат и время гидролиза.

Таблица 5 - Условия получения ферментативных гидролизатов молочнокислых бактерий_

Условия гидролиза ФЕРМЕНТ

Проназа Лизоцим Трипсин Панкреатин

Буфер Трис-буфер Трис-буфер Трис-буфер Трис-буфер

Предварительное кипячение + + + +

Время гидролиза, час 2 л .> 2 3

Температура, °С 37 37 37 37

1/*АПтЮ/"П1А фермента, мг/мл 2 2 2 4

Все полученные гидролизаты были проанализированы по показателям: количественное содержание общего белка, пептидов с М.м.< 1500, аминокислот, а также ГМДГ1. Результаты анализа ферментативных гидролизатов представлены в таблице 6. В полученных гидролизатах содержание низкомолекулярных пептидов достигало 0,32, а содержание ГМДП -0,024 г/100мл.

Таблица 6 - Результаты количественного определения основных биологически активных веществ в гидролизатах, полученных ферментативным способом (п=3)_

Показатель Гидролизат

1 2 3 4 5

Аминокислоты, г/100мл 1,73 0,570 0,690 0,860 0,580

Общий белок, г/100мл 1,28 0,700 0,830 0,810 0,550

Пептиды, г/100мл 0,320 0,160 0,170 0,190 0,160

ГМДП, г/100мл 0,009 0,015 0,024 0,008 0,005

Анализ термокисло! ных ¡идролизатов показал, что содержание низкомолекулярных пептидов и ГМДП достигало 1,88 и 0,063 г/100мл

соответственно (таблица 7).

Таблица 7 - Результаты количественного определения основных биологически активных веществ в гидролизатах, полученных термокислотным способом (п=3)_

Показатель Гидролизат

1 2 3 4 5

Аминокислоты, г/100мл 2,67 1,39 2,44 1,51 1,59

Общий белок, г/ 100мл 4,72 3,29 4,77 3,30 3,64

Пептиды, г/100мл 1,88 1,27 1,74 1,56 1,50

ГМДП, г/ 100мл 0,005 0,055 0,007 0,063 0,023

Таким образам, сравнивая термокислотный и ферментативный

способы получения гидролизатов молочнокислых бактерий, можно утверждать, что по всем составляющим биологически активных веществ, в том числе и содержанию ГМДП, термокислотный способ гораздо более эффективный.

Поэтому дальнейшие исследования принято было проводить на примере термокислотного способа, и, в частности, на примере гидролизата

№4, так как в его составе содержание ГМДП является максимальным. Гидролизат №4 явился отправной точкой при разработке лекарственного препарата «Биолактон».

Следующей составляющей при разработке оптимального состава конечного продукта является выбор консерванта. В работе использовалось два альтернативных консерванта: кислота молочная и нипагин.

Дня оценки эффективности консервантов использовали методику, описанную в ВФС 42-3456-99 «Определение эффективности антимикробных консервантов лекарственных средств».

Результаты исследований показали, что консервантом, обеспечивающим оптимальный срок хранения гидролизата, является нипагин в концентрации 1 г/л. Для количественного определения нипагина был использован метод ВЭЖХ (рисунок 2).

Рисунок 2 - Хроматограмма гидролизата

Данный метод позволяет разделить нипагин с другими

компонентами пробы.

Стандартизация лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий («Биолактои»)

Для стандартизации данного лекарственного препарата - жидкой лекарственной формы для внутреннего применения согласно ОСТ 4291500.05.001 - 00 были выбраны следующие показатели: описание, подлинность, сухой остаток, рН, номинальный объем, количественное определение, микробиологическая чистота, а также срок годности.

