Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фитохимическое исследование по стандартизации и созданию антимикробных средств на основе травы чистотела большого и травы маклейки

На правах рукописи

АРТАМОНОВА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ И СОЗДАНИЮ АНТИМИКРОБНЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ТРАВЫ ЧИСТОТЕЛА БОЛЬШОГО И ТРАВЫ МАКЛЕЙИ

15.00.02. - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

□03158508

Самара 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, доцент Ежков Владимир Николаевич Доктор химических наук, профессор Онучак Людмила Артемовна

Ведущее учреждение - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится ¿^-^-/¿-^^/^Р 20рУг. в ^^часов

на заседании диссертационного совета К 208 085 03 при ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (443079, г Самара, проспект К Маркса, 165 Б)

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (г Самара, ул Арцыбупгевская, 171)

Автореферат разослан «"

'2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета к фарм н , доцент

ЕВ Авдеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В медицинской практике с целью профилактики и лечения различных заболеваний широко используются противовоспалительные, антимикробные и регенерирующие лекарственные средства растительного происхождения Однако хфоблема создания эффективных фитопрепаратов данного спектра действия по-прежнему остается актуальной Это связано с тем, что лекарственные средства на основе природных биологически активных соединений (БАС) обладают рядом преимуществ по сравнению с их синтетическими аналогами, так как широта терапевтического действия фитопрепаратов сочетается с минимальными побочными эффектами, что особенно важно при лечении хронических заболеваний Такие свойства препаратов обеспечивает ряд биологически активных соединений растительного происхождения, в том числе и алкалоиды

Перспективными источниками получения антимикробных лекарственных средств является трава чистотела большого (СкеШотит тщия Ь ) и трава маклейи (Мас1еауа вр) - видов Маковых — Рартегасеае Ранее при химическом изучении чистотела большого было обнаружено, что в нем содержатся алкалоиды сангвинарин и хелеритрин, и трава чистотела большого была предложена в качестве источника получения данных алкалоидов. Однако в дальнейшем было установлено, что вследствие низкого содержания сангвинарина и хелеритрина производство препарата «Сангвиритрин» из травы чистотела большого экономически нецелесообразно. Поиски данных алкалоидов в других растениях сем. маковые привели к тому, что вследствие высокого содержания сангвинарина и хелеритрина в траве маклейи данное растение рекомендовано для получения лекарственного средства «Сангвиритрин». Препарат «Сангвиритрин», представляющий собой сумму бисульфатов алкалоидов сангвинарина и хелеритрина, нашел широкое применение в дерматологии, стоматологии, гинекологии и неврологии

Несмотря на многолетний опыт применения данных растений в медицинской практике, проблема более подробного изучения химического состава данных растений, стандартизации и создания новых отечественных фитопрепаратов на их основе по-прежнему остается актуальной

Оценка качества лекарственного растительного сырья (ЛРС) травы чистотела осуществляется в соответствии с ФС 47 ГФ СССР XI издания «Трава чистотела большого» Ранее были разработаны объективные методики качественного и количественного анализа сырья и препаратов чистотела большого, однако в них не предусмотрено использование государственного стандартного образца (ГСО) (Первушкин С В , Сохина А А , 1999)

Необходимость совершенствования нормативной базы возникает в связи с тем, что современные тенденции развития методов стандартизации лекарственных средств служат предпосылкой для формирования новых фармакопейных требований к их качеству (Арзамасцев АП, 2000, Багирова В Л., 2001) В отношении обсуждаемого объекта целесообразным представляется пересмотр разделов «Качественные реакции» и «Количественное определение», что обусловлено повышением уровня требований к объективности и унифицированности методов анализа сырья, фитосубстанций и лекарственных средств (Самылина И А , 1994).

Таким образом, представляется актуальным дальнейшее сравнительное фитохимическое исследование сырья чистотела большого и маклейи, а также поиск новых путей к решению проблемы химической стандартизации сырья и препаратов

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является сравнительное фитохимическое исследование травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной и разработка новых подходов к решению проблемы стандартизации сырья и препаратов на их основе

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи 1 Сравнительное изучение химического состава травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной.

2. Разработка подходов к стандартизации сырья и препаратов чистотела большого и маклейи с учетом принципа унификации методик в ряду ЛРС - субстанция -лекарственная форма.

3. Разработка методик качественного анализа травы чистотела большого, а также галенового препарата «Чистотела настойка» с использованием стандартного образца коптизина

4. Разработка методик количественного анализа травы чистотела большого и

галеновою препарата «Чистотела настойка» с использованием стандартного образца коптизина

5. Разработка методик качественного анализа травы маклейи мелкоплодной и препарата «Маклейи настойка»

6 Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов в траве чистотела большого и траве маклейи

7. Разработка и изучение в процессе хранения числовых показателей травы чистотела большого, а также препарата «Маклейи настойка». 8 Разработка проектов и изменений нормативной документации (НД) на траву чистотела большого, ГСО коптизина и галенового препарата «Чистотела настойка»

Научная новизна. В результате сравнительного изучения химического состава травы чистотела большого (Chelidomum majus L) и травы маклейи мелкоплодной (Macleaya microcarpa (Maxim ) Fedde), культивируемых в Самарской области, выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединения, относящихся к алкалоидам и флавоноидам. Из травы чистотела большого впервые выделен нарциссин (3-о-рутинозид изорамнетина), а из травы маклейи мелкоплодной - рутин (3-о-рутинозид кверцетина) Для установления структуры и изучения физико-химических свойств выделенных соединений были использованы метод УФ-, ЯМР-спектроскопия тонкослойно-хроматографического анализа (ТСХ), а также результаты различных химических превращений (кислотный, ферментативный гидролиз)

Обоснована необходимость использования в методиках качественного и количественного анализа травы чистотела большого и препаратах на его основе ГСО коптизина

Обоснована целесообразность использования ТСХ и УФ-спектроскошш для определения подлинности сырья и препаратов маклейи

Практическая значимость. Охарактеризованы выделенные и идентифицированные доминирующие вещества травы чистотела большого и травы маклейи' коптизин, берберин, сангвинарин, хелеритрин, рутин, нарциссин и изорамнетин

Разработаны методики качественного и количественного анализа травы чистотела большого с использованием ГСО коптизина.

