Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Оценка качества и эффективности биологически активных добавок с коэнзимом Q10

На правах рукописи

003481769

КАЛЕНИКОВА Елена Игоревна

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА И ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК С КОЭНЗИМОМ (510

Специальности: 15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия 14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

2 9 О ИТ 2003

Москва - 2009 г.

003481769

Работа выполнена в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова.

Научные консультанты: академик РАМН, доктор фармацевтических наук, профессор_

Ведущая организация - ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ»

Защита состоится «24» декабря 2009г. в 15й ч на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова (119019, Москва, Никитский бульвар, д.13).

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке ММА им. И.М.Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49).

Автореферат разослан «_»_ 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук

Арзамасцев Александр Павлович

доктор медицинских наук, профессор Медведев Олег Стефанович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор фармацевтических наук

Белобородое Владимир Леонидович

Жердсв Владимир Павлович Чистяков Виктор Владимирович

профессор

Садчикова Наталья Петровна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность:

Согласно существующим международным требованиям, любое оригинальное и воспроизведенное лекарственное средство должно соответствовать следующим критериям: эффективность, безопасность, качество. Это в равной степени следует отнести и к биологически активным добавкам (БАД), требования к которым в современных условиях постоянно возрастают. Надлежащий уровень качества обеспечивается соответствующим нормативным документом, отражающим как общие подходы к контролю качества и стандартизации, так и показатели, которые определяются предполагаемым медицинским применением лекарственного средства или БАД.

Достижения молекулярной биологии и биохимии открывают новые возможности лечения заболеваний с учетом патофизиологических механизмов, протекающих на уровне клеточных и субклеточных структур. В основе ведущих метаболических процессов лежат окислительно-восстановительные реакции. Среди них особую роль играют свободнорадикальные реакции, приводящие к образованию перекисных соединений. Активация процессов свободнорадикального окисления вследствие дисбаланса в системе «прооксиданты-антиоксиданты» и последующие изменения в клетках, тканях и системах организма получили название окислительного стресса. Усиление деструктивных процессов при окислительном стрессе может являться патогенетическим фактором заболевания, даже не будучи основной причиной его развития.

Однако сегодня нет единого мнения о биологической роли окислительных реакций с участием свободных радикалов кислорода. Большинство исследователей считают активные формы кислорода важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом программ дифферснцировки, пролиферации и апоптоза клеток. Развитие патологических процессов связано с изменением клеточных программ, следовательно, развитие многих заболеваний определяется балансом прооксидантов и антиоксидантов. Отношение к последним в современной научной литературе варьирует от полного игнорирования и даже отрицания до ожиданий излечения от всех болезней и продления жизни [Е.Б. Меньшикова с соавт., 2008]. В

таких случаях важнейшим критерием истины должна стать практика, но пока и она не дала однозначных ответов на многие вопросы.

Среди использующихся в медицинской практике наиболее перспективным антиоксидантом является убихинон (коэнзим <3ю, СоСЦ) - вещество эндогенной природы, обязательный компонент мембран митохондрий, лизосом, аппарата Гольджи, плазматических мембран.

Струкурная формула коэнзима Ою(2,3-диметокси-5-метил-6-декапренил-1,4-

бензохинон).

Коэнзим 1о в митохондриях участвует в синтезе АТФ как переносчик электронов, сопрягающий процессы электронного транспорта и окислительного фосфорилирования. В то же время, убихинон - единственный липидорастворимый антиоксидант, синтезирующийся в клетках животных и человека. Еще одно уникальное свойство Со(Зю - постоянная регенерация его окисленной формы с помощью ферментных систем организма и антиоксидантов неферментной природы - аскорбата, а-токоферола (а-ТОС), возвращающая ему антиоксидантную активность (схема 1).

Убихинои СоО (окисленная форма)

Убихннол СоГШ; (восстановленная форма)

Схема 1. Взаимопревращения окисленной и восстановленной форм убихинона.

По результатам многих клинических исследований СоС^о рекомендован в качестве дополнительной терапии при хронической сердечной недостаточности, кардиомиопатии, стенокардии, гипертонии, инфаркте миокарда, атеросклерозе; имеются данные о его эффективности при мигрени, болезни Паркинсона, латеральном амиотрофическом склерозе, астме, диабете, почечной недостаточности. Наибольшее число клинических исследований Со(2ю посвящено сердечной недостаточности, однако окончательный вывод о его эффективности при этом заболевании еще не сделан. Актуально проведение дальнейших исследований, направленных, с одной стороны, на выявление препаратов, обладающих максимальной биодоступностыо и способных пополнить эндогенные уровни в сердечной мышце, а с другой - на более глубокое понимание патогенетических механизмов (на уровне ткани и клетки) как потенциальных объектов фармакологического воздействия Со(2н>.

На мировом фармацевтическом рынке Сор к! повсеместно доступен в виде биологически активных добавок к пище и лишь в нескольких странах - как активное вещество в составе лекарственных препаратов. Российский современный фармацевтический рынок изобилует предложениями СоО, „-содержаших БАД зарубежного и отечественного производства. Широкая и навязчивая реклама БАД к пище, проводимая средствами массовой информации, приводит к росту их неконтролируемого потребления. Эта ситуация обязывает повышать уровень требований к безопасности и качеству биологически активных добавок, которые на сегодняшний день регламентируются техническими условиями в соответствии с требованиям «Руководства по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (Руководство Р 4.1.1672-03). На основании требований Руководства количественный анализ СоСЗю в БАД осуществляется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектированием по поглощению в ультрафиолетовой области спектра. Недостаточная чувствительность определения и условия пробоподготовки ограничивают применение этой методики образцами с высоким содержанием СоСЬо, то есть лекарственными препаратами и БАД.

Безопасность БАД на основе Со<Зю контролируется по критериям, предъявляемым к продуктам питания: содержанию токсичных элементов (тяжелых

металлов), пестицидов и радионуклидов. Между тем, содержащиеся в БАД активные компоненты могут вызывать терапевтические эффекты и иметь побочные; вещества эндогенной природы при длительном приеме могут оказывать влияние на уровень их синтеза в тканях организма, приводя к формированию небезопасного эффекта отмены. Кроме того, Руководство не предусматривает стандартизации БАД и не требует подтверждения их фармакологической эффективности, что имеет первостепенное значение в случае медицинского применения.

Целыо данного исследования явилась комплексная оценка качества и эффективности БАД с CoQh> для обоснования их применения в качестве кардиопротекторов.

Достижение поставленной цели осуществлялось последовательным решением следующих задач:

1. Разработать методики определения CoQm в БАД, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с электрохимическим детектированием, для оценки их качества и стандартизации.

2. Разработать ВЭЖХ-методики определения коэнзимов Q9, Qw и а-ТОС в тканях крыс (плазме/сыворотке крови, миокарде, головном мозге) для изучения фармакокинетики БАД на основе CoQm при однократном и хроническом введении, а также тканевого содержания коэнзимов Q и а-ТОС при патологии миокарда.

3. Провести сравнительное изучение фармакокинетики CoQm у крыс после однократного введения внутрь порошка субстанции и различных БАД серии «Кудесан» (раствора и таблеток).

4. Изучить влияние БАД «Кудесан» при хроническом введении и после его прекращения на содержание коэнзимов Q и а-ТОС в плазме крови и миокарде крыс.

5. Разработать методику определения уровня гидроксильных радикалов в миокарде in vivo с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием и микродиализа миокарда для оценки интенсивности окислительных процессов.

6. Определить уровень гидроксильных радикалов в миокарде при патологических состояниях:

- в гипертрофированном миокарде крыс с наследственной артериальной гипертензией (линия БИТ^Р);

- в миокарде крыс (\Vistar) при острой региональной ишемии и последующей реперфузии

для патогенетического обоснования антиоксидантной терапии.

7. Оценить уровни коэнзимов С) и а-ТОС:

- в плазме и гипертрофированном миокарде крыс различных возрастов с наследственной артериальной гипертензией;

- в постинфарктном ремоделированном миокарде иормотензивных крыс

для патогенетического обоснования применения СоСЬо в качестве кардиопротектора.

8. Оценить кардиопротекторные эффекты БАД «Кудесан» при хроническом введении крысам с наследственной артериальной гипертензией линии ЗНГ^Р и крысам \Vistar с инфарктом миокарда.

Научная новизна

Разработаны методики определения Сорю с применением ВЭЖХ с электрохимическим детектированием в БАД: растворе солюбилизнрованиой субстанции СоСЗш, таблетках микрокапсулированного СоСЦ, а также в плазме крови, тканях мозга и миокарда, позволяющие одновременно проводить определение СоОч и а-ТОС.

Изучена фармакокинетика Сор1(| в порошке субстанции, растворе солгобилизированной субстанции и таблетках микрокапсулированной субстанции. Доказаны фармакокинетические преимущества модифицированных субстанций Сор ю. Для раствора солюбилизированного СоС^о выявлена способность при хроническом введении внутрь повышать уровни в миокарде. Обнаружен эффект отмены Со<Зш: падение концентраций в миокарде ниже нормальных значений через 2 недели после прекращения длительного введения внутрь.

Впервые проведена сравнительная оценка содержания коэнзимов р.,, <3Ш и а-ТОС в плазме крови, гипертрофированном миокарде и головном мозге крыс с наследственной артериальной гипертензией различного возраста относительно тканей иормотензивных животных. Выявлена взаимосвязь плазменных и миокардиальных уровней СоСЬ0 со степенью гипертрофии левого желудочка.

Впервые выявлено снижение содержания коэнзимов Qio и а-ТОС в гипертрофированном постинфарктном миокарде. Обнаружена сильная корреляционная зависимость между размером инфаркта и концентрациями коэнзимов Q в плазме крови.

Разработана ВЭЖХ-методика определения гидроксильных радикалов в ткани миокарда in vivo, обладающая наибольшей чувствительностью из приведенных в литературе аналогов. На примере спонтанно гипертензивных крыс SHRSP впервые выявлены повышенные уровни гидроксильного радикала как возможная причина сниженной устойчивости гипертрофированного миокарда к ишемии и установлена их прямая взаимосвязь со степенью гипертрофии сердечной мышцы. Доказано усиление генерации гидроксильных радикалов во время эпизодов реперфузии при ишемическом прекондиционировании (ИП) миокарда. Показано, что ишемическое прекондиционирование сокращает продолжительность реперфузионного выброса гидроксильных радикалов в миокарде крысы после региональной ишемии, что может являться одним из механизмов кардиопротекторного действия ИП, проявляющегося в многократном сокращении размера зоны некроза.

Показан кардиопротекторный эффект CoQw при длительном введении внутрь на различных экспериментальных моделях гипертрофии миокарда: при развитии первичной артериальной гипертензии у спонтанно гипертензивных крыс и у животных с инфарктом миокарда. Обнаружено, что выраженность эффекта взаимосвязана с концентрациями CoQio в плазме крови и миокарде.

Теоретическая п практическая значимость

> Методики определения CoQm на основе ВЭЖХ могут использоваться для его количественного определения в различных композициях, применяемых в качестве БАД и лекарственных препаратов. Высокая чувствительность разработанной методики определения CoQm в биологических объектах позволяет применять ее для изучения фармакокинетики при проведении доклинических и клинических испытаний.

> Методика определения уровня гидроксильных радикалов в ткани in vivo на основе микродиализа миокарда и ВЭЖХ предоставляет возможность экспериментальной прижизненной оценки окислительного статуса тканей.

Возможность мониторинга тканевых уровней гидроксилыюго радикала позволяет в фармакологическом эксперименте оценивать on-line эффективность мер, направленных на ограничение генерации активных форм кислорода.

> Доказана патогенетическая значимость усиленной генерации активных форм кислорода и сниженных миокардиальных уровней CoQio при острых и хронических патологических состояниях миокарда. Выявленный дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными факторами существенно дополняет представление о патогенетической роли окислительного стресса при сердечнососудистых заболеваниях.

> Доказана кардиопротекторная эффективность CoQm в составе БАД «Кудесан» раствор на различных моделях гипертрофии миокарда. Полученные результаты являются теоретическим основанием для проведения полного доклинического изучения CoQi() и решения вопроса о создании лекарственных средств на его основе.

> Впервые выявленный для CoQio эффект отмены требует пересмотра отношения к нему как абсолютно безопасному фармакологическому агенту. Возможность резкого снижения содержания СoQ id в миокарде ниже нормальных значений после прекращения его приема обязывает с крайней осторожностью применять высокие дозы CoQio и диктует необходимость разработки фармакокинетически обоснованных безопасных режимов дозирования. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 13 всероссийских (18 докладов) и 13 международных (23 доклада) съездах, конференциях, симпозиумах, конгрессах.

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, из них 15 статей, в том числе 13 - в ведущих рецензируемых отечественных журналах.

Объем и структура работы:

Диссертация состоит из семи частей: введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей 4 главы, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и трех приложений. Диссертация изложена на 192 страницах, содержит 66 рисунков и 25 таблиц. Список литературы представлен 205 наименованиями, из которых 192 - зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Обоснование применения CoQio для кардиопротекции по результатам изучения прооксидантных и антиоксидантных характеристик гипертрофированного миокарда.

• Оценка качества БАД по содержанию CoQio методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием.

• Результаты изучения фармакокинетики CoQio в составе различных БАД серии «Кудесан»: «Кудесан» раствор, таблетках «Кудесан форте», жевательных таблетках «Кудесан для детей» для разработки эффективных и безопасных режимов дозирования.

• Оценка эффективности БАД «Кудесан» как кардиопротектора при гипертрофии миокарда различного генеза.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель, задачи и основные положения диссертационной работы. Данная работа посвящена комплексной оценке качества и эффективности БАД отечественного производства на основе высокотехнологичных субстанций коэнзима Q|0: солюбилизированной и микрокапсулированной. В диссертации представлены результаты исследований фармацевтических, фармакокинетических, патофизиологических и фармакологических факторов, обосновывающие и доказывающие способность коэнзима Qio как терапевтического агента оказывать защитное действие на сердечную мышцу. Основным аналитическим инструментом для изучения объектов исследования (субстанции и БАД на основе коэнзима Qm, образцов плазмы, сыворотки крови, тканей миокарда и мозга, микродиализатов миокарда крыс) послужила ВЭЖХ в сочетании с электрохимическим детектированием. В исследовании использованы современные экспериментальные методы и подходы: микродиализ миокарда in vivo в сочетании с on-line анализом образцов диализата, модели острого и хронического инфаркта миокарда, наследственной артериальной гипертензии (крысы линии SHR и SHRSP), региональной ишемии-реперфузии и ишемического прекондиционирования миокарда, морфологические исследования с применением световой и электронной микроскопии.

Обзор литературы включает сведения об истории открытия и изучения коэнзима Qio, современные представления о путях его биосинтеза и биохимических функциях, описание физико-химических свойств убихинонов. Подробно изложены существующие методы количественного определения коэнзимов Q (электрохимические, спектрофотометрические, хроматографические в сочетании с различными принципами детектирования) и способы пробоподготовки объектов со сложной матрицей. Приводятся данные о результатах применения коэнзима Qm в лечении сердечно-сосудистых заболеваний. Особое внимание уделено анализу литературы по фармакокинетике коэнзима QU): механизмам его абсорбции и транспорта, содержанию в тканях эндогенного и распределению экзогенного липида, фармакокинетическим параметрам.

Первая глава экспериментальной части посвящена разработке методик количественного определения коэнзима Qm и а-ТОС в БАД и образцах тканей: плазме крови, миокарде, головном мозге. Объектами исследования были БАД «Кудесан» раствор, таблетки «Кудесан форте» и «Кудесан для детей» (ЗАО «Аквион»), Методика включает следующие этапы: 1) подготовку образца (разведение, измельчение, гомогенизацию); 2) экстракцию; 3) упаривание экстракта и перерастворение; 4) восстановление убихинона до убихинола; 5) хроматографическое ВЭЖХ-разделение и 6) количественный анализ электрохимическим методом.

Для экстракции коэнзима Qm и а-ТОС из анализируемых объектов была выбрана смесь 96% этанол:гексан (2:5). После экстракции и упаривания гексановой фракции сухой остаток перерастворяли в этаноле и восстанавливали окисленный коэнзим Qio добавлением раствора NaBH4 в этаноле. Хроматографический анализ проводился в обращено-фазовом режиме на колонке 150x4,6 мм с сорбентом С18, 5цм. Детектирование осуществляли по потенциалу окисления восстановленной формы коэнзима Qm на электрохимическом детекторе «Coulochem И» с аналитической ячейкой модели 5011 (США) при напряжениях на первой и второй паре электродов -50 и +350 мВ соответственно (рис. 1).

Определение проводили методом внешнего стандарта по калибровочным функциям, построенным для стандартных разведений CoQm в этаноле. Предел обнаружения CoQm - 0,1 нг. БАД «Кудесан» раствор и таблетки содержали в

качестве второго действующего вещества а-токоферола ацетат, определение которого в БАД не проводилось из-за отсутствия у него электрохимической активности.

Рис.1. Хроматограммы стандартного раствора коэнзима <3т до (/) и после внесения №ВН4 (2, 3).

Разработанная методика позволила провести количественное определение содержания СоОюВ БАД серии «Кудесан». Результаты определения представлены в табл. 1. Как следует из данных табл. 1, содержание Со<Зк) во всех трех формах БАД соответствовало заявленной дозировке, находясь в пределах допустимых ТУ отклонений.

Таблица 1

Объект исследования Содержание по сертификату Пределы отклонений по ТУ Найдено, мг/мл, табл Сред.±ст.откл Найдено, %от дозировки Сред.±ст.откл.

«Кудесан» раствор 27,9 мг/мл (сер. 521207) 27-33 мг/мл 27,5±0,50 92±2 (п=6)

«Кудесан форте» таблетки 29,0 мг/табл (сер. 030907) 25,5-34,5 мг 28,8±1,1 96±3,7 (п=10)

«Кудесан для детей» таблетки 8,1 мг/табл (сер. 120907) 6,37-8,63 мг 7,9±0,5 105±7 (п=10)

Условия хроматографирования обеспечивали полное разделение C0Q10, CoQ.; и а-ТОС, необходимое при анализе образцов тканей человека и животных, содержащих гомологи убихинона (рис. 2-4). Применительно к образцам биоматериала разработанная методика обеспечивала высокую чувствительность (предел обнаружения CoQm, CoQ9 - 0,1 нг, а-ТОС - 0,01 нг) и правильность определения (96-99%).

H

C:\6SASOO\HEART\previe.

; 1

а-ТОС <—

1 fi 5

Q* U Q<k,

Рис. 2. Хроматограммы экстракта плазмы крови крысы до (/) и после (2) внесения ЫаВН4; чувствительность детектора - 500 нА (1, 2). Повторное внесение образца: чувствительность 100 нА (3).

Рис. 3. Хроматограммы экстракта миокарда крысы до (1) и после внесения №ВК,: неполное восстановление (2); полное восстановление СоС^ и СоС^т (3,4).

Рис. 4. Хроматограммы экстракта головного мозга крысы до (/) и после внесения №ВН4 (2); после повторного внесения для контроля полноты восстановления СоСЬ и СоС>|0 (3).

Во второй главе представлены результаты изучения фармакокинетики Со(}н) в составе различных БАД серии «Кудесан» при однократном и повторяющемся длительном введении внутрь. Со<Зк> является липофильпым соединением с малой растворимостью, поэтому содержащие его фармацсвтичсскис продукты характеризуются низкой биодоступиостыо. На степень всасывания вещества наибольшее влияние оказывают физико-химические свойства его субстанции (физическое состояние, степень дисперсности и т.д.) и состав препарата. На сегодня опубликованы лишь единичные исследования, посвященные изучению фармакокинетики субстанции и препаратов (или БАД) на основе Сор,о.

Сравнительная оценка фармакокинетики и биодоступпости СоО Н1 после однократного введения внутрь в дозе 10 мг/кг проводилась для порошка субстанции, солгобилизированной субстанции в составе БАД «Кудссаи» раствор, микрокапсулированной субстанции СоОю в составе таблеток «Кудесан форте» и «Кудесан для детей». Исследование выполнено на бодрствующих взрослых самцах крыс \Vistai' с имплантированными катетерами в бедренной артерии для отбора проб крови. Порошок и измельченные таблетки вводили в желудок через зонд в виде взвеси в 0,2% геле метилцеллюлозы (в/о) в пропорции 1мг Со(3ш/100мкл; «Кудесан» раствор разводили дистиллированной водой до той же концентрации.

Пробы крови отбирали в течение 2-х суток после введения. Чувствительность методики определения - 10 иг Со<Зк> в мл плазмы (рис. 5).

Прирост содержания СоСЬо в плазме крови крыс после введения порошка субстанции и трех БАД приведен на рис. 6.

C:\ESAS00\HEAftT\QPHKIN12, СЭиппс! В

г; л II! : н ; |! в || : II ( Ъо

-------щ. .... .... 11 1 II м ■ | ¡1 '! 1 1

«ц]и \ 1

Рис. 5. Хроматограмма экстрактов плазмы крови крысы до (А) и через 2 часа после (В) введения внутрь Со(},0 (] 0 мг/кг).

Рис. 6. Кинетические кривые зависимости концентрация-время при введении СоОю внутрь в составе 3-х БАД серии «Кудесан» и порошка субстанции (10 мг Со<Зк,/кг). Приведены усредненные концентрации по 7 животным.

Определены и рассчитаны модельно независимым методом основные фармакокинетические параметры, приведенные в табл. 2: С „,.,* - максимальная концентрация СоОю в плазме, Т „,ах - время ее достижения, АиС(мя - площадь под кривой «концентрация-время», Сш„/АиСо-.(я - относительная скорость всасывания. Для раствора и таблеток солюбилизированного СоОю относительно порошка субстанции рассчитывали: Г - относительную биодоступность, определяемую отношением АиС0-а/АиС„.,д, и Г - относительную степень всасывания, определяемую отношением С„,а,.т/С„тд.

