Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка липосомальных форм с ситостерином гороха с целью применения в медицинской практике

На правах рукописи

003488857

ГЛИНКИНА АЛИНА ЕВГЕНЬЕВНА

РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ С СИТОСТЕРИНОМ

ГОРОХА

С ЦЕЛЬЮ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 О ЛЕК

Москва 2009

003488857

Диссертация выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова и в РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор Иван Иванович Краснюк доктор медицинских наук Федор Витальевич Доненко

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических, профессор Наталья Борисовна Демина кандидат фармацевтических наук Наталья Кирилловна Горчакова

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений РАСХН.

Защита состоится: у/ ул 2009 г. в *2 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова по адресу: 121019, Москва, Никитский бульвар, д. 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, г.Москва, Нахимовский пр. д. 49.

Автореферат разослан « ¿О» X/ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, Д.208.040.09

доктор фармацевтических наук ^ СА-'У^

профессор Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы:

Настоящий период развития отечественной медицины и фармации характеризуется отчетливой тенденцией к более интенсивному использованию лекарственных средств растительного происхождения. В связи с этим одной из важных проблем фармации является изыскание новых растительных источников биологически активных веществ и создание на их основе эффективных лекарственных препаратов.

Представители семейства Бобовые, такие как горох посевной, соя, фасоль и другие представители семейства широко известны как ценные пищевые продукты. В тоже время эти представители имеют значение и в медицине. Так из фасоли выделены лектины (фитогемагглютинины - ФГА), обладающие гемагглютинирующей способностью и имеющие применение в медицинской практике. Горох посевной, применяется в народной медицине как мочегонное, гипогликемическое средство, а также для лечения воспалений кожи, экземы и гнойных ран. Известно, что горох богат фитостеринами. Фитостерины (стерины растительного происхождения) - это вещества, которые показали биологическую эффективность, ингибируя пролиферацию и индуцируя апоптоз в клетках солидных опухолей толстой кишки и молочной железы человека, а также являются важными для снижения уровня холестерина.

В связи с тем, что горох, соя и другие белок содержащие растения являются наиболее доступными источниками питания, то для профилактики различных заболеваний представляется интересным исследование традиционных для нашей страны пищевых продуктов с целью выявления из них биологически активных комплексов.

В настоящее время в мире исследование биологической активности фитостеринов является одной из самых популярных направлений научных

исследований. Количество публикаций по этому направлению не уступает количеству публикаций, например, по онкологии.

Популярность и актуальность этого направления связана с высокой биологической активностью этих соединений, способных снижать риск развития онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний более чем на 20%.

В качестве доставки фитостеринов в организм человека нами была выбрана липосомальная форма. Липосомы близки по химическому составу с природными мембранами клеток, поэтому при их введении в организм они не вызывают негативных и аллергических реакций. Липосомы способны переносить широкий круг фармакологически активных веществ: противоопухолевые и противомикробные препараты, гормоны, ферменты, вакцины. Включенные в липосомы лекарственные вещества становятся более устойчивыми в организме, так как изолированы липидной мембраной, благодаря которой обеспечивается их направленная доставка.

Исходя из вышеперечисленного, научные исследования, посвященные разработке технологии получения фитостеринов из семян гороха и стандартизации липосомальных форм, предназначенных для повышения иммуномодулирующей активности организма являются актуальными в настоящее время. Цель исследования

Целью настоящей работы явилась разработка методов выделения и очистки фитостеринов гороха, изучение их иммуномодулирующей и противоопухолевой активности, с целью создания на их основе липосомальной формы для применения в медицинской практике. Задачи исследования

1. Изучить липидный состав семян гороха методом газовой хроматографии масс-спектрометрии и оценить их биологическую активность.

2. Разработать методику выделения и очистки фитостеринов гороха.

3. Изучить иммуномодулирующую и противоопухолевую активность ситостерина гороха.

4. Получить липосомальную форму ситостерина гороха.

Научная новизна исследования

Заключается в том, что на основании проведенных комплексных исследований впервые разработан рациональный метод технологии выделения фитостеринов из семян гороха и сои.

Разработан метод количественного определения ситостерина в экстрактах из семян гороха и сои.

Выявлен качественный и количественный состав липидов гороха и определена их биологическая активность.

