Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование 1,1^-этилен-2,2^-бипиридилийдибромида

На нравах рукописи

003054745 т " ¿ии/

ЧУПАК ВАДИМ ВАСИЛЬЕВИЧ

ШлМл^.

6

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ 1,1 '-ЭТИЛЕН-2,2 '-БИПИРИДИЛИЙДИБРОМИДА

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Курск - 2007

003054745

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Шорманов В.К. Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук,

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Пятигорская государственная

Защита состоится «/У » 2007 г. п/->'~ ¿¡О часов

на заседании диссертационного совета К 208.039.01 при ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава» (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, д.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет Росздрава» (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, д. 3).

Автореферат разослан »

профессор Яцюк Валентина Яковлевна кандидат фармацевтических наук Дурицын Евгений Петрович

фармацевтическая академия Росздрава»

диссертационного совета

Ученый секретарь

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. 1,1 -этален-2,2'-бипиридилийдябромид (синонимы: ДИКВАТ, реглон, ФБ-2, приглон) широко применяется в качестве гербицида и десиканта сорных растений, для десикации семенников сахарной свёклы в период побурения 30-40% клубочков. В ряде стран применяется для десикации хлопчатника, картофеля, подсолнечника и ряда других культур. Относится к контактным гербицидам сплошного действия, характеризуется быстрым гербицидным эффектом и уничтожает надземную часть растений даже при использовании малых доз. Дикват обладает значительной токсичностью по отношению к теплокровным животным и человеку. Описаны многочисленные случаи отравления данным веществом, в том числе с летальным исходом. Отравления могуг происходить при непосредственном контакте с веществом в процессе его производства, хранения и применения, вследствие аварий, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, употребления некачественных продуктов питания, содержащих остаточные количества диквата, а также при суицидных попытках.

ДДзо диквата для крыс составляет 282 мг/кг, летальная доза для человека, очевидно, равна 90 - 180 мг/кг. Широкое применение диквата, его высокая токсичность, наличие случаев летального отравления обусловливает необходимость изучения этого соединения в судебно-химическом отношении. До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования диквата из объектов биологического происхождения, его обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литерапуре отсутствуют данные по сохраняемости рассматриваемого вещества в биологическом (трупном) материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методики судебно-химического исследования диквата является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики судебно-химического исследования 1,1 -эт";и1ен-2,2'-б|ншрид1шийдибро,мида.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить особенности электронных и колебательных спектров 1,1-этилен-2,2'-бипирщщлийдибромида.

2. Определить характер хроматографической активности исследуемого вещества в тонких слоях и колонках сорбентов.

3. Изучить особенности образования окрашенных продуктов в реакциях 1,Г-этилен-2Д'-бипиридилийдибромида с рядом цветореагентов. Определить возможность применения данных цветных реакций в условиях анализа биологического материала.

4. Изучить особенности изолирования объекта исследования различными группами изолирующих агентов из биологического материала, разработать схему очистки извлечений.

5. Исследовать распределение 1,1—этилен-2,2'- бигшридилийдибромида в органах и биологических жидкостях теплокровных животных.

6. Определить сроки сохранения рассматриваемого вещества в разлагающемся трупном материале.

Научная новизна исследований. Изучены отдельные закономерности хромато графического поведения 1,1 -этилен-2,2-бипиридилийдибромида в сорбентах с гидроксшшрованной и привитой поверхностями при использовании различных подвижных фаз; определены оптимальные условия и рассчитан ряд параметров хроматографирования исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов.

На основе проведенных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения 1,1 '-этилен- 2,2' -бипиридилийдибромида методами ТСХ и хроматоспектрофотометрии.

Исследованы особенности электронных и колебательных спектров поглощения 1,1 —этилен-2,2 '-бипиридилийдибромида. Для повышения селективности качественного спектрофотометрического определения рассчитан ряд основных оптических характеристик электронных спектров, их первые и вторые производные.

Показана возможность образования окрашенных продуктов при взаимодействии 1,1-этилен—2,2- бипиридилийдибромида с глюкозой в водной и водно-диметилформамидной средах в присутствии гидрокарбоната натрия в условиях нагревания. На основе предложенных хромогенных реакций разработаны методики идентификации исследуемого вещества.