Таблица 2

Фармакокинетические параметры CoQio(среднее значение±станд. отклонение)

Порошок CoQio «Кудесан» раствор Таблетки «Кудесан форте» Таблетки «Кудесан для детей»

AUCO-48 (мкг* час/мл) 2,6±0,3 6,9±0,8" 19,4±4,1"* 8,5±2,3"&

С т„х (нг/мл) 199±27 654±48* 615±99* 363±54#*&

Т „ш, (час) 4,3±0,5 3,3±0,3 14,6±3,4#* 9,3±2,6

Cimx/AUCo_48 (час"') 0,081±0,014 0,103±0,014 0,035±0,004** 0,051±0,008*

f (%) 364 734 325

Г (%) 329 309 182

# - значимые отличия от порошка субстанции; * - значимые отличия от «Кудесан» раствор; & - значимые отличия от таблеток «Кудесан форте».

Данные табл. 2 и рис. 6 наглядно демонстрируют фармакокинетические преимущества модифицированных субстанций СоС^ю в составе БАД: многократно более высокие значения С,шх, АиСо-4», Г1 и Г Наибольшие значения АиС<мя и, соответственно, относительной биодоступности СоС^ю в составе БАД «Кудесан форте» могут быть следствием пролонгированного всасывания за счет микрокристаллической целлюлозы в составе таблеток. Солюбилизированная форма СоС^о обеспечивает наиболее высокие значения максимальной концентрации при наименьшем времени их достижения и наибольшую относительную степень всасывания при максимальной относительной скорости всасывания.

Кинетические кривые коэнзима Ою (после введения порошка жирорастворимой субстанции, раствора солюбилизированной субстанции или измельченных таблеток) у нескольких животных имели дополнительные пики концентраций, наблюдавшиеся в интервале от 7 до 24 часов после введения вещества (рис. 7). Известно, что жирорастворимый коэнзим <3ю после всасывания в кишечнике захватывается из циркуляции гепатоцитами. Дополнительные пики концентраций коэнзима С2ю являются отражением феномена энтерогепатической циркуляции и/или повторного выброса из печени в кровоток. Ломаный характер кинетических кривых после первого пика концентрации исключил возможность корректного расчета константы элиминации.

время, часы

Рис. 7. Индивидуальные кинетические кривые коэнзима (^ю после введения внутрь с дополнительными пиками концентраций.

Данные литературы свидетельствуют о том, что превентивный однократный прием Со(2ю не оказывает выраженного защитного действия на миокард, подвергшийся острой ишемии и/или окислительному стрессу. Причина, по-видимому, кроется в том, что кратковременного повышения концентраций коэнзима (5ю в крови недостаточно: необходимо пополнение его содержания в тканях миокарда. Для оценки такой возможности нами была изучена динамика концентраций Со<Зю и СоСЬ в сыворотке крови и миокарде крыс при хроническом энтеральном введении СоС?ю и после его прекращения. Фармакокинетические преимущества Со(5ш в составе БАД «Кудесан» раствор, наименьшая вариабельность концентраций и удобство воспроизводимого точного дозирования при введении внутрь определили выбор этой формы для проведения исследования.

БАД «Кудесан» раствор в дозе Со(Зю 10 мг/кг или равный объем растворителя вводили животным внутрь ежедневно в течение 3-х и 6-ти недель. Образцы сыворотки и миокард левого желудочка получали спустя 3-4 часа после очередного введения, т. е. в интервал времени, соответствующий максимальным концентрациям Со(2ю в крови. Концентрации Со(5ю и СоСЬ в сыворотке крови и миокарде на фоне введения БАД и после его отмены приведены в табл. 3 и на рис. 8-9. Согласно представленным данным, через 3 и 6 недель введения БАД «Кудесан» концентрации Со(Зш в сыворотке крыс в 8 и 15 раз превышали значения в контрольных группах. Через 2 недели после прекращения введения содержание Со<Зю в сыворотке оставалось в три раза выше, чем в контрольной группе, и только через 6 недель разница между контрольной и опытной группами исчезала (табл. 3).

Таблица 3

Содержание Со(Зю и Со(^9 в сыворотке крови крыс через 3 и б нед введения внутрь БАД «Кудесан» раствор и спустя 2 и 6 нед после его отмены (среднее значение±станд. отклонение)____

Группы крыс, количество в группе 3 нед. 6 нед. 2 нед. после 6 нед. после

введения введения отмены отмены

Со(Зю контрольные (22) 119±21 (5) 68±37 (5) 62±19 (6) 53±24 (6)

нг/мл получавшие «Кудесан» (30) 943±480* (6) 1084±649* (8) 170±101* (8) 86±20 (8)

Сор, контрольные (22) 858±131 (5) 380±184 (5) 449±92 (6) 359±214 (6)

нг/мл получавшие «Кудесан» (30) 547 ±267 (6) 547±181 (В) 545 ±111 (8) 465 ±155 (8)

* - значимые различия с параллельной контрольной группой, р<0,05.

Уровни СоС>9 в сыворотке крови на фоне введения БАД и после его прекращения незначительно превышали контрольные значения. Характерно, что при этом они были постоянны, как бы «нормализованы» и лишь немного снизились через 6 недель после отмены. Причиной подобной стабильности может являться депо препарата в печени, образующееся при регулярном введении достаточно высокой дозы СоС2ю. Известно, что после абсорбции в желудочно-кишечном тракте

Со(Зю захватывается тканями печени и затем высвобождается в плазму крови для последующего включения в липопротеиды различной плотности. Возможно, что в печени происходит конверсия поступившего СоСЬо в СоСЬ и накопление последнего. Постепенное же высвобождение накопившегося Со0<, может поддерживать в сыворотке его постоянный уровень, не зависящий от динамики концентраций СоОю.

В миокарде крыс спустя 3 и 6 недель приема препарата содержание С'оОю возросло примерно на 40-60% относительно соответствующих контрольных животных. Отмена препарата привела через 2 недели к резкому снижению миокардиальных уровней СоОю (более чем в 3 раза), составлявших уже лишь 38% относительно контрольной группы. Через 6 недель после прекращения введения содержание Со(Зю в миокарде крыс восстановилось до уровня равновозрастных контрольных животных (рис. 8).

100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60 -80

* -(З.о —>

3 > 6 8

*

недели

Рис. 8. Изменение содержания коэнзима О № в миокарде крыс в течение 6-ти недель введения коэнзима (¿ю и 6-ти недель после его отмены. По оси ординат - изменения относительно контрольной группы, принятой за 100%.

* - значимость различий с равновозрастной контрольной

группой.

100 -

40 20 0

-20 -_'

-40 +(}„

<3ю —>

недели

Рис. 9. Изменения содержания коэнзима в миокарде левого

желудочка крыс в течение 6-ти недель введения коэнзима СЬо и 6-ти недель после его отмены. По оси ординат -изменения относительно контрольной группы, принятой за 100%. * - значимость различий с равновозрастной контрольной

группой.

Падение содержания Со<Зю в миокарде после прекращения введения ниже значений контрольной группы свидетельствует о наличии эффекта отмены для данной дозы. Регулярное поступление СоСЦ извне, приводящее к повышению концентрации Со<Зю в миокарде, по-видимому, подавляло его биосинтез, на восстановление нормального уровня которого после отмены препарата потребовалось около 6 недель.

Миокардиальные уровни СоСЬ через 3 и 6 недель введения БАД оказались выше, чем в соответствующих контрольных группах. Через 2 недели после прекращения введения содержание Со<39 в миокарде упало до значений ниже чем в контрольной группе; спустя еще 4 недели содержание Со<39 практически нормализовалось (рис. 9).

У крыс объединенной контрольной группы обнаружена отрицательная корреляционная взаимосвязь между содержанием каждого из коэнзимов <3 в сыворотке крови и в миокарде (рис. 10), свидетельствующая об отсутствии в норме поступления коэнзимов <3 из крови в ткани сердца.

<110 в сыворотке крови, нг/мл <39 в сыворотке крови, кг/г

Рис. 10. Соотношение концентраций коэнзимов 0 в сыворотке крови с концентрациями в миокарде у крыс объединенной контрольной группы.

Длительное введение экзогенного Со<Зт в составе БАД «Кудесан» приводило к подъему его концентрации в крови и инверсии коэффициента корреляции: формировалась усиливающаяся от 3-й к 6-й неделе положительная взаимосвязь между сывороточными и миокардиальными уровнями Со(Зю, отражающая его концентрационно-зависимое поступление из крови в миокард.

После прекращения введения коэффициенты корреляции резко снижались, возвращаясь в сторону отрицательных значений (табл. 3).

Прирост уровней СоСЬ в сердечной мышце в результате введения Со(2ю, по-видимому, являлся результатом метаболической трансформации последнего, а не поступления Со(}9 из крови, так как изменение содержания СоСЬ в миокарде происходило однонаправлено с Со<Зю при неизмененных концентрациях СоСЬ в

сыворотке.

Таблица 3

Взаимосвязь содержания СоОю и СоО, между сывороткой крови и миокардом крыс

Группы крыс (количество в группе) Коэффициент корреляции

CoQio в сыворотке vs CoQio в миокарде Со(39 в сыворотке уэ Сор9 в миокарде

Объединенная контрольная - 0,502 - 0,466

(22)

3 недели введения Со(5ю(6) 0,573 0,754

6 недель введения Со<Зю (8) 0,615 0,552

2 недели после отмены (8) 0,135 0,264

6 недель после отмены (8) 0,005 - 0,145

Таким образом, при ежедневном введении Со(Зт внутрь в дозе 10 мг/кг в составе БАД «Кудесан» С^ш в сыворотке крови многократно превышала фоновые концентрации Со(2к>; достоверно возрастало и его содержание в миокарде. Поступление экзогенного убихинона, вероятно, приводит к подавлению его биосинтеза, что объясняет факт резкого падения содержания СоС^ю и Со<39 в миокарде через 2 недели после прекращения введения БАД. Нормализация тканевого уровня Со(Зю и Со(}9 происходила не ранее, чем через 6 недель после прекращения введения.

Третья глава экспериментальной части предоставляет доказательства патогенетической роли усиленной генерации активных форм кислорода (АФК) в ишемическом-реперфузионном повреждении миокарда и процессах ремоделирования сердечной мышцы как основание для исследования антиоксидантов на наличие кардиопротекторной эффективности.

Самый короткоживущий и наиболее агрессивный из всех кислородсодержащих радикалов - гидроксильный радикал (ОН*). Он способен реагировать с биомолекулами большинства классов соединений с константой скорости Ю9-1010 М/сек и не имеет специфичного эндогенного антиоксиданта. Именно избыток ОН* инициирует перекисное окисление липидов, каскадный характер которого приводит к развитию патологических процессов на уровне клетки и ткани.

Для определения in vivo тканевого уровня ОН' была разработана методика, сочетающая микродиализ миокарда раствором Рингера с салициловой кислотой и ВЭЖХ-анализ содержания в диализате 2,3-дигидроксибензойной кислоты (2,3-ДГБК) - специфического продукта гидроксилирования салицилата:

соон

2,5-ДГБК (40%) 2,3-ДГБК (49%) пирокатехин (11 %)

Схема 2. Продукты биотрансформации салициловой кислоты.

Микродиализ проводили с помощью линейного диализного волокна, прошитого в стенку миокарда левого желудочка наркотизированных животных с открытой грудной клеткой (рис. 11). После имплантации диализатор перфузировали раствором Рингера не менее 1 ч, а затем раствором Рингера с салициловой кислотой до установления стабильного уровня 2,3-ДГБК. Пробы диализата собирали непрерывно 5- или 10-минутными порциями и анализировали

on-line ввиду нестабильности салицилата и возможности завышения уровней 2,3-ДГБК.

Рис. 11. Расположение лигатуры (1) на ветви левой нисходящей коронарной артерии и диализатора (2), прошитого в миокард левого желудочка

крысы.

Хроматографический анализ проводили в обращеннофазовом изократическом режиме элюентом, содержащим К-дигидрофосфатный буферный раствор (рН 2,5), лимонную кислоту, Ыа2ЭДТА, октилсульфонат натрия и 11% (об/об) метанола. Электрохимическое детектирование осуществляли при потенциалах -40 мВ на первом и +350 мВ на втором, измерительном электроде. Предел обнаружения для 2,3-ДГБК - 2 пг.

1ч

Рис.12. Хроматограмма диализата миокарда до ишемии (А) и при реперфузии (В). 1 - 2,5-ДГБК; 2 -2,3-ДГБК; 3 - салициловая кислота. Колонка HR-80 С18, 80 х 4,6 мм, 3 цм (ESA, США).

Мониторинг фонового уровня ОН' в гипертрофированном миокарде спонтанно гипертензивных крыс ЗНЯБР показал, что интенсивность генерации ОН" увеличена относительно нормотензивных крыс \Vistar, \VICY (рис. 13) и прямо взаимосвязана со степенью гипертрофии левого желудочка (рис. 14).

а ш и

ч

-р <0,0001

■ р <0,005 ~

О \Vistar ♦ вНЯБР А WKY

Рис. 13. Средние индивидуальные значения уровня 2,3-ДГБК в диализате миокарда крыс линий \УКУ, \Vistar и ВШ^Р (% к содержанию в перфузионном растворе).

Рис. 14. Взаимосвязь средних индивидуальных значений уровня 2,3-ДГБК в диализате миокарда со степенью гипертрофии ЛЖ ЗНЯЗР.

-=• 40

а ш и

ч

30

г = 0.831 р < 0,05

2,4 2,6 2,8

индекс массы левого желудочка, г/кг

Динамику уровня ОН" при ишемии-реперфузии изучали у крыс 8НЯ8Р и \Vistar. Региональную ишемию миокарда создавали 30-минутной перевязкой нисходящей ветви левой коронарной артерии (рис. 11); 60-минутная реперфузия стартовала после снятия лигатуры (рис. 15).

Т-? 2

Рис. 15. Уровни 2,3-ДГБК в диализате миокарда крыс линий БНЯЗР (1) и \Vistar (2) (% к содержанию в перфузионном растворе). Значимые различия: &- с фоновым уровнем в группе, *- между группами БИКБР и \Vistar.

окклюзия

Время,мин

Показано, что суммарный ишемический и реперфузионный выброс ОН' в миокарде 8НЛ8Р положительно коррелировал с фоновым уровнем генерации и был в 1,6 раза больше, чем у крыс \Vistar (рис. 16,17). Величина зоны некроза в гипертрофированном миокарде БИКБР оказалась на 40% больше, чем у крыс \Vistar, при равных размерах зоны риска (рис. 18).

1 г

фон 30 мин

Рис. 16. Количество 2,3-ДГБК в диализате миокарда крыс линий \Vistar (1) и БНИБР (2) до, во время ишемии и при реперфузии. Значимость различий между группами: *р = 0,02; **р < 0,0002.

■&

о- I

äi с о ы (О (О го

30 35 40 45 50 55

Средние фоновые концентрации 2.3-ДГБК, пг на 15 мкл диализата

Рис.17. Взаимосвязь средних фоновых уровней ОН' в диализате БИКБР с суммарным выбросом ОН' при реперфузии (г = 0,752, р< 0,05).

X

о

О)

га х

s

г

S

с

ф

СО

40

П J

1 2 зона риска

1 2 зона некроза

Рис. 18. Величина зоны риска (отношение зоны ишемии ко всему миокарду ЛЖ, %) и зоны некроза (отношение зоны некроза к зоне ишемии, %) в миокарде крыс линий Wistar (1) и SHRSP (2). Значимость различия между группами: * р < 0,005.

Полученные результаты доказали меньшую устойчивость гипертрофированного миокарда БНЫЗР к острому окислительному стрессу. Факторами большего некротического повреждения могут являться, с одной стороны, выявленный усиленный выброс АФК, а с другой - дефицит в системе 2-й линии антиоксидантной защиты гипертрофированной ткани.

Известно, что ишемическое прекондиционирование миокарда способно ограничить повреждение сердечной мышцы, вызванное последующими ишемией и реперфузией. Предполагается, что АФК могут участвовать в формировании эффекта ИП, так как предварительное введение антиоксидантов предотвращает развитие резистентности. Однако, прямых доказательств увеличения интенсивности генерации АФК на кратких эпизодах ишемии-реперфузии при ИП получено не было. На очередном этапе исследований оценивали влияние ИП на тканевые уровни ОН* на протяжении ИП и последующих региональной ишемии и реперфузии.

Рис. 19. Уровни 2,3-ДГБК (М±8Е) в диализатах миокарда крыс двух групп. • - животные с 30-мин ишемией (п=6); □ - животные с ИП перед 30-мин ишемией (п=5).

# - р<0,05 по сравнению с фоновым уровнем в группе с

30-мин шемией;

* - р<0,05 по сравнению с фоновым уровнем в группе с

ИП;

& - р<0,05 между группами.

Мониторинг уровня 2,3-ДГБК выявил всплески генерации ОН" на кратких эпизодах реперфузии ИП (рис. 19), подтверждающие гипотезу о роли АФК как эндогенного фактора развития резистентности миокарда к ишемическому воздействию. Действительно, оказалось, что ИП предотвращает ишемический и

приводит к сокращению продолжительности реперфузионного выброса ОН*, что сопровождалось 5-кратным уменьшением размера зоны некроза (табл. 4).

Результаты проведенного в очаге ишемии-реперфузии мониторинга уровня ОН* в гипертрофированном миокарде крыс выявили прямую связь между интенсивностью генерации ОН* и размером очага некроза. Обнаруженное усиленное образование ОН" определило дальнейшую задачу исследований: изучение содержания антиоксидантов 2-й линии защиты - Сор и а-ТОС в тканях миокарда с повышенным оксидантным статусом и кардиопротекторной эффективности введения экзогенного Со<Зю в составе БАД «Кудесан».

Таблица 4

Характеристики уровней гидроксильного радикала в миокарде крыс при реперфузии после 30-минутной ишемии и степени повреждения миокарда (среднее значение±стандартное отклонение)___

Группа с 30-мин ишемией Группа с ИП

Максимальный выброс ОН", % к фону 214±18 237±51

Время максимального реперфузионного выброса, мин 15-20 5-10

Продолжительность усиленной генерации ОН*, мин Более 60 15

Размер зоны риска, % ко всему миокарду левого желудочка 52,5±2,2 46,6±2,5

Размер зоны некроза, % к зоне риска 30,8±3,3 5,4±1,4*

* - значимость отличий от группы без ишемического прекондиционирования, р<0,0001.

В четвертой главе оценивается антиоксидантный статус миокарда и других тканей 8НЯ8Р относительно крыс \V1CY, а также постинфарктного гипертрофированного миокарда крыс \Vistar по содержанию коэнзимов О и а-ТОС. Представлены результаты длительного введения внутрь БАД «Кудесан» раствор -свидетельства его защитного действия на миокард.

Гипертензивные животные БИКБР всех исследованных возрастных групп имели повышенное артериальное давление и гипертрофию левого желудочка сердца; индекс массы правого желудочка БИКБР не отличался от равновозрастных крыс \VKY- Содержание СоСЬ, СоСЦи а-ТОС в плазме крови, миокарде и головном мозге определяли у крыс БНЕЗР в возрасте 6, 12, 24 и 50 недель (рис. 20), В плазме крови ЗНЛЗР относительно \УКУ к 12-недельному возрасту снижается содержание

С'оОю, в головном мозге - Со(^9. В гипертрофированном ЛЖ крыс линии БНЯ^Р всех возрастных групп выявлен дефицит Со<Зю, Со<39 и а-ТОС. Наименее страдает содержание Со(} в ЛЖ самых молодых животных, располагающем 4-кратным избытком а-ТОС. В ПЖ при отсутствии гипертрофических изменений уровни Со<Зю были снижены у 12-недельных крыс, Со<39 - с возраста 24 недели. Достаточные уровни СоС) в ПЖ 6-недельных животных, возможно, поддерживаются 10-кратным избытком а-ТОС, содержание которого падает до возрастной нормы к 12 неделям жизни при одновременном развитии дефицита

Сод.

Рис. 20. Содержание коэнзимов Ою (а), (),, (б) и а-ТОС (с) в правом (ПЖ) и левом (ЛЖ) желудочках сердца 8НЯ8Р относительно

* - значимые различия абсолютных уровней между \VICY и 8ПК8Р.

У молодых крыс линии БИКБР в возрасте 6-ти недель, на раннем этапе развития гипертрофии миокарда, индекс массы ЛЖ был прямо пропорционален концентрации СоСЬо в плазме крови (г=0,944; р<0,05) и обратно пропорционален содержанию СоОю в миокарде (г= - 0,658; р<0,05) (рис.21).

40,0 30,0 20,0 10,0

0,0

2,50

3,00 3,50

гипертрофия ЛЖ

б

2,50

3,00 3,50

гипертрофия ЛЖ

Рис. 21. Зависимость индекса массы от содержания Со<Зю в плазме крови и миокарде левого желудочка 6-недельных крыс ЗЛЯБР.

Пополнение содержания СоСЦ в миокарде БНЯЗР для изучения возможности ограничения развития гипертрофии достигалось введением внутрь БАД «Кудесан» раствор (10 мг Со(2ю, 1,5 мг а-ТОС /кг в день) с 6-й по 12-ю неделю жизни. Содержание коэнзимов 0 и а-ТОС измеряли в плазме, миокарде и головном мозге животных через 17-19 часов после последнего введения БАД. Спустя 6 недель введения плазменные уровни Со<Зю были в 3,5 раза выше по сравнению с контрольными животными (44±7.6 уэ 13.7±0.9 нг/мл соответственно, р<0.0001). Данные табл. 5 подтверждают способность БАД «Кудесан» при приеме внутрь повышать содержание СоОю в миокарде 8НЯ8Р; одновременно происходил подъем уровней СоСЬ и а-ТОС относительно нелеченных животных. Тот же эффект наблюдался и в миокарде ПЖ при отсутствии изменений СоСЦ и СоСЬ в головном мозге.

Таблица 5

Содержание коэнзимов (2 и а-ТОС в миокарде ЛЖ у 12-недельных крыс \УКУ, 8НЯ8Р и БНЯЗР, получавших БАД «Кудесан» раствор в течение 6-ти недель (среднее значение ± стандартное отклонение)'__

Группы крыс, сод9, сод.о, а-ТОС,

количество в группе мкг/г мкг/г мкг/г

ДУКУ (9) 159±9,1 8,1 ±0,44* 8,5±2,14

БНЛЗР (7) 168±12,7 7,1±0,54" 9,8±1,41

БИКБР+О (8) 185±7,4*" 8,0±0,41* 13,0±1,7*"

' - количественное определение проводили в цельных гомогенатах миокарда. * - значимые отличия от группы ¡ШИ^Р, р<0,01; "-значимые отличия от группы \УКУ, р<0,01.