Предложена новая липосомальная лекарственная форма из семян гороха, для использования в медицине и в качестве биологически активной добавки к пище. Произведина съёмка микролипосом из семян гороха для их морфологической характеристики.

Впервые выявлено иммуномодулирующее действие липосомальных форм с ситостерином из семян гороха.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования

Разработана методика выделения и очистки фитостеринов гороха с их дальнейшей идентификацией и определением физико-химических свойств.

Изучена биологическая активность фитостеринов и влияние степени их очистки на биологические свойства.

Созданы липосомы с ситостерином, обеспечивающие иммуномодулирующее действие.

Внедрено в учебный процесс методическое пособие для студентов фармацевтического факультета по элективному курсу: «Микрокапсулированная лекарственная форма - липосомы».

Разработан проект ФСП «Ситостерин липосомальный» лиофилизат для приготовления суспензии для перорального употребления 200 мг. Апробация работы: Основные положения диссертации доложены на научно- методических конференциях кафедры технология лекарственных форм ММА им. И.М. Сеченова (2007, 2008гг.), медико-фармацевтическом конгрессе «Человек и лекарство» (2009г.) и международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» 2008-2009гг. Положения выносимые на защиту:

-результаты изучения содержания липидов и фитостеринов в семенах гороха; -результаты разработки способов выделения и оптимальной очистки фитостеринов с целью сохранения их биологической активности; - материалы разработки методик для оценки качества и стандартизации липосом с фитостеринами;

результаты оценки биологической активности фитостеринов в липосомальной форме.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 10 работ. Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением кафедры технологии лекарственных форм ММА им. И.М.Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации - 01.2.006 06352).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, «обзора литературы» и четырех глав собственных исследований. Список публикаций включает в себя 22 источников отечественной литературы и 106 источников зарубежной литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включая 35рисунков и 14 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость. Первая глава посвящена изучению фитостеринов гороха и сои.

В качестве объекта исследования было выбрано четыре сорта гороха посевного и два сорта сои. Сорта гороха и сои были приобретены в сети розничной продажи семян Центрального региона России в 2008 г. В качестве объекта исследования сои было выбрано два сорта: Комсомолка К5950 и Приморская 494.

Методика выделения и очистки фитостеринов. При подборе растворителя на основе литературных источников использовали гептан и этанол. Разделение фракций осуществляли с помощью колоночной хроматографии на сефадексе ЬН-20 и матрицей ЫСЬгоргер. Гептанрастворимую и этанолрастворимую фракции наносили на колонку уравновешенную этанолом. Последующее элюирование осуществляли ступенчатым элюатом с возрастающей его гидрофобностью.

Содержание гептанрастворимых фракций семян гороха приведено в таблице 1.

Таблица 1

Среднее содержание гептанрастворимых фракций семян гороха

Сорт семян гороха Цвет семян гороха Средний вес* фракции отдельных сортов семян гороха Средний вес* фракции

Нистрам 1.9±0.2

Альфа зеленый 1.7+0.2 1.8 + 0.4

Эврика 1.4+_0.1

Русское поле желтый 1.2+0.4 1.3+0.3

* Средний вес гептанрастворимой фракции на 100 г гороховой муки. Приведены средние данные трех экспериментов.

Как следует из таблицы 1 средний вес гептанэкстрагируемой фракции зеленых сортов гороха больше, чем средний вес гептанэкстрагируемой фракции желтых семян гороха и составляет 1.8 и 1.3 г на 100 г гороховой муки соответственно.

Для дальнейшей характеристики гептанрастворимых фракций были изучены их спектры поглощения (Рис. 1).

Рис. 1. Спектры поглощения веществ экстрагированных гептаном из муки семян гороха. 1 -спектр поглощения веществ из желтых семян; 2 -спектр поглощения веществ из зеленых семян. Измерение проводили на спектрофотометре HP 8452 А с диодной матрицей.

Желтые и зеленые семена гороха значительно отличаются по количественному содержанию пигментов. В зеленых семенах, исходя из данных (рис. 1) спектра поглощения содержание пигмента в 5 раз выше, чем желтых. В зависимости от физико-химических свойств этого пигмента можно ожидать, что работа с зелеными семенами по выделению фитостеринов будет серьезно затруднена. Поэтому для выделения фракций фитостеринов с минимальной примесью пигментов в дальнейшем мы использовали экстракцию этанолом.

