Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка и совершенствование методов стандартизации стоматологических средств и материалов, содержащих эвгенол

На правах рукоп;

Шабалина Ангелина Эдуардовна

Разработка и совершенствование методов стандартизации стоматологических средств и материалов, содержащих эвгенол

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2008

003447850

Работа выполнена на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» и в «111 Главном Государственном Центре Судебно-Медицинских и Криминалистических Экспертиз» Министерства Обороны РФ

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор Нестерова Ольга Владимировна доктор фармацевтических наук, профессор Саломатин Евгений Михайлович

Официальные оппоненты

доктор фармацевтических наук, профессор Берлянд Александр Семенович Московский государственный медико-стоматологический университет доктор химических наук, профессор Зык Николай Васильевич Московский государственный университет имени MB Ломоносова

Ведущая организация:

ИНСТИТУТ СТАНДАРТИЗАЦИИ И КОНТРОЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ФГУ «НЦ ЭСМП» РОСЗДРАВНАДЗОРА

Защита диссертации состоится 17 октября 2008 г. в 14 часов

На заседании диссертационного совета Д 212 203 13 при Российском университете дружбы народов по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу 117198, г Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6 Автореферат диссертации размещен на сайте www rudn ru

Автореферат разослан 15 сентября 2008 г

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Лукашева Е В

Общая характеристика работы. Актуальность темы

Обеспечение населения высокоэффективными и высококачественными лекарственными препаратами - одна из основных задач современной фармации

Совершенно очевидно, что эффективность лечения теснейшим образом связана с качеством используемых материалов, требования к которым заложены в нормативной документации (НД) (Колипова Ю А, 2003, Емшанова С В , 2005)

Широкое применение лекарственных средств на основе лекарственного растительного сырья (JIPC) отечественного и, особенно, зарубежного производства, не только в фармации, но и в стоматологии, диктует необходимость разработки и внедрения новых методик стандартизации и контроля качества (Щабалина А Э , Нестерова О В , 2005)

Анализ нормативной и патентной документации показал, что определение подлинности и доброкачественности материалов, основанное на идентификации индивидуальных компонентов заявленного состава с последующей их количественной оценкой требованиям НД на стоматологические материалы, не предусмотрено, а основными критериями определения подлинности стоматологических материалов являются лишь рабочие физико-технические характеристики (время деформации, адгезивные свойства (прилипание к дентину), твердость на излом, коэффициент усадки, и т д) Определение этих свойств, безусловно, важно, но недостаточно для полноты определения качества стоматологической продукции (Беляков Ю А, 2002, Власова И В , 2004)

Особое место в этой проблеме занимают эвгенолсодержащие стоматологические материалы, которые составляют более трети всей стоматологической продукции, имеющей в составе компоненты эфирных масел Широта применения эвгенола, получаемого из эфирного масла различных частей гвоздичного дерева (Eugenia Caryophyllata) и базилика эвгенолового (Ocinum gratissimum), обусловлена спектром его фармакологического действия антибактериального, противовоспалительного, местнообезболивающего Особенности химических свойств эвгенола позволяют использовать его в качестве связующего и девитализирующего звена в клинической и ортопедической стоматологии (Трегубов А Л, 2003)

Более того, в экспертной практике известны случаи отравления эвгенолом (LD50=2680 мг/кг, крысы per os), и его изомером-изоэвгенолом (LDso=1580 мг/кг, крысы per os), что свидетельствует о необходимости жесткого контроля качества стоматологических материалов на его основе (М J OWell, 2006, Доброриз А М , 2004)

Таким образом, разработка современных методов стандартизации, позволяющих обнаружить и определить подлинность, а также дать количественную оценку входящего в состав стоматологических средств и материалов (в том числе пломбировочных) эвгенола, является актуальной задачей

Цель и задачи исследования.

Целью диссертационной работы явилась разработка методики обнаружения, определения подлинности и количественной оценки эвгенола, входящего в состав лекарственных средств и материалов, применяемых в стоматологии, с последующей стандартизацией изучаемых объектов

Задачи исследования

1 Определить показатели качества исследуемых эвгенолсодержащих материалов различных фирм-производителей, а также предложить показатели подлинности с учетом определения таковых в фармацевтической продукции

О

2 Разработать экспресс-методику определения эвгенола и примесей методом хроматографии в тонком слое сорбента (с использованием разных проявителей)

3 Установить методом ГХ-МС примесный состав исследуемых препаратов с целью определения источника получения эвгенола (природный и/или синтетический)

4 Разработать методику обнаружения и количественного определения эвгенола в стоматологических материалах (в том числе, пломбировочных) методом равновесной парогазовой фазы с газовой хроматографией и масс-селективным детектированием

5 Предложить методику стандартизации и разработать НД на стоматологические средства и материалы на основе эвгенола

Научная новизна

Проведена оценка качества по критериям, регламентируемым НД на жидкие лекарственные препараты, содержащие эвгенол применяемые в фармации, препарата «Эвгенол стоматологический» фирм «Омега Дент», «Радуга-Р», «ВладМива»

Предложены и обоснованы современные физико-химические методы определения подлинности и качества исследуемой продукции (цемент на основе оксида цинка с эвгенолом, «Гутасиллер», «Кариосан», «Антисептический раствор», «Эвгенол стоматологический») методом спектрофотометрии в УФ-области, экспресс-методом хроматографии в тонком слое сорбента

Методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием установлен примесный состав анализируемых объектов ацетилэвгенол, Р-кариофиллен, Р-кариофиллена оксид, ванилин В случае синтетического источника получения изоэвгенол, З-метокси-6-аллилфенол, бензойная кислота, толуол, что положено в основу раздела «Примеси»

Разработана методика количественного определения эвгенола в жидких стоматологических материалах, а также в пломбировочном материале, в основе которого лежит метод равновесной парогазовой фазы с применением капиллярной газовой хроматографии и масс-спектрального детектирования

Впервые разработаны рекомендации к разделам «Подлинность» и «Содержание индивидуальных компонентов» в ТУ на «Эвгенол стоматологический»

Практическая значимость результатов исследования.

Результаты диссертационного исследования важны в оценке качества стоматологических материалов на основе эвгенола, с целью сокращения количества побочных реакций, возникающих вследствие стоматологического лечения, оказанного с применением лекарственных средств, содержащих эвгенол

Определены физико-химические показатели качества «Эвгенола стоматологического» фирмы («Омега Дент», «ВладМива», «Радуга-Р») Разработаны и предложены новые методики идентификации и количественного определения эвгенола в комплексных стоматологических средствах и пломбировочных материалах, которые легли в основу НД на «Эвгенол стоматологический»

Проведенное исследование показало необходимость изменения существующего подхода к оценке качества эвгенолсодержащих стоматологических материалов, основанное лишь на оценке технических характеристик предложено дополнить нормы определения качества современными физико-химическими методами спектрофотометрией в УФ-области, хроматографией в тонком слое сорбента, ГХ-МС (с применением равновесной паровой фазы)

Внедрение результатов исследования в практику.

Разработаны проекты ТУ «Эвгенол стоматологический», «Цементы стоматологические на основе оксида цинка и эвгенола»

Проведено внедрение разработанных методик идентификации, разделения, определения чистоты в контрольно — аналитическую лабораторию Главного Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники республики Узбекистан, о чем имеется акт внедрения №29/3254 от 15 октября 2007 года.