Таблица 6

Показатели артериального давления, частоты сердечных сокращений и гипертрофии ЛЖ у 12-недельных крыс \\TCY, БИКБР и БНЕБР, получавших БАД «Кудесан» раствор в течение 6-ти недель (среднее значение±стандартное

Группы крыс, количество в группе АД, мм рт. ст. ЧСС, уд./мин Индекс массы ЛЖ, г/кг

WKY (11) SHRSP (7) SHRSP + 0 (8) 127±19* 210±24" 194±48# 331±45* 380±27# 357±48 2,39±0,11* 3,00±0,25# 2,85±0,16#

* - значимые отличия от группы БИКБР, р<0,01.

* - значимые отличия от группы \VICY, р<0,01.

Небольшое снижение среднегруппового АД и индекса массы ЛЖ в леченной группе не было статистически значимым. Более четким было снижение ЧСС, приведшее к сближению среднегрупповых значений с контрольной группой \¥КУ (табл. 6).

220

of 170

120

Ю 1

2,50 2,90 3,30 3,70 индекс массы ЛЖ

2,50 2,90 3,30 3,70 индекс массы ЛЖ

10,0

220

2

о 8,0

6,0

2,50 2,90 3,30

индекс массы ЛЖ

пТ 185

150

2,50 2,90 3,30

икщекс массы ЛЖ

Рис. 22. Взаимосвязь степени гипертрофии левого желудочка SHRSP и содержания коэнзимов Q в миокарде ЛЖ. А - группа SHRSP; Б - группа SHRSP+Q. Коэффициенты корреляции: для AI г= -0,859 (р<0,05), А2 г= -0,936 (р<0,0/); для Б1 г= -0,746 (р<0,05), Б2 г= -0,819 (р<0,05).

В обеих группах гипертеизивных животных индекс массы ЛЖ был обратно пропорционален содержанию в миокарде CoQio и CoQ9 (рис. 22). Иными словами, степень гипертрофии миокарда ЛЖ была меньше у животных с более высоким тканевым содержанием коэнзимов Q.

Выраженность признаков гипертрофии миокарда на тканевом уровне оценивали микроскопически с помощью светового микроскопа Leitzt (Германия) и электронного микроскопа Philips СМ-10 (Голландия).

При светооптическом исследовании миокарда обеих групп SHRSP наблюдали однотипные структурные изменения: увеличение размеров кардиомиоцитов и их ядер, полиморфизм последних, разрывы мышечных волокон, разобщенность клеток и увеличение межклеточных пространств, дезорганизацию миофибрилл, утрату клетками поперечной исчерченности, кровоизлияния. Деструктивные изменения были выражены и в сосудах, особенно в крупных. Просветы сохранившихся капилляров были, как правило, расширены, часто со стазом эритроцитов. В межклеточных пространствах встречались очаги образования соединительной (рубцовой) ткани.

Гипертрофия миокарда, будучи процессом компенсаторно-приспособительным, сочетает деструктивные изменения с регенераторными -приспособительными реакциями, которые легче обнаружить в ткани на ультраструктурном уровне. При электронно-микроскопическом исследовании сердец SHRSP, не получавших БАД. в кардиомиоцитах наблюдали увеличение размеров ядер и деструктивные изменения: расширения околоядерного пространства, разрывы и фрагментацию миофибрилл. Митохондрии располагались хаотично, большая часть была с разрушенным матриксом: частичное или почти полное отсутствие крист, концентрическая, дугообразная или иная формы у сохранившихся. Деструктивные изменения в миокарде этих животных носили выраженный, тотальный характер; признаков компенсаторно-приспособительных реакций не было обнаружено.

Изучение ультраструктуры сердечной мышцы левого желудочка SHRSP, получавших «Кудесан». также показало выраженные деструктивные изменения в ее клетках (разрушение миофибрилл, хаотичное расположение митохондрий, и др.) и сосудах. Однако процессы деструкции не носили столь тотального характера, как в

миокарде нелечеииых животных. Часть кардиомиоцитов сохраняла миофибриллы с правильной поперечной исчерченностью и цепочечное расположение митохондрий, свойственное этим клеткам в норме. Присутствовали признаки компенсаторно-приспособительных реакций: ядра кардиомиоцитов нередко имели фестончатую форму, увеличивающую поверхность ядра и свидетельствующую об активации его функции; сохранившие свое строение капилляры прилежали к сарколемме миоцитов, осуществляя таким образом тесный контакт с ними, что необходимо для обеспечения нормального обмена веществ в клетках (рис. 23).

Таким образом, у крыс, получавших СоСЦ, гипертрофия миокарда носила компенсаторно-приспособительный характер. Проведенное комплексное исследование позволяет сделать вывод, что БАД «Кудесан» оказывает кардиопротекторное действие на миокард спонтанно гипертензивных крыс, так как его применение предотвратило развитие дегенеративных, необратимых структурных изменений за период наблюдения.

-»•к--» - . ---------.--■-Л'-<г—

а , п- [ V ■¿Л-'/ъе*? .

' V, •(• > М - ' % ¿л'

о ь*' ч >•** ] • о яг ■ ■ -

1% ч Ч<Л V Л "/* > • X

I! х'-Д"/ . / ; л \ . *

—"Т Т^^'Т^-Г™'.......

»

Рис 23. Компенсаторно-приспособительные реакции в миокарде крыс линии БИКБР, получавших «Кудесан»: а - Капилляр, образованный эндотелиальной клеткой с ядром, вдающимся в его просвет. Сарколемма кардиомиоцита имеет небольшие выступы, тесно прилежащие к стенке капилляра. Сохраненная правильная поперечная исчерченность миофибрилл кардиомиоцита, гиперплазия митохондрий. Увеличение х 7800. Ь - Ядро кардиомиоцита с дисперсным расположением гетерохроматина; большая часть мембраны ядра имеет фестончатую форму. К ядру тесно прилежат миофибриллы с расположенными между ними митохондриями. Увеличение х 18000.

Следующей задачей было изучение содержания Со(} в гипертрофированном постинфарктном миокарде крыс и определение эффективности введения Со(5т в БАД «Кудесан» (в дозе СоС?ю 10 мг/кг в сутки в течение 3 нед до окклюзии и 3 нед после) для ограничения процессов постинфарктного ремоделирования миокарда.

Инфаркт миокарда создавали у крыс \Vistar хронической окклюзией левой нисходящей коронарной артерии; при ложной операции лигатуру, накладываемую на коронарную артерию, не затягивали, не создавая препятствий для коронарного кровообращения. Через 3 недели после операции, спустя более 18 часов после последнего введения «Кудесана» определяли индекс массы желудочков сердца и величину инфаркта, отбирали пробы плазмы и миокарда внеинфарктной зоны.

Хроническая окклюзия коронарных артерий приводила к формированию зоны инфаркта (27,8±12,1% всей площади поверхности ЛЖ), развитию гипертрофии ЛЖ (индекс массы ЛЖ: 2,38±0,27 г/кг по сравнению с 1,92±0,13 г/кг у ложно-оперированных животных, р<0,0001) и не влияла па индекс массы ПЖ (0,69+0,23 г/кг у постннфарктпых и 0,59±0,15 г/кг у ложно-оперированных крыс). В группе животных, получавших «Кудесан», размер зоны некроза (16,2±8,1%) и гипертрофия ЛЖ (2,18±0,24 г/кг) были меньше (р<0,05), чем в нелеченой группе.

90 1 5 60

2 30 а

• з

04

сЯэОЯ» о о о

0 20 40 60

размер зоны некроза, %

800

400

♦О ♦ <2.

♦ 1

02

О О

0 20 40 60

размер зоны некроза, %

Рис. 24. Зависимость между размером зоны некроза и концентрациями в плазме Со(Зю(3; г= -0,839,/><0,01) и Со()ч(1~, г= -0,723, р< 0,05) у постинфарктных крыс. 1 н 3 - животные, получавшие «Кудесан»; 2 и 4 - контрольные животные.

В группе животных, получавших БАД, обнаружена отрицательная взаимосвязь размера зоны некроза с плазменными концентрациями Со(Зю (/= -0,839, р<0,01) и СоС^ч (/— —0,723, р<0,05) (рис. 24). У постинфарктных животных, не получавших препарат, размер зоны некроза и индекс массы ЛЖ не зависели от содержания Сор. Ни в одной группе не было выявлено корреляционных связей содержания а-токоферола со степенью ишемического повреждения миокарда.

Морфологическое исследование на светооптическом уровне показало, что у животных, получавших «Кудесан», происходит более раннее и интенсивное формирование рубцовой ткани (рис 25 (1). Электронная микроскопия позволила выявить, что компенсаторно-приспособительные процессы, развивающиеся в постинфарктном миокарде на ультраструктурном уровне, в обеих группах животных были однотипны и имели одинаковую направленность (рис. 25 а,Ь).

М- §й },

v

* ' * г/ * I /, ' / / *

, , • *; / -Л^

тт

ь

л*

7.

•"А

' '' Ж'

•Шь'УГ-

г у *

Рис. 25. Микроскопия постинфарктного миокарда крыс, получавших «Кудесан»: а - образование «арок» сарколеммой кардиомиоцита; заключенные в них митохондрии имеют разрушающиеся кристы; гиперплазия митохондрий. Увеличение XI7800. Ь - атипичное ядро кардиомиоцита с глубокими инвагинациями ядерной мембраны и тесно прилежащими митохондриями, полиморфизм, гипертрофия и деструкция митохондрий. Увеличение XI3200. с - гипертрофия, гиперплазия и деструкция митохондрий; разрушение сарколеммы и миофибрилл. Прилегающая стенка сосуда имеет выраженную извитость эндотелия с развитой гранулярной цитоплазматической сетью. Сохранен базальный слой сосуда. Увеличение Х17800. с/ - формирование рубца: цитоплазма фибробластов представлена главным образом гранулярной цитоплазматической сетью, большая часть канальцев которой расширена до образования щелей и лакун, имеющих открытый выход во внеклеточное пространство; большие скопления коллагеновых фибрилл вокруг фибробластов. Ядро фестончатой формы с хаотичным расположением гетерохроматина. Увеличение Х7800.

Однако в группе крыс, получавших «Кудесан», процессы внутриклеточной регенерации, наиболее ярко проявившиеся в развитии гипертрофии и гиперплазии митохондрий (рис. 25 а,с), а также интенсивность образования соединительной ткани и активная реакция со стороны микрососудов (расширение их просветов, увеличение размеров эндотелиоцитов и их ядер) были более выраженными.

Результаты морфометрического, морфологического и аналитического исследований позволили получить комплексную характеристику постинфарктного миокарда крыс. Хроническая окклюзия коронарных артерий приводила к формированию очага некроза и развитию компенсаторной гипертрофии миокарда ЛЖ. В постинфарктном миокарде наблюдались деструктивные изменения (разрывы мышечных волокон, дезорганизация миофибрилл, деструкция митохондрий, утрата кардиомиоцитами поперечной исчерченности, разрушение сосудов) наряду с компенсаторно-приспособительными процессами: гипертрофией кардиомиоцитов, стромальных элементов, митохондрий, гиперплазией митохондрий, реакцией микрососудов, формированием рубцовой ткани (рис. 25).

Следствием перенесенного инфаркта было существенное снижение содержания антиоксидантов во внеинфарктном миокарде ЛЖ (Сорю - на 43%, СоР, — на 45%, сс-ТОС — на 35%, табл. 7). Оказалось, что постинфарктное истощение антиоксидантного резерва характерно лишь для гипертрофированного миокарда ЛЖ, тогда как в негипертрофированном ПЖ содержание СоС! не изменялось. Выявленный дефицит Сор и а-ТОС в постинфарктном миокарде обосновывал попытку их использования в качестве кардиопротекторов. Очевидно, что плазменные уровни убихинона сильно варьируют в зависимости от времени с момента его введения. В нашем исследовании образцы плазмы забирали во второй половине междозового интервала, когда концентрации убихинона были близки к минимальным, циркулирующим в крови наибольшую часть суток. Эти значения более чем в 2 раза, а содержание а-ТОС - на 13% превышали концентрации в миокарде нелеченых постинфарктных животных.

Наличие сильной обратной взаимосвязи плазменных концентраций коэнзимов 0 с размером зоны некроза свидетельствует о способности повышенных концентраций Со(Зю уменьшать степень ишемических повреждений миокарда. Длительное предварительное и продолжающееся после окклюзии введение БАД

«Кудесан» позволяло сохранить более высокие уровни Сор в постинфарктном миокарде при неизменном уровне а-ТОС (табл. 7) и обеспечивало ему повышенную устойчивость к последующему ишемическому окислительному стрессу: сокращение зоны некроза и снижение индекса массы постинфарктного ЛЖ.

Таблица 7

Содержание СоСЬ, СоОИ1 и а-ТОС в миокарде ЛЖ и плазме крыс различных экспериментальных групп (среднее значение±стандартное отклонение)'_

Содержание Ложно-оперированны е крысы Постинфарктные нелеченые крысы Постинфарктные крысы, получавшие «Кудесан»

В миокарде ЛЖ, мкг/г сырой ткани (я=7) («=12) («=10)

СоО, 129,5 + 23,8 71,6 ±27,4* 100,3 ±23,0**

Со0„, 7,26 ± 1,5 4,16 ± 1,65* 5,39 ± 1,41 **

а-ТОС 0,82 ±0,19 0,49 ± 0,37* 0,33 ±0,18*

В плазме, нг/мл (л=7) («=12) (п=7)

СоО, 291,4 ±63,7 246,0 ± 66,6 380,6 ± 149,9

СоС},,, 15,2 ±5,3 14,4 ±3,64 40,5 ±22,0**

а-ТОС (мкг/мл) 1,9 ±0,57 1,5 ±0,49 2,13 ±0,20*

1 - количественное определение проводили в цельных гомогенатах миокарда. Вероятность ошибки: * р<0,05 по отношению к ложно-оперированным; " р<0,05 по отношению к постинфарктным нелеченым.

Только у леченых животных обнаружена достоверная корреляция между размером зоны некроза и концентрациями Сор в плазме. Иными словами, чем выше содержание Со(3 в плазме, тем меньше размер некротического повреждения в миокарде. Так как именно повышенные концентрации Со<3 в плазме являются источником пополнения пула в миокарде за счет экзогенного убихинона, можно предположить, что более высокие концентрации в плазме обеспечивают и большее его поступление в миокард. Очевидно, что СоО представляют лишь одно звено в многокомпонентной системе, обеспечивающей компенсаторные процессы в постинфарктном миокарде. Расход СоО в условиях ишемического окислительного

стресса зависит и от состояния других элементов антиоксидантной защиты ткани. В результате концентрации СоС>, измеренные в конце эксперимента, не были строго пропорциональны степени повреждения миокарда.

Таким образом, повышенное содержание Со(} в плазме крови и миокарде как результат введения экзогенного убихинона в составе БАД «Кудссан» способно увеличить выживаемость клеток миокарда в условиях ишемии. У животных, получавших «Кудесан», происходило более раннее и интенсивное формирование рубцовой ткани; процессы внутриклеточной регенерации были более выраженными. В результате размер зоны некроза и, как следствие, индекс массы ЛЖ уменьшались.

•к -к -к

Итогом проведенных исследований является комплексная оценка БАД на основе коэнзима Он, по критериям качества и эффективности. Соответствие важнейшего показателя качества - количественного содержания активного компонента (СоС)|<>) требованиям нормативной документации позволило изучить и сравнить фармакокинетические характеристики нескольких БАД, содержащих модифицированные субстанции коэнзима От, и определить их относительную биодоступность. Доказана способность БАД «Кудесан» при длительном приеме внутрь увеличивать содержание коэнзима (^ю в сердечной мышце, тем самым повышая устойчивость миокарда к острым и хроническим ишемическим состояниям. Выявленная взаимосвязь тканевых уровней коэнзима Рю и степени патологических изменений миокарда (индекса массы желудочка сердца, размера зоны некроза) придает особое значение обнаруженному эффекту отмены: резкое снижение миокардиальных уровней Со(Зк> чревато снижением устойчивости к повышенным нагрузкам и эпизодам ишемии. При разработке безопасных, фармакокинетически обоснованных режимов дозирования целесообразно использование разработанной высокочувствительной и специфичной методики количественного определения убихннона в плазме крови и миокарде.

Комплексный анализ полученных результатов позволил охарактеризовать особенности окислительно-восстановительного статуса гипертрофированного миокарда. Повышенный уровень наиболее агрессивного из АФК - гидроксильного радикала и, одновременно, сниженное содержание коэнзимов С? представляются в

свете полученных данных звеньями одной цепи, ведущей к развитию и прогреесировашио процессов ремоделирования сердечной мышцы, и основанием для применения коэнзима С^о в терапевтических целях.

Прямая взаимосвязь индивидуальных эндогенных уровней коэнзимов 0 с и-ТОС, обнаруженная в плазме крови и миокарде, свидетельствует об их совместном функционировании как антиоксидантов. Введение экзогенного коэнзима Ою и сх-токоферола в составе БАД «Кудесан» повышало содержание спарринг-партнеров и приводило к временному нарушению равновесия между ними, на гармонизацию которого требовалось несколько недель. Этот факт может отчасти объяснить отсроченное проявление эффектов коэнзима (^ю при хроническом приеме. Впервые обнаруженный эффект отмены коэнзима С^о- снижение миокардиальных уровней ниже контрольных значений сопровождался снижением и уровней а-токоферола. Восстановление нормального содержания и соотношения обоих антиоксидантов в сердечной мышце протекало на протяжении месяца.

Однако, и у спонтанно гипертензивных, и у постинфарктных животных степень патологических изменений миокарда коррелировала с содержанием коэнзима О, но не а-токоферола. Этот факт подчеркивает уникальный терапевтический потенциал коэнзима (Зю, выполняющего двуединую функцию: обеспечения переноса электронов для достаточного синтеза макроэргических фосфатов и детоксикации избытка свободных радикалов. Уменьшение выраженности патологии миокарда в результате повышения тканевого содержания коэнзимов 0 доказывает наличие обратной связи и обосновывает использование коэнзима СЬо для кардиопротекции.

выводы

1. Разработана ВЭЖХ-методика разделения и высокочувствительного электрохимического определения коэнзимов Q,, Qu> и а-ТОС, применимая для анализа лекарственных форм, содержащих солюбилизированный и микрокапсулированный коэнзим Qi0, а также плазмы/сыворотки крови, миокарда и нервной ткани.

2. Доказаны преимущества по биодоступности наноразмерных субстанций (солюбилизированного и микрокапсулированного CoQl0) относительно порошка жирорастворимой субстанции. Изучена фармакокинетика CoQ to для порошка субстанции, раствора солюбилизированного CoQio и таблеток микрокапсулированного CoQio.

3. Изучено влияние длительного 6-неделыюго введения per os БАД «Кудесан» раствор, содержащего солюбилизированный CoQioH а-ТОС, на их уровни в плазме и миокарде крыс: показана возможность увеличения содержания CoQio и а-ТОС в сердечной мышце и сопряженное повышение уровней CoQ9.

4. Выявлен эффект отмены CoQm после длительного применения внутрь, проявившийся через 2 недели в снижении миокардиальных уровней коэнзимов Q и и а-токоферола ниже контрольных значений.

5. Разработана ВЭЖХ-методика определения уровня гидроксильных радикалов (ОН') в миокарде in vivo, базирующаяся на микродиализе миокарда раствором салицилата натрия и высокочувствительном электрохимическом детектировании в диализатах продуктов гидроксилирования салицилата. Представленная методика позволяет отслеживать уровень генерации ОН" на протяжении нескольких часов.

6. Выявлен повышенный уровень ОН' в гипертрофированном миокарде животных с наследственной артериальной гипертензией и в миокарде крыс при острой ишемии-реперфузии. При патологических состояниях миокарда интенсивность генерации ОН* в ткани была пропорциональна выраженности патологии: при гипертрофии миокарда - индексу массы, при ишемии-реперфузии - размеру некротического повреждения.

7. Выявлено истощение содержания антиоксидантов - коэнзимов Q и а-ТОС в постинфарктном гипертрофированном миокарде крыс. В миокарде крыс с

наследственной артериальной гипертензией выявлен дефицит коэнзимов уже в 6-неделыюм возрасте для обоих желудочков сердца спонтанно гипертензивных животных были характерны сниженные уровни Сор и повышенные уровни а-ТОС; дефицит Со(2т увеличивался с возрастом, а уровни а-ТОС снижались до возрастной нормы к 24-й неделе жизни.

8. Выраженность гипертрофии миокарда у молодых (6 месячных) спонтанпо-гипертензивных крыс - индекс массы левого желудочка положительно коррелировал с уровнями СоС> в плазме и отрицательно - с их содержанием в миокарде. Не выявлено взаимосвязи индекса массы гипертрофированного левого желудочка с плазменными или миокардиальными уровнями а-ТОС.

9. Установлен кардиопротекторный эффект БАД «Кудесан» у крыс с наследственной артериальной гипертензией. Хроническое введение приводило к повышению его содержания в сердечной мышце при сохранении обратной связи с индексом массы левого желудочка, что сопровождалось замедлением деструктивных и активизацией регенераторных процессов в гипертрофированном миокарде.

10. Установлен кардиопротекторный эффект БАД «Кудесан» при инфаркте миокарда. Хроническое предварительное и продолжающееся после инфаркта введение внутрь БАД «Кудесан» раствор повышало уровни коэнзимов 0 в сердечной мышце и одновременно ограничивало размер зоны некроза и постинфарктную гипертрофию миокарда. Наличие сильной обратной взаимосвязи плазменных концентраций коэнзимов р с величиной зоны некроза подтверждает причинную роль повышенных тканевых уровней Со(5 в ограничении ишемических повреждений миокарда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И., Мурашев А.Н., Медведев О.С. Уровни гндроксилыюго радикала, коэнзима Q и альфа-токоферола в гипертрофированном миокарде крыс SHRSP// Сборник статей международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем",-Минск, Беларусь, 21-23 июня 2006 г. - Минск, 2006. - С. 168-169.

2. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Ежедневный прием Кудесана повышает содержание коэнзима Q в миокарде и альфа-токоферола в головном мозге спонтанно-гипертензивных крыс// Тезисы докладов XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». -Москва, 18-22 апреля 2005. - М„ 2005. - С.654.

3. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Микродиализ миокарда ш vivo для оценки фонового уровня генерации свободных радикалов кислорода// Тезисы докладов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2003. - С.707-708.

4. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Мониторинг уровня гидроксильных радикалов in vivo в миокарде крысы// Фундаментальные проблемы фармакологии. Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов. - 2003. - С. 137.

5. Городецкая Е.А,. Каленикова Е.И., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Нарастающий с возрастом дефицит коэнзима Q в гипертрофированном миокарде гипертензивных крыс// Сборник трудов 4-й научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». - Смоленск, 26-30 сентября 2005 г. -Смоленск, 2005. -С.136-137.

6. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И. Образование гидроксильных радикалов в миокарде крысы после экспериментальной ишемии различной длительности// Бюл. зкеперимен. биологии и медицины. - 2001. - Т. 131, №6. - С.629-632.

7. Городецкая Е.А., Каленикова Е.И., Фоминых М.Ф., Пупкова Т.Н., Мурашев А.Н., Медведев О.С. Возрастные изменения в системе антиоксидантной защиты гипертрофированного миокарда крысы// Рос. физиол. жури. им. И.М.Сеченова. -2004. - Т.90, №8. - С. 428-429. - (Тезисы докладов съезда физиологов России, Екатеринбург).

8. Городецкая Е.А., Шашурин Д.А., Каленикова Е.И. Профилактический прием коэнзима Qio ограничивает постинфарктные зону некроза и гипертрофию миокарда у крыс// Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2004. - С.779-780.

9. Гудков JI.JL, Шумаев К.Б., Каленикова Е.И., Губкина С.А., Ванин А.Ф. Антиоксидантное и прооксндантное действие доноров оксида азота и метаболитов// Биофизика. - 2007. - Т.52, №3. - Р.503-509.

10. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Колокольчикова Е.Г., МурашевА.Н., Медведев О.С. Введение коэнзима Qu> защищает гипертрофированный миокард спонтанно гипертензивных крыс// 5-я национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота и здоровье человека». - Смоленск, 2007.- с.165-166.

11. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Колокольчикова Е. Г., Шашурин Д.А., Медведев О .С. Повышение тканевых уровней коэнзима Q ограничивает процессы постинфарктного ремоделирования миокарда// Тезисы докладов III Съезда биофизиков России. - Воронеж, 2004. - С.528-529.

12. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Колокольчикова Е.Г., Шашурин Д.А., Медведев О.С. Хроническое введение коэнзима Qm ограничивает постинфарктное ремоделирование миокарда у крыс// Биохимия. - 2007. - Т.72, №3. - С.407-415.

13. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Коновалова Г.Г., Медведев О.С., Рууге Э.К., Ланкин В.З. Влияние длительного введения и последующей отмены коэнзима Qio на его содержание в миокарде и сыворотке крови крыс// Фармация. - 2009. -№2. - С. 42-44.

14. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Маджумдер И.С., Сюткнн В.Е. Эффекты коэнзима Qm на окислительный стресс и состояние ангедонии у крыс, леченых пегилированным интерфероном-альфа// 5-я национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота и здоровье человека». - Смоленск, 2007. - С.105-106.

15. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Биодоступность коэнзима Qio в различных лекарственных формах// Химико-фармацевтический журнал. -2009. - Т.43, № 8. - С.41-44.

16. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Избыточная генерация активных форм кислорода и истощение антиоксидантного резерва в ишемизированном миокарде крыс// Кардиоваскуляриая терапия и профилактика — 2008. - Т.7, №6. - С. 160.

17. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Фармакокинетика коэнзима Qio.// Бюл. эксперимент, биологии и медицины. - 2008. - Т. 146, №9. -С.288-291.

18. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Фармакокинетика кознзима Q10// Кардиоваскуляриая терапия и профилактика. - 2008. - Т.7, №6. - С. 161.

19. Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Фармакокинетика кознзима Q10// Рос. мед. жур. - 2008. - Т. 16, №5. - С.338-340.

20. Каленнкова Е.А., Городецкая Е.А., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Гипертрофированный миокард менее устойчив к ишемии: роль свободных радикалов кислорода// Тезисы докладов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2003. - С.719.

21. Каленнкова Е.И., Городецкая Е.А., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Коэнзим Q в мозге спонтанно-гипертензивпых и нормотензивных крыс различного возраста// Сборник трудов 4-й научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». - Смоленск, 26-30 сентября 2005 г. - Смоленск, 2005. - С.274-275

22. Каленнкова Е.И., Городецкая Е.А., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Роль свободных радикалов кислорода в повышенной чувствительности гипертрофированного миокарда крысы к ишемии// Биохимия. - 2004. - Т.69, № 3. - С.386-392.

23. Каленнкова Е.И., Городецкая Е.А., Мурашев А.Н., Рууге Э.К., Медведев О.С. Усиленная продукция гидроксильных радикалов в гипертрофированном миокарде крысы: микродиализное исследование in vivo/I Биофизика. — 2003. - Т.48, №1. -С.97-103.

24. Каленнкова Е.И., Городецкая Е.А., Шашурин Д.А., Медведев О.С. Избыточная генерация активных форм кислорода и истощение антиоксидантного резерва в ишемизированном миокарде// Сборник статей международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистсм". Минск, Беларусь, 21-23 июня 2006 г. - Минск, 2006. - С. 194-196.

25. Каленнкова Е.И., Городецкая Е.А., Шашурин Д.А., Рууге Э.К. Убихинон и гипертрофия миокарда// Тезисы докладов Третьей всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии кровообращения. - Москва, 2004. -С.31.

26. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленнкова Е.И., Заббарова И.В., Каминный А.И., Тихазе А.К., Ланкин В.З., Рууге Э.К., Капелько В.И. Изменение антиоксидантного статуса миокарда под влиянием коэнзима Qi0 при окислительном стрессе// Биохимия. - 2005. - Т.70, вып. 1., №2. - С.97-104.

27. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленнкова Е.И., Заббарова И.В., Тихазе А.К., Цыплёнкова В.Г., Ланкин В.З. Защита коэнзимом Q миокарда крыс при окислительном стрессе, индуцируемом пероксидом водорода// Биохимия. - 2004. -Т.69, №5. - С.639-646.

28. Лакомкин В.Л., Коновалова Г.Г., Каленнкова Е.И., Заббарова И.В., Цыплёнкова В.Г., Тихазе А.К., Ланкин В.З., Рууге Э.К., Капелько В.И. Влияние убихинона на сократительную функцию и антиоксидантный статус миокарда при наследственной гипертонии у крыс// Кардиология. - 2006, №5. - С.54-62.

29. Лакомкин В.Л., Цыпленкова В.Г., Каленикова Е.И., Заббарова И. В., Коновалова Г.Г. Длительный прием убихинона защищает сердце от последствий окислительного стресса// Кардиоваскуляриая терапия и профилактика. - 2003. -Т.2, №3. - С.185. - (Материалы Российского национального конгресса кардиологов «От исследований к стандартам лечения». Москва, 7-10 октября 2003)

30. Поварова О.В., Гарибова Т.Л., Каленикова Е.И., Галаева И.П., Крайнева В.А., Медведев О.С., Воронина Т.А. Влияние фенил-Ьбутилнитрона (PBN), мексидола и иооглготила на зону ишемического поражения мозга и память крыс после окклюзии средней мозговой артерии// Экспериментальная и клиническая фармакология. -2004.-Т. 67, №1. - С.3-6.

31. Поварова О.В., Каленикова Е.И., Ганьшина Т.С., Мирзоян Р.С., Медведев О.С. Окислительный стресс и нейропротекция при ишемическом инсульте: эффект а-феншМ-бутил нитрона и комплекса пирролидона-2 с пироглютаминовой кислотой// Фундаментальные проблемы фармакологии. Сборник тезисов 2-го Съезда Российского Научного Общества фармакологов. - 2003. - С.88.

32. Поварова О.В., Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Антиоксиданты как нейропротекторы при ишемическом инсульте// Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2003. - Т.66, №3. - С.69-73.

33. Поварова О.В., Каленикова Е.И., Городецкая Е.А., Медведев О.С. Длительное профилактическое введение коэнзима Qui защищает головной мозг от ишемического повреждения// 5-я национальная научно практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота и здоровье человека». - Смоленск, 2007. - С.341-342.

34. Поварова О.В., Каленикова Е.И., Медведев О.С. Локальная ишемия головного мозга и коэнзим Q// Тезисы докладов XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2004. - С.822.

35. Чазов Е.И., Каленикова Е.И., Городецкая Е.А. Мониторинг гидроксильных радикалов in vivo в миокарде крысы при ишемии-реперфузии: эффект ишемического прекондиционирования// Доклады Академии наук. - 2001. - Т.380, №6. -С.840-843.

36. Gorodetskaya Е., Kalenikova Е., Kolokolchikova Е., Murashev A., Medvedev О. Protective effects of coenzyme Qm supplementation on hypertrophied myocardium of spontaneously hypertensive rats// Journal of Hypertension. - 2007. - V.25, Suppl.2. -S121. - (Seventeenth European Meeting on Hypertension, Milan, Italy, June 15-19,2007)

37. Gorodetskaya E., Kalenikova E., Medvedev O. Increase of coenzyme Qio level in rat myocardium after single administration of nanotechnologically prepared coenzyme Qii)// Journal of Hypertension. - 2009. - Suppl.4- SI39. - (Nineteenth European Meeting on Hypertension, Milan, Italy, June 12-16, 2009)

38. Gorodetskaya E.A., Kalenikova E.I., Murashev A.N., Medvedev O.S. Increased Hydroxyl Radical Generation and Deficit of Coenzyme Q in Myocardium of SHRSP// Physiological Research. - 2008. - V.57, N3. - P. 43P. - (Proceeding of the 13lh International SHR Symposium, June 20-22, 2008, Prague, Czech Republic)

39. Gorodetskaya E.A., Kalenikova E.I., Murashev A.N., Medvedev O.S. The deficit of coenzyme Q in hypertrophied myocardium of the rats with arterial hypertension// Journal of Hypertension. - 2005. - S355-S356. - (Fifteenth European Meeting on Hypertension, Milan, Italy, June 17-21,2005)

40. Gorodetskaya E.A., Kalenikova E.I., Murashev A.N., Ruuge E.K., Medvedev O.S. Increased level of oxygen free radicals in rat hypertrophied myocardium (in vivo study by microdialysis with salicylate)// Тезисы докладов международного симпозиума "Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive, and Therapeutic Values". -СПб., 2002.-С. 146.

41. Gorodetskaya E.A., Shashurin D.A., Kalenikova E.I. Decreased coenzyme Q content in postinfarct myocardium// International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health». - Smolensk, 2003. - P.58. - (Work collection)

42. Kalenikova E., Gorodetskaya E., Kolokolchikova E., Murashev A., Medvedev O. The improvement of postinfarct myocardium remodeling by coenzyme Qm supplementation// Journal of Hypertension - 2007. - V.25, Suppl.2. - S121-S122.

43. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Medvedev O.S. In vivo monitoring of oxygen free radicals level in rat myocardium: effect of ischemic preconditioning// Тезисы докладов междунар. симпозиума "Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive, and Therapeutic Values". - СПб., 2002. - С. 152.

44. Kalenikova E., Gorodetskaya E., Medvedev O. The pharmacokinetic of nanotechnologically prepared coenzyme Qio// Journal of Hypertension. - 2009. -Suppl.4. - S139. - (Nineteenth European Meeting on Hypertension, Milan, Italy, June 1216,2009)

45. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N., Medvedev O.S. Coenzyme Q and a-tocopherol in braine of spontaneously hypertensive stroke-prone rats during aging// Journal of Hypertension. - 2005. - S233-S234. - (Fifteenth European Meeting on Hypertension, Milan, Italy, June 17-21, 2005)

46. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N., Medvedev O.S. Depletion of Coenzyme Q Content in Myocardium of SHRSP During Aging// Physiological Research. - 2008. - V.57, №3. - P. 48P. - (Proceeding of the 13lh International SHR Symposium, June 20-22, 2008, Prague, Czech Republic)

47. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N., Ruuge E.K. Coenzyme Q and a-tocopherol in rat brain during aging and after long-term coenzyme Q and a-tocopherol containing nutrient supplementation// European Neuropsychopharmacology. - April

2005. - V.15. Suppl.2. - P.206. - (Abstracts of 8th ECNP Regional meeting. April 14-16, Moscow, Russia)

48. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N., Ruuge E.K. Elevated hydroxyl radical generation in hypertrophied myocardium of SHR-SP estimated in vivo by microdialysis with salicylate// American Journal of Hypertension. - 2002. - V.15, N4(Part2). - P.147A-148A.

49. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N., Ruuge E.K. Hypertrophied myocardium is more sensitive to oxidative stress// Abstract Book of Thirteen European Meeting on Hypertension. - Milan, 2003. - S.142.

50. Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N., Ruuge E.K., Medvedev O.S. Increased damage of hypertrophied myocardium induced by ischemia and reperfusion// International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health». - Smolensk, 2003. - Work collection, P. 60.

51. Lakomkin V.L., Zabbarova I.V., Kalenikova E.I., Tsyplenkova V.G., Ruuge E.K. Effects of coenzyme Q10 enriched diet on deterioration of contractility, mitochondrial function and structure of cardiac muscle caused by oxidative stress// International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health». -Smolensk, 2003. - Work collection, P.64.

52. Povarova O.V., Kalenikova E. I., Medvedev O.S. Acute focal cerebral ischemia and coenzyme Q// European Neuropsychopharmacology. - April 2005. - V.15, Suppl.2. -P.244. - (Abstracts of 8lh ECNP Regional meeting. April 14-16, Moscow, Russia)

53. Povarova O.V., Kalenikova E.I., Medvedev O.S. Acute focal cerebral ischemia: oxidative stress and neuroprotection (phenyl-tert-butyl-nitrone)// International conference «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health». - Smolensk, 2003. - Work collection, P.122-123.

54. Povarova O.V., Kalenikova E.I., Medvedev O.S. Coenzyme Q in rat brain after acute cerebral stroke// Restorative Neurology and Neuroscience. - 2002. - V.20, N6 - P.286. - (Abstracts of the 3rd Magdeburg Symposium Neuroprotection and Neurorepair)

55. Ruuge E.K., Gorodetskaya E.A., Kalenikova E.I., Medvedev O.S. Effect of ischemic preconditioning on oxygen radical production in myocardium: a microdialysis study with salicylate// European Heart J. - 2002. - V.4, Suppl. Aug. - P. 637.

56. Ruuge E.K., Kalenikova E.I., Gorodetskaya E.A., Murashev A.N. Increased production of reactive oxygen species in hypertrophied myocardium: in vivo study by microdialysis technique// European Heart J. - 2002. - V.4, Suppl. Aug. - P.671.

Типография МГУ 119991, ГСП-1, г. Москва, Ленинские Горы, д. 1, стр. 15 Заказ № 3624 Тираж 100 экз.

Актуальность темы

Согласно существующим международным требованиям, сформулированным в документах Международной федерации фармпроизводителей и ассоциаций (www.fip.org), любое оригинальное и воспроизведенное лекарственное средство должно соответствовать следующим критериям: эффективность, безопасность, качество. Это в равной степени следует отнести и к БАД, требования к которым в современных условиях постоянно возрастают.

Надлежащий уровень качества обеспечивается соответствующим нормативным документом, отражающим как общие подходы к контролю качества и стандартизации, так и показатели, которые определяются предполагаемым медицинским применением лекарственного средства или БАД.

Достижения молекулярной биологии и биохимии открывают новые возможности лечения заболеваний, в том числе сердечно-сосудистых, с учетом патофизиологических механизмов, протекающих на уровне клеточных и субклеточных структур. В основе ведущих метаболических процессов лежат окислительно-восстановительные реакции. Среди них особую роль играют свободнорадикальные реакции, ведущие к образованию перекисных соединений. Активация процессов свободнорадикального окисления вследствие дисбаланса в системе «прооксиданты-антиоксиданты» и последующие изменения в клетках, тканях и системах организма получили название окислительного стресса. Следствием окислительного стресса являются повреждения важнейших биополимеров - нуклеиновых кислот,, белков, липидов, полиненасыщенных жирных кислот. Усиление деструктивных процессов при окислительном стрессе может являться патогенетическим фактором заболевания, даже не будучи основной причиной его развития.

Однако сегодня нет единого мнения- о биологической' роли окислительных реакций с участием свободных радикалов кислорода. Большинство исследователей считают активные формы кислорода важными регуляторами клеточных процессов и ключевым элементом программ дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток. Развитие патологических процессов связано с изменением клеточных программ, следовательно, развитие многих заболеваний определяется балансом прооксидантов и антиоксидантов. Отношение к последним в современной научной литературе варьирует от полного игнорирования и даже отрицания до ожиданий излечения от всех болезней и продления жизни [9]. В таких случаях важнейшим критерием истины должна стать практика, но пока и она не дала однозначных ответов на многие вопросы.

Среди использующихся в медицинской практике наиболее перспективным антиоксидантом является убихинон (коэнзим СЫ, СоСЬо) - вещество эндогенной природы, обязательный компонент мембран митохондрий, лизосом, аппарата Гольджи, плазматических мембран. Коэнзим С>ю в митохондриях участвует в синтезе АТФ как переносчик электронов, сопрягающий процессы электронного транспорта и окислительного фосфорилирования. В то же время, убихинон -единственный липидорастворимый антиоксидант, синтезирующийся в клетках животных и человека. Еще одно уникальное свойство СоСЬо - постоянная регенерация его окисленной формы с помощью ферментных систем организма и антиоксидантов неферментной природы - аскорбата, а-токоферола (а-ТОС), возвращающая ему антиоксидантную активность.

По результатам многих клинических исследований СоС^ю рекомендован в качестве дополнительной терапии при хронической сердечной недостаточности, кардиомиопатии, стенокардии, гипертонии, инфаркте миокарда, атеросклерозе; имеются данные о его эффективности при мигрени, болезни Паркинсона, латеральном амиотрофическом склерозе, астме, диабете, почечной недостаточности. Наибольшее число клинических исследований Со(Зю посвящено сердечной недостаточности, однако окончательный вывод о его эффективности при этом заболевании еще не сделан. Большинство, но не все полученные результаты свидетельствуют об эффективности добавления СоСНо к стандартной терапии. Объектом критики является небольшое число пациентов, включенных во все (кроме одного) клинические испытания. Как правило, при их проведении не контролировались уровни Сорю в крови до и после его приема. Актуально проведение дальнейших исследований, направленных, с одной стороны, на выявление препаратов, обладающих максимальной биодоступностью и способных пополнить эндогенные уровни в крови и сердечной мышце, а с другой - на более глубокое понимание патогенетических механизмов (на уровне ткани и клетки) как потенциальных объектов фармакологического воздействия Сорю

В Японии, где было осуществлено первое клиническое применение СоСЬо, он вошел в национальную Фармакопею. На мировом фармацевтическом рынке СоС>1о повсеместно доступен в виде биологически активных добавок к пище, и лишь в нескольких странах - как активное вещество в составе лекарственных препаратов. Российский современный фармацевтический рынок изобилует предложениями СоС^ю-содержащих БАД зарубежного и отечественного производства. Широкая и навязчивая реклама БАД к пище, проводимая средствами массовой информации, приводит к росту их неконтролируемого потребления. Эта ситуация обязывает повышать уровень требований к безопасности и качеству биологически активных добавок, которые на сегодняшний день регламентируются техническими условиями в соответствии с требованиям «Руководства по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (Руководство Р 4.1.1672-03). Данный документ устанавливает «методы контроля ингредиентного состава и показателей качества и безопасности, которые применяются на этапах экспертизы и регистрации БАД, при разработке и производстве БАД, их ввозе, хранении, транспортировке и реализации на территории Российской Федерации, при разработке нормативной и технической документации, регламентирующей вопросы обращения БАД».

На основании требований Руководства количественный анализ СоСЬо в БАД осуществляется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектированием по поглощению в ультрафиолетовой области спектра. Недостаточная чувствительность определения и условия- пробоподготовки ограничивают применение этой методики образцами с высоким содержанием СоСЬо, то есть лекарственными препаратами и БАД. Безопасность БАД на, основе СоСЬо контролируется по критериям, предъявлямым к продуктам питания: содержанию токсичных элементов (тяжелых металлов), пестицидов, и радионуклидов. Между тем, содержащиеся в БАД активные компоненты могут вызывать терапевтические эффекты и иметь побочные; вещества эндогенной природы при длительном приеме могут оказывать влияние на уровень их синтеза в тканях организма, приводя к формированию небезопасного эффекта отмены. Кроме того, Руководство не предусматривает стандартизации БАД и не требует подтверждения их фармакологической эффективности, что имеет первостепенное значение в случае медицинского применения.

Целью данного исследования явилась комплексная оценка качества и эффективности БАД, содержащих CoQio, для обоснования их применения в качестве кардиопротекторов.

Достижение поставленной цели осуществлялось последовательным решением следующих задач:

1. Разработать ВЭЖХ-методики определения CoQio в препаратах БАД «Кудесан» (растворе и таблетках) для оценки их качества и стандартизации.

2. Разработать ВЭЖХ-методики определения коэнзимов Q9, Qio и а-ТОС в тканях крыс (плазме/сыворотке крови, миокарде, головном мозге) для изучения тканевого содержания коэнзимов Q и а-ТОС, a также фармакокинетики БАД при однократном и хроническом введении.

3. Провести сравнительное изучение фармакокинетики OoQio у крыс после однократного введения внутрь порошка субстанции и различных БАД серии «Кудесан» (раствора и таблеток).