Таблица 8 - Нормы качества лекарственного препарата «Биолактон»

Показатели Методы Нормы

Описание Визуально Прозрачный раствор темно-коричневого цвета

Подлинность: 1. Сумма пептидов с М м.<1500 Спектрофотометрия в видимой области Спектр поглощения испыт и станд. раствора имеют один максимум при 527±2 нм

2.ГМДП Капиллярный электрофорез На электрофоре) рам мс раствора испьгг образца должен присутствовать пик, соответствующий по электроподвижности пику на электрофореграмме раствора стана, образца (ГМДП)

Сухой остаток (ГФ XI, вып 2, с 148) Не менее 7,5 %

рН Потенциометрически - 2,8-3,5

Номинальный объём ОСТ 42-506-96 100±5 мл

Кол-ное определение: I Белок Спектрофотометрия в видимой области не более 3,40 г/100мл

2.Пептиды Спектрофотометрия в видимой области не менее 1,50 г/100мл

3. Аминокислоты; Спектрофотометрия в видимой области не менее 1,40г/100мл

4 ГМДГТ, Капиллярный электрофорез не менее 0,060 г/100мл

5.Нипагин ВЭЖХ 0,080-0,120 г/100мл

Микробиологическая чистота ГФ XI, вып 2, стр.193 и изм. №3 соответствует категории ЗБ

Срок годности 2 года

Валидационные характеристики методик количественного определения основных биологически активных веществ «Биолактона» представлены в таблице 9.

Таблица 9-Валидационные характеристики методик количественного определения основных биологически активных веществ в лекарственном препарате «Биолактон»____

Методика определения белка Методика определения пептидов Методика определения аминокислот Методика определения ГМДП Методика определения нипагина

Специфичность Спектр поглощения испыт и станд. раствора имеют один максимум при 550±2 11М Спектр поглощения испыт и станд раствора имеют один максимум при 527±2 нм Спектр поглощения испыт. и станд раствора имеют один максимум при 620±2 нм 1 Соответствие электрофорети-ческих подвижностей 2 Сохранение асимметрии пика 1.Соответствие времен удерживания 2 Сохранение асимметрии пика

Прецизионное! ь,% 1,15 1.03 1.85 3.44 3,59

Точность. ИЗО наЗ-х уровнях конц, % 99,1-101,2 97,4-103,2 97,4-102,6 98,6-102,5 96,8-103,3

Предел кол-го опр-я, г/100мл 0,089 0,064 0,074 0,005 0,008

Критерии пригодности системы - - - Rs>l,51; То 05= 1,2-1,3 D=310"5-5-10"s, N>60000, ЯБ >2,25; То оз=0,9-1,1 N>6000

Все показатели валидности методик удовлетворяют нормам ICH. Изучение фармакологической активности препарата «Биолактон»

На заключительном этапе исследований была проведена фармакологическая оценка разработанного лекарственного препарата.

На белых крысах-самцах линии Жи.'ог, массой 180±20 проводились исследования по изучению влияния «Биолактона» на иммунологический статус организма (показатели гуморального и клеточнош иммунитета).

Исследования выполнялись в сравнении с шпаклюй, контрольной, а также группой животных получавших «Ликопид» на модели экспериментальной токсической иммуносупрессии, вызванной раствором тетрахлорметана. «Ликопид» вводили перорально в дозе 1,26 мг/кг, «Биолактон» вводили в дозе 2 мл/кг, что соответствует, аналогичной дозе ГМДП в таблетках «Ликопид».

При оценке влияния лекарственных препаратов на иммунную реактивность организма установлено, что курсовое их применение не оказывает значимого влияния на факторы гуморального иммунитета (бактерицидную активность сыворотки крови БАСК), активности (5-лизина и лизоцима) по сравнению с контрольной группой животных при моделировании интоксикации.

Со стороны клеточного иммунитета у животных опытных групп отмечены существенные отличия относительно животных контрольной группы (таблица 10). Так, курсовое введение всех объектов исследования активирует фагоцитарную активность лейкоцитов (ФАЛ), а по влиянию на данный показатель иммунитета «Биолактон» оказывает более выраженное воздействие, чем препарат сравнения «Ликопид». Установлено также, что курсовое применение исследуемых лекарственных препаратов оказывают статистически значимое положительное влияние на показатель «процент завершенности фагоцитоза» (ПЗФ). Позитивные отличия выявлены и при анализе показателя «фагоцитарный индекс лейкоцитов» (ФИЛ).