Разработаны методики качественного анализа травы маклейи с использованием ТСХ-анализа, ГСО сангвиритрина и УФ-спектроскопии

Определены и изучены в процессе хранения числовые показатели качества травы чистотела большого, травы маклейи, препарата «Маклейи настойка», в том числе «Содержание алкалоидов», «Сухой остаток», «Концентрация спирта», «Микробиологическая чистота

Разработаны проекты фармакопейных статей «Чистотела большого трава», «Коптизин - стандартный образец», фармакопейной статьи предприятия «Чистотела настойка».

Результаты исследований используются в научных изысканиях и учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (акты внедрения № 1-3 от 03.09.07 г )

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты сравнительного изучения химического состава травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной

2. Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации сырья чистотела большого и маклейи, а также препаратов на их основе

3 Методики качественного и количественного анализа сырья чистотела большого и препарата «Чистотела настойка» с использованием ГСО коптизина 4. Методики качественного анализа травы маклейи мелкоплодной и препарата «Маклейи настойка» с использованием ТСХ-анализа, ГСО сангвиритрина и УФ-спектроскопии

5 Методика количественного анализа фловоноидов в траве чистотела большого и траве маклейи мелкоплодной.

6 Результаты исследований показателей качества ЛРС «Чистотела большого трава» и лекарственного средства «Маклейи настойка».

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного образовательного учреждения высшего профссионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Государственная регистрация № 012001053332) и

республиканских программ-

«Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме1 «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277)

«Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536)

Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на X и XI Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2005, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006), Межвузовской конференции молодых ученых «Аспирантские чтения» (Самара, 2006), XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007), V Международной конференции «Медико-социальная экология личности, состояние и перспективы» (Минск, 2007), Ш Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007)

Основное содержание работы опубликовано в 9 научных работах. Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 31 рисунок Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 208 источников, из которых 28 - на иностранных языках

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена научная новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований чистотела большого и маклейи, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению

химического состава растений, фармакологической активности, применению в медицинской практике.

В главе 2 представлены характеристика объектов и методов исследования Приведены методики химического, физического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также метода контроля качества лекарственных форм на основе травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной.

В главах 3-6 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению химического состава травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной, совершенствованию методов стандартизации данного сырья и препаратов на его основе, разработке новых препаратов и оценке их качества

В приложение вынесены материалы по разработке нормативной документации, акты внедрения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изучение химического состава

В результате сравнительного изучения химического состава травы чистотела большого (Chelidonium majus L ) и травы маклейи мелкоплодной (Macleaya microcarpa (Maxim) Fedde), произрастающих в Самарской области, выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединения, относящихся к алкалоидам (коптизин, берберин, сангвинарин, хелеритрин) и флавоноидам (нарциссин, изорамнетин, рутин) (табл 1)

Для установления структуры выделенных веществ использованы данные ТСХ-анализа, УФ-, 'Н-ЯМР-спектров, а также результаты химических превращений (кислотный и ферментативный гидролиз) и непосредственное сравнение с достоверными образцами веществ. Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировали методом ТСХ в нескольких системах и с использованием различных способов детекции

Коптизин (1). 'Н-ЯМР-спектр соединения ( U в смеси d-ацетона и D20 (1*1) содержит сигналы протонов, характерные для молекулы коптизина. четыре однопротонных синглетных сигнала при 9,79 мд (С-8), 8,76 мд (С-13), 7,87 мд

(С-1) и 7,61 мд (С-4), два двухпротонных триплета с константой спин-спинового взаимодействия (J) 6 Гц при 3,29 (С-5) и 4,95 мд. (С-6), два двухпротонных дублетных сигнала (J = 9 Гц) при 6,90 м.д. (С-11) и 7,98 м д. (С-12), а также два двухпротонных синглетных сигнала при 6,09 и 6,45 м д, принадлежащих метилендиоксигруппам при С-2,3 и С-9,10 соответственно (рис 1)

Нарциссин (З-О-рутинозид изорамнетина) (5) желтые кристаллы из этанола, С28Нз2016, т пл. 173-175°, [а] ^+12,0° (0,83, вода), в этаноле- 256, 267пл, +А1С13 269, 275пл, 405нм 1Н-ЯМР -спектр в смеси дейтероацетона и D2O (200 МГц) (Gemmmi 200) 5, м д 7,96 (д, 2 Гц, Н1^), 7,65 (дд, 2 и 8,5 Гц, Н^б), 6,96 (д, 2 Гц, Н1^), 6,50 (д, 2 Гц, Н!-8), 6,24 (д, 2 Гц, Н-6), 5,22 (д, 7 Гц, Нп-1 глюкопиранозы), 4,51 (д, 2 Гц, Нш-1 рамнопиранозы), 3,95 (с, ЗН, СН30), 3,2-3,8 (10 H Сахаров), 1,05 (д, 6 Гц, СНз рамнозы)