4. Изучить влияние БАД «Кудесан» при хроническом введении и после его отмены на содержание коэнзимов Q и а-ТОС в плазме крови и миокарде крыс.

5. Разработать методику определения уровня гидроксильных радикалов в ткани миокарда ш vivo с помощью ВЭЖХ с электрохимическим детектированием и микродиализа миокарда для оценки интенсивности окислительных процессов.

6. Определить уровень гидроксильных радикалов в гипертрофированном миокарде, крыс с наследственной5 артериальной гипертензией ис сердечной? мышце нормотензивных крыс в условиях острой транзиторной ишемии для выяснения обоснованности патогенетической антиоксидантной терапии;

7. Оценить уровни коэнзимов; Q и а-ТОС в плазме и гипертрофированном миокарде крыс различных возрастов с наследственной артериальной гипертензией и в постинфарктном ремоделированном миокарде нормотензивных крыс для патогенетического обоснования применения CoQio в качестве кардиопротектора. 8. Оценить кардиопротекгорные эффекты CoQio у крыс с наследственной артериальной гипертензией и у крыс Wistar с инфарктом миокарда.

Научная новизна

Разработаны методики определения CoQio в БАД (растворе солюбилизированной субстанции CoQio, таблетках микрокапсулированного CoQio), плазме крови, нервной ткани и миокарде, позволяющие одновременно проводить определение C0Q9 и а-ТОС, с применением ВЭЖХ с электрохимическим детектированием.

Изучена фармакокинетика CoQio в порошке субстанции, растворе солюбилизированной субстанции и таблетках микрокапсулированной субстанции. Доказаны фармакокинетические преимущества наноразмерных субстаций CoQi0. Для раствора солюбилизированного CoQio выявлена способность при хроническом введении внутрь повышать уровни в миокарде.

Обнаружен эффект отмены CoQ]0: падение его концентраций в миокарде через 2 недели после прекращения длительного введения per os.

Впервые проведена сравнительная оценка содержания коэнзимов Q9, Qw и а-ТОС в плазме крови, гипертрофированном миокарде и головном мозге крыс с наследственной артериальной гипертензией линий SHR и SHRSP различного возраста по сравнению с тканями нормотензивных животных. Выявлена взаимосвязь плазменных и миокардиальных уровней CoQio со степенью гипертрофии левого желудочка.

Впервые выявлено снижение содержания коэнзимов Q9, Qi0 и а-ТОС в гипертрофированном постинфарктном миокарде после хронической окклюзии коронарной артерии. Обнаружена сильная отрицательная корреляционная зависимость между размером инфаркта и концентрациями коэнзимов Q в плазме крови.

Разработана ВЭЖХ-методика определения гидроксильных радикалов в ткани миокарда in vivo, обладающая наибольшей чувствительностью из приведенных в литературе аналогов. Впервые выявлены повышенные уровни гидроксильного радикала в гипертрофированном миокарде крыс линии SHRSP по сравнению с нормальным миокардом и установлена их прямая взаимосвязь со степенью гипертрофии сердечной мышцы. Доказано усиление генерации гидроксильных радикалов во время эпизодов реперфузии ишемического прекондиционирования миокарда. Показано, что ишемическое прекондиционирование сокращает продолжительность реперфузионного выброса гидроксильных радикалов в миокарде крысы после 30-минутной региональной ишемии, что может являться одной из причин многократного сокращения размера зоны повреждения.

Показан кардиопротекторный эффект CoQio при длительном введении внутрь на различных экспериментальных моделях гипертрофии миокарда: спонтанно гипертензивных крысах и крысах с хронической окклюзией коронарной артерии. Обнаружено, что выраженность эффекта взаимосвязана с концентрациями CoQio в плазме крови и миокарде.

Теоретическая и практическая значимость

Методики определения CoQio на основе ВЭЖХ могут использоваться для его количественного определения в различных композициях, применяемых в качестве БАД и лекарственных препаратов. Высокая чувствительность разработанной методики определения CoQio в биологических объектах позволяет применять ее для изучения фармакокинетики при проведении доклинических и клинических испытаний.

Методика определения уровня гидроксильных радикалов в ткани in vivo на основе микродиализа миокарда и ВЭЖХ предоставляет возможность экспериментальной прижизненной оценки окислительного статуса тканей. Возможность мониторинга тканевых уровней гидроксильного радикала позволяет в фармакологическом эксперименте оценивать on-line эффективность мер, направленных на ограничение генерации активных форм кислорода.

Доказана патогенетическая значимость усиленной генерации активных форм кислорода и сниженных миокардиальных уровней CoQio при сердечно-сосудистых заболеваниях, сопровождающихся гипертрофией сердечной мышцы. Выявленный дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными факторами существенно дополняет представление о патогенетической роли окислительного стресса при сердечно-сосудистых заболеваниях.

На различных моделях гипертрофии миокарда доказана кардиопротекторная эффективность СоРю. Полученные результаты являются теоретическим основанием для проведения клинического изучения Сорю и решения вопроса о создании лекарственных средств на его основе.

Впервые выявленный для СоРю эффект отмены требует пересмотра отношения к нему как абсолютно безопасному фармакологическому агенту. Возможность резкого снижения содержания СоРю в миокарде ниже нормальных значений после прекращения его приема обязывает с крайней осторожностью применять высокие дозы СоРю и диктует необходимость разработки фармакокинетически обоснованных безопасных режимов дозирования.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Обоснование применения Сорю для кардиопротекции по результатам изучения прооксидантных и антиоксидантных характеристик гипертрофированного миокарда.

2. Оценка качества Б АД по содержанию Сорю методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием.

3. Результаты изучения фармакокинетики Сор10 в составе различных БАД серии «Кудесан»: «Кудесан» раствор, таблетках «Кудесан форте», жевательных таблетках «Кудесан для детей» для разработки эффективных и безопасных режимов дозирования.

4. Оценка эффективности СоРю как кардиопротектора при гипертрофии миокарда различного генеза.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

История открытия и изучения

Коэнзим Q был выделен из печени крысы в 1955 г. в Англии группой ученых под руководством Ричарда А. Мортона и охарактеризован в дальнейшем как бензохинон, соединенный с ненасыщенной изопреноидной боковой цепью, присутствующий во всех живых клетках: «ubiquitous quinone» - «вездесущий хинон» [51]. Два года спустя, в 1957 г., в США Фредерик Крейн с сотрудниками выделили из бычьего сердца и идентифицировали новое вещество - компонент дыхательной цепи митохондрий, - хинон, функционирующий как кофермент для переноса электронов с комплексов I и II на комплекс III [34]. В 1958 г. профессор Карл Фолкерс с сотрудниками фирмы Merck, Inc. определили точную химическую структуру убихинона и впервые синтезировали его. Митохондриальный «Coenzyme quinone» Крейна (сокращенно коэнзим Q, CoQ) оказался идентичным выделенному ранее Мортоном убихинону - производному 2,3-диметокси-5-метил-1,4-бензохинона (рис. 1). А О Б О

Рис. 1. Структурная формула убихинонов 6-10 (А) и коэнзима СЫ (Б).

В середине 1960-х годов в Японии Юичи Ямамура впервые применил гомолог убихинона СоСЬ в лечении заболевания человека - застойной сердечной недостаточности. В 1966-м Меллорс и Таппель доказали антиоксидантные свойства восстановленной формы СоС2б [112]. В 1972 г. Паоло Литгарру совместно с Карлом Фолкерсом выявили дефицит СоС2юУ пациентов с заболеваниями сердца [103,104]. В середине 1970-х годов в Японии была разработана технология промышленного производства СоС^о (2,3-диметокси-5-метил-6-декапренил-1,4-бензохинона) в количествах, достаточных для проведения широкомасштабных клинических испытаний.

В 1978 г. Питер Митчелл стал лауреатом Нобелевской премии за вклад в расшифровку биологических процессов превращения энергии, в том числе роли коэнзима С2ю как переносчика электронов [119].

С начала 1980-х годов, благодаря доступности чистой субстанции СоС)10, производимой фармацевтической промышленностью Японии, и возможности прямого определения Сор в крови и тканях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, значительно возросли количество и масштаб проводимых клинических испытаний СоСЬо.

Биосинтез коэнзимов

Биосинтез коэнзима С>10 происходит по так называемому мевалонатному пути: последовательности реакций, ведущих от ацетил-СоА к образованию фарнезилпирофосфата (фарнезил-РР, РРР) - субстрата для последующего синтеза холестерина, Сор, долихола, долицила и пренилирования белков (рис. 2) [59]. Конверсия ацетил-СоА до БРР - общий отрезок пути синтеза для всех конечных продуктов. При этом липиды мевалонатного пути синтезируются с высоко дифференцированными скоростями и в регламентированных количествах благодаря наличию регуляции конечных этапов, предположительно, через регуляцию РРР-утилизирующих ферментов [185].

В отличие от других изопреноидных липидов молекула убихинона содержит бензольное кольцо, происходящее из тирозина. После присоединения изопреноидной боковой цепи ароматическое кольцо модифицируется в ходе нескольких ферментативных реакций: декарбоксилирования, гидроксилирования, метилирования. Большинство этапов биосинтеза были выяснены в результате исследований, выполненных на дрожжах и бактериях, и остаются мало изученными у млекопитающих.

Так, в клетках млекопитающих транспренилтрансфераза использует в качестве субстрата не БРР, а геранил-РР [173]. У человека СоСЬо является доминирующим убихиноном, составляющим в различных тканях от 93 до 98% общего содержания СоС>; 2-7% приходится на СоС)9. У крыс и других видов грызунов преобладает СоСЬ, а Сорю присутствует в количестве 10-30% общего пула (табл. 2). Механизмы реакций, ведущих к образованию двух разных гомологичных продуктов, не выяснены.

Acetyl-CoA i

HMG-CoA I

Mevalonate I

Isopentenyl-PP Geranyl-PP I „• Famesyl-PP tram-Prenyltransferase 40H-benzoate T Squalene transferase лг у synthase

Decapi enyl-40H-benzoate Squalene

I I

Cholesterol

Tyrosine

4-OH-Benzoate Decaprenyl~PP<«

-HMG-CoA reductase

Protein prenylauon Geranylgeranyl-PP cis-Prenyltransferase

Coenzyme Q

Polyprenyl-PP ж" \

Dolichol Dolichyl-P

Рис. 2. Схема биосинтеза СоС>, холестерина и других липидов мевалонатного пути (по [39] с уточнениями [185]). Пояснения в тексте.

В начале мевалонатного пути три молекулы ацетил-СоА объединяются в 3-гидрокси-3-метил-глутарил СоА (ШуЮ-Со А), который в дальнейшем конвертируется в мевалонат с участием НМО-СоА редуктазы - главного регуляторного фермента биосинтеза холестерина [25]. Эффективные конкурентные ингибиторы этого фермента являются наиболее часто используемыми гиполипидемическими средствами - статинами [106].

Биохимические функции коэнзимов Q

Убихинон выполняет в клетках организма множество различных функций, основывающихся на его окислительно-восстановительных свойствах и растворимости в липидах. В качестве основных по мнению авторов [185] можно выделить следующие:

1. участие в качестве переносчика электронов в дыхательной цепи митохондрий;

2. участие в транспорте электронов в плазматической мембране и лизосомах (восстановление хинон редуктазой и окисление NADH оксидазой) [165];

3. антиоксидантная функция (подробнее в Экспериментальной части, Гл. 1, п. 1.2);

4. регуляция проницаемости митохондриальных пор;

5. участие в трансмембранном переносе протонов [44];

6. регуляция физико-химических свойств мембраны;

7. модуляция количества р2-интегринов (молекул адгезии) на поверхности моноцитов крови.

Физико-химические свойства коэнзимов Q

Убихиноны, в зависимости от количества изопреноидных звеньев в боковой цепи, обозначаются как убихинон-1 .10. Все изопреновые звенья в молекуле находятся в транс-положении [2]. Такая структура обеспечивает убихинону высокое сродство к клеточным мембранам. Низшие гомологи Q1-Q5 представляют собой жидкости, высшие - кристаллические вещества желтого или ярко-оранжевого цвета. Все убихиноны нерастворимы в воде, но растворяются в большинстве органических растворителей; наилучшая растворимость наблюдается в гексане, этаноле, пропаноле-1 и пропаноле-2 [190].

CoQio - кристаллический порошок от желтого до ярко-оранжевого цвета, без вкуса и запаха. Растворим в диэтиловом эфире, слабо растворим в 96% этиловом спирте и практически нерастворим в воде. Постепенно разлагается на свету; температура плавления около 48°С.

Все убихиноны имеют специфический спектр поглощения в ультрафиолетовой области с характерным максимумом при 275 нм. Инфракрасные спектры для всех соединений этого ряда содержат практически одинаковые полосы, свойственные их общему ядру.

Убихиноны бактерий содержат от шести до десяти изопреноидных звеньев, высших растений - девять, клетки млекопитающих - девять и десять изопреновых фрагментов. CoQio подобно другим гомологам существует в окисленной (убихинон) и восстановленной (убихинол, CoQH2) формах (рис. 3).

При обработке восстановителями CoQ]0 легко переходит в хинольную форму. Восстановленная форма неустойчива, и при воздействии таких окислителей, как кислород, 1,4-бензохинон, хлорид железа (III) и хлорид меди (II) превращается обратно в убихинон [66].

2Н+, 2с нзс~° щс-о chjj

Убихинон CoQ (окисленная форма)

ОН СН3

Убихинол CoQH2 (восстановленная форма)

Рис. 3. Окисленная и восстановленная формы коэнзима Q.

Обе формы - убихинон и убихинол свободно перемещаются в липидной фазе мембран митохондрий, перенося электроны с НАДН-дегидрогеназы на цитохром Ь5. Донорами электронов для убихинона служат, наряду с НАДН-дегидрогеназой, другие флавиновые дегидрогеназы и супероксидный анион-радикал. В недавно открытой окислительно-восстановительной цепи в лизосомах переносчиком электронов служит полувосстановленная форма коэнзима 0 -убисемихинон [8].

Методы определения коэнзимов Q

Для определения коэнзимов Q применяют три основные группы методов: электрохимические, спектрофотометрические и хроматографические. Наибольшее распространение получил метод ВЭЖХ в сочетании с различными вариантами детектирования.

Электрохимические методы

Наличие электрофорных групп в составе убихинона и его производных позволяет использовать для их определения электрохимические методы.

В работе [197] описан полярографический способ определения CoQio- В основе данного метода лежит образование убихиноном комплекса включения с |3-циклодекстрином в присутствии йодид-иона в 0,1 М ацетатном буфере с рН 4,7, Предел обнаружения составил 0,01 мкмоль/л. Предложенный метод позволяет определять CoQio в фармпрепаратах и биологически активных добавках.

При необходимости анализа электрохимическими методами биологических объектов мешающее влияние матрицы оказывается слишком велико. Для предварительного выделения анализируемых субстанций требуется сложная и длительная пробоподготовка, в ходе которой с большой долей вероятности может произойти изменение состава образца, в частности, изменение соотношения убихинон-убихинол в полученной пробе по сравнению с состоянием in vivo. Для предотвращения окисления убихинола возможно добавление в пробу антиоксидантов, однако доказательств эффективности их действия в литературе не обнаружено.

Спектрофотометрические методы

К преимуществам данной группы методов следует отнести доступность, быстроту проведения и низкую стоимость анализа. Высокие коэффициенты молярного поглощения рассматриваемых соединений (e275=14440 и 14020 моль"1 см" 1 для C0Q9 и C0Q10 соответственно [4] позволяют проводить прямое спектрофотометрическое определение с чувствительностью, достаточной для анализа многих биологических объектов (на уровне 100 мкг/л).

Ряд работ [83,84] посвящен анализу фармпрепаратов, в состав которых входят ретинол ацетат, токоферол ацетат и СоСЬо методом дифференциальной спектрофотометрии. Методика не требует проведения предварительных операций, таких как разделение или маскирование и может быть использована при серийном анализе. Поскольку спектры рассматриваемых соединений достаточно близки, для определения использовали спектры второго порядка. Для СоС^ю максимум в соответствующем спектре приходится на 222 нм. Закон Бугера-Ламберта-Бера выполняется в диапазоне 5-30 мкг/мл. Предел обнаружения составил 1,1 мкг/мл. Недостатком является узкий круг объектов, к которым применима данная методика: определение коэнзимов возможно только в препаратах, содержащих бинарные смеси активных компонентов СоСЫ - токоферол ацетат или СоСЬо -ретинол ацетат. Несмотря на это, сочетание описанного метода с жидкостной или твердофазной экстракцией позволяет выполнять определение Со<310 в плазме крови [82].

Метод колориметрического определения СоС>ю в крови и моче человека был разработан в 1973 г. [4]. Предварительно проводили реакцию нуклеофильного замещения метоксигрупп цианэтилацетатом. При этом образуется соединение, обладающее интенсивной голубой окраской. Этот же подход был использован для анализа тканей морских беспозвоночных [47]. Однако при анализе образцов с высоким содержанием жира наблюдалось значительное занижение результатов.

Для устранения матричных эффектов Хагерман предложил использовать для селективного связывания и последующего выделения убихинона искусственно синтезированный пептид, состоящий из 14 аминокислот [63]. Коэнзим С) выделяли из раствора вместе с иммобилизованным на твердом носителе пептидом и проводили количественное определение спектрофотометрически.

Главным недостатком данной группы методов является недостаточно высокая чувствительность и низкая селективность. Устранение влияния матричных компонентов на стадии пробоподготовки усложняет процедуру и может приводить к ряду негативных последствий, описанных выше.

Хроматографические методы со спектрофотометрическим и электрохимическим детектированием

Неполярная природа убихинона и его гомологов обусловливает использование обращенно-фазового варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии [140]. В работе [14] показано, что данный метод существенно превосходит нормально-фазовый вариант по воспроизводимости и позволяет добиться большей селективности при совместном определении СоСЬо и его аналогов. Судя по литературным данным, наиболее часто применяют спектрофотометрическое и электрохимическое детектирование.

В работе [81] описан метод совместного определения ретинола, а-ТОС и коэнзима СоСЬо в плазме крови. Разделение проводили на колонке ЫСЬтоэрИег 100 ШМ8 (4x125 мм, размер зерна 5 мкм), используя в качестве подвижной фазы смесь метанола с гексаном в объемном соотношении 72:28. Детектирование осуществляли при длине волны 276 нм. Предел обнаружения убихинона составил 0,83 мкмоль/л.

В работе [43] предложен метод определения коэнзима СЫ в мышечной ткани и плазме с использованием в качестве внутреннего стандарта ди-пропокси-СоСЬо. К гомогенизированному образцу или плазме добавляли 50 мкл внутреннего стандарта и проводили экстракцию с последующей сменой растворителя. Убихиноны детектировали при 275 нм. Градуировочный график был линеен в интервале 101000 нмоль/л, предел обнаружения 6 нмоль/л.

Авторы работы [142] для экстракции жирорастворимых изопреноидных соединений из тканей мозга и печени проводили сапонификацию 15 М КОН в метаноле. В качестве неподвижной фазы использовали колонку икгасагЬ 5 ОБ8-20 фирмы РЬепотепех. Разделение осуществлялось в градиентном режиме в смеси вода:метанол:изопропанол. Данная методика позволяет наряду с другими компонентами определять коэнзимы СЬ и Ою в интервале концентраций 1-60 мг/л.

Авторы работы [136] разработали методику определения убихинонов в биологических объектах, таких как плазма, моча и ткани органов. В качестве внутреннего стандарта использовали СоС^ц. Анализ проводили на колонке БтеРаск С18 (4,6x250 мм). В качестве подвижной фазы использовали смесь метанола с гексаном (3:1). Спектрофотометрическое детектирование осуществляли при длине волны 275 нм. Предел обнаружения составил 10 нг.

Простой и достаточно экспрессный метод определения общего содержания CoQ10 в плазме описан в работе [125]. К 200 мкл плазмы добавляли 50 мкл раствора 1,4-бензохинона (2 мг/мл) для перевода убихинолов в окисленную форму, проводили реакцию в течение 10 минут и осаждали белки 1 мл н-пропанола. После центрифугирования надосадочную жидкость отбирали и вводили в хроматограф. Разделение проводили на колонке Supelcosil LC 18. Для изучения стабильности полученного раствора образцы хранили в течение трех суток при 25, 4 и -22°С. Было показано, что при этом суммарное содержание коэнзима в пробе не меняется. В случае спектрофотометрического детектирования (275 нм) использовали подвижную фазу, состоящую из этанола и метанола (65:35). Для совместного определения окисленной и восстановленной формы использовали кулонометрический детектор. Убихинон переводили в восстановленную форму, прикладывая к ячейке потенциал -500 мВ и в дальнейшем проводили определение при 350 мВ. Для обеспечения достаточной электропроводности раствора в подвижную фазу вводили 50 мМ перхлората натрия. Предел обнаружения при использовании кулонометрического детектора составил 5 мкг/л.

Авторам работы [172] удалось осуществить разделение окисленной и восстановленной форм C0Q9 и C0Q10 на обращенно-фазовой колонке Microsorb-MV (4,6x150 мм, размер зерна 5 мкм). Подвижная фаза состояла из смеси безводного ацетата натрия (4,2 г), 15 мл уксусной кислоты, 15 мл изопропанола, 830 мл метанола и 140 мл гексана. Кулонометрическое детектирование осуществляли по следующей схеме: в предколоночной кондиционирующей ячейке проводилось окисление электроактивных компонентов элюента, затем, после разделения веществ на колонке, элюат поступал в дополнительную защитную ячейку с потенциалом электрода 0,7 В. После этого вещества попадали в аналитическую ячейку с двумя* последовательными электродами. Потенциалы электродов устанавливали равными -1 и 0,45 В'. При этом на первом электроде, происходил предварительный перевод коэнзимов в восстановленную форму, а на втором осуществляли непосредственно детектирование. Для определения общей концентрации коэнзимов потенциал электрода в предколоночной ячейке выставляли равным 0,7 В, при индивидуальном определении убихинонов и убихинолов потенциал электрода составил -0,075 В. Стандартные растворы C0Q9H2 и C0Q10H2 готовили восстановлением соответствующих убихинонов раствором боргидрида натрия. Предел обнаружения составил 15 мкг/л.