Исходя из данных литературы фитостерин обладает биологической активностью, когда он входит в состав пищевых продуктов. В то же время, очищенный ситостерин практически не обладает биологической активностью. Поэтому третья фракция (рис.3) подвергалась меньшей очистке. Максимальное содержание фитостеринов отмечалось во фракции III (рисунок 4). Время удерживания ситостерина составило 9.19 секунды.

Для идентификации ситостерина было проведено сравнение масс-спектров эталонного ситостерина и ситостерина, входящего в состав фракции II (рис.5). Показано, что, как и эталонный ситостерин, ситостерин, входящий в состав гороха имеет молекулярный пик m/z 414. Кроме этого совпадают все m/z тяжелых ионов 396, 381, 329, 303, 273, 255 и т.д. эти данные позволяют утверждать, что во фракции II идентифицирован ситостерин.

Дальнейшая наработка ситостерина была проведена по следующей схеме (рисунок 2).

Рис. 2. Схема очистки фитостеринов гороха

Рис. 3. Схема очистки фитостеринов гороха и получение фракции III

Рис. 4. Газовохроматографический масс-спектр этаноловой фракции желтых семян гороха и элюированной этанолом. Фракция III.

WM«* w-i с.э«с->.;с-

»•и! 1 e.»«j 1 \ J Ii. 1- ■ И v V- .<■ j *■ „.i/'li i.V. I'.' ; l ::

ЧУ ..... ...............> .......... ________, ...Л- *!• «'.'. | * Сишосшерин Я/»:«

Рис.5. Масс-спектр эталонного ситостерина (внизу) и ситостерина из образца гороха (вверху). По оси абсциис - m/z, по оси ординат -интенсивность (усл.ед.).

Количественное определение ситостерина проводили по реакции Либермана-Бурхарда.

Для количественного определения готовили раствор ситостерина с уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой, дающее зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации ситостерина. Чтобы исключить погрешности при количественном определении ситостерина в лекарственной форме, необходимо измерение оптической плотности испытуемого раствора1 проводить против раствора сравнения, содержащего соответствующие вспомогательные вещества в таком же разведении.

На рисунке 6 приведен спектр окрашенного комплекса ситостерина. Как видно из приведенного спектра окрашенный комплекс имеет три выраженных максимума поглощения 332 нм, 414 нм и 638 нм. Отметим, что при 656 нм также присутствует максимум поглощения, но его интенсивность уступает трем ранее перечисленным пикам. Уксусный ангидрид предварительно перегоняют, чтобы удалить примесь уксусной кислоты и экзогенной окраски. Количество ситостерина в пробе определяют по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой измеряют

экстинкции растворов ситостерина различной концентрации, полученных из стандартно приготовленного раствора ситостерина.

Сту ч rlp-id г а:

ы

рэсгесршепь

1 1UDMH

Wj-alsnQ*

1 растворитель

г лин о

3 1 тфИТ^СТЧуиН

1 1 -1

S.Е236Е-2 3,5812Е-2 1.7Э02Е-2

I,0681E-4 -6,1035£'-5 -3.S673E-4

0,39955 0,15231 S,3232E-2

0,30171 О,13 655

Рис. 6. Спектр поглощения окрашенного комплекса ситостерина в реакции Либермана-Бурхарда. По оси абсцисс - длина волны в нм. По оси ординат - поглощение отн. ед.

0,0 0,5 1,0 1.5 2,0

Концентрация ситостерола (в мг/пробу)

Рис. 7. Проверка выполнения закона Бугера-Ламберта-Бера. Кривая зависимости между поглощением окрашенного комплекса ситостерина при 638 нм от его концентрации в пробе.

На рисунке 7 показана зависимость поглощения окрашенного комплекса ситостерина при 638 нм от количества его в пробе. Из результатов, представленных на рис. 6, видно, что поглощение раствора ситостерина подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера. Следовательно, в диапазоне

указанных концентраций возможно с точностью (до 10 мкг на пробу), определить содержание фитостерина в пробе.

Количественное содержание ситостерина в семенах гороха и сои Данные по среднему количественному содержанию ситостерина в желтых и зеленых семенах гороха приведены на рисунке 8. Как показано на представленном рисунке в желтых семенах гороха содержится в среднем более 62 мг ситостерина на 100 мг гороховой муки, тогда как в зеленых семенах почти в 4 раза меньше (менее 15 мг ситостерина на 100 мг гороховой муки).