Фрагменты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс стоматологического факультета ММА им И М Сеченова и медицинского факультета стоматологического отделения Российского университета дружбы народов

Положения, выдвигаемые на защиту

1 Данные по определению показателей подлинности и качества стоматологических материалов, содержащих эвгенол

2 Выбор оптимальных параметров для разделения эвгенола и его примесей в тонком слое сорбента (экспресс-методика)

3 Определение подлинности исследуемых материалов методом спектрофотометрии в УФ-области спектра.

4 Методика количественного определения эвгенола в жидких стоматологических материалах его содержащих

5 Методика обнаружения и количественного определения эвгенола в пломбировочных материалах

6 Результаты исследования по теоретическому и экспериментальному обоснованию необходимости внедрения современных физико-химических методов в НД на эв-генолсодержащие стоматологические материалы

Апробация работы и публикация.

Основные результаты исследования доложены на

- X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005г),

- IV Научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создание функциональных продуктов» (Москва, 2007),

- Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007)

- Научно-практической конференции, посвященной 65-летию судебно - медицинской экспертизы Вооруженных Сил Российской Федерации (Москва, 2008)

- К вопросу стандартизации эвгенолсодержащих материалов в стоматологической практике // Журнал Естественные и технические науки - 2008 - №2 - С 176-178(соавт Саломатин Е М , Симонов Е А )

- Метод исследования эвгенола // Журнал Судебно-медицинская экспертиза -2008 — №5

- О разработке методик определения подлинности и качества эвгенолсодержащих стоматологических материалов // Вестник Московского Государственного Университета - Т 49 - №10 - 2008 (Нестерова О В , Кузьменко А Н , Попков В А)

Публикации по результатам исследования

Опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи, 1 тезисы

Объем и структура диссертации диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 94 рисунка, 58 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, общих выводов, библиографического указателя, включающего 187 источников и Приложений

Содержание работы.

Стандартизация лекарственных препаратов - одна из важнейших задач современной фармации К сожалению, препараты стоматологического назначения в отличие от иных лекарственных средств не включены в мировые фармакопеи Для них отсутствует НД в форме временных фармакопейных статей (ВФС) или фармакопейных статей предприятий (ФСП) Для некоторых стоматологических материалов известны технические условия (ТУ), ГОСТы, нормирующие их физико-технические свойства (показатели истираемости, сопротивление к разрушению) Но показатели, характеризующие качественный состав и количественное содержание компонентов, заявленные производителями, не контролируются в связи с отсутствием соответствующих нормативных требований

Учитывая сложившиеся тенденции расширения ассортимента лекарственных средств, содержащих эфирные масла и их основные компоненты (терпены и ароматические соединения), необходимо приведение НД на эти и иные стоматологические материалы в соответствие с современными требованиями к лекарственным средствам

Материалы н методы исследования

Объектами исследования служили препарат «Эвгенол стоматологический» трех фирм — производителей («Омега Дент», «ВладМива», «Радуга-Р»), отвечающий требованиям ТУ (9336 - 058 - 45814830 - 01) и ГОСТ Р 51094 - 97 (ISO 3107 - 88) «Материалы стоматологические цементные на основе оксида цинка с эвгенолом и без эвгенола», «Цемент на основе оксида цинка с эвгенолом, не содержащий формальдегид («Омега Дент»), «Кариосан» - цемент в виде порошка и жидкости («Spofa Dental» - Чехия), «Сеалит Ультра» (Франция), «Гу-тасиллер» - фирмы «Омега Дент», «Антисептический раствор» - фирмы «Омега Дент» В качестве стандарта использовался эвгенол фирмы «Merck» (99%) (Таблица 1)

Таблица 1 Стандарт, использованный при анализе

Наименование Формула Фирма-производитель

Эвгенол, 4 аллил-2-метоксифенол (аллил гваякол) он ¡^¡г- ОСН5 V СН2-СН =СН2 «Merck» (Germany) (99%) Тзам = -12°С - (-0°С), Т™ = 254°С, d = 1 066 г/мл, Мг=164 2, п20=1 541, Merck Index 13 3931

Физико-химические показатели качества «Эвгенола стоматологического» трех фирм производителей определяли по методикам Европейской Фармакопеи 2007 (EPh 6th edition 2007), ТУ (9336 - 058 - 45814830 - 01) и ГОСТ Р 51094 - 97 (ISO 3107 - 88) «Материалы стоматологические цементные на основе оксида цинка с эвгенолом и без эвгенола» Определение цвета, запаха и прозрачности по ГОСТ Р 5472 - 50 Определение показателей преломления ( и качественные реакции по ТУ (9336 - 058 - 45814830 - 01)

Определение подлинности и присутствие родственных примесей проводили методом хроматографии в тонком слое сорбента (EPh 6th edition 2007) на пластинках фирмы «Merck» 10*10 Silicagel 60 F254, система растворителей бензол - хлороформ (9 1), - методом спек-трофотометрии в УФ-области на спектрофотометре фирмы «Agilent» 8453 В спиртовом растворе стандарта эвгенола наблюдали два максимума поглощения при /П1,ах = 232±2 НМ И А-тах — 282±2 нм

Идентификация компонентов и количественное определение.

Исследования проводили на хромато-масс-спектрометре «6890-5973N» фирмы «Agilent Technologies» (США), работавшем в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ и оборудованном капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0 25 мм Газ-носитель - гелий Температура инжектора и интерфейса составляли 280°С Температура колонки программировалась от 90°С до 310°С со скоростью 35°С /мин Ввод образца объемом 1 мкл осуществляли методом с делением потока газа-носителя 1 20, предварительно растворив образец в системе растворителей хлороформ-этанол (1 1) Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 31 до 550 m/z После проведения хромато-графирования масс-спектры, соответствующие вершинам хроматографических пиков, сравнивали с масс-спектрами библиотек «PMW_TOX3», «NIST05» и «Wiley7N» (Рис 1) Идентификацию выявленных компонентов проводили в режиме регистрации по полному ионному току

100'

164

103

131

149

121

37

40 60 80 100 120 140 160 180 (mainlib) Eugenol m/z

Рис 1 Масс - спектр эвгенола из библиотеки стандартов «NIST05»

Количественную оценку эвгенола в жидких стоматологических препаратах и пломбировочных материалах производили методом равновесной паровой фазы с применением капиллярной газовой хроматографии и масс-спектрального детектирования Исследование проводили на приборе фирмы «Agilent Technologies» модель «6890-5973N» (США) с анализатором паровой фазы «Gerstel MPS 2» (Германия), оборудованном капиллярной колонкой HP FF АР Ввод парогазовой фазы образцов объемом 25 мкл осуществляли методом с делением потока газа-носителя (1 10)

Масс-спектрометр работал в режиме снятия масс-спектров в диапазоне от 20 до 280 дальтон, в режиме СИМ (селективный ионный мониторинг) по характеристическим ионам эвгенола, чтобы повысить чувствительность определения Для целей этой работы были выбраны характеристические ионы 164 1, 137 1 и 91 1 дальтон

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программного продукта ChemStat 10 0 и табличного процессора Excel пакета Microsoft Office 2007

Результаты исследования и их обсуждение.