Изорамнетин (б) УФ-спектр выделенного соединения имеет 3 характерных максимума поглощения 256нм, 267нм и 368нм

Рутин (7) светло желтое аморфное вещество состава С27Н30О16; УФ-спектр X™* 257,267пл, 362,5нм 2Н-ЯМР-спектр (200 МГц), 5, м.д.. 7,66 (д, 9 Гц, Н-21), 7,58 (д, 9 Гц, Н-61), 6,91 (д, 9 Гц, Н-51), 6,44 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,21 (д, 2,5 Гц, Н-6), 5,07 (д, 7 Гц, Н-1 "-глюкозы), 4,56 (д, 2 Гц, Н-1ш-рамнозы), 4,4 - 3,2 (м, бН-глюкозы + 4Н рамнозы) (рис. 2)

Флавоноиды нарциссин и рутин впервые выделены для видов Chelidonium rnajus (L.) и Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde. соответственно

ИДНМ1Ц11ЦН1Щ1

Рис. 1 - 'Н-ЯМР-спектр коптизина в смеси дейтероацетона и D20

Таблица 1 - Физико-химические характеристики выделенных и идентифицированных соединений

№ п/п Название, структурная и химическая формула (растительное сырье) Физико-химические характеристики

1 I Ч Соптизин C19H14Í ч," (трава чистотела большого) ► х- Ктк (ЕЮН) 280 нм, 360 нм, 460 нм т пл 283-286°С (спирт)

2 í < «ерберин СгоНхвС З+Ы (трава чистотела большого) >-!Г Хгоах (ЕЮН) 266 нм, 348 нм, 360 нм, 463 нм

3 С » * 'ангвинарин юлкоплодной) '&5F С2оН1404Н (трава маклейи >■ * Хщ« (ЕЮН) 288 нм, 239 нм (пл), 336 нм

4 > Селеритрин С21Н нАК (трава маклейи мелкоплодной) X Ка (ЕЮН) 242 нм (пл ), 290 нм, 327 нм

5 Нарциссин С28Н32О16 (трава чистотела большого) А™« (ЕЮН) 257 нм, 268 нм (пл ), 360 нм т пл 173-175°С

6 Изорамнетин СгаНззО^ (трава чистотела большого) W (ЕЮН) 256 нм, 267 нм (пл ), 368 нм

7 Рутин С27Н30О16 (трава маклейи мелкоплодной) А™« (ЕЮН) 258 нм, 267 нм (пл ), 362 нм т пл 189-19ГС

и

"зт......эЬ"'" "за" з"*"' и'а^аг

Рис 2 - 'Н-ЯМР-спектр рутина в смеси дейтероацетона и БгО

2. Совершенствование методов стандартизации лекарственного сырья и препаратов чистотела большого.

Качество сырья чистотела большого в настоящее время регламентируется ГФ СССР XI издания (ст 47) Учитывая то обстоятельство, что в данной фармакопейной статье отсутствует раздел «Качественные реакции», ранее учеными СамГМУ проф В.А Куркиным, проф С В. Первушкиным и ст. препод. А А Сохиной разработан проект ФС, где предложено осуществлять определение подлинности сырья по содержанию алкалоидов, а также путем обнаружения доминирующего алкалоида - коптизина методом ТСХ. Разработана также методика количественного определения суммы алкалоидов, основанная на хроматоспектрофотометрии. Однако в анализе не используется стандартный образец коптизина. Учитывая возрастающий интерес к Государственным стандартным образцам (Арзамасцев А П., 2000, Багирова В Л., 2001), актуальным является разработка стандартного образца коптизина, с помощью которого можно более объективно оценивать качество сырья и препаратов на его основе

Кроме того, в действующей ФС на сырье чистотела в разделе «Микроскопия» отсутствуют микрофотографии, поэтому с учетом современных требований представляется актуальным включить их в соответствующий раздел НД

Актуальным представляется также разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве чистотела большого, по содержанию которых оценивают качество гомеопатических препаратов

2.1. Микроскопическое исследование травы чистотела большого

На микропрепарате травы чистотела большого после просветления объекта исследования в растворе хлоралгидрата видны клетки верхнего эпидермиса листа со слабо извилистыми боковыми контурами Клеточная стенка верхнего эпидермиса имеет небольшие четковидные утолщения. Клетки нижнего эпидермиса с сильно извилистыми контурами Устьица расположены только на нижней стороне листа Околоустичный аппарат состоит из 4-7 околоустьичных клеток (аномицитный тип) На эпидермисе нижней стороне листа встречаются простые, многоклеточные, 1-рядные волоски, клетки их тонкостенные, постепенно удлиняющиеся в направлении снизу вверх, иногда перекрученные или с отдельными спавшими члениками

Крупные жилки сильно выступают с нижней стороны листа Основная ткань главной жилки паренхиматозная, клетки которой значительно вытянуты продольно Вдоль главной жилки расположены спиральные сосуды

После просветления объекта изучения в щелочи на микропрепарате четко просматриваются проводящие жилки с млечными трубками и темно-бурым зернистым содержимым.

Результаты микроскопических исследований нашли отражение в проекте ФС «Чистотела большого трава».

2.2. Качественный анализ сырья чистотела большого и препарата «Чистотела настойка»

Для определения подлинности сырья чистотела большого использовали ТСХ-анализ, основанный на обнаружении и идентификации доминирующего алкалоида растения, причем с использованием коптизина, рекомендованного нами в качестве стандартного образца (проект ФС «Коптизин - стандартный образец»).