80 -60 -40 -20 ■ 0 ■

Рис. 8. Содержание ситостерина в семенах гороха в мг на 100 грамм гороховой муки. По оси ординат количество ситостерина мг. По оси абсцисс

желтые семена , зеленые семена - '-1

Таблица 2.

Количественное содержание фитостеринов в различных сортах сои

Сорт Среднее содержание фитостеринов в мг на 100 гр семян

Комсомолка К5950 37.8 + 4.1

Приморская 494 29.2+ 3.5

Согласно данным, представленным на рисунке 8, и в таблице 2 семена гороха имеют более высокое содержание ситостерина, чем семена сои.

11

Поэтому в дальнейших экспериментах был использован ситостерин, полученный из желтых семян гороха.

Вторая глава посвящена выделению липидов гороха, их составу и оценке их биологической активности.

Семена гороха являются ценным источником различных липидных фракций, ряд из которых хорошо известны как биологически активные вещества, такие как бета-токоферол и ненасыщенные жирные кислоты. В целом состав идентифицированных липидов желтых и зеленых семенян гороха не отличается. Однако, среднее содержание гамма токоферола в два раза, а олеиновой кислоты в 1.4 раза выше в зеленых семенах гороха, тогда как среднее содержание ситостерина почти в 3 раза выше в желтых семенах гороха.

Таким образом, с помощью проведенных методов анализа газовой хроматографии и последующей масс-спектрометрией, удалось идентифицировать 18 липидов (табл.3), которые по весу составляют около 24% липидов из общего количества веществ, которые были экстрагированы гептаном из желтых семенах гороха. А в зеленых семенах гороха эти 18 липидов по весу составляют около 18% от общего количества экстрагированных веществ. Остальные вещества липидной природы не удалось идентифицировать указанным методом, так как их масс-спектры или времена удерживания не совпадали с библиотечными данными. И для их идентификации планируются дополнительные исследования. Более 60% (из идентифицированных) липидов содержат уникальные ненасыщенные жирные кислоты и серосодержащие липиды.

Оценка иммуномодулирующей активности липидов, выделенных из зеленых семян гороха, оценивалась по их способности стимулировать спонтанную цитотоксическую активность МНПК здоровых доноров при испытании на линии опухолевых клеток К-562. В качестве препарата сравнения было использовано оливковое масло. Полученные данные

свидетельствуют о том, что липиды гороха повышает цитостатическую активность МНПК, при этом активность липидов гороха превышает таковую для оливкового масла.

Выделенные из семян гороха липиды обладают иммуномодулирующими свойствами. Эти данные свидетельствуют о том, что семена гороха могут рассматриваться как ценный источник липидов, прежде всего ненасыщенных жирных кислот, с иммуномодулирующей активностью.

Таблица 3.

Количественное содержание липидов в семенах гороха

N0. Название липида Количественное содержание липида в мг на 100 грамм гороховой муки желтых семян гороха Количественное содержание липида в мг на 100 грамм гороховой муки зеленых семян гороха

1 Диизооктиладипат 7.92 + 0.39 8.1 +0.4

2 Метиловый эфир гексадекановой кислоты 10.74 + 0.22 4.2 + 0.25

3 Бета-Токоферол 33.2+1.9 35.1 +0.21

4 Ситостерин 56.1+3.4 21.3 + 1.27

5 Бета-Амирин 7.8 + 0.37 8.7 + 0.43

6 3.3 '-Тиобисдидодециловый эфир пропановой кислоты 6.1 ±0.36 7.3 ± 0.43

7 Стигмастан-3,5-диен 7.9 + 0.39 8.1+0.41

8 п-Пентадециловый эфир 2-пропеновой кислоты 20.7+1.2 22.1 ± 1.32

9 9,17 Октадекадиенал 3.6+0.2 4.5 + 0.28

10 Бис(2-этилгексил)овый эфир гексановой кислоты 15.6 + 0.93 17.0 ± 1.04

11 Додецилакрилат 23.9 + 1.43 32.3 + 1.93

12 Октадеканоивая кислота 9.9 + 0.59 10.8 + 0.65

13 З-Меркаптододециловый эфир пропановой кислоты 9.4 + 0.56 9.7 + 0.58

14 Моно(2этилгексил)овый эфир 1,2-бензендикарбоксиловой кислоты 43.4 + 2.61 49.7 + 2.98

15 Гамма-Токоферол 5.2 + 0.31 12.3 + 0.72

16 Олеиновая кислота 30.8+1.24 43.1 + 1.75

17 п-Гексадекановая кислота 1.2 + 0.1 2.3+ 0.14

18 Октадекановая кислота 17.8+1.06 19.6+1.17

Общее количество идентифицированных липидов 311.16(24%) 324.7(18%)

Третья глава посвящена химико-фармацевтическим методам разработки липосомальных форм ситостерина.