Определение показателей качества «Эвгенола стоматологического».

На первом этапе проводили исследования в соответствии с разделом «Описание» Все образцы эвгенола стоматологического представляли собой бледно-желтоватые прозрачные жидкости с сильным запахом гвоздики (ГОСТ 5472 - 50)

Растворимость в различных растворителях (EPh 6th edition 2007) все исследуемые образцы «легко растворимы» в этаноле, эфире и хлороформе

Качественные реакции на эвгенол.

Метод Ml Реакция на фенольный гидроксил Несколько капель эвгенола растворяют в 2 мл этилового спирта, прибавляют 1 каплю раствора хлорида железа (III) и серную кислоту Появляется сине — зеленоватая окраска, меняющаяся на желтовато-зеленоватую, в течение 10 минут.

Метод Л°2 Реакция на непредельную двойную связь Эвгенол, имея в пара-положении аллильный радикал, может бромироваться Раствор брома в воде имеет бурую окраску Продукты присоединения - бесцветны, что возможно использовать, как простой визуальный тест на непредельную двойную связь

Метод МЗ Реакция образования поликонденсатов К 2 мл концентрированной серной кислоты (H2SO4) прибавляют 1 каплю эвгенола Появляется красное окрашивание, свидетельствующее об образовании поликонденсатов, которые с течением времени застывают

Определение примесей.

К 2-3 мл эвгенола прибавляют 20-30 мл 3% водного раствора NaOH и нагревают на водяной бане при частом помешивании 5-10 минут (см Рис 2)

Получается совершенно прозрачный раствор Наличие осадка говорит о недостаточной очистке эвгенола при его получении или о наличии посторонних примесей

СН2-СН=СН2 CH2- сн = СН2

Рис 2 Реакция определения примесей в растворе эвгенола

Таблица 2 Показатели подлинности препарата «Эвгенол стоматологический»

Препарат Плотность (d), г/мл Показатель преломления <»£> ГОСТ 548290 Качественные реакции (FeCb, H2SO4) Определение примесей (N3011) Вывод

PCO эвгенола I 064 I 542±0 005 положительно отрицательно Соответствует нд

Эвгенол «Омега Дент» 1 064 1 542±0 005 положительно отрицательно Соответствует НД

Эвгенол «Раду-га-Р» 1 060 1 540±0 005 положительно слабое помутнение раствора Не соответствует НД

Эвгенол «Влад- 1.061 1.542 слабое помут- Не соответст-

Мива» положительно нение раство- вует НД

ра

Установлено, что из всех исследуемых препаратов, лишь эвгенол стоматологический фирмы «Омега Дент», соответствует НД по вышеприведенным показателям (Таблица 2).

Определение посторонних примесей (чистота) осуществляли методом хроматографии в тонком слое сорбента в системе растворителей бензол-хлороформ (9:1). В качестве реагентов для обнаружения зон эвгенола, кариофиллена, ацетилэвгенола были использованы: раствора анисового альдегида 5%, раствор ванилина в 70% серной кислоте и УФ-облучатель при длине волны 254±2 нм (EPh 6th edition 2007). По полученным хроматограммам рассчитаны величины Rf (Таблица 3).

Таблица 3. Величина Rf для эвгенола и примесей по данным ТСХ.

Препарат Вещество Rf±A X Проявитель Анисовый альдегид/цвет пятна Проявитель - раствор ванилина в 70% серной кислоте/цвет

Эвгенол ГСО Эвгенол 0.56±0.10 фиолетово-коричневый малиновый

Эвгенол «Омега Дент» Эвгенол 0.56±0.13 фиолетово-коричневый малиновый

Эвгенол «ВладМива» Эвгенол Кариофиллен 0.57±0.13 0.92±0.10 фиолетово-коричневый красный малиновый темно-фиолетовый

Эвгенол «Радуга-Р» Эвгенол Ацетилэвгенол 0.57±0.10 0.30±0.12 фиолетово-коричневый голубовато-фиолетовый малиновый синевато - розовый

Хроматограммы некоторых исследуемых стоматологических материалов представлены на рисунках ниже (Рис. 3 и Рис. 4).

ФР

llfp«-' . . т~-ж

а

а) б) в)

Рис. 3. Хроматограммы «Эвгенола стоматологического» различных фирм-производителей: а) «Омега Дент», б) «ВладМива», в) «Радуга-Р»; ФР - фронт растворителя.

Из литературных источников известно, что эвгенолу часто сопутствует изоэвгенол -родственная примесь, отличающаяся от эвгенола положением двойной связи в аллильном радикале и более заметным раздражающим действием. Однако, в системе толуол-этанол (9:1), предложенной А.Ф. Фартушным (Фартушный А.Ф.. 1992), эффективность разделения меньше, чем в системе гексан-этилацетат (17:3).

ФР

Рис. 4. Определение родственной примеси (изоэвгенола) методом хроматографии в тонком слое сорбента в системе гексан-этилацетат (17:3); ФР - фронт растворителя.

Результаты, полученные при использовании метода в предложенной нами системе растворителей, отражены в таблице ниже (Таблица 4).

Таблица 4. Величина Кг для эвгенола и изоэвгенола по данным ТСХ._

Система растворителей гсксан-этилацстат (17:3)

Препарат Вещество 1М: ДХ

Эвгенол ГСО Эвгенол 0.65±0.03

«Антисептический раствор» Эвгенол Изоэвгенол 0.65±0.04 0.28±0.04

Система растворителей толуол-этанол (9:1)

Препарат Вещество кг±дх

Эвгенол ГСО Эвгенол 0.22±0.05

«Антисептический раствор» Эвгенол Изоэвгенол. 0.22±0.05 0.19±0.03

Заключение по разделу.

Представленные данные хроматографирования в тонком слое сорбента свидетельствуют о том, что все исследуемые препараты содержат различные примеси, определенные по показателю и цветности пятен различными проявителями (анисовый альдегид - ацетилэвгенол: голубовато-фиолетовый; кариофиллен: красно-фиолетовый; ванилин в 70% серной кислоте -ацетилэвгенол: голубовато-розовый; кариофиллен: темно-фиолетовый).

Установлено, что наиболее приемлемой для определения изоэвгенола является система гексан-этилацетат (17:3). Примесь изоэвгенола была обнаружена в препарате «Антисептический раствор» фирмы «Омега Дент».

Определение подлинности эвгенола методом спектрофотометрии в УФ-области

Для определения подлинности препаратов «Эвгенол стоматологический» трех фирм производителей был выбран диапазон длин волн от 200 до 320 нм (Anthony С Moffat, 2006) Исследуемые образцы брали в количестве 2 мкл и добавляли до метки этанола (колба на 10 мл), затем отбирали аликвоту в количестве 4 5 мл помещали в кюветное отделение, предварительно сняв УФ-спектр спирта (95°) в качестве фона и относительно него проводили все измерения Абсорбция спиртового раствора эвгенола-стандарта имеет 2 максимума поглощения: Хтах = 232±2 нм, А = 0 96 и Хтах = 282±2 нм, А = 0 47 Отношение величин поглощения при двух максимумах 2 04-2 08

УФ-спектры «Эвгенола стоматологического» различных фирм-производителей представлены на рисунке (Рис 5) Данные о воспроизводимости методики определения эвгенола в исследуемых материалах методом УФ-спектрофотометрии представлены в таблице (Таблица

5)

УФ спектры «Эвгенола стоматологического» различных фирм-производителей

Wavelength (nm)

Рис 5 УФ-спектр эвгенола стоматологического различных фирм-производителей

Таблица 5 Воспроизводимость методики определения эвгенола в препарате «Эвгенол стоматологический» методом УФ-спектрофотометрии____

Фирма-производитель N хср±дхср, мг/100 мл S Бср V

«Омега Дент» 10 116 12±1 25 1 68 1 07% 2 75

«ВладМива» 10 121 5±1 75 1 75 1 44% 2 75

«Радуга-Р» 10 111 4±1 50 2 02 1 35% 2 75

Заключение по разделу.