Впервые для изолирования 1,1'-этилен-2,2-

бипиридилийдибромида из биологического материала обосновано использование в качестве изолирующего агента смеси растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2). На основе применения в качестве изолирующего агента смеси растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) и очистки в тонких слоях или колонках обращённофазовых сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемого соединениия в ткани трупных органов и биожидкостях, применимые как для исследования свежего, так и гнилостно измененного трупного материала.

С использованием вновь разработанных методик в опытах на животных (кролики) исследованы особенности распределения 1,1—этилен-2,2'-бипиридилийдибромида в организме теплокровных.

Определены сроки сохранения рассматриваемого отравляющего вещества в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Практическая значимость работы. На основании проведённых исследований разработана методика изолирования из биологического материала, очистки, идентификации и количественною определения 1,Г-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида. Методика судебно-химнческого исследования представлена в виде проекта информационного письма.

Внедрение результатов работы:

- методика определения 1,Г-этплен-2,2'-бипиридилийдибромида хроматоспектрофотометрическим методом (внедрена в учебный и научный процесс кафедры органически химии Курского государственного медицинского университета с 22.11.2005 и кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.09.2006);

- методика идентификации 1,Г-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида с применением хроматографии в тонких слоях обращённофазного сорбента (внедрена в учебный и научный процесс кафедры органической химии Курского государственного медицинского университета с 22Л1.2005 и кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.09.2006);

- методика определения 1,1 '-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида в ткани трупных органов (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 15.11.2005 и кафедры фармакологии и биохимии Орловского государственного университета с 01.09.2006);

- методика определения 1,1 '-эт[щен-2,2'-бипиридилийдибромида в биологических жидкостях (внедрена в учебный и научный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 15.11.2005 и кафедры фармаколога! и биохимии Орловского государственного университета с 01.09.2006);

Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета N 36 РАМН. Номер государственной регистрации 01.200. 511193.

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследования хроматографической активности диквата в тонких слоях и колонках сорбентов;

- особенности поглощения электромагнитного излучения анализируемого вещества в УФ- и ИК- областях спектра;

- условия взаимодействия диквата с рядом цветореагентов;

- методики идентификации и количественного определения объекта исследования хроматографическими и фотометрическими методами;

- результаты исследования очистки диквата в тонких слоях и колонках сорбентов;

- методика изолирования объекта исследования из биологического материала и очистки от соэкстрактивных веществ;

- особенности распределения диквата в организме теплокровных животных;

- сохраняемость диквата в трупном материале и в биологических жидкостях.

Апробация работы. Основные положения работы представлены и доложены на научно-практической конференции с международным участием «Становление, перспективы судебно-токсикологической службы, научные исследования», Харьков, 9-10 ноября 2005 года, на 71 итоговой научной сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-Чернозёмного научного цешра РАМН (Курск, 2006), на 71 итоговой межвузовской научной конференции «Молодёжная наука и современность», Курск, 18-19 апреля 2006 года, на Региональной научно-практической конференции (с международным участием), посвященной 40-летаю фармацевтического факультета КГМУ «Достижения, проблемы, перспективы фармацевтической науки и практики», Курск, 15 декабря 2006.

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре работы.

Объём и структура диссертации . Диссертанцоннаяработа состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (5 глав), общих выводов, списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 155 страницах машинописного текста, содержат 5 рисунков, 19 таблиц. Список цитируемой литературы включает 175 источников, из которых 97 - на иностранных языках.

Первая глава (обзор литературы) включает в себя известные данные о диквате (1,1 -этилен-2,2'-бипирид1Шийдибромцце) как объекте химико-токсикологического исследования.

Вторая глава посвящена вопросам идентификации объекта исследования хроматографическими и спектральными методами.

В третьей главе приводятся экспериментальные данные по вопросам количественного определения анализируемого вещества.

Четвёртая глава включает в себя результаты изучения особенностей выделения и очистки объекта исследования хроматографическими методами.

В пятой главе рассмотрены вопросы определения диквата после его изолирования из биологического материала оптимальным изолирующим агентом.

В шестой главе приведены данные, полученные в результате изучения особенностей распределения диквата в организме теплокровных и сохраняемости в трупном материале.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе был использован 1,Г-этилен-2Д'-бипирвдилийдибромид -стандарт НИИ защиты растений с содержанием действующего вещества не менее 99 %.