В настоящей работе в качестве липидной основы использовали лецитин. В литературном обзоре говорилось, что ситостерин по своим свойствам сходен с холестерином и, следовательно, в использовании последнего в стабилизации липосом не было необходимости. Хромато-масс-спектрометрический анализ экстрактов семян гороха показал, что в них содержатся антиоксиданты (в частности токоферолы). Следовательно, в добавлении экзогенных антиоксидантов также не было необходимости. Многослойные липосомы получали модифицированным методом "обращения фаз": Полученную суспензию липосом затем очищали от мицеллярных структур с помощью метода миниколоночной хроматографии с последующим центрифугированием.

Для стерилизации липосомальных дисперсий был выбран метод мембранной фильтрации. Исследования, проведенные после

стерилизующей фильтрации показали, что липосомальные дисперсии не претерпевали никаких химических или физических деструкций.

Методика сублимационной сушки липосомальной дисперсии ситостерина осуществлялась согласно рекомендуемому протоколу (У.Р. ТогсЫПп, 2003)

Измерение размера липосом проводили методом лазерной корреляционной спектроскопии. Сущность метода заключается в измерении динамического рассеяния света раствором исследуемого образца.

Необходимость мониторинга количественного содержания фосфолипидов в липосомах была вызвана сохранением биологической активности ситостерина. Как уже указывалось выше при удалении липидов в процессе очистки ситостерина, последний теряет свою биологическую активность. Поэтому добавлением в липосомы яичных фосфолипидов было обусловлено необходимостью сохранить биологическую активность ситостерина за счет образующегося комплекса ситостерина с фосфолипидами. Спектрофотометрическое количественное определение фосфолипидов основано на колометрическом определении неорганического фосфата по Барлетту (V.P. Torchilin, 2003).

Состав липосом, содержащих ситостерин. Количественный контроль состава липосом осуществлялся газовохроматографически - масс-спектрометрическими методами анализа, о которых упоминалось ранее. Состав липосом: ситостерина, инкапсулированного в липосомы, в пересчете на сухое вещество (200 мг). Фосфолипиды яичного желтка в пересчете на содержание фосфора (Lipoid, Германия, а также часть фосфолипидов, которые экстрагируются из семян гороха совместно с ситостерином) ( 200 мг). В-токоферола ацетата (экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином) ( 59 мг). В-амирин (экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином) (28 мг). Метиловый эфир гексадекановой кислоты (экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином) (24 мг). Стигмастан-3,5-диен (экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином) (34 мг). 3-меркаптододециловый эфир пропановой кислоты (экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином) (17 мг). 3.3'-тиобисдидодециловый эфир пропановой кислоты (экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином) (14 мг). Моно (2-этилгексиловый эфир 1,2-бензендикарбоксиловой кислоты) (экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином) (13 мг). n-пентадециловый эфир 2-пропеновой кислоты (экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином) ( 5.0 мг). Бис(2-этилгексиловый эфир) гексановой кислоты (экстрагируется из семян гороха

совместно с ситостерином) ( 5.0 мг). у-Токоферол (экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином) (5.1 мг). Олеиновая кислота (экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином) (4.3 мг). Вещества, которые экстрагируется из семян гороха совместно с ситостерином являются его природными стабилизаторами и в специальных методах идентификации и количественной коррекции не нуждаются, так как попытки изменить природный их состав приводят к потере биологической активности ситостерина.

Результаты количественного содержания ситостерина во фракции III в новой липосомальной лекарственной форме представлены в таблице 4. Как видно из полученных данных, среднее содержание ситостерина в образце липосом (в мг) составляло 201.7 ± 13.3; относительная ошибка среднего результата количественного определения ситостерина в липосомальной дисперсии не превышала 0,16 %. Примесь липидов гороха в препарате ситостерина составляет около 50 % от общего содержания веществ во фракции III.