Спектральные характеристики (наличие двух максимумов при — 282^2 нм А;гах — 232±2 нм) лишь «Эвгенола стоматологического» «Омега Дент», полностью совпали со спектром «стандартного образца»

Статистическая обработка результатов качественного анализа методом УФ-спектрофотометрии позволяет говорить о том, что метод не отягощен систематическими

ошибками, относительная ошибка среднего результата составляет ±1 50, ±1 75, ±1 25 для «Эвгенола стоматологического» фирмы «Радуга-Р», «ВладМива» и «Омега Дент», соответственно Согласно полученным данным (Таблица 5), методика обладает удовлетворительной точностью и хорошей воспроизводимостью Методика включена в разработанный нами проект нормативной документации на «Материалы стоматологические на основе эвгенола»

Качественное и количественное определение компонентов входящих в состав исследуемых стоматологических материалов методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием.

Тенденции увеличения поступления на рынок лекарственных препаратов на основе ЛРС способствуют развитию современных физико-химических методов анализа, к которым относится метод газовой хроматографии с масс-селективным детектированием, использованный в нашем исследовании

Перед введением образцов исследуемых материалов брали 1 мкл раствора анализируемого вещества, добавляли в него растворителя 0 5 мкл (С2Н5ОН+СНСЬз (1 1)) и термостати-ровали в течение 20 минут при температуре 60°С

Абсолютное время удерживания (И, а5сод) стандартного раствора эвгенола показано на рисунке 11 и 12 (при температуре 80°С) и составляет 5 791±0 150 минут (5 791-5 839)

ОТКЛИК (в, мВ)

2е*07

Т1С ЕУС_РиН_2 ПааЛт»

1200 И00 1600

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ мин)

а)

Т1С ЕУв_Р1ЖЕ

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ (И, МИН)

б)

Рис 6 Хроматограммы «Эвгенола стоматологического» с указанием основных примесей а) «Омега Дент», б) «ВладМива»

Все примеси, обнаруженные в ходе исследования, можно разделить на 2 основные группы природного происхождения (компоненты эфирного масла гвоздики) и синтетического (получаемые, как промежуточные звенья промышленного синтеза эвгенола)

Количественное содержание эвгенола и его примесей, заявленное в спецификациях фирм-производителей, отличается от полученных данных (Таблица 6)

Таблица б Количественное содержание эвгенола в препарате «Эвгенол стоматологический»

Фирма-производитель Содержание эвгенола в % Содержание примесей в %*

ТУ Фактическое ТУ Фактическое

«Омега Дент» 99 6 90 48±0 82

«ВладМива» 99 6 71 59±1 12 22 08±1 03

«Радуга-Р» 99 6 64 38±0 64 31 64±0 79

* - примеси, составляющие не менее 1%

Т1С диКавИег

1200 14Х 1600

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ (Я«, Инн)

а)

ПС СЯУОЗАМ)

ОТКЛИК (3,мВ)

1 СО 2 00 3 00 4 00 5 00

6 00 7 00 8 00 9 00 10 00 11 00 12 00

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ^, миЦ

б)

Рис 7 Хроматограммы исследуемых стоматологических материалов с указанием основных примесей а) «Гутасиллер», б) «Кариосан»

Приведенные выше хроматограммы со временами удерживания летучих компонентов исследуемых препаратов, наглядно демонстрируют примесный состав (Рис 6 и Рис 7) Основные примеси, обнаруженные в исследуемых препаратах - это терпеноидные легколетучие соединения В-кариофиллен, ацетилэвгенол, кариофиллен оксид, ванилин, камфора, ментол, эвкалиптол, Р-карен, а и Р-пинены, копаен, цинеол, р-иланген, р-оцимен, кадинол, а-гумулен, - а также производные эвгенола изоэвгенол, 4-пропенилфенол и др

Статистическая обработка результатов, полученных методом ГХ-МС, осуществлялась с помощью программного продукта ChemStat 10 0 и табличного процессора Excel пакета Microsoft Office 2007, метрологические характеристики метода приведены в таблице ниже (Таблица 7)

Таблица 7 Характеристика разработанного метода определения эвгенола в препаратах вероятность )=95%, количество испытаний п=7, коэффициент Стьюдента 1(р,1)=2 57___

Препарат Xfc) S2 S 8ш АХ ДХ(СР) Д Д(СР)

Эвгенол «Омега Дент» 92 61 0 0512 0 2263 0 1003 0 762 04187 0 9428% 0 6296%

Эвгенол «ВладМива» 79 42 0 2537 0 5036 0 2056 12942 0 5284 1 322% 0 5397%

Эвгенол «Радуга-Р» 69 34 0 3744 06119 0 2498 0 6419 0 2620 0 7364% 0 3006%

«Гутасиллер» 85 62 0 5102 0 7143 0 3851 1 1551 0 7369 1,5237% 0 6187%

«Кариосан» 23 12 0 3296 0 5741 0 3412 0 4689 0 1938 0 6017% 0 2859%

«Сеалит регуляр» 10 97 0 0923 0 3038 0 1189 0 7291 0 3952 0 8941% 0 5126%

Цинк-оксид эвгеноло-вый цемент 27 84 0 2800 0 5291 0 1421 0 5861 01631 0 4741% 0 2376%

Из данных таблицы следует, что относительная ошибка определения незначительная Это позволяет говорить о надежности данного метода и возможности его использования для количественного определения эвгенола в стоматологических материалах

Обнаружение эвгенола в жидких стоматологических препаратах и пломбировочных материалах методом равновесной паровой фазы с применением капиллярной газовой хроматографии и масс-спектрального детектирования

Для проведения пробоподготовки на основе анализа свойств вещества, в частности высокого парциального давления над жидкостью, мы выбрали метод исследования равновесной паровой фазы с применением капиллярной газовой хроматографии и масс-спектрального детектирования

Жидкие пробы исследуемых материалов в количестве 1 мл помещали во флаконы, добавляли 1 г хлорида натрия, закрывали герметичной крышкой и термостатировали при 80°С в течение получаса Затем автоматическим путем отбирали аликвоту для исследования Температура шприца для ввода была установлена равной 80°С

Твердые образцы пломб размером до 100 мг (заранее приготовленные на разных концентрациях эвгенола и выдержанные в холодильнике) растирали в ступке пестиком, добавляли 1 мл дистиллированной воды, 1 г хлорида натрия Калибровку проводили по растворам индивидуальных веществ с точно известной концентрацией Для градуировочных растворов использовали стандарт эвгенола фирмы «Мегск» с известными параметрами Растворы готовили с таким расчетом, чтобы концентрация эвгенола в полученных растворах составляла от 5 мкг/мл до 100 мкг/мл (что соответствует максимальной концентрации эвгенола в пломбировочном материале)

Типичная хроматограмма эвгенола-стандарта представлена на рисунке ниже (Рис 8) (R, асбол = 14 83-14 98 mm)

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ (Rt мин}

Рис. 8. Типичная хроматограмма эвгенола-стандарта.