Было показано, что раствор убихинола в н-пропаноле стабилен при хранении в течение 4 часов, в то время как для образцов тканей за этот же срок происходит окисление до 50% содержащегося в них убихинола. По мнению авторов работы [172], использование для экстракции охлажденного спирта способствует замедлению окислительных процессов.

Работа [190] посвящена разработке методики автоматизированного определения C0Q10 и CoQi0H2 в плазме крови методом ВЭЖХ с электрохимическим детектированием. Пробоподготовка образца сводилась к депротеинизации плазмы этанолом. Каждую пробу анализировали два раза: до и после обработки раствором боргидрида натрия в метаноле. Разделение осуществляли на колонке Hypersil С18 (4^125 мм, размер зерна сорбента 5 мкм) в градиентном режиме смеси перхлората натрия в метаноле:этанола:третбутанола. Добавление в подвижную фазу хлорной кислоты способствовало поддержанию постоянного уровня фоновой электропроводности. Детектирование осуществляли на амперометрическом детекторе с хлоридсеребряным электродом сравнения. В качестве рабочего использовали стеклоуглеродный электрод (потенциал электрода 700 мВ). Область линейности градуировочного графика составила 0,1-3 мкмоль/л. Предел обнаружения 2 мкг/л.

В этом же исследовании авторы оценивали стабильность растворов коэнзимов Q. Было показано, что стандартный раствор убихинона с концентрацией 1 ммоль/л сохранен в течение месяца, но при понижении концентрации хотя бы до 100 мкмоль/л раствор хранится не более недели при -80°С. При -20°С раствор стандарта стабилен не более чем 24 часа.

В' работе [13] исследовали соотношение окисленной и восстановленной форм C0Q9 и CoQio в тканях органов крыс и человека. Анализ осуществляли на колонке Hypersil ODS с диаметром зерна 3 мкм. Использование программы градиентного элюирования в смеси вода:метанол:изопропанол:гексан позволило за 50 минут осуществить разделение убихинонов-6,9 и 10, и соответствующих убихинолов (рис. 4). По данным авторов, проведение однократной экстракции образца с использованием петролейного эфира в качестве экстрагента является наиболее эффективным с позиции определения in vivo соотношения окисленной и восстановленной форм коэнзимов. 3 i-i---Vis--ft-г*8--->'а----¿г---й—

Рис. 4. Хроматограмма смеси жирорастворимых компонентов, выделенных из сердца человека. Колонка Hypersil ODS. Спектрофотометрическое детектирование при длине волны 210 нм. Идентифицированные пики: 1-холестерол, 2-CoQ6H2, 3-CoQ9H2,4-CoQ10H2, 5-CoQ10[13].

Работа [126] посвящена определению жирорастворимых антиоксидантов в плазме крови: а-ТОС, у-ТОС, ß-каротина, ликопена, убихинола, убихинона. Анализ проводили на колонке Supelcosil LC-8-DB (4,6x150 мм, Змкм) с использованием в качестве подвижной фазы 20 мкМ перхлората лития в смеси метанол:вода (96:4). Детектирование осуществляли с помощью кулонометрического детектора с двухэлектродной ячейкой (потенциалы электродов 0,01 и 0,35 В). За 35 минут удалось разделить 7 компонентов (рис. 5).

Методику определения общего содержания CoQ]0 в микропробах плазмы методом жидкостной хроматографии с кулонометрическим детектированием предложили авторы работы [53]. Потенциалы электродов в электрохимической ячейке были равны -0,15 и 0,6 В. Предел обнаружения составил 60 фмоль.

Time (min)

Рис. 5. Хроматограмма экстракта плазмы крови. Колонка Supelcosil 4,6x150 мм. Подвижная фаза: 20 мкМ LiC104 в смеси метанол:вода (96:4). Кулонометрическое детектирование. Идентифицированные соединения: у-токоферол (у-ТС), а-токоферол (а-ТС), а-каротин (а-С), ß-каротин (ß-C), убихинол-10 (UB-oI) и убихинон-10 (UB-one) [126].

Работа [113] посвящена совместному определению окисленной и восстановленной форм CoQio в плазме крови. Детектирование осуществлялось при помощи кулонометрического детектора с двухэлектродной аналитической ячейкой при потенциалах электродов -150 и 600 мВ соответственно. Авторы работы высказали предположение, что ионы металлов, находящиеся в подвижной фазе, могут влиять на первоначальное соотношение восстановленной и окисленной форм, инициируя окисление убихинолов. Частично снизить содержание ионов металлов, по мнению авторов, можно, применяя в качестве фонового электролита формиат аммония.

Уровень коэнзимов Q в митохондриях крыс исследовали в работах [100, 116]. Экстракцию проводили из 20-200 мкл гомогенизированного образца, добавляя 10 мкл 10%-го водного раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и 750 мкл смеси гексан:этанол (5:2).

Органический слой упаривали в токе азота и перерастворяли в 100 мкл этанола. Подвижная фаза состояла из 0,7% NaC104 в смеси этанол:метанол:70%-я хлорная кислота (900:100:1). Детектирование осуществляли с помощью кулонометрического детектора при потенциалах электродов: в защитной ячейке 20 мВ, в кондиционирующей ячейке -550 мВ, аналитической 175 мВ. Данный метод позволяет определять суммарную концентрацию коэнзима в клетках на уровне до 5 пмоль.

CoQio в пищевых добавках определяли в работе [170] методом ВЭЖХ с кулонометрическим детектированием. Исходные образцы растворяли в н-пропаноле. Электроактивные составляющие матрицы окисляли в пред- и постколоночных ячейках, определение коэнзимов проводилось в двухэлектродной электрохимической ячейке. Область линейности составила 0,05-8 мкг/мл.; предел обнаружения - 5 нг/мл.

Сравнение возможностей электрохимического и спектрофотометрического детектирования при определении CoQio в плазме крови проводили в работе [58]. Для снижения мешающего влияния компонентов матрицы пробу подвергали очистке на силикагелевом картридже (Bond Elut Si). Полученный элюат пропускали через картридж Bond Elut Cl8, элюировали изопропиловым спиртом и анализировали на обращено-фазовой колонке Ultrasphere XL Cl8 (4,6x70 мм), используя в качестве элюента метанол :изопропанол (4:1) для спектрофотометрического детектирования или 50мМ ацетатный буфер:изопропанол:метанол (24:450:1435) для электрохимического. Пределы обнаружения составили 50 и 5 мкг/л для спектрофотометрического и электрохимического детекторов, соответственно.

Последовательное подключение электрохимического и спектрофотометрического детекторов в работе [95] позволило одновременно определить окисленную и восстановленную формы коэнзимов. Экстрагированные из образца ткани компоненты (а, у и Ö-TOC, CoQ9, СоС^Нг, CoQio, CoQi0H2) разделяли на обращено-фазовой колонке Ultrasphere ODS в- градиентном режиме (смесь этанол:изопропанол:20мМ LiC104 в этаноле). Детектирование осуществляли спекгрофотометрически (1=275 нм) для убихинонов и токоферолов и электрохимически для убихииолов при потенциале электрода 600 мВ. Предел обнаружения убихинона составил 1 пмоль.

В работе [109] анализировали возможность применения диодно-матричного и электрохимического детекторов при анализе пищевых продуктов на содержание CoQ9 и CoQio. Для исследования были взяты образцы говядины, сельди и ржаной муки. Элюент состоял из метанола, этанола, изопропанола и 1 М аммонийно-ацетатного буфера с pH 4,4 (53:24:21:2). Потенциалы электродов составляли -1000 и 500 мВ. В результате за 15 минут удалось добиться разделения убихинонов Q9 и Qio. В том случае, если полученные после экстракции образцы содержали коэнзимы исключительно в окисленной форме, наблюдалось хорошее соответствие между результатами, полученными на разных детекторах. Однако при наличии остаточных количеств убихинола полученные разными методами данные значительно отличались. В целом электрохимический детектор оказался намного чувствительнее (пределы обнаружения для CoQ9 и CoQio составили соответственно 0,4 и 0,6 нг/мкл при использовании диодно-матричного детектора; 0,02 и 0,03 нг/мкл с использованием'э'лектрохимического детектора).

Разделение гомологов убихинонов Q6 - Q10 в изократическом режиме осуществили на обращено-фазовой колонке Ultrasphere ODS (4,6x250 мм) в работе [140]. В качестве наиболее оптимальной подвижной фазы была выбрана смесь третбутил-метилового эфира с ацетонитрилом (29:71). Применение такого элюента позволяет достигнуть полного разделения всех 5 соединений за 3 минуты.

В подавляющем большинстве описанных ранее работ в качестве фонового электролита использовали перхлорат лития. Однако в работе [113] установлено, что его использование влечет за собой сокращение срока службы прибора в силу высокой коррозирующей способности перхлоратов. Поэтому в данной работе была рассмотрена возможность применения других фоновых электролитов. Известно, что в качестве индифферентных электролитов для спиртов наиболее часто применяют неорганические соли и оотования (NaCI04, LiGl, NH4G1 и КОН) [12]. Из органических веществ наиболее распространены тетраалкиламмониевые соли: хлорид, бромид, йодид, перхлорат и нитрат тетраметиламмония, перхлорат и тетрафенилборат тетраизоамиламмония и др. При использовании в качестве компонента подвижной фазы ацетонитрила рекомендуется применять 1ЛСЮ4,

NaC104, тетрафенилборат тетраэтиламмония, перхлорат тетрабутиламмония, а также минеральные кислоты. Оптимальным фоновым электролитом, по мнению авторов работы [113], является формиат аммония.

Высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическнм детектированием

В последнее время широкое развитие получил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Преимущества данного метода заключаются в чувствительности, сравнимой с электрохимическим детектором, а также в селективности и высочайшей достоверности при определении коэнзимов в объектах со сложным составом. Используя масс-спектрометрический детектор можно проводить одновременное определение окисленной и восстановленной форм на фоне мешающих компонентов матрицы, сведя при этом к минимуму процедуру пробоподготовки. В случае анализа различных форм убихинонов в биологических, объектах эти преимущества проявляются наиболее отчетливо.

В работе [174] для определения C0Q9 и C0Q10 в тканях органов использовали жидкостную хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием в режиме электрораспылителыюй ионизации. В работе использовали масс-спектрометр с тройным квадруполем. Таю как убихиноны являются малополярными соединениями, то использование электрораспылительной ионизации в классическом варианте не позволяет проводить определение с необходимой чувствительностью. Повышение чувствительности было достигнуто путем введения в подвижную фазу 1-алкиламинов. Хроматографическое разделение проводили на колонке YMC Pack Pro (2,0x75 мм) с использованием в качестве элюента смеси метанол:изопропанол:муравьиная кислота (45:55:0,5). Подобранный состав подвижной фазы оказался-оптимальным и позволил сократить время анализа до 6 минут. Детектирование-осуществляли в« режиме MS-MS по выделенным ионам-827 ->197, 895 ->197, 963 ->197 для C0Q9, G0Q10 и CoQn.

В* работе [56] исследовали состав ила методом ВЭЖХ-МС с химической ионизацией при атмосферном давлении в режиме регистрации отрицательных ионов. Для анализа использовали обращенно-фазовую колонку Zorbax

СЮ8(4.6х250 мм). Элюент состоял из метанола и изопроиилового эфира (83:17). Детектирование осуществляли на квадрупольном масс-спектрометре Мюготаэз, снабженном источником химической ионизации с г-спреем. Такая конфигурация позволяет вводить пробу в прибор без дополнительного деления потока, что приводит к росту чувствительности. В образце удалось идентифицировать 12 менахинонов (МКП, (п=6-10); МКПН2, (п=7-10); МКПН4, (п=8-9); МК8Н6) и убихиноны (Зб - СЬо (рис. 6). Режим регистрации отрицательных ионов (предел обнаружения составил 0,02 нг/мкл и 0,5 нг/мкл для убихинонов б и 10) оказался более выигрышным по чувствительности по сравнению с режимом регистрации положительных ионов (0,04 и 0,4 нг/мкл). При использовании диодно-матричного детектора были обнаружены только убихиноны С^-С^о и 9 менахинонов, что демонстрирует недостаточную чувствительность спектрофотометрического детектирования. Детектирование велось при 275 и 270 нм для определения убихинонов и менахинонов соответственно.

ПС 1001

JQ-S мк

UQ-7

TI Г"

МК-,9(Н2) W

UQ-9

МК-' мк-7(н2) МК-®(Н4}а UQ-I0 ^ fik.-s(h2

МК-8

МК-10

МК-9(И4) if Г мк-10(н2)

WV

Time (min)

5.00 10.00

20.00

40,00

50.00

МК-9 i ■' 40.00 50,00

60.00 70.00

Ддае(тт)

60.00

70.00

Рис. 6. Хроматограмма экстракта образца ила. Колонка Zorbax-ODS 250x4,6 мм. Элюент - метанол:изопропиловый эфир (83:17). Масс-спектрометрическое детектирование в режиме регистрации отрицательных ионов [55].

Количественное определение CoQio в продуктах питания методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием описано в работе [164]. Разделение осуществляли на колонке Luna С18 (4,6x150 мм, диаметр зерна сорбента 3 мкм) с использованием подвижной фазы состоящей из этанола, диоксана и уксусной кислоты. Время удерживания коэнзима составило в данных условиях 4,1±0,1 мин. Идентификацию и количественный анализ проводили с использованием источника химической ионизации в режиме регистрации положительных ионов. Предел обнаружения в этих условиях составил 0,1 мг/кг. Степень извлечения варьировалась от 75 до 90% и зависела главным образом от содержания жира в матрице образца.

Распределение и метаболизм убихинона в организме изучали в исследовании [19] после внутрибрюшинного введения крысам СоСЫ, меченого изотопом углерода С13. Коэнзимы экстрагировали из образца мышечной ткани в смесь хлороформа, метанола и воды (1:1:0,3) в течение 60 минут при 37°С. После экстракции соотношение компонентов растворителя доводили до 3:2:1 и центрифугировали смесь. Водно-метанольный слой, содержащий метаболиты, промывали смесью хлороформа и метанола (3:1). Экстракт упаривали, перерастворяли в смеси хлороформа и метанола и вводили в прибор. На основании полученных масс-спектров была предложена структура фосфорилированного метаболита СоС^ю (рис. 7).

Рис. 7. Предложенная структура основного метаболита CoQio [19].

Работа [55] посвящена идентификации изопреноидных хинонов в Escherichia coli методом ВЭЖХ-МС с химической ионизациией при атмосферном давлении в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов. В пробе были обнаружены коэнзимы Q6, Q7, Qg и CoQio. Предел обнаружения составил 5 и 40 мкг/г сухого образца для CoQ6 и CoQ10 соответственно.

ОН I

0=Р-0 I О

ОН

В работе [205] был разработан экспрессный метод определения CoQi0 в табачных листьях. Детектирование осуществляли на масс-спектрометре фирмы Finnigan с приставкой для электрораспылительной ионизации в режиме регистрации положительных ионов. Пробоподготовка включала в себя ультразвуковую экстракцию свежих листьев безводным этанолом в течение 15 минут и последующей экстракцией гексаном. Разделение осуществляли на колонке Symmetry Shield RP 18. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и изопропанола (8:7) с добавкой муравьиной кислоты (0,5%). Степень извлечения убихинона варьировала от 98,2 до 99,3%. Предел обнаружения составил 1,2 нг/мл.

Работа [66] посвящена определению CoQ]0 в плазме крови методами ВЭЖХ-МС и ВЭЖХ-ЭХ. В работе использовали масс-спектрометрический детектор, снабженный ионной ловушкой и двумя источниками ионизации: электроспреем и химической ионизации при атмосферном давлении. Авторы работы исследовали возможность применения двух вышеуказанных вариантов ионизации в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов. Наилучшие результаты были получены в режиме регистрации отрицательных ионов: в этом случае соотношение сигнал/шум было максимальным. В режиме химической ионизации при атмосферном давлении с регистрацией отрицательных ионов предел обнаружения составил 1 нг/мл.

Таким образом, по литературным данным, при ВЭЖХ-определении коэнзимов Q используются самые разнообразные детекторы, каждый из которых обладает своими достоинствами и недостатками. Краткое сравнение различных способов детектирования представлено в табл. 1.

Таблица 1. Сравнение различных вариантов детектирования коэнзимов Q.

Метод Объект Определяемые соединения Предел обнаружения Условия детектирования Источник

ВЭЖХ-СФ Биологические ткани Q6, Q6H2) Q9H2) 09,QioII2,Q.o • - 210 нм [13]

ВЭЖХ-СФ Пищевые продукты 09, Qio С>9-400мкг/л Qio-600 мкг/л 275нм [109]

ВЭЖХ-СФ Биологические ткани, плазма крови Qio 5 мкг/л 275 нм [43]

ВЭЖХ-СФ Продукты питания 010 0,2 мг/кг 275 нм [164]

ВЭЖХ-СФ Биологические ткани Qs, Q.o,Qu 10 нг/колонку 275 нм [136]

ВЭЖХ-СФ Плазма крови Qm 50 мкг/л 275 нм [58]

ВЭЖХ-СФ Биологические ткани Q9, Q9H2, Q10, О10Н2 - 275 нм [95]

Таблица 1. (продолжение)

ВЭЖХ-ЭХ Плазма крови Qio, Q10H2 2 мкг/л Амперометрическое. Потенциал электрода 700 мВ относительно хлорндсеребряного эл-да сравнения [190] вэжх-эх Плазма крови Q9, Q9H2, Q10, Q10H2 1 мкг/л Кулонометрическое. Потенциалы электродов: постколоночная ячейка: -600 мВ, аналитическая: -150 мВ, 600 мВ [113]

ВЭЖХ-ЭХ Пищевые продукты Q9, Q10 Q9 —20 мкг/л Qio-30 мкг/л Амперометрическое Потенциалы электродов: постколоночная ячейка: —1000 мВ; аналитическая 500мВ [109]

ВЭЖХ-ЭХ Митохондрии Q9, Qio 5 пмоль/кол онку Кулонометрическое. Потенциалы электродов защитная ячейка 200 мВ, постколоночная -550 мВ, аналитическая 175 мВ [100, 116]

ВЭЖХ-ЭХ Плазма крови Q10H2, Qio 5 мкг/л Кулонометрическое Потенциалы электродов: -500 мВ 350мВ [125]

ВЭЖХ-ЭХ Биологические ткани Q6, Q9H2, QioH2, Q9, Qio 15 мкг/л Кулонометрическое. Потенциалы электродов: предколоночные ячейки: -75 мВ, 700 мВ; аналитическая ячейка -1 в, 0,45 в [172]

ВЭЖХ-ЭХ Плазма крови Q9, Qio 5 мкг/л Амперометрическое. Потенциал электрода 600 мВ [58]

ВЭЖХ-ЭХ Биологические ткани Qg, Q9H2, Qio, Q.oH2 1 пмоль/ко лонку Амперометрическое. Потенциал электрода 600 мВ [95]

ВЭЖХ-ЭХ Плазма крови Q9, Qio 10 пг/колонк У Кулонометрическое. Потенциалы электродов: предколоночная ячейка: ОмВ, аналитическая: -1000 мВ, 300 мВ [66]

ВЭЖХ-МС Q9, Qio, Q10H2 1 мкг/л APCI (-); m/z: Q9 795—»780 Q10H2 863—>848 Qio 863—848 вэжх-мс Биологические ткани Q9, Qio, Qu 0,5 мкг/г ESI (+); m/z: Q9 827—>197 Qio 895—»197 Qu 963—>197 [174]

ВЭЖХ-МС Ил Qe, Qt, Qs, Q9, Qio Qe- 20м кг/л Qio-40 мкг/л APCI (-); m/z: Q6- 575,4 Q,o-847.8 [56]

Qe-500 мкг/л Qio-400 APCI (+); m/z: Q6-613,4 Qio-886 мкг/л вэжх-мс Продукты питания (Зю 0,1 мкг/г АРС1 (+); т/г 863,4 [164] вэжх-мс Клетки ЕсоИ СЬ, <37, (Зв, СЬо <Зб-5 мкг/г; <3.0-50 мкг/г АРС1 (-); т/г <Зб-590 <210-863 [55]

На основании вышеизложенных данных можно сделать вывод, что спектрофотометрические детекторы во многих случаях, особенно при анализе биологических объектов, не обладают достаточной чувствительностью и селективностью. Метод, сочетающий ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием, обладая чувствительностью электрохимического детектора и наибольшей селективностью, пока не получил широкого распространения из-за высокой стоимости оборудования и необходимости специализированной профессиональной подготовки персонала. В то же время, высокоэффективная жидкостная хроматография в последние десятилетия стала рутинным методом благодаря доступности хроматографического оборудования отечественного производства и простоте программного обеспечения. Использование электрохимического детектора обеспечивает наиболее высокую чувствительность и селективность определения, что является необходимым условием при анализе объектов с мультикомпонентной матрицей (лекарственных форм, биологических объектов) и позволяет одновременно оценивать в образце содержание окисленной и восстановленной форм коэнзимов <3 [174, 74, 69].

Способы пробоподготовки биологических объектов

Подготовка пробы является важнейшей и необходимой процедурой, предшествующей собственно количественному анализу и имеющая целью отделение определяемого вещества от сопутствующих мешающих компонентов матрицы. Полнота перехода определяемых веществ из образца в пробу обеспечивает правильность и воспроизводимость методики, существенно влияя и на чувствительность определения. На этой стадии возможно разведение или концентрация пробы.

Существует несколько основных подходов к выделению коэнзимов из биологических образцов. Самым распространенным способом является экстракция неполярным растворителем с дальнейшим упариванием и сменой растворителя.

При анализе плазмы крови в работах [168, 126] к образцу непосредственно добавляли смесь спирта с гексаном. Авторы работ [81, 43, 53, 58] предварительно осаждали белки спиртом с последующей экстракцией гексаном. Эту процедуру проводили несколько раз, объединенные гексановые экстракты упаривали и перерастворяли пробу в спирте или подвижной фазе.