Таблица 4.

Содержание ситостерина в липосомальной лекарственной форме

№ образца Оптическая Оптическая Содержание Метрологические

плотность плотность ситостерина в характеристики

исследуемого раствора липосомах, мг

раствора PCO

1 0,26 0,25 210 х =201,7

2 0,27 0,27 200 Sx= 13,3

3 0,25 0,25 200 Sx"=5,4

4 0,28 0,30 180

5 0,30 0,30 200 Ах = 13,9

6 0,30 0,27 220 = £0,16%

Суммарные показатели качества липосомальной формы ситостерина в процессе хранения приведены в таблице 5. На основании проведенных

исследований предлагается срок хранения липосомальных форм ситостерина при-18° С не более года.

Таблица 5

Результаты анализа липосомальной формы ситостерина в процессе хранения

Серия № Дата анализа Подлинность Количественное содержание действующих веществ Биологическая активность

Содержание фосфолипидов А Содержание ситостерина** * * * и 2 Я С Я с X 1 Содержание фосфолипидов в мг Содержание [ РТ1ТПРТРПТШЯ Р_ Размер липосом в нм

1 8.09.2008 + + + 199 198 180 +

1 8.09.2009 + + + 197 201 180 +

2 8.09.2008 + + + 202 200 180 +

2 8.09.2009 + + + 201 200 180 +

3 8.09.2008 + + + 203 199 180 +

3 8.09.2009 + + + 200 197 180 +

*развитие синей окраски Барлетта

** развитие зеленой окраски Либермана-Бурхарда

*** наличие аполистенции

+ - положительная реакция, соответсвующая ранее установленным параметрам

Четвертая глава посвящена биологической активности липосомальной формы ситостерина гороха.

На рисунке 9 представлена микрофотография колонии клеток карциномы Эрлиха, которая культивируется с перитонеальными клетками (лимфоцитами и макрофагами) интактных мышей. Как следует из представленной микрофотографии опухолевые клетки имеют округлую форму и способны расти, как прикрепившись к пластику, так и без прикрепления к нему в виде плавающих в среде «виноградных гроздьев». Спонтанная цитотоксическая активность перитонеальных клеток

незначительна и не оказывает существенного влияния на пролиферацию опухолевых клеток. Рост фибробластов не отмечается.

Следовательно, в данных условиях эффекторные клетки интактных мышей не способны сдерживать рост клеток карциномы Эрлиха.

Рис. 9. Клетки карциномы Эрлиха и перитонеальные клетки при росте в системе in vitro. Контроль. 400-кратное увеличение.

На рисунке 10 представлена микрофотография колонии клеток карциномы Эрлиха, культивируется in vitro в присутствии нетрасформированных перитонеальных клеток интактных мышей, после добавления липосомальной формы фракции I. Как следует из представленных данных опухолевые клетки, которые в контрольной серии занимали практически все поле зрения на данной фотографии, практически отсутствуют. Видны лимфоидные элементы и клетки нормального мезотелия которые имеют округлую форму. Фибробласты, клетки имеющие веретенообразную форму. В препарате определяются также сами липосомы, которые за счет эффектов светорассеивания и светопреломления имеют вид мелких пузырьков.

Рисунок 10. Клетки карциномы Эрлиха и перитонеальные клетки при росте в системе in vitro после добавления липосом фракции I. 400-кратное увеличение.

На основании представленных данных можно предположить, что гибель опухолевых клеток обусловлена стимулирующим влиянием липосомальной формы фракции I на спонтанную противоопухолевую киллерную активность лимфоцитов интактных мышей, инкубируемыми с клетками опухоли Эрлиха.

Липосомальная форма фракции III оказывает сходное, но более выраженное с вышеописанным, действие.