Ниже (Рис. 9) показаны некоторые, полученные в приведенных условиях, хроматограм-мы анализируемых материалов: «Антисептический раствор» («Омега Дент»), препарат «Сеа-лит Регуляр» («Pierre Rolland»), «Эвгенол стоматологический» («Омега Дент»), цинк-оксидэвгеноловый цемент («Омега Дент»).

2000000 1500000

12 00 14.00

22 00 24 00

2000000 1500ООО

TIC PUR_£UGE.D

6.00 8.00 10 00 12 00

2000 22 00 24.С

1500000 1000000 500000

20.00 2200 24.С

TIC ZNO.EIIGE.

D j~ эвгенол [

a,В - пинены

2000 22 00

Рис. 9. Хроматограммы исследуемых материалов.

Установлено, что в «Антисептическом растворе» фирмы «Омега Дент» вместо заявленного эвгенола и тимола, присутствовал только тимол (Я, а6сол = 14 72 тш) Все остальные исследуемые препараты содержали эвгенол

Метрологические характеристики разработанного метода проверяют, определяя следующие показатели

Предел детектирования

Определяли с помощью анализа серии образцов, заведомо не содержащих его и, в которые он был добавлен (Таблица 8)

Таблица 8 Результаты определения эвгенола по полному ионному току

Образец, Концентрация эвгенола в пробе, мкг/мл

№ 0.5 1.0* 50 10.0 20.0

1 + + + + +

2 + + + + +

3 - + + + +

4 + + + + +

5 + + + + +

6 + + + + +

7 + + + + +

8 + + + + +

9 + + + + +

10 - + + + +

* соединение при данной концентрации надежно определяется с соотношением сигнал/шум

более 3 1

Предел детектирования при исследовании по полному ионному току составил 1 О мкг/мл раствора

Устойчивость метода

Оценка устойчивости метода проводилась по следующим этапам процедуры

- Влияние температуры термостатирования для выделения эвгенола при 60°С, 80°С и 90°С

- Влияние времени термостатирования образца на величину предела детектирования метода.

- Влияние температуры шприца.

Исследования показали, что методика обладает хорошей устойчивостью

Селективность/специфичность метода.

Оценивали как стабильность измерений в присутствии мешающих веществ в матрице пробы Выяснилось, что анализируемые пломбировочные материалы (в порошке) содержат значительное количество различных терпенов, мешающих определению эвгенола (близкие по значению времена удерживания, в частности, тимол)

Для решения данной проблемы использовали метод автоматической деконволюции, реализованный в программном продукте «АМОК», входящей в комплект поставки использованного масс-спектрального оборудования На рисунке ниже показаны результаты работы этой программы (Рис 10)

Рис. 10. Использование программного продукта «АМ015» для разделения спектров тимола и эвгенола.

В результате использования данной программы были разделены тимол и эвгенол, что позволило беспрепятственно оценить последний количественно.

С целью количественного определения эвгенола в пломбировочном материале методом ГХ-МС с применением равновесной паровой фазы, строили калибровочный график зависимости концентрации приготовленных стандартных растворов от площади пиков.

Статистическая характеристика количественного определения эвгенола представлена в таблице (Таблица 9).

Таблица 9. Статистическая характеристика количественного определения эвгенола.

Ожидаемая концентрация, мкг/мл Х(ср> Среднее значение, мкг/мл ДХ(СР) Стандартное отклонение, мкг/мл Коэффициент вариации (%) "(ср) Неопределенность (%)

1.0 (п=15, р=3) 0.75 ±0.27 5.0 0.4

5.0 (п=15, р=3) 3.95 ±0.38 3.5 1.1

20.0 (п=15, р=3) 18.81 ± 1.70 6.7 4.3

р - число аликвот

п - количество анализов

Статистическая обработка результатов позволяет говорить о том, что метод не отягощен систематическими ошибками, относительная ошибка среднего результата составляет ±0.27, ±0.38, ±1.70.

Согласно полученным данным методика обладает удовлетворительной точностью и хорошей воспроизводимостью.

Разработка методик контроля качества и стандартизации эвгенола стоматологического (в проект ТУ).

По разработанным методикам определения подлинности, качественного и количественного анализа были установлены нормы качества на стоматологические материалы на основе эвгенола Это, в первую очередь, монопрепарат «Эвгенол стоматологический» и комплексные препараты, в которых эвгенол представлен в виде жидкости Регламентировать качество препаратов на основе эвгенола, было предложено по комплексу показателей (Таблица 10)

Таблица 10 Нормы качества эвгенола стоматологического и препаратов, его содержащих

Показатели Характеристики и нормы

Описание Бесцветная или бледно-желтая прозрачная жидкость, темнеющая на воздухе с сильным запахом гвоздики

- Подлинность - Качественные реакции - ТСХ (УФ-детектор, проявитель - ванилин, анисовый альдегид) - УФ - спектрофотомет-рия - С железа III хлоридом, появляется сине-зеленое окрашивание, - С конц серной кислотой, появляется красное окрашивание, - С Вгг обесцвечивание раствора бромной воды

На хроматограмме должно быть три пятна одно пятно на уровне пятна стандартного образца эвгенола, одно пятно ниже уровня эвгенола - ацетилэвгенол, одно пятно выше уровня эвгенола - карио-филлен Система растворителей бензол-хлороформ (9 1)

Спиртовой раствор эвгенола имеет два максимума поглощения в УФ-области спектра - Х™х = 232+2 нм, А = 0 96 - Хтах = 282+2 нм, А = 0 47 А|/Аг = 2 04

- Чистота - Прозрачность раствора - Родственные примеси - Допустимые примеси - Недопустимые примеси С 3% водным раствором №ОН, с последующим нагреванием на водной бане (5-7 минут) Должен получиться прозрачный раствор,

- Метод ТСХ, используя силикагель ОР254 в качестве неподвижной фазы Система растворителей гексан-этилацетат (17 3), Ял = 0 28 изоэвгенол Яд = 0 65 эвгенол - Метод ГХ - МС ванилин, ацетилэвгенол, кариофиллен, карио-филлен-оксид - Метод ГХ - МС толуол, изоэвгенол

Количественное определение Метод ГХ-МС Для пломбировочного материала метод ГХ - МС с применением равновесной паровой фазой Количество эвгенола чистого не менее 99%

Срок годности 3 года

Разработанные нами методики, основанные на комплексных физико-химических исследованиях, анализ полученных результатов и данных научной литературы о свойствах эвгенола стоматологического позволили выявить необходимость пересмотра существующего подхода к оценке качества стоматологической продукции на его основе А также послужили основанием для рекомендаций по включению в стандарт качества химических и физико-химических методов, которые используются для оценки подлинности, установления примесного состава и количественного определения в составе стоматологических препаратов и материалов