При анализе биологических тканей экстракцию из гомогенизированного образца проводили смесью спирта с гексаном. Чтобы избежать окисления образца, в пробу вводили антиоксиданты (например, в работе [113] для этой цели использовали 2,6-ди-третбутил-п-крезол). Затем объединенные экстракты промывали водой, упаривали и перерастворяли в изопропиловом спирте [109]. В различных работах пробы гомогенизировали с 0,25 М раствором сахарозы [13], раствором додецилсульфата натрия [95], раствором NaCl [109] или дистиллированной водой [168].

Часто при пробоподготовке объектов со сложной матрицей, содержащей большое количество жиров, используют сапонификацию. Так, в работе [47] образцы тканей морских беспозвоночных сапонифицировали щелочью в метаноле в присутствии' пирогаллола как антиоксиданта, экстрагировали эфиром, полученный экстракт промывали водой и выпаривали на водяной бане. Сухой остаток растворяли в гексане и очищали на колонке с силикагелем, используя для элюирования раствор диэтилового эфира в гексане. Модификация данной методики предложена Okamoto Т., Fukui К. [136]. Перед очисткой на картридже все содержащиеся в образце коэнзимы переводили в окисленную форму гексацианоферратом(Ш) калия. После элюирования смесью бензол-ацетон элюат упаривали и сухой остаток растворяли в метаноле. В работе [56] для экстракции коэнзимов Q из ила использовали смесь хлороформа с метанолом в соотношении 2:1. Смесь упаривали на роторном испарителе, сухой остаток экстрагировали гексаном. Полученный экстракт очищали, используя» картриджи для твердофазной экстракции. Sep-Eak Plus на основе силикагеля. Для селективного элюирования менахинонов и убихинонов применяли 10%-й раствора диэтилового эфира в гексане. Элюат упаривали в токе азота и перерастворяли в 2 мл ацетона.

В упомянутых работах стадия очистки образца на силикагеле необходима для снижения мешающего влияния компонентов матрицы, которые переходят в экстракт, в первую очередь, жирных кислот [136]. В качестве альтернативы в работе [142] предлагается после упаривания экстракта перевести жирные кислоты в соответствующие метиловые эфиры, используя для данной цели диазометан.

В ряде описанных работ пробоподготовка сводилась к экстракции образца спиртом. Наиболее часто такой подход применяется при анализе плазмы крови [190, 66, 125]. В работе [172] для выделения коэнзимов из тканей замороженные образцы гомогенизировали с 2 мл холодного пропанола-1. К гомогенизированной смеси добавляли 100 мкл холодной воды, перемешивали и центрифугировали смесь. Надосадочную жидкость отбирали и вводили в прибор. Аналогичным образом, в работе [174] навеску образца гомогенизировали в воде и добавляли метанол, после чего смесь центрифугировали и надосадочную жидкость вводили в прибор. Экстракцию спиртом также применяли при определении коэнзимов в табачных листьях [205].

Для некоторых специфических объектов, таких, как бактериальные колонии Escherichia coli, пробоподготовка может сводиться к твердофазной экстракции на картриджах Sep-Pak Plus Silica. В качестве элюента использовали гексан [55].

Необходимо отметить, что в ряде случаев на стадии пробоподготовки осуществляли перевод всех коэнзимов в окисленную форму. Для этой цели применяли 1,4-бензохинон [66, 125], гексацианоферрат калия [136], или кислород воздуха [66]. Это упрощает анализ, однако данный подход не позволяет проводить одновременное определение окисленной и восстановленной форм коэнзимов. С этой позиции оптимальным вариантом пробоподготовки является экстракция спиртом, в ходе которой с наибольшей вероятностью сохраняется исходное соотношение форм. Тем не менее, в литературе нет сведений о преимуществах такой пробоподготовки по сравнению с другими ее вариантами.

Сердечно-сосудистые заболевания и CoQ10

Известно, что сердечная, мышца содержит CoQio в максимальных по сравнению с другими тканями количествах [13, 202, 185], что обусловлено высокими энергетическими требованиями к кардиомиоцитам. Наибольшее число экспериментальных и клинических исследований CoQio .до сегодняшнего дня посвящено заболеваниям сердца: сердечной недостаточности, гипертензии, инфаркту миокарда [1, 150].

Первое терапевтическое применение CoQio было осуществлено в Японии у пациентов с застойной сердечной недостаточностью. Обоснованием использования CoQio для лечения данного заболевания является дефицит CoQio в крови и тканях миокарда больных, прямо коррелирующий со степенью нарушения функции левого желудочка [123]. В недавнем исследовании [120] группой новозеландских ученых выявлена роль CoQio как независимого предиктора смертности у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (ХСН).

Длительный регулярный прием CoQio позволяет восполнить его дефицит в крови и тканях пациентов, приводя к значительному улучшению функциональных показателей миокарда, сокращению потребности в сопутствующем лечении сердечно-сосудистыми препаратами при полном отсутствии токсичности [104, 97, 123]. Улучшение функции миокарда становилось заметным через месяц после начала приема CoQio, через 6 месяцев достигало максимума и в дальнейшем оставалось стабильным на фоне приема кофермента. После прекращения приема через 1 месяц показатели сердечной функции начинали снижаться и возвращались к прежним значениям спустя 3-6 месяцев [96, 124].

Масштабное исследование [121], продолжавшееся 1 год, включало 641 пациента с застойной сердечной недостаточностью. Половина пациентов получали 2 мг/кг в день CoQi0 в дополнение к стандартной терапии, другая- половина -плацебо. Через год у всех пациентов, принимавших CoQio, значительно уменьшилась тяжесть симптомов и частота госпитализаций по причине сердечной недостаточности при отсутствии улучшений в группе плацебо.

В 173 медицинских центрах Италии в 1994 г. было проведено открытое постмаркетинговое исследование клинической эффективности и безопасности CoQio у больных ХСН II и III функциональных классов [16]. Из 2664 опрошенных больных, принимавших CoQio, у 78% снижался цианоз, у 78,6% уменьшались отеки, у 63% - реже ощущалась,аритмия-и у 73% - головокружение.- 54% больных отметили уменьшение выраженности' трех и более сиптомов, при этом только 0,75% пациентов жаловались на побочные явления, связанные с приемом CoQio.

Однако два хорошо организованных исследования, включающих суммарно 85 пациентов с застойной сердечной недостаточностью, не выявили каких-либо признаков улучшения их состояния [86, 191].

Мета-анализ, проведенный в 2003 г. [122], оценил результаты 13 двойных слепых рандомизированных исследований эффективности применения CoQ10 при ХСН, включавших в сумме 1000 леченых пациентов. Только в 3 исследованиях, представляющих 100 леченых больных, не было выявлено признаков улучшений состояния. В остальных и по сумме всех работ были получены достоверные свидетельства:

- улучшения функционального класса больных;

- повышения толерантности к физической нагрузке;

- снижения частоты госпитализации.

Сочетание таких биохимических функций убихинона как непосредственное участие в процессах синтеза энергии в качестве переносчика электронов и его потенциал эффективного антиоксиданта, регенерируемого in vivo, в совокупности с безопасностью приема в широком диапазоне доз представляет CoQio «идеальным терапевтическим агентом для лечения ишемического-реперфузионного повреждения миокарда» [194].

Действительно, экспериментальные [5, 110] и клинические исследования в области сердечно-сосудистой хирургии выявили эффективность предварительного приема CoQio (длительного перорального по 30-150 мг/день в течение 6-14 дней или внутривенного введения) перед операциями на сердце или сосудах. После замены сердечного клапана в периоде восстановления у пациентов, получавших кофермент, реже отмечался сниженный минутный сердечный выброс [169]. Внутривенное введение 5 мг/кг CoQio за два часа до аортокоронарного шунтирования [166] повышало ударный индекс левого желудочка в постоперационном периоде. Длительный прием CoQ]0 внутрь перед предстоящей операцией' шунтирования повышал постоперационный сердечный индекс и фракцию выброса левого желудочка, сокращал время восстановления пациентов [76], снижал количество аритмий и содержание TBARS в крови венечного синуса [28]. Прием по 150 мг CoQIO в день в течение недели перед операцией на брюшной аорте уменьшал количество признаков окислительных повреждений в крови пациентов [29]. В то же время, однократный прием внутрь даже большой дозы CoQio (600 мг) за 12 часов до коронарной реваскуляризации не вызвал ни одного заметного эффекта [167].

Двойное слепое рандомизированное контролируемое исследование [158] включало 144 больных после острого инфаркта миокарда, 73 из которых получали CoQio на фоне стандартной терапии. У этих пациентов в течение года наблюдения в два раза реже случались сердечно-сосудистые события (24% против 45%, р<0,02), нефатальные повторные инфаркты (13,7% против 25%, р<0,05) и сердечная смерть.

Одним из возможных путей реализации кардиопротекторного действия CoQio является предотвращение удлинения Q-T-интервала у больных с инфарктом миокарда, которое сопряжено с большей частотой их смерти. В исследовании [91] в течение 1 года наблюдали 61 больного с острым инфарктом миокарда. Пациенты через 6 часов от начала инфаркта получали либо плацебо, либо CoQio (100 мг/день) и селен (500 мг/день) на фоне одинаковой терапии. В контольной группе у 40% больных отмечали удлинение интервала Q-T, что не наблюдалось в группе пациентов, получавших антиоксиданты. За год наблюдения среди пациентов, принимавших антиоксиданты, умер лишь один (по причине некардиального характера); в контрольной группе больных смертность составила 20% (6 человек).

Способность CoQio снижать кровяное давление у пациентов с гипертонией была показана М. Nagano еще в 1976 году. В 2007 году группой Франка Розенфельда были опубликованы результаты мета-анализа всех клинических исследований применения CoQio при гипертонии. Анализировались результаты 12 клинических исследований, включавших 362 пациента. Вывод был однозначен: CoQio способен понижать систолическое давление пациентов с гипертонией в среднем на 17 мм рт ст и диастолическое - на 10 мм рт ст без значительных побочных эффектов [147]. На этом основании- авторы высказали предположение, что CoQio может служить» альтернативой лекарственным гипотензивным препаратам или быть использован для усиления их эффекта.

У больных сахарным диабетом 2 типа показана способность CoQio контролировать не только уровень артериального давления, но и уровень гликемии, снижая содержание гликозилированного гемоглобина [70].

Таким образом, большинство данных литературы свидетельствуют об эффективности применения CoQio при сердечной недостаточности, гипертонии, инфаркте миокарда. Тем не менее, считая доказательную базу неудовлетворительной American Heart Association пока воздерживается рекомендовать CoQio в качестве терапевтического агента для лечения хронической сердечной недостаточности, стенокардии, а также для постоянного приема [http://www. americanheart. org].

Фармакокинетика коэнзима Qio

Абсорбция и транспорт

Специфических мест абсорбции CoQio в желудочно-кишечном тракте человека не описано. На модели изолированного ЖКТ крысы показано, что наибольшей проницаемостью для CoQio обладает двенадцатиперстная кишка и далее, в порядке убывания, толстая кишка, подвздошная кишка, тощая кишка [138]. Как и в случае других липидов, абсорбция CoQ10 представляется комплексным процессом, включающим механизмы активного транспорта и пассивную диффузию [20]. Возможность всасывания в толстой и подвздошной кишке свидетельствует о существовании энтерогепатической рециркуляции CoQiq.

Механизмы абсорбции CoQio, по-видимому, те же, что и для другого жирорастворимого антиоксиданта - витамина Е (а-ТОН). В тонком кишечнике желчь и секрет поджелудочной железы обеспечивают эмульгирование и образование мицелл CoQ]0, необходимые для последующей абсорбции. Подобно другим липофильным веществам, в процессе абсорбции CoQio включается в хиломикроны и транспортируется-лимфатической системой в кровь. [85]. Сразу после всасывания CoQi0 обнаруживается^ в составе мезентериальных липопротеидов, богатых триацилглицеролом. В - периферической циркуляции эти частицы под действием липопротеин-липазы превращаются в хиломикроны и быстро захватываются печенью. В клетках печени CoQio «переупаковывается» в частицы лииопротеидов и вновь высвобождается в циркулирующую кровь, аналогично а-токоферолу [45, 183]. В плазме практически весь пул CoQio распределен в липопротеидах: наибольшие количества - в ЛПНП и ЛПОНП, и малая часть - в ЛВП [185]. Как следствие, плазменные уровни CoQ]0 находятся в зависимости от содержания в плазме липопротеидов [94]. В циркулирующей крови CoQio перераспределяется между липопротеидами для защиты их от окисления [177]. Доля восстановленной формы в общем пуле CoQ)0 в крови максимальна среди тканей организма и составляет около 95-97% общего содержания CoQ10 [13].

При приеме внутрь эффективность абсорбции CoQio низка вследствие его нерастворимости в воде, ограниченной растворимости в жирах и относительно большой молекулярной массы. Определение абсолютной биодоступности CoQio на сегодня невозможно из-за отсутствия форм для внутривенного введения. Поэтому большинство исследований фармакокинетики CoQl0 проведено при пероральном и внутримышечном введении. Попытка оценить долю CoQ10, абсорбируемого при приеме per os, была осуществлена в исследовании Y. Zhang на крысах: биодоступность, по расчетам авторов, составила 2-3% [201].

У человека после приема CoQio натощак per os его- плазменные уровни начинают медленно повышаться на протяжении первых 1-2 часов [117]. Время достижения максимальной концентрации в плазме (Ттах) наблюдается в интервале 6-8 часов [114]. Кинетика процесса абсорбции носит нелинейный характер, что часто связано с механизмами активного транспорта, и была описана у здоровых добровольцев как функция нулевого порядка [180]. Нелинейность кинетики всасывания CoQio подтверждается уменьшающимся приростом концентраций в плазме при увеличении дозы. В исследовании Shults [155] показано, что увеличение ежедневного потребления в четыре раза (с 300 до 1200 мг) повысило плазменные уровни лишь в 2,5 раза (с.1,4.до 3,4 мкг/мл). Механизмы всасывания CoQio достигают насыщения при дозах 2400 мг в день и дальнейшее увеличение дозы до 3000' мг в день не вызывает увеличения концентраций в плазме. Следовательно,- абсорбция CoQ10 ограничена, и процент абсорбции падает с увеличением-дозы.

Вследствие комплексности процесса, абсорбция CoQio может зависеть от целого ряда факторов. Так, высказывается мнение, что значительное влияние на степень всасывания CoQio может оказывать одновременный его прием с пищей [20, 21]. Однако в поддержку этого постулата имеется очень мало данных. Недостаточно изучено влияние возраста, пола, диеты, лекарственной формы и некоторых других факторов на биодоступность CoQio при хроническом приеме. Межиндивидуальная вариабельность степени абсорбции CoQio по площади под кривой концентрация-время достигает 30-50% [180; 32]. Эти факты определяют необходимость мониторинга плазменных уровней CoQio при клинических исследованиях, в особенности при изучении новых препаратов.

При приеме дозированных форм степень абсорбции зависит от физического состояния и природы субстанции CoQio в составе препарата. Как жирорастворимая субстанция, CoQio лучше всасывается растворенным в маслах, чем принятым в виде сухого порошка, таблеток или капсул [193, 159]. Деление суточной дозы на два или более приемов способствует достижению более высоких уровней в плазме [159].

В последние годы были созданы высокотехнологичные наноразмерные (nanoised) субстанции CoQio (рис. 8).

Architecture of NanoSorb™ Molecule

Lipid S«lubl« Ingredient* (Nutrients ft Vitamin»)

Water Soluble Ingredients (Nutrient* ft Vitamins)

New Polar Lipid

Lipid Layer

Рисунок 8. Структура нанопродукта технологии №по8огЬ, обеспечивающей молекулярную дисперсию жирорастворимых ингредиентов.

Первые исследования фармакокинетики этих субстанций в лекарственных формах продемонстрировали, что они обладают большей биодоступностыо, чем приготовленные по стандартным технологиям [163, 32, 117, 200]. К наноразмерным продуктам относят также солюбилизированные, микрокапсулированные и липосомальные субстанции СоС>ю. Микрокапсулирование убихинона заключается в «одевании» на каждую молекулу полисахаридного октациклодекстринового кольца (рис. 9).

Рис. 9. Химическая структура микрокапсулированного в циклодекстрине коэнзима Qio (QlOVital®, USA).

Циклодекстрин - полисахарид с гидрофильной поверхностью и гидрофобной внутренней средой. Липофильные молекулы CoQio, заключенные в индивидуальные капсулы полисахарида с гидрофильной поверхностью, полностью отделены друг от друга, что предотвращает их слипание в конгломераты (рис. 10).

Солюбилизированные формы содержат CoQio в составе мицелл, способных растворяться в воде. В обоих случаях продукт представляет собой субстанцию, в которой молекула или небольшая группа молекул CoQio изолирована от других. Таким образом, достигается практически полная молекулярная дисперсия CoQio, ускоряющая и облегчающая процесс всасывания и повышающая его биодоступность [204, 187, 200, 32]. ordinary nutrient nanoized nutrient

Рис. 10. Абсорбция обычной и микрокапсулированной субстанции: слипание обычной субстанции в конгломераты, ограничивающие степень абсорбции (1) и полная дисперсия частиц микрокапсулированной субстанции (2).

Включение СоОю в липосомы также способствует увеличению его биодоступности в результате облегченной абсорбции. Для липосомальной субстанции показана способность уже через 15 минут после внутривенного введения водной суспензии повышать содержание СоСЬо в миокарде и увеличивать устойчивость к ишемическому-реперфузионному повреждению [128, 129].

Эндогенные уровни Сорю в тканях

Коэнзим О («вездесущий хинон») у животных и человека присутствует во всех тканях. Содержание его видо- и органоспецифично. У относительно короткоживущих видов животных (мыши, крысы) доминатной формой является коэнзим С>9 [202]; у долгоживущих видов млекопитающих и человека преобладает декаизопреновый гомолог - коэнзим СЬо. Тканевое распределение и редокс-статус СоС^о в различных тканях человека и крысы приведены в табл. 2. Данные таблицы демонстрируют, что наибольшие количества СоО содержатся в тканях с высокими энергетическими затратами или метаболической активностью, таких как сердце, почки, печень и мышцы. Тканеспецифичным является не только общее содержание СоС^, но и соотношение убифенол/убихинон. Как правило, большая часть Со0> присутствует в восстановленной форме, за исключением мозга и легких, что считается отражением интенсивных окислительных процессов в этих тканях.

Таблица 2. Содержание и редокс-етатуе CoQio и CoQ9 в тканях человека и крысы [13, 202, 185]

Ткань/орган Содержание СоС^о (мкг/г) Содержание Со(29 (мкг/г) Доля восстановленной формы (%)

Человек

Сердце 114 3 61

Почки 67 3 75

Печень 55 2 95

Мышцы 40 1 60

Селезенка 25 1 23

Мозг 13 1 25

Легкие 8 1 24

Поджелудочная 33 2 100 железа

Кишечник 12 1 93

Желудок 12 59

Плазма крови 1,1 [171, 115] Не 94-97 [171, 115] нмоль/мл) определялась

Крыса

Сердце 17 202 22

Печень 21 131 87

Почки 22 124 42

Мышца 3 43 40

Мозг 19 37 27

Поджелудочная 3 37 62 железа

Селезенка 9 23 18

Легкие 2 17 12

Кишечник 19 51 67

Желудок 5 56 52

Плазма крови следы 270 65,3 нг/мл) [168]

Внутриклеточное распределение Сор на примере ткани печени приведено в табл. 3.

Таблица 3. Внутриклеточное распределение коэнзимов 0 в печени крысы

202].

Фракция Со(39 (пмоль/мг белка) (пмоль/мг белка)

Гомогенат 1040 99

Митохондрии 5919 535

Лизосомы 1126 120

Везикулы аппарата 805 92

Гольджи

Плазматические мембраны 353 37

Микросомы 249 57

Ядерная фракция 188 27

Пероксисомы 121 13

Цитозоль 106 11

Максимальное количество Со<3 содержат митохондрии, минимальное -цитозольная фракция и пероксисомы. Поэтому среди клеток крови в лимфоцитах и тромбоцитах находятся значительные количества СоС>, а в бедных митохондриями красных кровяных тельцах - только следы, предположительно относящиеся к мембранному пулу [179].

Нормальный интервал концентраций СоС^ю в плазме здоровых взрослых обычно сотавляет от 0,4 до 2,0 мкг/мл с небольшими популяционными вариациями (табл. 4).

Коэнзимы 0 в плазме крови ассоциированы в основном с липопротеидами, поэтому в некоторых исследованиях содержание Со(} нормируется на общий холестерин плазмы. Так, для американской популяции приводятся нормированные по холестерину значения в интервале 0,113 - 0,329 мкмоль/моль у мужчин и 0,119 - 0,326 мкмоль/моль у женщин [162].

Табл. 4. Референсные интервалы концентраций СоСЫ в плазме крови взрослых в различных популяциях

Популяция Содержание в плазме, мкг/мл Источник мужчины женщины

Финляндия 0,4- 1,72 0,43 - 1,47 [77]

США 0,5-1,91 0,5-1,91 [115]

Великобритания 0,227-1,432 0,227- 1,432 [43]

Захват CoQ тканями

Синтез убихинона протекает во всех тканях организма, поэтому в обычных условиях они не зависят от поступления его извне. Однако, содержание CoQ в тканях может меняться под воздействием ряда физиологических и патофизиологических факторов, таких как старение и окислительный стресс [46, 137]. В этих условиях для предотвращения или замедления развития патологических изменений становится актуальным пополнение сниженных тканевых уровней за счет экзогенного CoQ.

Механизм захвата CoQio тканями до сих пор детально не изучен. Предполагается [20], что механизмы абсорбции и распределения CoQio и а-ТОС могут быть сходными. Это предположение подкрепляется наблюдением Ibrahim Н. [72]: при добавлении в корм крысам комбинации CoQio+a-TOC прирост содержания CoQio в печени увеличивался при низких дозах а-ТОС и падал при высоких.

Печень располагает специфическим связывающим белком для возврата а-ТОС в циркуляцию в составе ЛПОНП и дальнейшего его транспорта к различным органам [198]. CoQio обнаружен в различных липопротеидах плазмы крови, как следствие возможного перераспределения в циркуляции.