Таблица 11 - Влияние «Биолактона» на показатели клеточного иммунитета

Группа животных ФАЛ,% ПЗФ,% ФИЛ, ед

Интактная 43,7±3,3 50,1±3,6 0,57±0,01

Контрольная 29,4±1,1 35,2±2,5 0,32±0,01

Биолактон 42,5±2,9* х 42,1±1,9 0,44±0,01*х

Ликопцд 34,2±1,5* 42,7±2,0* 0,39±0,01*

Примечание' Обозначены достоверные сдвиги (р<0 05). * - по сравнению с контрольными животными, х - относительно группы животных, получавших «Ликопид».

Полученные результаты коррелируются с данными литературы о влиянии подобных соединений (гликопептидов мурамилдипептиднош ряда) на клеточный иммунитет и об отсутствии влияния на гуморальный.

Фармакологические исследования проводились совместно с кандидатом фармацевтических наук, ассистентом кафедры биологической химии и микробиологии Клишиной И.И.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведена сравнительная оценка фотометрических методик для количественного анализа общего содержания белков и пептидов с целью их определения в гидролизатах молочнокислых бактерий. Показано, что оптимальной является методика количественного определения белков и пептидов с реактивом Бенедикта.

2. Доказана возможность использования метода КЭ для количественного определения ГМДП в гидролизатах молочнокислых бактерий, полученных различными способами, а также для оценки их стабильности.

3. Определены факторы, влияющие на разделение ФТК-производного ГМДП от сопутствующих ФТК-производных других пептидов и аминокислот.

4. Обоснованы параметры пригодности системы для электрофоретического разделения ГМДП. Показано, что одним из основных параметров пригодности электрофоретической системы является коэффициент диффузии

5. Проведены исследования по выбору оптимального способа получения гидролизата молочнокислых бактерий. Показано, что оптимальным являлся метод термокислотного гидролиза, который применер для создания лекарственного препарата «Биолактон». Выбран консервирующий компонент - нипагин и проведена вадидационная оценка методики его количественного определения в полученном гидролизате.

6. Проведены исследования по стандартизации лекарственного препарата «Биолактон». Для нормирования качества полученного продукта, использованы следующие показатели: описание, подлинность, сухой остаток, рН, номинальный объем, количественное определение и микроби<?логическая чистота. В условиях естественного хранения установлен срок годности «Биолактона», который равен два года;

7. Проведена фармакологическая оценка действия «Биолактона» на показатели клеточного и гуморального иммунитета экспериментальных животных. Установлено, что «Биолактон» оказывает существенное влияние только на показатели клеточного иммунитета.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение состава препарата, полученного на основе гидролизата молочнокислых бактерий // Хим. - фармац. журн. - Т.39, №3. - 2005. - С. 5153 (Соавт. В .А. Самойлов, Н.М. Гостищева, Г.В. Сеньчукова, М.В. Гаврилин).

2. Разработка методов анализа и оптимизация состава лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий // Материалы II съезда фармацевтических работников 5-7 июня 2005 г. - Сочи, - С.63-64 (Соавт. М.В. Гаврилин, Г.В. Сеньчукова).

3. Выбор оптимальных условий получения гидролизатов молочнокислых бактерий // Актуальные проблемы медицинской биотехнологии: материалы второй научно-практической конференции. -Анапа, 2005. - С. 9-10 (Соавт. М.В. Гаврилин, Г.В. Сеньчукова).

4. Выбор оптимальных условий получения гидролизатов молочнокислых ' бактерий термокислотным способом // Разработка исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов. - Пятигорск, 2005. -Вып. 60. -С.280-281.

5. Выбор оптимальной методики количественного определения белков и пептидов в гидролгоатах молочнокислых бактерий // Разработка исследование и маркетинг повой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов. - Пятигорск, 2006. - Вып. 61. - С.179-180 (Соавт. М.В. Гаврилин, Г.В. Сеньчукова).