Применены метода; хроматографии в тонких слоях сорбентов, жидкостной колоночной хроматографии низкого давления, электронной и ИК-спектрофотометрии, хромато-масс-спсктрометрии.

Методики количественного определения были разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества. Обработка результатов проводилась в соответствии с установленными требованиями с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследована хроматографическая подвижность 1,Г-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида в тонких слоях и колонках нормальнофазовых и обращйннофазовых сорбентов. Для характеристики подвижности анализируемого соединения в тонких слоях сорбентов рассчитывались значения коэффициента хроматографической активности Rf и условного удерживания в тонком слое сорбента В.

Как свидетельствуют данные таблицы 1, наиболее оптимальные условия хроматографирования 1,Г-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида в тонких слоях сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями достигаются при использовании ряда подвижных фаз высокой полярности, создаваемой за счёт силыю-кислотного компонента.

Таблица 1

Оптимальные подвижные фазы для хроматографирования анализируемого вещества в тонких слоях сорбентов___

Кратность

Подвижные фазы хроматогра- Rf В

фирования

Номальнофазовый сорбент (широкопористый силикагель)

0,1 н. раствор хлороводородной кислоты 2 0,32 3,13

Ацетонитрил - 0,1 н. раствор 2 0,34 2,94 хлороводородной кислоты (2:8)

Обращённофазовый сорбент (широкопористый силикагель, обработанный вазелиновым маслом)

Ацетонитрил- 1 н. раствор серной кислоты 1 0,56 2,70 (2:8)

Ацетонитрил- буферный раствор с рН 1,68 2 0,60 1,67 (2:8)

Ацетонитрил-0,5 н. раствор трилонаБ (2:8) 2 0,31 3,23

Для варианта нормальнофазовой ТСХ такими подвижными фазами явились 0,1 н. раствор хлороводородной кислоты и система растворителей 0,1 н. раствор хлороводородной кислоты-ацетонитрил (8:2), для варианта обращённофазовой ТСХ - системы растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты (2:8), ацетонитрил-буферный раствор с рН 1,68 (2:8) и ацетонитрил-0,5 М раствор трилона Б (2:8). Использование последних двух элюентов предусматривает двукратное хроматографирование.

Наиболее универсальной подвижной фазой для определения исследуемого вещества методом ТСХ (пластины «Силуфол» UV-254, обработанные вазелиновым маслом) и методом колоночной хроматографии (колонки с сорбентом «Силасорб С-18»), обеспечивающей оптимальные результаты хроматографирования, является система растворителей ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты (2:8). Данная система растворителей позволяет идентифицировать 1,1'-этилен-2,2'-бипиридилийдибромид в присутствии веществ нейтрального характера, а также многих соединений кислотной и основной природы.

Результаты изучения хроматографических свойств рассматриваемого соединения указывают на возможность его идентификации методами ТСХ и колоночной жидкостной хроматографии.

Открываемый минимум при идентификации 1,1'-этилен—2,2'-бипиридилийдибромида методами ТСХ и колоночной хроматографии составляет 0,1-0,2 мкг.

Рассмотрена возможность идентификации 1,Г-этилен-2,2-бипирвдиливдибромида хромато-масс-спектрометрическим методом с использованием капиллярной колонки и масс-селективного детектора, работающего в режиме электронного удара (70 эВ). Получаемая газо-жидкосгная хроматограмма представлена на рисунке 1.

Как следует из рисунка, на хроматограмме обнаруживается пик вещества с временем удерживания 3,602 мин. Масс-спектр вещества, соответствующего пику на хроматограмме, представлен на рисунке 2.

Как свидетельствуют полученные данные, масс-спектр включает сигналы ряда осколков с характерными массами (44,78,103,130,193,207). Основным (с массой, принимаемой за 100%), является осколок с массой 207. Подобное сочетание характерных осколков вещества с временем удерживания пика позволяет с достаточной степенью селективности идентифицировать анализируемое вещество хромато-масс-спектрометрическим методом.