С целью унификации методов анализа сырья и препарата «Чистотела настойка» за основу взяты подходы к стандартизации, рекомендованные при разработке методики качественного анализа травы чистотела большого с использованием ГСО коптизина

При просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 254 нм на уровне пятна PCO коптизина обнаруживается доминирующее пятно с величиной Rf около 0,45, имеющее желтую окраску

При просмотре хроматограммы при длине волны 366 нм на уровне пятна ГСО коптизина обнаруживается доминирующее пятно с величиной И* около 0,45, имеющее ярко-желтую флуоресценцию

После обработки хроматограммы реактивом Драгендорфа на уровне пятна ГСО коптизина обнаруживается доминирующее пятно около 0,45), имеющее кирпично-красную окраску (рис 3) Допускается наличие других пятен.

Рис 3 - ТСХ сырья и настойки чистотела большого. Обозначения

1 - Водно-спиртовое извлечение из травы чистотела большого

2 - Чистотела настойка

3 - ГСО коптизина

Идентифицировать коптизин в сырье и настойке чистотела наряду с ТСХ-анализом предлагается по характеру УФ-спектра водно-спиртового извлечения, очищенного через слой оксида алюминия, который имеет максимумы поглощения при 280 нм+2 нм, 360 нм+2 нм и 460 нм+2 нм (рис 4) и по характеру кривой поглощения близок к таковому спиртового раствора ГСО коптизина (рис. 5).

Рис 4 - УФ-спектр вводио-спиртового извлечения травы чистотела большого, очищенного через слой оксида алюминия

А

Рис 5 - УФ-спектр спиртового раствора коптизина

2.3. Количественное определение суммы алкалоидов в траве и настойке чистотела большого

Учитывая тот факт, что доминирующими БАС травы чистотела большого являются алкалоиды, представляется целесообразным проводить анализ данного вида сырья именно по этой группе веществ.

Наиболее показательным и для УФ-спектров раствора коптизина и очищенного испытуемого раствора является максимум поглощения при длине волны 360 нм (рис 5) Параллельно при данной аналитической длине волны измеряется оптическая плотность раствора коптизина. Опыты с коптязином показали, что потери алкалоидов в условиях очистки на оксиде алюминия не наблюдаются

По данным литературы установлено, что наибольшее извлечение алкалоидов из сырья чистотела большого достигается при размере частиц 1 мм и экстракции сырья 70 % этиловым спиртом в соотношении 1 30 на кипящей водяной бане (умеренное кипение) В ходе разработки методики количественного определения суммы алкалоидов изучено влияние времени экстракции на извлечение целевого продукта (табл. 2).

Таблица 2 - Влияние времени экстракции на извлечение суммы алкалоидов из травы чистотела большого

Экстрагент (этанол) Соотношение сырье-экстрагент Время экстракции, мин Содержание суммы алкалоидов, %

70% 1 30 15 1,78

70% 1 30 30 1,82

70% 1 30 45 2,3

70% 1 30 60 1,9

В ходе исследований было показано, что наибольшее извлечение алкалоидов из сырья чистотела большого достигается при экспозиции 45 мин на кипящей водяной бане.

Метрологические характеристики разработанной методики количественного анализа суммы алкалоидов в траве чистотела большого и в настойке чистотела методом спектрофотометрии с использованием стандартного образца коптизина представлены в таблице 3 и 4

Таблица 3 - Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы алкалоидов в траве чистотела

большого

/ X 5 Р, % АХ Е, %

10 1,59 0,01 95 2,23 0,07 ±4,40

Таблица 4 - Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы алкалоидов в настойке

чистотела

/ X 5 Р, % КР,Л АХ Е, %

10 0,11 0,006 95 2,23 0,004 ±3,64

Опыты с добавками PCO коптизина к навеске сырья и в препарат показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики.

2.4. Количественное определение суммы флавоноидов в траве чистотела большого

С целью разработки методики нами были определены оптимальные условия экстракции травы чистотела большого* эктрагент 70% этанол, соотношение сырье-экстрагент - 1 30, время экстракции - настаивание на водяной бане при температуре 85-90°С в течение 45 мин (табл. 5)

В ходе разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в траве чистотела большого изучены УФ-спеюры водно-спиртовых извлечений из данного сырья (рис 6)

При разработке методики количественного определения суммы флавоноидов использовали реакцию комплексообразования с раствором алюминия хлорида для исключения вклада в значение оптической плотности других групп соединений. В этом случае наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов, который обнаруживается в УФ-спектре в виде максимума поглощения при длине волны 412 нм Это находит подтверждение в условиях дифференциальной спекгрофотомегрии. максимум поглощения при 412 нм (рис. 6).

Изучение УФ-спектров ГСО рутина показало, что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет тот же максимум поглощения (412 нм) Следовательно, рутин может быть использован в методике анализа в качестве ГСО

С использованием разработанной методики проанализирован ряд образцов сырья и показано, что содержание флавоноидов в траве чистотела большого варьирует в пределах от 0,50% до 1,51% На наш взгляд, это дает основание предложить в качестве нижнего предела показатель содержания суммы флавоноидов не менее 0,50%.