6. Использование капиллярного электрофореза для количественного определения глюкозаминилмурамилдипептида в микробных лизатах // Разработка исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов. - Пятигорск, 2006. - Вып. 61. - С. 180-182 (Соавт. М.В. Гаврилин, Г.В. Сеньчукова).

7. Использование капиллярного электрофореза для количественного определения глюкозаминилмурамилдипептида в гидролизатах молочнокислых бактерий // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2006. - Т.2, №1. - С. 46-48 (Соавт. М.В. Гаврилин).

8. Изучение фармакологической активности гидролизатов молочнокислых бактерий // Молодые ученые - медицине: тез. докл. пятой науч. конф. молодых ученых. - Владикавказ: СОГМА, 2006.-С.93-94.

СЕНЧЕНКО СЕРГЕЙ ПЕТРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА И ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 27 декабря 2006 г. Формат 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № £0

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ» 357532, г Пятигорск, пр Калинина, 11

СЕНЧЕНКО СЕРГЕЙ ПЕТРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ АНАЛИЗА И ОПТИМИЗАЦИЯ СОСТАВА ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати 27 декабря 2006 г. Формат 60x84 1/16 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРС1ВРННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ» 357532, г Пятигорск, пр Калинина, 11

Актуальность. Современная отечественная промышленность для получения лекарственных препаратов, как правило, использует лекарственное растительное сырье и продукты химического синтеза, и значительно реже для этих целей применяются бактерии. Вместе с тем, использование бактерий в качестве сырья может быть достаточно перспективным, ввиду высокого содержания в них важных биологически активных веществ. Кроме того, высокая скорость роста бактерий позволяет культивировать их в больших количествах за достаточно короткое время, что делает использование бактерий в качестве сырья рентабельным.

Среди биологически активных веществ бактерий особую ценность представляют белки, пептиды, аминокислоты, а также аминосахара, органические кислоты, витамины и т.д.

Белковые вещества бактерий могут служить источником лечебного питания, а продукты их полного гидролиза (смесь всех аминокислот) применяться для парентерального питания.

Особое значение имеют углевод-белковые биополимеры или пептидогликаны, в которых сравнительно короткие олигопептидные фрагменты присоединены к полисахаридной цепи. Примером может служить пептидогликан клеточной стенки бактерий, построенный из остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенными между собой (3 (1—>4) - гликозидными связями. Линейный полисахарид связан с олигопептидными цепями через лактильные остатки мурамовой кислоты, создавая, таким образом, защитный каркас бактериальной клетки.

Заслуживает внимания также тот факт, что данные структуры и вещества содержатся только в бактериальной стенке, у животных и растений они отсутствуют. Кроме того, у грам-положительных бактерий (род Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus и др.) доля пептидогликана составляет до 70% от сухой массы клеточной стенки, тогда как у грам-отрицательных бактерий этот показатель составляет максимум 10%.

Расщепление протеогликана приводит к смеси гликопептидов, обладающих адъюваитной и противоопухолевой активностями. Наименьшей структурной единицей, проявляющей такого рода активности, является мурамилдипептид - MurNAc-L-Ala-D-GluNH2.

Мурамилдипептид и его производные обладают широким спектром биологических эффектов, наиболее важным, из которых, является плейотропное иммуномодулирующее действие. Именно с иммуномодулирующим действием связано применение производных мурамилдипептида для стимуляции естественных защитных реакций организма против опухолей и болезнетворных микроорганизмов. Кроме иммуноадъювантной, мурамилдипептид обладает противоопухолевой и антиинфекционной активностью, а также снотворными свойствами.

Производные мурамилдипептида входят в состав виросомной противогриппозной вакцины. В настоящее время существует ряд препаратов на основе производных мурамилдипептида. Например: «Ромуртид» (Япония) - иммуностимулятор после радиотерапии рака; «Мурабутид» - применяется при вторичных иммунодефицитах; «Ликопид» (Россия) - при иммунодефиците разной природы.

Благодаря этим свойствам гликопептиды бактериальной клетки привлекают пристальное внимание исследователей как потенциальные компоненты лекарственных средств.