выводы

1 Проведена оценка качества эвгенолсодержащих стоматологических материалов по показателям, нормируемым в фармацевтических препаратах, содержащих эвгенол (растворимость в различных растворителях, определение показателя преломления, плотность, качественные реакции на функциональные группы) Впервые рекомендовано использование физико-химических методов (УФ-спектрофотометрия и хроматография в тонком слое сорбента) для определения подлинности жидких субстанций стоматологических материалов

2 Разработана экспресс-методика определения эвгенола и его примесей (кариофилен, ацетилэвгенол, изоэвгенол) методом хроматографии в тонком слое сорбента в системе растворителей бензол-хлороформ (9 1) для кариофилена и ацетилэвгенола, гексан-этилацетат (17 3) для изоэвгенола В качестве проявителей использовались раствор ванилина в 70% серной кислоте и 5% раствор анисового альдегида

3 Определен качественный состав исследуемых материалов методом ГХ-МС В результате данного скринингового анализа установлено, что все исследуемые препараты содержат примеси, как «природного», так и «синтетического» происхождения (¡3-кариофиллен, камфора, ванилин, ацетилэвгенол, аир- пинены, изоэвгенол, 4-пропенил-1 -фенол, бензойная кислотаза) за исключением препарата «Гутасиллер», содержащего в качестве примесей камфору и а и Р-кариофиллен

4 Разработан метод идентификации эвгенола в жидких стоматологических и пломбировочных материалах (равновесной парогазовой фазы с применением ГХ-МС), предел обнаружения которого составляет 1 мкг/мл для жидких образцов и 25 мкг/г для твердых образцов (R, аСсол = 14 83-14 93 минут) Метод обладает хорошей устойчивостью (к меняющимся условиям хроматографирования), а также селективностью и специфичностью Метрологические характеристики метода позволяют применять его для определения эвгенола в пломбах, имевших длительный контакт с биосредами организма

5 Разработана методика количественного определения эвгенола в жидких моно- и комплексных препаратах методом ГХ-МС с применением равновесной парогазовой фазы Установлено, что препараты значительно различаются по количественному содержанию эвгенола и примесей («Эвгенол стоматологический» фирмы «Омега Дент» 90 48%, «ВладМива» 71 59%, «Радуга-Р» 64 38%, при заявленных 99 6% эвгенола) Это говорит о недостаточной степени очистки стоматологических материалов и связано с отсутствием методик определения эвгенола в жидких субстанциях стоматологических материалов на его основе

6 Сформулированы требования в ТУ на «Эвгенол стоматологический» и жидкие стоматологические материалы его содержащие Предложено и обосновано использование физико-химических методов анализа для определения качества исследуемой продукции Внедрение разработанных норм существенно повысит качество поступающей на рынок эвгенолсодержащей продукции, а значит усилит эффективность оказания услуг стоматологической помощи с применением данных материалов

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Шабалина А Э , Нестерова О В Изучение некоторых показателей качества эвгенола стоматологического//Человек и лекарство Тез Докл Российск Нац Конгресса 16-20апр 2005 -М 2005 -С 128

2 Шабалина А Э , Нестерова О В Анализ состояния и перспективы развития методов стандартизации лекарственных эвгенолсодержащих средств и материалов, используемых в стоматологии // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты Сбор Науч Трудов -М,2007 — Т4 -вып 15 -С 107-119

3 Шабалина А Э , Симонов Е А , Киричек А В Метод исследования эвгенола // Су-дебно - медицинская экспертиза - М 2008

4 Шабалина А Э О необходимости совершенствования НД на эвгенолсодержащие стоматологические материалы и лечебно - профилактические средства стоматологического назначения // Современные проблемы медико-криминалистических, судеб-но-химических и химико-токсикологических экспертных исследований Всерос Науч -прак Конф - М 2007, - С 293-296

5 Шабалина А Э , Саломатин Е М , Киричек А В , Симонов Е А Метод количественного определения эвгенола в стоматологических материалах // Проблемы судебно-медицинской экспертизы в условиях реформирования Вооруженных сил и Федеральной прокуратуры Российской Федерации Мат-лы Науч -пракгич Конф - М 2008, - С 269-270

6 Шабалина А Э , Попков В А , Симонов Е А , Саломатин Е М К вопросу стандартизации эвгенолсодержащих материалов в стоматологической практике // Естественные и технические науки Журн -М 2008, - Вып 1,-ISSN 1684-2626,-С 176-178

7 Шабалина А Э, Нестерова О В , Кузьменко А Н, Попков BAO разработке методик определения подлинности и доброкачественности эвгенолсодержащих стоматологических материалов//Вестник МГУ -Т49 -№10 - М 2008

Шабалина Ангелина Эдуардовна (Россия) Разработка и совершенствование методов стандартизации стоматологических средств и материалов, содержащих эвгенол

В настоящей работе проведены исследования по оценке качества жидких стоматологических материалов методом ТСХ и УФ-спеетрофотометрии

Методами ГХ-МС и ТСХ (с использованием различных проявителей) выявлены и разделены на 2 группы основные примеси природного происхождения (Р-кариофиллен, ацетилэв-генол, камфора) и синтетического происхождения (изоэвгенол)

Разработан метод обнаружения и количественного определения эвгенола в жидких стоматологических и пломбировочных материалах методом равновесной паровой фазы с применением ГХ-МС Доказано, что статистическая характеристика метода позволяет применять его для обнаружения эвгенола в пломбах, имеющих длительный контакт с биосредами организма

Разработаны ТУ на «Эвгенол стоматологический» с применением физико-химических методов анализа.

Angelina Е Shabalma (Russia) Development and elaboration of methods of standardization medicinal eugenol-containing means and the materials using in stomatology

In the present work are carried out researches according to quality liquid stomatologic materials by TLC method and UV-spectrophotometery

The basic admixtures have been found out by GC-MS and TLC methods (different revealing reagents has been used) and have been divided into 2 groups admixtures of natural origin (p- ca-ryophyllen, acetyleugenol, camphor) and admixtures of synthetic origin (isoeugenol)

The method of detection and quantitative definition of eugenol in liquid stomatologic materials by equilibrium vapour-phase method with GC-MS analysis has been developed

It is proved, that the statistical characteristic of a method allows applying it to detect eugenol in the sealants having long contact to bioenvironments of an organism

Specifications on «Eugenol stomatologic» with application of physical and chemical methods of the analysis have been developed

Стандартизация лекарственных препаратов - важнейшая экономическая задача фармации в совершенствовании современного производства, необходимая для обеспечения населения высокоэффективными и высококачественными препаратами. Это требование является одной из основных задач фармацевтической науки. Однако поступлению надлежащих продуктов на мировой рынок должны сопутствовать ряд мероприятий, позволяющих гарантировать их качество. Совершенно очевидно, что эффективность лечения теснейшим образом связана с качеством используемых материалов, требования к которым заложены в нормативной документации с учетом последних достижений науки [51, 53, 74].

Все увеличивающееся число доступных на фармацевтическом и стоматологическом рынке лекарственных средств, тенденция роста фальсифицированной продукции требуют внедрения новых фармакопейных методов анализа и контроля качества готовых лекарственных форм, что обеспечивает их безопасность и эффективность. В последнее время особый интерес для фармацевтов во всем мире представляет разработка новых современных физико-химических и физических методов, а также измерительных приборов для контроля качества лекарственных средств.