Изучены особенности светопоглощения рассматриваемого вещества в УФ- и видимой областях спектра при использовании в качестве растворяющих сред воды, водных растворов кислот, гидрофильных органических растворителей, а также смесей гидрофильных органических растворителей с водой или водными растворами кислот. Для повышения селективности

определения анализируемого вещества рассчитаны первые и вторые производные электронных спектров.

Рисунок 1. Газо-жцдкостная хроматограмма испаряемого вещества Abundance

9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 20001000 о

(03

78

130

2<р

193

"<4 I I_ I _т

|| I I ||| гг. т i м р i i i) 11 'i .......... i II ■ I i'l) i"tr,..............., , . . . (

40 60 80 100 120 И0 160 ISO 200 220 240 260 280

miz

Рнсунок2. Масс-спсктр вещества с временем удерживания 3,602 мин

В ИК-спекграх исследуемого вещества (таблица 2) выявлены характеристические полосы поглощения, соответствующие колебаниям различных участков молекулы: валентным СН (в том числе в ядре пиридина), валентным симметричным СН2, валентным колебаниям пиридинового кольца, ножничным СН2 алифатического участка, плоскостным и внегоюскосшым деформационным колебаниям СН.

Таблица 2

Характеристика ИК-спектра 1,1'- диэтнл - 2,2' дипиридилия дибромида

Максимумы характеристических полос

Отнесение колебаний

3061 3003

Валентные СН в ядре пиридина Валентные СН в ядре пиридина

2950

Валентные СН

2866 Валентные симметричные СН:

1611 Валентные колебания пиридинового кольца

1576 Валентные колебания пиридинового кольца

1497 Валентные колебания пиридинового кольца

1463 Ножничные СН2 алифатического участка

молекулы ?

1192 Плоскостные деформационные колебания

СН в пиридиновом кольце

792 Внеплоскостные деформационные

колебания СН в пиридиновом кольце 713 Внеплоскостные деформационные

колебания СН в пиридиновом кольце

Показана возможность идентификации 1,Г-этилен-2,2'-бипиридшшйдибромида по его УФ- и ИК-спектрам.

Изучены особенности взаимодействия анализируемого вещества с рядом цветореагентов, включающих глюкозу и раствор гидрокарбоната натрия и обладающих восстанавливающими свойствами.

На основе рассмотренных цветных реакций разработаны методики идентификации анализируемого вещества. Открываемый минимум - 0,20,3 мкг/мл.

Разработаны методики количественного спектрофотометрического определения исследуемого вещества на основе его поглощения в 1 н. растворе серной кислоты и в смеси ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (2:8). Предложена методика хроматоспектрофотометрического определения рассматриваемого соединения на основе поглощения в смеси ацетонитрил -1 н. раствор серной кислоты (2:8) после предварительного хроматографирования в тонком слое обращённофазового сорбента. Как следует из таблицы 3, относительная ошибка среднего результата во всех случаях не превышает ±1,15 %.

Таблица 3

Результаты количественного определения определения 1,Г-этилен-2,2 —дипнрндилнйднбромида (п=6; Р=0,95)

в;

А х

Спектрофотометрах по поглощению в среде 1 н раствора серной кислоты

100,01 0,80 0,41 0,33 0,91

Спектрофотометрия по поглощению в среде ацетонитрил-1 н раствор серной кислоты (8:2) 99,94 0,66 0,27 0,75 0,75

Хроматоспектрофотометрия 99,92 1,01 0,41 1,15 1,15

Для очистки исследуемого вещества рассмотрена возможность применения хроматографических методов.

По результатам изучения хромата графической активности 1,1'-этилен-2,2'-бипиридютийдибромида предложены способы его очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала в колонках с сорбентом «Силасорб С-18» и на пластинах «Силуфол» иУ-254. предварительно обработанных вазелиновым маслом. Потери анализируемого вещества при хроматографировании не превысили 1 %.

В опытах с контрольными образцами биоматериала показана достаточная эффективность очистки извлечений методами ТСХ и колоночной жидкостной хроматографии низкого давления.

Проведено сравнительное изучение изолирования 1,Г-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида из биоматериала изолирующими агентами различной природы. В качестве изолирующих жидкостей рассмотрены гидрофильные органические растворители (ацетонитрил, ацетон, этанол), 1 н. раствор хлороводородной кислоты, а также смеси гидрофильных органических растворителей с 1 н. хлороводородной кислотой, взятые в определённых соотношениях.