Таблица 5 - Зависимость полноты извлечения суммы флавоноидов из травы чистотела большого от условий экстракции

№ п/п Экстрагент (этанол) Соотношение сырье-экстрагент Время экстракции, мин Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье (в%)

1 40% 1.30 45 1,03

2 60% 1:30 45 1,19

3. 70% 1.30 45 1,53

4. 80% 1:30 45 1,49

5 70% 1 20 45 1,28

6 70% 150 45 1,33

7 70% 1 30 30 1,43

8 70% 1 30 60 1,46

9 70% 1 30 90 1,40

Рис 6 - УФ-спектры растворов извлечений из травы чистотела большого Обозначения • 1 - раствор извлечения из травы чистотела большого,

2 - раствор извлечения из травы чистотела большого с добавлением алюминия хлорида,

3 - раствор извлечения из травы чистотела большого с добавлением алюминия хлорида (дифференциальный спектр)

Метрологические характеристики методики количественного определения флавоноидов в траве чистотела большого методом дифференциальной спектрофотометрии представлены в таблице 6

Таблица 6 - Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы флавоноидов в траве чистотела большого

/ X s р, % t(PJ) AK Д %

10 1,01 0,06 95 2,23 0,04 ±3,96

Опыты с добавками PCO рутина к навеске сырья показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики

3. Совершенствование методов стандартизации травы маклейи мелкоплодной.

Необходимость во внесении изменений по разделам химической стандартизации, включения некоторых новых разделов и изменения редакции отдельных уже имеющихся продиктована рядом обстоятельств В разделе «Качественные реакции» (ФС 42-2666-89 «Трава маклейи») не используются такие современные методы анализа, как ТСХ и УФ-спектроскопия, нашедшие в последнее время широкое применение в методиках качественного анализа Использующиеся в НД на сырье маклейи качественные реакции являются общими реакциями на группу алкалоидов, что, на наш взгляд, не является доказательством содержания характерных алкалоидов изучаемого растения Использование ГСО сангвиршрина в методе ТСХ позволяет достоверно идентифицировать доминирующие алкалоиды, содержащиеся в извлечении из травы маклейи мелкоплодной С целью усовершенствования методов анализа сырья и препаратов маклейи нами были разработаны методики качественного анализа сырья маклейи с использованием ТСХ и УФ-спектроскошш.

3.1. Качественный анализ травы маклейи с использованием ТСХ-анализа.

Оценка подлинности сырья проводилась с использованием ТСХ-анализа и образца PCO сангвиритрина Хроматограмму просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм и 366 нм до и после обработки хроматограммы реактивом Драгендорфа При этом на хроматограмме на уровне пятен PCO сангвиритрина обнаруживаются 2 пятна с величиной Rf около 0,7 (сангвинарин) и 0,6

(хелеритрин), имеющих соответственно оранжевую и желтую окраску в видимом свете и ярко-оранжевую и ярко-желтую флуоресценцию при просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 366 нм, а также кирпично-красную и желтую окраску при проявлении реактивом Драгендорфа (рис 7) Допускается также наличие других пятен.

3.2. Качественный анализ травы маклейи с использованием УФ-спектроскопии.

Анализ УФ-спектров раствора PCO сангвиритрина показал, что данный раствор имеет следующие максимумы поглощения 272 нм, 283 нм (пл), 327 нм,

Рис 7 - Хроматограмма извлечений из травы

маклейи мелкоплодной (Сорбфил ПТСХ-ПА-УФ, хлороформ-этанол, 2 1).

Обозначения

1 - извлечение из травы маклейи, культивируемой в Ботаническом

саду г. Самары;

2 - извлечение из травы маклейи, культивируемой в п Антоновка Самарской обл. (ЗАО «Самаралектравы»);

3 - р-р PCO сангвиритрина,

УФ-спектр извлечения из травы маклейи мелкоплодной имеет следующие максимумы поглощения 273 нм, 283 нм (пл), 327 нм и 452 нм (пл) (рис 8) Следовательно, данные характеристики, а именно максимумы поглощения около 270 и 327 нм можно использовать для качественной и количественной идентификации сырья и препаратов маклейи

3.3. Количественное определение суммы флавоноидов в траве маклейи мелкоплодной

В ходе разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в траве маклейи мелкоплодной изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из данного сырья, а также УФ-спектр водно-спиртового извлечения после реакции комплексообразования с раствором алюминия хлорида (рис 8)

399 нм и 450 нм.

АЬзогЬзпсе

Рис. 8 - УФ-спектры растворов извлечений из травы маклейи мелкоплодной.

Обозначения: I - раствор извлечения из трапы маклейи мелкоплодной;

2 - раствор извлечения из травы маклейи мелкоплодной с добавлением алюминия хлорида.

Исходя из полученных в ходе исследования данных, а также то обстоятельсто, что доминирующим флавонондом травы маклейи мелкоплодной является рутин, раствор данного флавопоида был использован в методике анализа в качестве ГСО.

С использованием разработанной методики проанализирован ряд образцов сырья и показано, что содержание флавоноидов в траве маклейи мелкоплодной варьирует в пределах от 2,62 % до 3,94 %. На наш взгляд, это дает основание предложить в качестве нижнего предела показатель содержания суммы флавоноидов не менее 2,50 %.

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в траве маклейи мелкоплодной методом дифференциальной спектрофотометрии представлены в таблице 7,

Опыты с добавками PCO рутина к навеске сырья показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики.