Таким образом, в результате проведенных исследований липосомальная форма фитостерина гороха обладает биологической активностью. Эта биологическая активность проявляется в стимуляции противоопухолевого иммунитета, если животное получало ситостерин в дозе не менее 1.6 мг/мышь/сутки. С нашей точки зрения такой количественный контроль крайне важен. При пересчете дозы для человека можно ожидать, что подобная противоопухолевая активность ситостерина будет проявляться при его поступлении в организм человека не мене 2 г в сутки. Важно отметить, что антисклеротическая активность, по литературным данным,

проявляется в том же интервале доз. Исходя из данных, представленных на рис. 8, чтобы потреблять количество ситостерина в сутки, он должен употреблять около 2 кг семян гороха в сутки. Очевидно, что для современного человека с современным стилем питания такое потребление гороха является нереальным. Поэтому разработанная нами липосомальная форма ситостерина может найти свое применение как препарат с иммуномодулирующей, противоопухолевой и антисклеротической активностью. ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Содержание ситостерина в семенах гороха выше, чем семенах сои, составляя в среднем 23 мг и 62 мг ситостерина на 100 г зеленых и желтых семян гороха соответственно.

2. Разработан метод выделения и очистки ситостерина из семян гороха.

3. Разработаны липосомальные лекарственные формы препаратов ситостерина гороха, методика их химико-фармацевтического анализа и выбраны критерии качества лиофилизированной лекарственной формы.

4. Выявлено, что для сохранения биологической активности в препарате ситостерина необходимо присутствие примеси липидов гороха, которая снижается вплоть до исчезновения по мере уменьшения доли липидов гороха во фракциях III, I и II, содержащих 50%, 30% и 10% липидов соответственно.

5. Липосомальные лекарственные формы ситостерина гороха обладают иммуномодулирующей активностью и антиметастатическим действием на мышах с меланомой В16 при их введении в режиме 1.6 мг/мышь/сутки. Этот режим сходен с ежедневным потреблением человеком ситостерина в количестве более 2 г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Щепочкина О.Ю., Глинкина А.Е. Разработка методов определения биологически активных веществ в отдельных представителях семейства бобовых // Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», выпуск 63., Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2008г., С.522-523

2. Глинкина А.Е., Зайчикова С.Г., Щепочкина О.Ю., Доненко Ф.В. Выделение биологически активных веществ из отдельных представителях семейства Бобовые // Человек и лекарство: Тез. докл. XVII Росс. нац. конгр. -М., 2009-С. 639.

3. Глинкина А.Е., Краснюк И.И., Зайчикова С.Г. Выделение ингибиторов трипсина в семенах Бобовых // Человек и лекарство: Тез. докл. XVII Росс. нац. конгр. -М., 2009-С. 639.

4. Зайчикова С.Г., Глинкина А.Е., Доненко Ф.В., Тришин A.B., Градюшко А.Т. Иммуномодулирующая активность липидов гороха // Человек и лекарство: Тез. докл. XVII Росс. нац. конгр. - М., 2009-С. 661.

5. Глинкина А.Е., Краснюк И.И., Зайчикова С.Г., Тришин A.B., Доненко Ф.В. Выделение фитостеринов гороха и оценка их биологической активности // Молекулярная медицина и биобезопасность: тез. Докл. V межд. конф. - М„ 2008-С. 39-41.

6. Зайчикова С.Г., Тришин A.B., Глинкина А.Е. Фитоэстрогены -панацея или угроза здоровью? // Фармацевтическая биоэтика: III межд. конф. - М., 2007-С.50-52.

7. Краснюк И.И., Глинкина А.Е., Тришин A.B., Градюшко А.Т., Доненко Ф.В. Липиды гороха: состав и биологическая активность // журн. Фармация, №1, М., 2009-С.26-27.

8. Краснюк И.И., Глинкина А.Е., Тришин A.B., Градюшко А.Т., Доненко Ф.В. Ситостерин гороха: выделение и количественная оценка // журн. Фармация, №5, М., 2009-С. 18-20.

9. Краснюк И.И., Глинкина А.Е., Тришин A.B., Градюшко А.Т., Доненко

Ф.В. Ситостерин гороха: биологическая активность // журн. Фармация, №7, М., 2009-С.38-40.

Ю.Глинкина А.Е., Краснюк И.И., Зайчикова С.Г., Доненко Ф.В. Разработка липосомальных форм с ситостерином, обладающих иммуномодулирующей активностью // Молекулярная медицина и биобезопасность: тез. Докл. V межд. конф. - М., 2009-С. 64-64.

Подписано в печать 20.11.09 Формат 60X84/16 Бумага офисная «Зуе!оСору». Тираж 100 экз. Заказ №927 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24