Полученные результаты представлены на рисунке 3. 100

75 -

50

25

а. <0

а ™ ¿. а 2 н а. 2

г £ V о а. X О с; о 5 — о. X о с; о

§ о а СО к с?

о- 5 * с о X >3 сч о — г с; о >Х О г аз

6 8 то к с со а с;

»§ « 8 о о о О О о

Рисунок 3. Результаты изучения сравнительного изолирования 1,1'-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида из биологического материала

Как свидетельствуют полученные данные, наиболее высокий процент извлечения анализируемого соединения достигается при изолировании смесью этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2).

В дальнейшем в качестве изолирующего агента рассматривалась смесь этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2).

Исследована зависимость степени извлечения рассматриваемого вещества смесью этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) от количественного соотношения изолирующего агента и биоматериала, от кратности настаивания и продолжительности каждого отдельного настаивания.

Исследования зависимости степени извлечения диквата от объема изолирующего агента и кратности изолирования показали, что для достижения достаточно полного извлечения рассматриваемого соединения из биологического материала необходимо, по крайней мере, двукратное настаивание при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом случае должно превышать количество биологического материала как минимум в два раза.

При изучении зависимости степени извлечения от продолжительности контакта изолирующей жидкости и биоматериала установлено, что максимальные значения степени извлечения диквата из ткани трупной печени достигаются при продолжительности настаивания 45 и более минут. Исследования зависимости степени извлечения анализируемого соединения из биологического материала от темпералурного режима изолирования показали, что нагревание до кипения и кипячение уже е течение 10-15 минут позволяет повысить степень извлечения диквата приблизительно на 20%.

Установлено, что при увеличении содержания диквата в модельных смесях в достаточно широком интервале концентраций (2,5-75,0 мг) при постоянной массе навески ткани трупной печени (25 г) наблюдается лишь незначительное изменение степени извлечения, не превышающее 1,5%.

На основе предварительных исследований разработаны методики определения ), 1 '-эгнлен-2,2'-бипирвдш1ийдибромида в ткани трупных органов, крови и моче после изолирования смесью этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) и очистки извлечённого вещества методами ТСХ или колоночной хроматографии.

Количественная оценка результатов определения представлена на рисунках 4 и 5.

Печень Кровь Моча

Рисунок 4. Результаты определения 1,1 г-этилен-2,2'-бипнридилийди-бромида в биологическом материале с применением очистки методом ТСХ

Печень Кровь Моча

Рисунок 5. Результаты определения 1,1' - л и л е н-2,2'- бин и рид нл нйди -бромида в биологическом материале с применением очистки методом колоночной хроматографии

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании анализируемого соединения в количестве 100 мг в 100 г биоматериала разработанные методики позволяют определять в ткани печени 85,5486,11%, в крови -87,02-87,82%, в моче -97,11-97,39% исследуемого производного дипиридилия.

Методики характеризуются достаточными восп ро изводим о стъю и правильностью.

Показана возможность применения разработанных методик при исследовании гнилостно измененного трупного материала.

Определяемый минимум рассматриваемого вещества при изолировании смесью растворителей этаиол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) составляет 0,030-0,035 мг в 100 г трупного органа, 0,0200,025 мг в 100 1 крови, 0,010-0,015 мг в 100 г мочи, 0,040-0,045 мг в 100 г трупного органа, подвергшегося гнилостным изменениям.

Изучены особенности распределения 1,1'-этилен-2,2'-бипиридилий-дибромида в организме теплокровных животных (кролики). Экспериментальным животным в состоянии общего наркоза вводили внутрижелудочно трёхкратную ЛДя> отравляющего вещества. Животные погибалй через 3-5 часов после введения дозы.