Использование бактерий для получения гидролизных препаратов в нашей стране ранее не применялось, хотя накоплен значительный опыт культивирования бактерий в больших масштабах.

Особый интерес представляет культивирование молочнокислых бактерий. Они используются для получения эубиотических препаратов, которые находят широкое применение в медицине. Однако клиническая практика показала, что применение в нативном виде лактобактерий, зачастую оказывалось неэффективным, вследствие низкой приживаемости у рецепиентов, а также их частичной инактивации в желудке. В данном случае клинически более оправдано может быть применение продуктов гидролиза молочнокислых бактерий, которые содержат короткоцепочечные жирные кислоты, целый комплекс пептидов, аминокислоты и другие биологически активные вещества.

К числу таких препаратов можно отнести терапевтический раствор для носоглотки «ИРС-19» (Сарбах, Франция), представляющий собой лизаты различных видов бактерий (диплококки, стрептококки, стафилококки, нейссерия и др.), применяемый для стимуляции местного иммунитета. Капсулы «Бронхо-мунал» (Лек, Словения) - лиофилизированный лизат бактерий симбионтов слизистой оболочки дыхательных путей, также применяемый как иммуностимулятор.

Однако в нашей стране аналогов данным препаратам не существует. Это связано с тем, что не разработаны эффективные способы получения гидролизатов бактерий, а также нет валидированных методик оценки их качества.

В связи с этим актуальным является проведение исследований по разработке препарата на основе гидролизата лактобактерий, изучение его качественного и количественного состава, стабильности и биологической активности.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка методик анализа основных биологически активных веществ гидролизатов молочнокислых бактерий, стандартизация и первичная фармакологическая оценка лекарственного препарата на основе гидролизата бактерий Lactobacillus acidophilus.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку спектрофотометрических методик количественного анализа общего содержания белков и пептидов на возможность их определения в гидролизатах молочнокислых бактерий.

2. Изучить возможности использования методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза для качественного и количественного определения глюкозаминилмурамилдипептида в гидролизатах молочнокислых бактерий, полученных различными способами и использовать данные методы для оценки их стабильности.

3. Изучить факторы, влияющие на разделение фенилизотиокарбамил-производного глюкозаминилмурамилдипептида от сопутствующих фенилизотиокарбамил-производных других пептидов и аминокислот.

4. Обосновать параметры пригодности системы для электрофоретического разделения фенилизотиокарбамил-производного глюкозаминилмурамилдипептида от сопутствующих фенилизотиокарбамил-производных других пептидов и аминокислот.

5. Выбрать оптимальный способ получения гидролизата с помощью методов термокислотного и ферментативного гидролиза и предложить эффективный консервант.

6. Провести исследования по стандартизации лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий («Биолактон») и обосновать сроки его годности.

7. Провести первичную фармакологическую оценку действия препарата «Биолактон» на показатели клеточного и гуморального иммунитета экспериментальных животных.

Научная новизна. Впервые проведена валидационная оценка фотометрических методик количественного определения белков, низкомолекулярных пептидов и аминокислот. При этом установлено, что максимальную точность и воспроизводимость результатов определения общего содержания белков и пептидов обеспечивает методика с реактивом Бенедикта, а для определения общего содержания аминокислот - методика количественного определения с суспензией меди фосфата (II).

Теоретически обоснованы и экспериментально подтверждены условия электрофоретического определения фенилизотиокарбамил-производного глюкозаминилмурамилдипептида в присутствии фенилизотиокарбамил-производных других пептидов и аминокислот. Показано, что полное разделение может быть достигнуто с использованием мицелярного капиллярного электрофореза, где в качестве мицеллообразующей добавки использовался натрия додецилсульфат. Установлено, что основными факторами, влияющими на электрофоретическое разделение, являются ионная сила буферного раствора, формирующая ^-потенциал, а также добавка мицеллообразующего компонента.

Изучены показатели для определения пригодности электрофоретической системы. Впервые использована величина диффузного потенциала электролита в качестве критерия пригодности системы.