Участились случаи обращения населения в Министерство Здравоохранения и социального развития РФ по вопросу оказания некачественной стоматологической помощи. Это связано далеко не только с наличием малоквалифицированного персонала, а еще и с естественным развитием рынка стоматологических материалов, который сопровождается ростом контрафактной и низкокачественной продукции, контроль за которой осуществляется по стандартам стоматологической отрасли [107].

Особое место в этой проблеме занимают эвгенолсодержащие стоматологические материалы, которые составляют более трети стоматологической продукции, имеющей в своем составе компоненты эфирных масел. Широта применения эвгенола, получаемого из различных частей гвоздичного дерева и базилика эвгенолового, обусловлена спектром его фармакологического действия: антибактериальное, антисептическое, противовоспалительное и ра-нозаживляющее, местнообезболивающее, отвлекающее, спазмолитическое; при этом обладая меньшей токсичностью, отсутствием привыкания, хорошей переносимостью по сравнению с синтетическими аналогами (хлоргекседин, триклозан и др.). Эвгенол в пломбировочных материалах выполняет роль связующего, девитализирующего и противовоспалительного звена [95, 107].

Анализ нормативной и патентной документации показал, что определение подлинности и доброкачественности материалов, основанное на идентификации индивидуальных компонентов, заявленного состава с последующей их количественной оценкой требованиям НД на стоматологические материалы не предусмотрено, а основными критериями определения подлинности стоматологических материалов являются лишь рабочие технические характеристики (время деформации, относительное удлинение, адгезивные свойства (прилипание к дентину), совместимость с гипсом, твердость на излом, время отверждения, коэффициент усадки, и т.д.). Определение этих свойств, безусловно, важны, но недостаточны для полноты определения качества стоматологической продукции.

Эвгенол один из наиболее эффективных антисептиков, используемых в стоматологии, как монопрепарат для антисептической обработки корневых каналов, а также в качестве комплексных препаратов для временного и постоянного пломбирования. Наличие посторонних примесей будет ухудшать процесс схватываемости цемента, уменьшая бактерицидный эффект препаратов, а также снижать прочностные характеристики образовавшегося цемента, более того, часть примесей может оказывать и токсическое действие на организм (LD5CbBr~2680 мг/кг) [52, 54, 130].

Создание современных методов стандартизации, позволяющих контролировать подлинность и качество материалов на основе эвгенола, а также определять источник его получения и примесный состав, является, безусловно, актуальным вопросом для фармацевтической науки.

Заметим, что современная химическая литература пестрит сообщениями об успешном использовании методов хромато-масс-спектрометрии, применении баз данных и систем компьютерной идентификации для решения самых разнообразных научных и прикладных задач. Многолетний опыт работы различных химико-токсикологических лабораторий, в которых эксплуатируются системы компьютерной идентификации веществ, подтверждает важную роль информационных технологий (в сочетании с современной приборной базой спектрального анализа) в повышении эффективности качественного и количественного анализа [130].

Все вышесказанное предопределило выбор актуальной темы разработки и совершенствования методов стандартизации стоматологических средств и материалов, содержащих эвгенол, позволяющих контролировать подлинность и качество материалов на основе эвгенола, а также определять источник его получения и примесный состав. Практическая значимость работы также связана с разработкой метода обнаружения и количественного определения эвгенола в различных стоматологических средствах, пломбировочных материалах и препаратах, поскольку, в доступной нам литературе имеются данные, лишь по анализу эвгенола и его аналогов в биологических жидкостях человека [147, 154], что связано с имеющимися в судебно-медицинской практике случаями смертельного отравления эвгенолом и его изоме-ром-изоэвгенолом. В стоматологической практике известны также случаи попадания пломбировочного материала в пазухи носа, что сопровождается воспалительными процессами, обусловленными ростом различного рода грибов и вызывает одентогенный синусит. Также часто воспалительный процесс может достигать и лобных долей, с развитием фронтитов. Причем, как показывает практика, различные пломбировочные материалы вызывают рост разной патогенной микрофлоры, поэтому определение именно класса цемента, попадание которого в пазухи носа, сопровождается ростом определенного рода микроорганизмов, может существенно облегчить терапию пациента, с подбором соответствующих препаратов (чаще всего антибиотиков) [52].

Таким образом, разработка современных методов стандартизации позволяющих обнаружить, определить подлинность, качество и количественную оценку входящего в состав не только стоматологических средств эвгенола, а также в пломбировочные материалы является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилась разработка методики обнаружения, определения подлинности и количественной оценки эвгенола, входящего в состав лекарственных средств и материалов, применяемых в стоматологии, с последующей стандартизацией изучаемых объектов.

Задачи исследования.

- Определить показатели качества исследуемых эвгенолсодержащих материалов различных фирм-производителей, а также предложить показатели подлинности с учетом определения таковых в фармацевтической продукции.

- Разработать экспресс-методику определения эвгенола и примесей методом хроматографии в тонком слое сорбента (с использованием разных проявителей).

- Установить методом ГХ-МС примесный состав исследуемых препаратов с целью определения источника получения эвгенола (природный и/или синтетический).

- Разработать методику обнаружения и количественного определения эвгенола в стоматологических материалах (в том числе, пломбировочных) методом равновесной паровой фазы с применением газовой хроматографии и масс-спектрального детектирования.

- Предложить методику стандартизации и разработать НД на стоматологические средства и материалы на основе эвгенола.

Научная новизна.

- Проведена оценка качества стоматологических материалов «Эвгенола стоматологического» фирмы «Омега Дент», «Радуга-Р», «ВладМива», по критериям растворимость в различных растворителях, определение показателя преломления, плотность, качественные реакции на функциональные группы), регламентируемым НД на фармацевтические препараты.

- Предложены и обоснованы современные физико-химические методы определения подлинности и качества исследуемой продукции (цемента на основе оксида цинка с эвгенолом, «Гутасиллера», «Кариосана» и антисептического раствора), методом спектрофотометрии в УФ области и хроматографии в тонком слое сорбента.

- Разработаны методики определения чистоты «Эвгенола стоматологического» различного происхождения экспресс-методом хроматографии в тонком слое сорбента.

- Изучен примесный состав исследуемых материалов, исследования положены в основу идентификации источника получения эвгенола, а также в раздел ТУ «Примеси».

- Впервые разработаны рекомендации к разделам «Подлинность» и «Содержание индивидуальных компонентов» в ТУ на «Эвгенол стоматологический».

- Методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием в анализируемых объектах установлены основные примесные соединения: ацетилэвге-нол, p-кариофиллен, Р-кариофиллена оксид, ванилин, изоэвгенол, 3-метокси-б-аллилфенол, бензойная кислота, толуол, в случае синтетического источника получения.

- Разработаны методики количественного определения эвгенола в стоматологических материалах на основе эвгенола, а также в пломбировочном материале, в основе которого лежит современный физико-химический метод: метод равновесной паровой фазы с применением капиллярной газовой хроматографии и масс-спектрального детектирования.

Теоретическая и практическая значимость.