Таблица 7 - Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы флавоноидов в траве маклейи

мелкоплодной

/ X S Р, % t(P,f) АХ Е, %

10 3,28 0,21 95 2,23 0,14 ±4,27

4. Исследования по разработке лекарственного седства «Маклейи настойка»

Антимикробная активность препарата «Маклейи настойка» изучалась в сравнении с антимикробной активностью препарата «Сангвиритрин» методом титрования на плотных питательных средах в отношении 8 тест-штаммов микроорганизмов (Bacillus fntracoides, Staphylococcus aureus, Bacillus mesentericus, E Coli, S Gertneri, Shigella flexneri, B. Phyocmeum, Candida) Максимально испытуемая концентрация настойки маклейи равнялась 10000 мкг/мл, сангвиритрина 500 мкг/мл Данные результатов исследования приведены в таблице 8

Таблица 8 - Антимикробная активность препаратов «Маклейи настойка» и

«Сангвиритрин»

Палочка антракоида Золотистый стафилококк Мезентерикус Кишечная палочка Дизентирийная палочка Флекснера Сальмонелла Гергаера Синегнойная палочка Кандиды

«Маклейи настойка», мкг/мл 1250 1250 1250 >10000 5000 >10000 >10000 500

«Сангвиритрин», мкг/мл 62,5 62,5 62,5 >500 >500 >500 >500 100

Этанол 70% >10000 >10000 >10000 >10000 >10000 >10000 >10000 >10000

Как видно из приведенных данных настойка травы маклейи мелкоплодной проявляет выраженную антимикробную активность в отношении палочки антракоида, золотистого стафилококка, мезентерикуса, дизентерийной палочки Флекснера и кандид Отмечена высокая активность настойки маклейи в отношении Candida (500 мкг/мл) и достаточно высокая активность (1250 мкг/мл) в отношении

Bacillus fntracoides, Staphylococcus aureus, Bacillus mesentericus Таким образом, препарат «Маклейи настойка» может быть рекомендована в составе комплексной терапии в качестве антимикробного средства

4.1. Разработка методов стандартизации препарата «Маклейи настойка»

С целью унификации методов анализа сырья и готовой продукции за основу взяты подходы к стандартизации, рекомендованные при разработке методик качественного и количественного анализа травы маклейи мелкоплодной с использованием РСО сангвиритрина Разработаны методики химической стандартизации препарата «Маклейи настойка», основанные на определении доминирующих алкалоидов сангвинирина и хелеритрина методами ТСХ и спектроскопии.

4.1.1.Качественный анализ препарата «Маклейи настойка» с использованием ТСХ-анализа и УФ-снектроскопии.

При просмотре хроматограммы препарата «Маклейи настойка» в УФ-свете при длине волны 254 нм и 366 нм до и после обработки хроматограммы реактивом Драгендорфа на уровне пятен ГСО сангвиритрина обнаруживаются 2 пятна с величиной Rf около 0,7 (сангвинарин) и 0,6 (хелеритрин), имеющих соответственно оранжевую и желтую окраску в видимом свете и ярко-оранжевую и ярко-желтую флуоресценцию при просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 366 нм, а также кирпично-красную и желтую окраску при проявлении реактивом Драгендорфа Допускается также наличие других пятен

При разработке метода качественного анализа настойки травы маклейи мелкоплодной методом УФ спектроскопии были установлены 4 характерных максимума поглощения' 273 нм, 283 нм (пл), 327 нм и 452 нм (пл)

4.1.2. Количественное определение суммы алкалоидов в настойке маклейи мелкоплодной.

Проведенные исследования с очисткой настойки маклейи на оксиде алюминия показали, что часть алкалоидов задерживается этим сорбентом, что приводит к заниженным результатам, причем это подтверждено в опытытах с фильтрацией РСО сангвиритрина через слой оксида алюминия

В качестве аналитической выбрана длина волны 452 нм

Содержание суммы алкалоидов в пересчете на сангвиритрин в различных образцах препарата находится в пределах от 0,12 % до 0,23 % В качестве нижнего предела содержания суммы алкалоидов в настойке маклейи рекомендован показатель не менее «0,1 %».

Метрологические характеристики разработанной методики количественного анализа суммы алкалоидов в настойке маклейи методом спектрофотометрии с использованием PCO сангвиритрина представлены в таблице 9

Таблица 9 - Метрологические характеристики спектрофотометрической методики количественного определения суммы алкалоидов в настойке маклейи

/ X S Р, % t(P,fi АХ Д %

10 0,14 0,009 95 2,23 0,006 ±4,29

Опыты с добавками PCO сангвиритрина в препарат показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики (опыты с добавками)

ВЫВОДЫ

1 В результате сравнительного изучения химического состава травы чистотела большого (Chelidonium majus L.) и травы маклейи мелкоплодной (Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde), культивируемых в Самарской области, выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединений, относящихся к алкалоидам и флавоноидам

2 Выделенные вещества идентифицированы с испоьзованием ТСХ-анализа, УФ-, 1 Н-ЯМР-спектроскопии и различных химических превращений как алкалоиды коптизин, берберин, сангвинарин, хелеритрин и флавоноиды рутин, нарциссин и агликон изорамнетин. Флавоноиды нарциссин и рутин впервые выделены из травы чистотела большого и маклейи мелкоплодной соответственно

3 Предложены новые подходы к стандартизации сырья и препаратов травы чистотела большого, заключающиеся в ипользовании в методиках анализа ГСО коптизина с учетом принципа унификации методик в ряду ЛРС-субстанция-лекарственная форма

4 Разработаны методики качественного анализа травы чистотела большого, настойки чистотела и травы маклейи мелкоплодной, основанные на обнаружении доминирующих алкалоидов с использованием ТСХ-анализа, УФ-спектроскопии, а также ГСО коптизина и PCO сангвиритрина соответственно

5. Разработаны методики спектрофотометрического количественного определения суммы алкалоидов в траве чистотела большого и препарате «Чистотела настойка» с использованием ГСО коптизина (аналитическая длина волны 360 нм)

6 Разработаны методики качественного и количественного анализа алкалоидов в «Маклейи настойке» методом ТСХ-анализа и УФ-спектроскопии с использованием PCO сангвиритрина.