Из циркулирующей крови после однократного внутрибрюшинного введения CoQio способен интенсивно захватываться печенью, селезенкой, надпочечниками, яичками, моноцитами и лимфоцитами; меньший прирост наблюдается в сердце и гипофизе при неизменных уровнях в почках, мышцах и мозге [19]. Добавление CoQio и а-ТОС в различных соотношениях к стандартной диете крыс приводило к достоверному росту содержания CoQio только в тканях печени и селезенки [72].

В исследовании [201], выявившем крайне низкую степень абсорбции CoQ10 в желудочно-кишечном тракте, убихинон, растворенный в смеси соевого и рапсового масел, вводили крысам через желудочный зонд. Уровни в тканях измерялись спустя 6 часов, а также через 4 и 8 суток ежедневного введения. Был обнаружен захват CoQio из циркулирующей крови печенью и селезенкой. Прирост уровней в печени дозозависимо возрастал в интервале доз от 0,3 до 12 мкмоль/100 г веса, после чего достигал насыщения. Ни в почках, ни в сердце содержание CoQio не увеличилось. Возрастание содержания CoQio в печени не изменило уровней CoQ9, то есть не повлияло на интенсивность его биосинтеза. Эти данные согласовывались с результатами исследования биосинтеза с помощью 3Н-мевалоната, меченного in vivo, на фоне введения CoQio с пищей [106]. В дальнейшем на основании этих результатов сформировалось мнение, что введение экзогенного убихинона не подавляет биосинтез последнего [185, 20].

Замечено, что для пополнения тканевых уровней необходимо повышение содержания CoQio в крови в несколько раз. Увеличение содержания CoQio в сердце и митоходриях мозга как результат хронического введения высоких доз убихинона (150-650 мг/кг в день) было зафиксировано в единичных исследованиях: у крыс [93] и мышей [78].

Одним из посредников захвата CoQio тканями, как для холестерина и а-ТОС, может являться ЛПНП-рецегггор, которым насыщены надпочечники и яички, т.е. органы, интенсивно захватывающие CoQ]0 из крови. Этот механизм, однако, может быть не единственным, так как количество рецепторов в органе и степень захвата им CoQio не всегда согласуются. Возможно [185], что тканевой захват происходит при участии специфического рецептора для CoQ10 и/или связывающего белка.

Ограниченный захват CoQ10 тканями обусловлен особенностями его биосинтеза и внутриклеточного распределения. «Сэндвичное» расположение липида в центральной, гидрофобной зоне мембраны, между двумя слоями фосфолипидов, делает ее насыщенной, и вследствие этого отсутствует функциональная необходимость и возможность разместить дополнительную порцию экзогенного CoQio в этом ограниченном пространстве (рис. 11). Действительно, захваченный печенью меченный CoQio локализуется главным образом в лизосомах, эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи, а не в митохондриях, содержащих до 80% эндогенного пула убихинона [19]. Кроме того, все типы клеток сами синтезируют CoQ.

Dolichyl-P Cholesterol

DoHchol Coenzyme Q

Рис. 11. Расположение липидов мевалонатного пути синтеза в мембране

185].

Ситуация может меняться при патологически сниженных уровнях липида. Так, у детей с генетическим дефицитом синтеза CoQio [148] наблюдалось отсутствие его в лимфобластах и фибробластах, сопровождавшееся тяжелой неврологической симптоматикой и патологией мускулатуры. Прием CoQio разительно улучшал физические и интеллектуальные способности пациентов, восстанавливая ограниченную митохондриальную функцию. При кардиомиопатии и сниженном уровне CoQio в сердечной мышце (по данным биопсий) захват его миокардом на фоне приема экзогенного липида был интенсивнее у больных в тяжелой стадии заболевания, чем у больных со средней тяжестью течения болезни [54].

Следовательно, возможность распределения экзогенного CoQio из циркулирующей крови по органам и тканям, с одной стороны, зависит от его концентраций в плазме, а с другой - обусловлена их функциональным состоянием и потребностью в этом липиде. При достаточном тканевом уровне CoQ10 может не захватываться тканью или накапливаться во внутреннем пространстве отдельных органелл.

Фармакокинетические параметры CoQio

Зависимость концентрации CoQio в крови от времени после приема у людей была удачно аппроксимирована 3-частевой моделью [180]. После достижения Стах {Ттсис ' 6 час) фаза распределения продолжалась на протяжении следующих 6 часов. Через 24 часа после приема наблюдался второй пик плазменных концентраций, который предположительно мог являться результатом энтерогепатической рециркуляции (рис. 12).

Changes of CoQIO level in the blood after intake ф

03 о Б о 0 О 1 со

О 24 48 72 96 120 144 168 hr

Рис. 12. Фармакокинетическая кривая CoQio при приеме per os.

Предложенная комплексная фармакокинетическая модель позволила ее авторам объяснить наличие дополнительного пика концентрации и длительную терминальную фазу элиминации (/ й ~ 33 часа) как следствие перераспределения CoQio из периферических тканей в плазму крови. Согласующиеся данные были получены в исследованиях [193, 117], в которых после однократного приема CoQio для возврата уровней в плазме к исходным величинам потребовалось около 5-6 суток. В исследовании [71] показано, что через 2 недели после завершения 4-недельного введения CoQio в дозах 90 и 300 мг в день плазменные уровни все еще превышали исходные на 30 и 74%, соответственно. После однократного внутривенного введения [,4C]-CoQio морским свинкам его радиоактивность регистрировалась в надпочечниках, сердце, почках и мозге на протяжении 7 дней [199].

Приведенные данные свидетельствуют о возможности захвата экзогенного СоСЬо периферическими тканями с последующим медленным перераспределением в плазму в течение минимум 2 недель, в зависимости от продолжительности предшествующего периода введения.

Результаты исследований всасывания и распределения СоС)ю позволили понять причины безопасности сверхвысоких (до 3,5 г/день) доз и обосновать режимы дозирования: до 1200 мг в день взрослым и до 10 мг/кг в день детям. Контрольные определения концентраций в плазме рекомендуется проводить через 3-4 недели постоянного приема, когда достигается равновесный уровень [114].

В исследованиях на людях продемонстрирована более высокая биодоступность субстанций СоСЬо с повышенной растворимостью -солюбилизированных и комплексов с циклодекстрином [187, 204, 114] (рис. 13-15).

Анализируя накопленные данные контролируемых клинических испытаний различных фармацевтических продуктов СоСЬо, авторы обзора [21] пришли к заключению о наибольшей биодоступности солюбилизированных форм; как несолюбилизиронный, так и солюбилизированный, убихинол обладает лучшей биодоступностью, чем убихинон.

Рис. 13. Кинетические кривые после приема равных доз CoQio (120 мг) в виде трех различных форм: Q-Gel, содержащей солюбилизированую субстанцию (технология Bio-Solv®); all-Q® с наноразмерной субстанцией (TG/P) и Q-Sorb® с несолюбилизированным CoQio [187].

Рис. 14. Концентрации CoQio в плазме крови добровольцев на протяжении 12-ти (а) и 144-х часов (Ь) после приема внутрь 180 мг CoQio в четырех различных формах: трех формах, содержащих солюбилизированную субстанцию (три верхних графика), и одной форме, содержащей несолюбилизированную субстанцию CoQio [117].

0-5 -г

Он О 2 4 6

Типе !Ы в

10

12

Рис. 15. Прирост концентраций в плазме у людей после приема внутрь, натощак 60 мг Сорю в трех различных формах: мягких гелевых капсулах с эмульсией в соевом масле (Я); водной суспензии комплекса с Р-циклодекстрином (Т1) и порошке комплекса с р-цикло декстрином (Т2) [204].

Подводя итог анализу данных научной литературы можно заключить, что СоРю является перспективным терапевтическим агентом в лечении ишемических состояний миокарда. Проведение дальнейших клинических исследований предполагает, с одной стороны, применение препаратов Сорю, обладающих максимальной биодоступностью и способных повысить его содержание в крови и сердечной мышце, а с другой - более глубокое понимание патогенетических механизмов (на уровне ткани и клетки) как потенциальных объектов фармакологического воздействия. Современный фармацевтический рынок изобилует предложениями СоСЬо-содержащих биологически активных добавок и препаратов. В контроле их качества и оценке биоэквивалентности лидирующие позиции занимает ВЭЖХ с электрохимическим детектированием как аналитический метод, обладающий наибольшей чувствительностью и селективностью.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

IV. выводы

1. Разработана ВЭЖХ-методика разделения и высокочувствительного электрохимического определения коэнзимов Q9, Qi0 и а-ТОС, применимая для анализа лекарственных форм, содержащих солюбилизированный и микрокапсулированный коэнзим Qio, а также плазмы/сыворотки крови, тканей миокарда и мозга.

2. Изучена фармакокинетика CoQ10 для порошка субстанции, раствора солюбилизированного CoQio и таблеток микрокапсулированного CoQ10. Доказаны преимущества по биодоступности наноразмерных субстанций (солюбилизированного и микрокапсулированного CoQio) относительно порошка жирорастворимой субстанции.

3. Изучено влияние длительного энтерального введения БАД «Кудесан» раствор, содержащего солюбилизированный CoQi0 и а-ТОС. на их уровни в плазме и миокарде крыс: показана возможность увеличения содержания в сердечной мышце и сопряженное повышение уровней C0Q9. Прослежено динамическое изменение взаимоотношений C0Q10, C0Q9 и а-ТОС на фоне хронического введения препарата «Кудесан» раствор и после его прекращения.

4. Выявлен эффект отмены C0Q10 после длительного применения внутрь, проявившийся через 2 недели в снижении миокардиальных уровней коэнзимов Q и и а-токоферола ниже контрольных значений.

5. Разработана ВЭЖХ-методика определения уровня гидроксильных радикалов в ткани миокарда in vivo, базирующаяся на микродиализе миокарда раствором салицилата натрия и высокочувствительном электрохимическом детектировании в диализатах продуктов гидроксилирования салицилата. Представленная методика позволяет отслеживать уровень генерации ОН* на протяжении нескольких часов.

6. Выявлен повышенный уровень ОН* в гипертрофированном миокарде животных с наследственной артериальной гипертензией и в миокарде крыс при острой ишемии-реперфузии. При патологических состояниях миокарда интенсивность генерации ОН* в ткани положительно взаимосвязана с выраженностью патологии: при гипертрофии миокарда - с индексом массы, при ишемии-реперфузии - с размером некротического повреждения.

7. Выявлено истощение содержания антиоксидантов - коэнзимов 0 и а-ТОС в постинфарктном гипертрофированном миокарде крыс. В миокарде крыс с наследственной артериальной гипертензией выявлен дефицит коэнзимов С): уже в 6-недельном возрасте для обоих желудочков сердца спонтанно-гипертензивных животных характерны сниженные уровни СоС) и повышенные уровни а-ТОС; дефицит СоС^ю увеличивается с возрастом, а уровни а-ТОС снижаются до возрастной нормы к 24-й неделе жизни.

8. Выраженность патологии миокарда у молодых (6 месячных) спонтанно-гипертензивных крыс - индекс массы левого желудочка прямо коррелирует с уровнями СоС) в плазме и обратно пропорционален их содержанию в миокарде. Не выявлено взаимосвязи индекса массы гипертрофированного левого желудочка с плазменными или миокардиальными уровнями а-ТОС.

9. Установлен кардиопротекторный эффект БАД «Кудесан» раствор у крыс с наследственной артериальной гипертензией. Хроническое введение приводит к повышению его содержания в сердечной мышце при сохранении обратной связи с индексом массы левого желудочка, что сопровождается замедлением деструктивных и активизацией регенераторных процессов в гипертрофированной ткани миокарда.

10. Установлен кардиопротекторный эффект БАД «Кудесан» раствор при инфаркте миокарда. Хроническое предварительное и продолжающееся после инфаркта энтеральное введение БАД «Кудесан» раствор повышает уровни коэнзимов р в сердечной мышце и одновременно ограничивает размер зоны некроза и постинфарктную гипертрофию миокарда. Наличие сильной взаимосвязи плазменных концентраций коэнзимов Р с величиной зоны некроза подтверждает причинную роль повышенных тканевых уровней Сор в ограничении ишемических повреждений миокарда.

III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью данной работы было проведение комплексной оценки эффективности и качества БАД на основе коэнзима СЫ для обоснования его применения в качестве кардиопротектора. В диссертации представлены результаты исследований фармацевтических, фармакокинетических, патофизиологических и фармакологических факторов, аргументирующие и доказывающие способность коэнзима СЬ как терапевтического агента оказывать защитное действие на сердечную мышцу.

Проведение исследования стало возможным благодаря широчайшим возможностям высокоэффективной жидкостной хроматографии. ВЭЖХ в сочетании с электрохимическим детектором послужила основным аналитическим инструментом для изучения объектов исследования: субстанции и БАД на основе коэнзима СЬо, образцов плазмы, сыворотки крови, тканей миокарда и мозга, микродиализатов миокарда крыс.

Подобраны условия хроматографического разделения-и определения СоС)10, позволяющие одновременно проводить количественный анализ СоС^о, СоС)9 и а-ТОС с чувствительностью на уровне лучших из известных методик. Важность одновременной оценки уровня СоС>9 обусловлена преобладанием этого убихинона у таких экспериментальных животных как крысы. а-ТОС является вторым жирорастворимым антиоксидантом, работающим в мембранах в ансамбле с коэнзимом Процедура экстракции обеспечивает их воспроизводимое извлечение из биологических образцов с высокой эффективностью (92-100%).

Проведен комплексный анализ коэнзима СЫ как лекарственного вещества: количественное определение и изучение его фармакокинетики в составе нескольких БАД, оценка фармакологической- эффективности- на различных эксперименальных моделях патологии миокарда.

С помощью разработанной методики были проанализированы на соответствие заявленной дозировке БАД, содержащие СоС)|0: раствор солюбилизированного Сорю «Кудесан», таблетки микрокапсулированного СоС2ю «Кудесан форте» и «Кудесан для детей». Показано, что содержание СоСЫ в БАД

Кудесан», таблетках «Кудееан форте» и «Кудесан для детей» отвечает требованиям ТУ.

Высокая чувствительность определения дала возможность изучить фармакокинетику СоСЬо в экспериментах на крысах на протяжении 48 часов после введения внутрь. Определены и рассчитаны основные фармакокинетические параметры СоСЬо (Стач, Ттах, АиС0-485 Стах/Аис0.48) для порошка субстанции и БАД; обнаружены факты, подтверждающие наличие энтерогепатической циркуляциии. Для всех трех БАД в сравнении с порошком были достоверно выше величина максимальной концентрации Сгаах (в 1,5-3 раза) и биодоступность (264, 734 и 325% для БАД «Кудесан», «Кудесан форте» и «Кудесан для детей»). Выявленные фармакокинетические особенности БАД на основе солюбилизированного и микрокапсулированного СоС^о доказали преимущества его наноразмерных субстанций.

Доказана способность СоСЬо в составе БАД «Кудесан» раствор повышать содержание СоС^ю и СоСЬ в плазме и сердечной мышце крысы в результате длительного введения внутрь. Впервые прослежена динамика плазменных и миокардиальных концентраций коэнзимов С* не только при хроническом введении БАД «Кудесан» (через 3 и 6 недель), но и после его отмены (спустя 2 и 6 недель). Обнаружена обратная зависимость между эндогенными уровнями СоСЬо в плазме и миокарде контрольных крыс, свидетельствующая об отсутствии поступления эндогенного СоС^ю из плазмы крови в ткани миокарда. И в плазме, и в миокарде выявлена сильная положительная взаимосвязь эндогенных уровней Со(Зю и СоСЬ, СоСЬо и а-ТОС, СоСЬ и а-ТОС, что доказывает их командное функционирование как антиоксидантов. Прослежены изменения этих взаимоотношений на фоне хронического введения БАД «Кудесан» раствор и после его прекращения.

Впервые выявлен эффект отмены, проявившийся спустя« 2 недели в снижении миокардиального уровня- коэнзимов <3 ниже контрольных значений. Обнаруженный феномен требует пересмотра отношения к коэнзиму СЬо как абсолютно безопасному фармакологическому агенту даже в дозах до нескольких граммов в сутки. Возможность резкого снижения' содержания коэнзима СЬ0 в миокарде ниже нормальных значений после прекращения его приема обязывает с крайней осторожностью применять высокие дозы коэнзима СЫ и диктует необходимость разработки фармакокинетически обоснованных безопасных режимов дозирования.

Повышенная биодоступность солюбилизированной субстанции CoQio («Кудесан» раствор), возможность точного дозирования и способность при длительном введении пополнять уровни в миокарде определили выбор этого препарата для последующей оценки кардиопротекторной эффективности.

Для оценки интенсивности генерации АФК в миокарде разработана методика определения продукта гидроксилирования салицилата - 2,3-ДГБК в микродиализатах миокарда, позволяющая количественно оценить уровень гидроксильного радикала в ткани in vivo. Анализ on line микрообразцов диализата (в объеме 15-30 мкл) дал возможность мониторировать уровень ОН" в миокарде на протяжении нескольких часов и, таким образом, оценить интенсивность генерации АФК при острых и хронических патологических состояниях миокарда.

Впервые обнаружен повышенный фоновый уровень ОН" в гипертрофированном миокарде крыс с наследственной артериальной гипертензией (линия SHRSP) относительно миокарда нормотензивных крыс. Зарегистрировано возрастание генерации ОН* при острой ишемии-реперфузии миокарда крыс обеих линий. Интенсивность генерации ОН* оказалась прямо пропорциональна выраженности патологических изменений миокарда: фоновый уровень генерации у крыс линии SHRSP - индексу массы левого желудочка, величина реперфузионного выброса у крыс Wistar - размеру очага некроза по окончании ишемии-реперфузии. Показано, что при ишемии-реперфузии в гипертрофированном миокарде спонтанно гипертензивных крыс генерация гидроксильных радикалов происходит интенсивнее, чем в миокарде нормотензивных крыс. Это может являться одной из основных причин большего ишемического-реперфузионного повреждения и свидетельствовать о наличии в миокарде крыс SHRSP антиоксидантного дефицита.

Впервые обнаружено, что ишемическое прекондиционирование миокарда способно сократить продолжительность реперфузионного выброса гидроксильных радикалов и, возможно, поэтому приводит к многократному уменьшению размера зоны повреждения.

Выявленная взаимозависимость миокардиальных уровней ОН* и выраженности патологических изменений ткани может служить подтверждением участия процессов свободнорадикального окисления в патогенезе гипертрофии сердечной мышцы и патогенетическим обоснованием применения антиоксидантов.

ВЭЖХ-определение липофильных антиоксидантов - коэнзимов СЫ, <39 и а-ТОС в образцах плазмы, сыворотки, мозга и миокарда позволило оценить степень защищенности клеточных мембран от атаки свободных радикалов в норме и при патологических состояниях. Выявлен нарастающий с возрастом дефицит коэнзимов С) в миокарде спонтанно гипертензивных крыс. Характерно, что на раннем этапе развития гипертрофии, у 6-недельных крыс линии 8ЬЖ8Р, индекс массы ЛЖ не зависел от величин артериального давления, частоты сердечных сокращений, а был взаимосвязан с содержанием коэнзима СЬ0 в миокарде и плазме крови. Обнаружено истощение содержания коэнзимов С), а-ТОС и в гипертрофированном постинфарктном миокарде крыс Wistar.

Хроническое ежедневное введение внутрь БАД «Кудесан» (10 мг/кг) крысам с наследственной артериальной гипертензией с 6-й по 12-ю- неделю жизни повышало содержание коэнзимов С) в плазме и миокарде. Пополнение миокардиальных уровней сопровождалось замедлением деструктивных и активизацией регенераторных процессов в гипертрофированной сердечной мышце. «Кудесан» (внутрь, 10 мг/кг) в результате хронического предварительного и продолжающегося после инфаркта миокарда введения крысам \Vistar повышал плазменные и миокардиальные уровни коэнзимов С>, одновременно ограничивая размер зоны, некроза и постинфарктную гипертрофию левого желудочка. Выявленная сильная обратная взаимосвязь плазменных концентраций коэнзимов с размером зоны некроза свидетельствует о способности коэнзима СЫ уменьшать степень ишемических повреждений миокарда.

Комплексный анализ результатов проведенных исследований позволил охарактеризовать особенности окислительно-восстановительного статуса гипертрофированного миокарда. Повышенный уровень наиболее агрессивного из АФК - гидроксильного радикала и, одновременно, сниженное содержание коэнзимов С) представляются в свете полученных данных звеньями одной цепи, ведущей к развитию и прогрессированию процессов ремоделирования сердечной мышцы. Выявленный дисбаланс между прооксидантными и антиоксидантными факторами существенно дополняет представление о патогенетической роли окислительного стресса при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Прямая взаимосвязь индивидуальных эндогенных уровней коэнзимов <3 с а-ТОС в плазме крови и миокарде свидетельствует об их совместном функционировании как антиоксидантов. Введение экзогенного коэнзима СЬо и а-ТОС в составе БАД «Кудесан» повышает содержание этих спарринг-партнеров в миокарде, что приводит к временному нарушению равновесия между ними, на гармонизацию которого требуется несколько недель. Этот факт может отчасти объяснить отсроченное проявление эффектов коэнзима СЬо при хроническом приеме. Впервые обнаруженный эффект отмены коэнзима С2ю - снижение миокардиальных уровней убихинона ниже контрольных значений - сопровождался снижением и уровней а-токоферола. Восстановление нормального содержания и соотношения обоих антиоксидантов в сердечной мышце протекало на протяжении месяца.

Однако, и у спонтанногипертензивных, и у постинфарктных животных степень патологических изменений коррелировала с содержанием коэнзима С), но не а-токоферола. Этот факт подчеркивает уникальный терапевтический потенциал коэнзима СЬо, выполняющего двуединую фунцию: обеспечения переноса электронов для достаточного синтеза макроэргических фосфатов и детоксикации избытка свободных радикалов. Уменьшение выраженности патологии миокарда в результате повышения тканевого содержания коэнзимов доказывает наличие обратной связи и обосновывает использование коэнзима СЫ для кардиопротекции.