На основании результатов проведенных исследований нами подготовлены ТУ «Эвгенол стоматологический». Результаты диссертационного исследования необходимы в оценке качества стоматологических материалов, что повысит качество эвгенолсодержащей продукции, уменьшит поступление фальсификатов и сократит количество побочных реакций в результате стоматологического лечения, оказанного с применением лекарственных средств содержащих эвгенол.

Проведенное исследование показало необходимость изменения существующего подхода к оценке качества эвгенолсодержащих стоматологических материалов, основанное лишь на оценке технических характеристик: предложено дополнить нормы определения качества современными физико-химическими методами: спектрофотометрией в УФ-области, хроматографией в тонком слое сорбента, ГХ-МС (с применением равновесной паровой фазы).

Определены физико-химические показатели (плотность, показатель преломления) качества «Эвгенола стоматологического» фирмы («Омега Дент», «ВладМива», «Радуга-Р»), Разработаны новые методики идентификации и количественного определения эвгенола в комплексных стоматологических средствах и пломбировочных материалах, которые легли в основу проекта НД на «Эвгенол стоматологический».

Внедрение результатов исследования в практику.

Разработаны проекты ТУ: «Эвгенол стоматологический»; «Цементы стоматологические на основе оксида цинка и эвгенола».

Проведено внедрение разработанных методик идентификации, разделения, определения чистоты в контрольно-аналитическую лабораторию Главного Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники республики Узбекистан, о чем имеется акт внедрения №29/3254 от 15 октября 2007 года.

Фрагменты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс стоматологического факультета ММА им. И.М. Сеченова и медицинского факультета стоматологического отделения Российского университета дружбы народов.

Положения, выдвигаемые на защиту

- Данные по определению показателей подлинности и качества стоматологических материалов, содержащих эвгенол.

- Выбор оптимальных параметров для разделения эвгенола и его примесей в тонком слое сорбента (экспресс-методика).

- Определение подлинности методом спектрофотометрии в УФ области спектра.

- Методика количественного определения эвгенола в жидких стоматологических материалах его содержащих.

- Методика обнаружения и количественного определения эвгенола в пломбировочных материалах.

- Результаты исследования по теоретическому и экспериментальному обоснованию необходимости внедрения современных физико-химических методов в НД на эвгенолсодержащие стоматологические материалы.

Апробация работы.

Основные результаты исследования доложены на:

- X Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2007 г.);

- IV Научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создание функциональных продуктов» (Москва, 2007);

- Всероссийская научно-практическая конференция «Современные проблемы медико-криминалистических, судебно-химических и химико-токсикологических экспертных исследований» (Москва, 2007).

- Научно - практическая конференция, посвященная 65-летию судебно - медицинской экспертизы Вооруженных Сил Российской Федерации (Москва, 2008).

- К вопросу стандартизации эвгенолсодержащих материалов в стоматологической практике//Журнал Естественные и технические науки . — 2008. — №2. — С. 176178 (соавт.: Саломатин Е.М., Симонов Е.А.).

- Метод исследования эвгенола // Журнал Судебно-медицинская экспертиза. -2008,-№5.

- О разработке методик определения подлинности и качества эвгенолсодержащих стоматологических материалов // Вестник Московского Государстенного Университета. - Т.49. - №10. - 2008. (Нестерова О.В., Кузьменко А.Н., Попков В.А.).

Публикации по результатам исследования: опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи, 1 тезисы.

Объем и структура диссертации: диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, содержит 94 рисунка, 59 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, общих выводов, библиографического указателя включающего 187 источников и Приложений.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. Подводя итог проделанной работе, прежде всего, хотелось бы отметить, значительные пробелы в стандартизации в столь важной категории лекарственных препаратов, как «Стоматологические материалы», будь то антисептические средства различного назначения или пломбировочные материалы клинического назначения. Основываясь на такой стандартизации стоматологических материалов, большинство НД которых нормируют лишь физико-химические свойства, нами предложены методики для оп-редления подлинности и качества стоматологической эвгенолсодержащей продукции, базируемые на определении индивидуальных компонентов заявленного состава.

2. Проведенная оценка качества препарата «Эвгенол стоматологический» трех фирм-производителей, по показателям, нормируемым ТУ (9336-058-45814830-01), выявила, что лишь «Эвгенол стоматологический» фирмы «Омега Дент» соответствует требованиям ТУ по критериям подлинности (внешний вид, качественные реакции, определение примесей). В то же время, препарат «Эвгенол стоматологический» фирм «ВладМива» и «Радуга-Р» не соответствовали ТУ по вышеприведенным показателям.

3. Разработанный нами метод хроматографии в тонком слое сорбента, благодаря своей экспрессности, доступности и невысокой стоимости, необходимо использовать на этапе предварительной оценки содержания основных компоненов и примесей в эвгенолсодержащей стоматологической продукции. Применение данного метода в сочетании с различными проявителями (раствор анисового альдегида 5%, раствор ванилина в 70% серной кислоте) позволило выявить основные примеси, присутствующие в исследуемых материалах. Подобранная в ходе исследования оптимальная система растворителей бензол-хлороформ (9:1) позволила выявить такие примеси, как ацетилэвгенол и кариофиллен.

4. С помощью разработанной методики в предложенной системе растворителей гексан-этилацетат (17:3) в препарате «Антисептический раствор» фирмы «Омега Дент» была обнаружена токсичная примесь - изоэвгенол.

5. В результате скрининговых анализов методом ГХ-МС были определены примеси, как «природного», так и «синтетического» происхождения. К первым относятся тер-пиноиды, сопутствующие эвгенолу при получении его из эфирного масла, ко вторым относятся различные аллил-производные, получаемые, как сопутствующие компоненты при синтетическом способе получения эвгенола. Количественная оценка эвгенола в жидких моно- и комплексных препаратах осуществлялась методом ГХ-МС с применением равновесной парогазовой фазы. Предел обнаружения данным методом составил 1 мкг/мл для жидких стоматологических материалов и 25 мкг/г для твердых образцов (Rta6c. = 14.83-14.93). Метод обладает хорошей устойчивостью (к меняющимся условиям хроматографирования), а также селективностью и специфичностью. Метрологические характеристики метода позволяют применять его для определения эвгенола в пломбах, имевших длительный контакт с биосредами организма.

6. Установлено, что препараты значительно различаются по количественному содержанию эвгенола и примесей («Эвгенол стоматологический» фирмы «Омега Дент» 90.48%, «ВладМива» 71.59%, «Радуга-Р» 64.38%, при заявленных 99.6% эвгенола). Это говорит о недостаточной степени очистки стоматологических материалов и связано с отсутствием методик определения эвгенола в жидких субстанциях стоматологических материалов на его основе.

7. На основании подобранных оптимальных условий для ТСХ анализа, разработанных и обоснованных методик качественного и количественного анализа эвгенола, входящего в состав анализируемых препаратов, высокоспецифичным методом ГХ-МС с применением равновесной парогазовой фазы, обладающего удовлетворительной точностью и хорошей воспроизводимостью, предложен проект ТУ, позволяющий регламентировать качество эвгенола, входящего в состав стоматологических материалов по комплексу показателей.

8. На основании проведенных исследований обоснована необходимость комплексного подхода к стандартизации эвгенолсодержащей стоматологической продукции, что позволит уменьшить количество побочных явлений, а значит, повысить эффективность оказания стоматологической помощи с применением данных материалов.