7 Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в траве чистотела большого и траве маклейи мелкоплодной методом дифференциальной спектроскопии с использованием PCO рутина

8. В качестве нижнего предела содержания суммы флавоноидов в траве чистотела большого и траве маклейи мелкоплодной предложен показатель «не менее 0,50 %» и «не менее 2,50 %» соответственно.

9 На основании экспериментальных данных, полученных в ходе микроскопических, химических и аналитических исследований разработаны проекты ФС «Чистотела трава», «Коптизин - стандартный образец» и ФСП «Чистотела настойка» для включения в Российскую Государственную фармакопею ХП издания

10 В проект ФС «Чистотела настойка» в разделы «Подлинность» и «Количественное определение» введены методики качественного и количественного анализа препарата, в которых предложено использовать ГСО коптизина.

11 На основании химических, аналитических, технологических и микробиологических исследований обоснована целесообразность разработки нового антими1фобного лекарственного средства «Маклейи настойка»

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Браславский, В Б Перспективы использования антибактериальных растительных средств в медицинской практике. / В.Б. Браславский, О.Е

Правдивцева, А В. Куркина, В В. Стеняева, А И, Бонцевич, О В Шарова, Е С Артамонова, В М Рыжов // Экология и здоровье человека Труды X Всероссийского конгресса, Самара 11-13 октября 2005 г - Самара, 2005 - С 42-43.

2 Артамонова, ЕС. Сравнительное фитохимическое исследование травы чистотела большого и видов маклейи /ЕС Артамонова, В А Куркин // Экология и здоровье человека Проблемы выживания человека в техногенной среде современных городов- Труды XI Всероссийского конгресса, Самара, 5-7 декабря 2006 г - Самара, 2006 - С. 18-19

3. Куркин, В.А Актуальные аспекты стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего флавоноиды / В А Куркин, Е В Авдеева, В Б Браславский, ОЕ. Правдивцева, AB. Куркина, М.В. Егоров, О.В Шарова, ЕС Артамонова, В.М Рыжов, Ламрини Мохаммед // Человек и лекарство- Тез докл XIV Рос нац. конгр., Москва, 16-20 апр. 2007 г. - М, 2007 - С 839

4 Артамонова, Е.С. Сравнительное фитохимическое исследование травы чистотела большого и видов маклейи /ЕС Артамонова // Аспирантские чтения-Материалы межвуз конф молодых ученых - Самара, 2006. - С 221-225

5 Артамонова, Е С Проблемы стандартизации сырья чистотела большого / Е С Артамонова // Молодые ученые в медицине- Тез. докл XII Всероссийской научно-практической конф , Казань, 25-26 апр 2007 - Казань, 2007 - С 245

6. Артамонова, Е С Актуальные аспекты стандартизации сырья и препаратов чистотела большого / ЕС. Артамонова, В А. Куркин // Медико-социальная экология личности состояние и перспективы- Материалы V Международной конф , Минск, 6-7 апр. 2007. - Минск, 2007 - С 256-257

7 Артамонова, Е С Современные подходы к стандартизации сырья и препаратов чистотела большого / Е.С Артамонова // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. Материалы П1 Всероссийской конф , книга 2 - Барнаул, 2007 - С 267-270.

8. Куркин, В.А. Определение флавоноидов в траве чистотела большого / В А. Куркин, ЕС Артамонова //Фармация -2007 -№5 -С.10-12

9. Артамонова, Е С Актуальные аспекты стандартизации сырья и препаратов маклейи /ЕС Артамонова, В.А. Куркин // Химия растительного сырья -2007 -№2 - С 55-58

Подписано в печать 19 09 2007 Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать оперативная Уел печ л 1,63 Тираж 100 зкз Заказ 979

Ошечатано в типографии ООО «ОФОРТ» 443080, г Самара, ул Революционная, 70, литера П Тел 372-00-56,372-00-57

Актуальность темы. В медицинской практике с целью профилактики и лечения различных заболеваний широко используются противовоспалительные, антимикробные и регенерирующие лекарственные средства растительного происхождения. Однако проблема создания эффективных фитопрепаратов данного спектра действия по-прежнему остается актуальной. Это связано с тем, что лекарственные средства на основе природных биологически активных соединений (БАС) обладают рядом преимуществ по сравнению с их синтетическими аналогами, так как широта терапевтического действия фитопрепаратов сочетается с минимальными побочными эффектами, что особенно важно при лечении хронических заболеваний. Такие свойства препаратов обеспечивает ряд биологически активных соединений растительного происхождения, в том числе и алкалоиды.

Перспективными источниками получения антимикробных лекарственных средств являются трава чистотела большого {Chelidonium majus L.) и трава маклейи (Macleaya Sp.) - видов сем. Маковых {Papa veraceae). Ранее при химическом изучении чистотела большого было обнаружено, что в нем содержатся алкалоиды сангвинарин и хелеритрин, и трава чистотела большого была предложена в качестве источника получения данных алкалоидов [180]. Однако в дальнейшем было установлено, что вследствие низкого содержания сангвинарина и хелеритрина, производство препарата «Сангвиритрин» из травы чистотела большого экономически нецелесообразно. Поиски данных алкалоидов в других растениях сем. Маковых привели к тому, что вследствие высокого содержания сангвинарина и хелеритрина в траве маклейи данное растение рекомендовано для получения лекарственного средства «Сангвиритрин». Препарат «Сангвиритрин», представляющий собой сумму бисульфатов алкалоидов сангвинарина и хелеритрина нашел широкое применение в дерматологии, стоматологии, гинекологии и неврологии. Данный препарат обладает широким спектром антимикробной активности, ингибируя развитие грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжеподобных и мицелярных грибов, патогенных простейших. В числе положительных качеств отмечают высокую эффективность, хорошую переносимость, отсутствие общетоксических и местнораздражающих свойств, отсутствие явления резистентности даже при длительном применении.