Результаты изучения распределения представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты определения количественного содержания 1,1'-этилен-

Исследуемый объект Масса исследуемого объекта, г Найдено 1,1'-этилен-2,2'-бипиридилия (в пересчёте на дибромид)

В пересчёте на массу органа, мг В пересчёте на 100 г органов, мг

Тонкий кишечник 20 0,0408 0,2040

20 0,0468 0,2340

20 0,0580 0,2900

Кровь 20 0,0288 0,1440

20 0,0396 0,1880

20 0,0236 0,1180

Моча 27 0,2496 0,9244

22 0,19 96 0,9072

16 0,1192 0,7452

Селезёнка 20 0,0524 0,2620

20 0,0388 0,1940

20 0,0480 0,2400

Почки 17 0,1242 0,7306

20 0,1368 0,6840

21 0,1236 0,5886

Легкие 14 0,0142 0,1014

22 0,0360 0,1636

19 0,0250 0,1314

Печень 65 0,2861 0,4402

71 0,4820 0,6789

83 0,3162 0,3810

Мышцы 40 Следы Следы

40

40

Как свидетельствуют полученные данные, 1,Г-этилен-2,2'-бипиридилий обнаруживался как в органах, так и в биожидкостях

отравленных животных. Наибольшие количества отрав ля ющего агента присутствуют в моче, почках, печени, селезёнке и тонком кишечнике животных, погибших от отравления.

Исследованы особенности сохранения 1,1-этиле» 2,2-бипиридилийдибромида в трупном материале при температуре 18-22"С.

Результаты представлены на рисунке 6.

t, месяцы

Рнеунок 6. Результаты изучения сохраняемости 1,1'-этил ен-2,2 бипирияилийдибромида в трупном материале

Как свидетельствуют полученные данные, 1,Г-зтилен-2,2'-бипиридилийдибромид в предлагаемых условиях определяется в трупном материале в течение 4 месяцев. Через 4,5 месяцев обнаруживаются его следы.

Vio результатам проведённых исследований предложена общая схема химико-токсикологического анализа рассматриваемого соединения.

Предлагаемая схема позволяет изолировать, очистить, идентифицировать и количественно определи ть исследуемое отравляющее вещество.

ВЫВОДЫ

1. Исследован характер поглощения электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК-областях спектра 1,1' этилен-2,2'-бипиридилий-ди б ром и да.

Установлены особенности в поглощении рассматриваемого соединения.

Показана возможность идентификации исследуемого вещества методами электронной и колебательной спектрофотомстрии, а также на основе расчёта производных электронных спектров.

На основе способности к поглощению УФ- излучения в среде 1 н. раствора серной кислоты и в среде смеси ацетонитрил - 1 н. раствор серной кислоты (2:8) разработаны методики количественного определения рассматриваемого соединения спектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата в различных случаях не превышает ±1 %.

2. Изучена хроматографическая активность исследуемой дипиридилиевой структуры в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями с использованием элюентов различной полярности. Рассчитан ряд параметров хроматографирования.

Для хроматографирования в тонких слоях сорбента с гидроксилированной поверхностью (широкопористый силикагель на пластинах «Силуфол» иУ-254) оптимальной подвижной фазой является система растворителей ацетонитрил- 0,1 н. раствор хлороводородной кислоты (2:8).

Установлено, что универсальной подвижной фазой для хроматографирования рассматриваемого вещества в тонких слоях и колонках обращённофазовых сорбентов (См - Си) является система растворителей ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (2:8).

Разработана методика количественного определения 1,1'-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида хроматоспектрофотометрическим методом. Относительная ошибка среднего результата не превышает ± 1,15 %.

3. Показана возможность определения исследуемого соединения на основе применение цветных реакций с восстанавливающими реагентами (водный раствор глюкозы, раствор глюкозы в среде ДМФА-вода).

На основе изученных хромогенных реакций разработаны методики идентификации рассматриваемого соединения. Открываемый минимум 0,2-0,3 мкг/мл.

4. Изучены особенности препаративного хроматографирования объекта исследования на колонке с сорбентом «Силасорб» С-18 (размер частиц 30 р). Установлено, что при этом наиболее целесообразно использование подвижной фазы ацетонитрил-1 н. раствор серной кислоты (2:8). Дана оценка потерь анализируемого соединения в процессе препаративного и аналитического хроматографирования в колонках и тонких слоях сорбентов.

Показана достаточная эффективность предлагаемых схем хроматографической очистки рассматриваемого вещества от соэкстрактивных веществ биологического материала.

5. Проведено сравнительное изолирования исследуемого вещества из биологического материала различными изолирующими агентами.