При проведении выбора условий получения гидролизата молочнокислых бактерий штамма L. acidophilus В 2505 установлено, что максимальное накопление биологически активных веществ обеспечивает метод термокислотного гидролиза.

Обоснованы показатели и нормы качества лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий. С использованием физико-химических методов установлены сроки его годности - 2 года. Выбран оптимальный консервант, обеспечивающий микробиологическую стабильность в ходе хранения препарата.

В опытах на животных показано положительное влияние разработанного лекарственного препарата на общее физиологическое состояние (массу тела животных), а также на показатели клеточного иммунитета (фагоцитарная активность лейкоцитов, процент клеток с завершенным фагоцитом на 100 нейтрофилов и фагоцитарный индекс лейкоцитов). Кроме того, установлено, что в условиях желудочно-кишечных и легочных инфекционных патологий ягнят разработанный препарат в 80% случаев способствует полному выздоровлению подопытных животных.

Практическая значимость. Доказана возможность использования методов количественного определения общего содержания белков, пептидов и аминокислот при их совместном присутствии. Впервые разработана методика количественного определения глюкозаминилмурамилдипептида методом капиллярного электрофореза в присутствии других пептидов и аминокислот. Предлагаемые методики могут использоваться в практике анализа любых объектах, содержащих белки пептиды и аминокислоты.

Предложены способы оценки пригодности электрофоретической системы, которые могут быть использованы для анализа других веществ методом капиллярного электрофореза.

Оптимизированы способы ферментативного и термокислотного гидролиза бактериальной массы, которые могут быть широко использованы для глубокой переработки микробиологических объектов. На основании сравнительного изучения указанных способов для практического использования рекомендован термокислотный способ гидролиза.

Внедрение результатов исследований в практику. Разработан проект ФСП на лекарственный препарат «Биолактон», представляющий собой термокислотный гидролизат молочнокислых бактерий, который передан для внедрения на опытном производстве НИИ комплексного использования молочного сырья (НИИКИМ), г. Ставрополь.

Апробация и публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы доложены на:

1) XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005г.);

2) II конференции по медицинской биотехнологии (Анапа, 2005г.);

3) Научно-практической конференции «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва, 2006г.)

4) Ежегодных научных конференциях ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (Пятигорск, 2005 и 2006г.).

По теме диссертационной работы опубликовано 8 работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы (НИР) ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, а также в соответствии с соглашением о выполнении НИР между федеральным агентством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (№ 06/1049).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 41 таблицу и 45 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 116 источников, из которых 3 8 на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведена сравнительная оценка фотометрических методик для количественного анализа общего содержания белков и пептидов с целью их определения в гидролизатах молочнокислых бактерий. Показано, что оптимальной является методика количественного определения белков и пептидов с реактивом Бенедикта.

2. Доказана возможность использования метода КЭ для количественного определения ГМДП в гидролизатах молочнокислых бактерий, полученных различными способами, а также для оценки их стабильности.

3. Определены факторы, влияющие на разделение ФТК-производного ГМДП от сопутствующих ФТК-производных других пептидов и аминокислот.

4. Обоснованы параметры пригодности системы для электрофоретического разделения ГМДП. Показано, что одним из основных параметров пригодности электрофоретической системы является коэффициент диффузии.

5. Проведены исследования по выбору оптимального способа получения гидролизата молочнокислых бактерий. Показано, что оптимальным являлся метод термокислотного гидролиза, который применер для создания лекарственного препарата «Биолактон». Выбран консервирующий компонент - нипагин и проведена вадидационная оценка методики его количественного определения в полученном гидролизате.

6. Проведены исследования по стандартизации лекарственного препарата «Биолактон». Для нормирования качества полученного продукта, использованы следующие показатели: описание, подлинность, сухой остаток, рН, номинальный объем, количественное определение и микробиологическая чистота. В условиях естественного хранения установлен срок годности «Биолактона», который равен два года;

7. Проведена фармакологическая оценка действия «Биолактона» на показатели клеточного и гуморального иммунитета экспериментальных животных. Установлено, что «Биолактон» оказывает существенное влияние только на показатели клеточного иммунитета.