Установлено, что наиболее высокую степень извлечения рассматриваемого соединения удается достичь при использовании в качестве изолирующего агента смеси растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2). Процесс изолирования должен осуществляться в условиях проведения по крайней мере двукратного настаивания с объемом изолирующего агента, который как минимум в два раза численно превышает массу исследуемого биоматериала, в условиях нагревания до кипения и кипячения в течение 10 минут с последующим охлаждением и выдерживанием реакционного раствора не менее получаса.

6. Разработаны методики определения 1,1 —этилен-2,2-бипиридилийдибромида в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования смесью растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) и очистки методами тонкослойной и колоночной хроматографии с использованием обращённофазовых сорбентов.

7. При содержании 1,1 -этилен-2,2-бипиридилийдибромида в количестве 100 мг в 100 г биоматериала методики, основанные на изолировании смесью растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) и очистке методами ТСХ и колоночной хроматографии, позволяют определять в ткани свежей трупной печени 85,54-86,11%, в крови -87,02-87,82%, в моче -97,11-97,39% анализируемого соединения.

При таком же содержании 1,1 -этилен-2,2Ч5ипиридилийдибромида методика, основанная на изолировании смесью растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) и очистке хроматографией на колонке, позволяет определить в ткани гнилостно изменённой трупной печени 82,22%.

Разработанные методики характеризуются достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью.

Определяемый минимум рассматриваемого вещества при изолировании смесью растворителей этанол-1 н. раствор хлороводородной кислоты (8:2) составляет 0,030-0,035 мг в 100 г трупного органа, 0,0200,025 мг в 100 г крови, 0,010-0,015 мг в 100 г мочи, 0,040-0,045 мг в 100 г трупного органа, подвергшегося гнилостным изменениям.

8. Исследованы особенности распределения 1,Г-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида в организме теплокровных животных при введении яда через желудок.

1,1-этилен—2,2'-бипиридилийдибромид в наибольших количествах обнаруживается в моче, селезёнке, почках и тонком кишечнике животных, погибших от отравления.

9. Изучена сохраняемость 1,1 -этилен-2,2'-бипиридилийдибромида в

гнилостно разлагающемся трупном материале.

Показано, что в условиях сохранения модельных смесей 1,Г-этилен-2,2'-бипиридилийдибромида с тканыо трупной печени при температуре 18-22°С исследуемое вещество может быть обнаружено в трупном материале в течение 4 - 4,5 месяцев после начала эксперимента.

10. По результатам проведенных исследований предложена общая схема исследования биологического материала при отравлении 1,1-этилен-2,2'-бипиридилийдибромидом.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Чупак, В.В. Особенности изолирования диквата из биологического материала / В.В. Чупак, В.К. Шорманов // Проблемы экспертизы в медицине,- 2006.-Т. 6, № 4.-С. 46-48.

2. Шорманов, В.К. Идентификация диквата в тканях трупных органов с применением хроматографии в тонком слое обращённофазного сорбента / В.К. Шорманов, В.В. Чупак // Науч.-практ. конф. с междунар.участием «Состояние, перспективы судебно-гоксикологической службы и научных исследований» (2005 г., Харьков).- Харьков, 2005.-С. 60-61.

3. Шорманов, В.К. Идентификация диквата по электронным спектрам поглощения / В.К. Шорманов, В.В. Чупак // Сборник трудов науч. конф. КГМУ и сессии Центрально-Чернозёмного науч. центра РАМН «Университетская наука: взгляд в будущее» (2006 г., Курск).-Т. 2.-Курск, 2006.-С. 211-212.

4. Шорманов, В.К. Определение содержания диквата в клубнях картофеля / В.К. Шорманов, В.В. Чупак, В.А.Королёв // Картофель и овогци.-2006.-№ 8.-С. 26.

Сдано в набор 12.02.2007 г. Подписано в печать 12.02.2007 г. Формат 60x84 1/16. Бумага Айсберг. Объем 1,0 усл. псч. л. Гарнитура Тайме. Тираж 100 экз. Заказ № 381.

Издательство МУ «Издательский центр «ЮМЭКС», 305000, г. Курск, ул. Володарского, 44а Лицензия ИД № 04804 от21.05.2001 г.

Отпечатано: ПБОЮЛ Киселева О.В. ОГРН 304463202600213