Несмотря на многолетний опыт применения данных растений в медицинской практике, проблема более подробного изучения химического состава данных растений, стандартизации и создания новых отечественных фитопрепаратов на их основе по-прежнему остается актуальной.

Оценка качества лекарственного растительного сырья (ЛРС) травы чистотела осуществляется в соответствии с ФС 47 ГФ СССР XI издания «Трава чистотела большого». Ранее были разработаны объективные методики качественного и количественного анализа сырья и препаратов чистотела большого, однако в них не предусмотрено использование государственного стандартного образца (ГСО) (Первушкин С.В.,2000; Сохина А. А., 1999).

Необходимость совершенствования нормативной базы возникает в связи с тем, что современные тенденции развития методов стандартизации лекарственных средств служат предпосылкой для формирования новых фармакопейных требований к их качеству (Арзамасцев А.П., 2000; Багирова В.Л., 2001). В отношении обсуждаемого объекта целесообразным представляется пересмотр разделов «Качественные реакции» и «Количественное определение», что обусловлено повышением уровня требований к объективности и унифицированности методов анализа сырья, фитосубстанций и лекарственных средств (Самылина И.А., 1994).

Таким образом, представляется актуальным дальнейшее фитохимическое исследование сырья чистотела большого и маклейи, а также поиск новых путей к решению проблемы химической стандартизации сырья и препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является фитохимическое исследование травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной и разработка новых подходов к решению проблемы стандартизации сырья и препаратов на их основе.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Сравнительное изучение химического состава травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной.

2. Разработка подходов к стандартизации сырья и препаратов чистотела большого и маклейи с учетом принципа унификации методик в ряду ЛРС — субстанция - лекарственная форма.

3. Разработка методик качественного анализа травы чистотела большого, а также галенового препарата «Чистотела настойка» с использованием стандартного образца коптизина.

4. Разработка методик количественного анализа травы чистотела большого и галенового препарата «Чистотела настойка» с использованием стандартного образца коптизина.

5. Разработка методик качественного анализа травы маклейи мелкоплодной и препарата «Маклейи настойка».

6. Разработка методик количественного определения суммы флавоноидов в траве чистотела большого и траве маклейи.

7. Разработка и изучение в процессе хранения числовых показателей травы чистотела большого, а также препарата «Маклейи настойка».

8. Разработка проекта нормативной документации (НД) на траву чистотела большого, ГСО коптизина и галенового препарата «Чистотела настойка».

Научная новизна. В результате сравнительного изучения химического состава травы чистотела большого (СкеИйопшт та]т Ъ.) и травы маютейи мелкоплодной (Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde), культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединений, относящихся к алкалоидам и флавоноидам. Из травы чистотела большого впервые выделен нарциссин (З-О-рутинозид изорамнетина), а из травы маклейи мелкоплодной - рутин (З-О-рутинозид кверцетина). Для установления структуры и изучения физико-химических свойств выделенных соединений были использованы метод УФ-, ЯМР-спектроскопия, тонкослойно-хроматографического анализа (ТСХ), а также результаты различных химических превращений (кислотный, ферментативный гидролиз).

Обоснована необходимость использования в методиках качественного и количественного анализа травы чистотела большого и препаратах на его основе ГСО коптизина.

Обоснована целесообразность использования ТСХ и УФ-спектроскопии для определения подлинности сырья и препаратов маклейи.

Практическая значимость. Охарактеризованы выделенные и идентифицированные доминирующие вещества травы чистотела большого и травы маклейи: коптизин, берберин, сангвинарин, хелеритрин, рутин, нарциссин и изорамнетин.

Разработаны методики качественного и количественного анализа травы чистотела большого с использованием ГСО коптизина.

Разработаны методики качественного анализа травы маклейи с использованием ТСХ-анализа, ГСО сангвиритрина и УФ-спектроскопии.

Определены и изучены в процессе хранения числовые показатели качества травы чистотела большого, травы маклейи, препарата «Маклейи настойка», в том числе «Содержание алкалоидов», «Сухой остаток», «Концентрация спирта», «Микробиологическая чистота.

Разработаны проекты фармакопейных статей «Чистотела большого трава», «Коптизин - стандартный образец», фармакопейной статьи предприятия «Чистотела настойка».

Результаты исследований используются в научных изысканиях и учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (акты внедрения № 1-2 от 03.09.07 г.). Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты сравнительного изучения химического состава травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной.

2. Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации сырья чистотела большого и маклейи, а также препаратов на их основе.

3. Методики качественного и количественного анализа сырья чистотела большого и препарата «Чистотела настойка» с использованием ГСО коптизина.

4. Методики качественного анализа травы маклейи мелкоплодной и препарата «Маклейи настойка» с использованием ТСХ-анализа, ГСО сангвиритрина и УФ-спектроскопии.

5. Методика количественного анализа флавоноидов в траве чистотела большого и траве маклейи мелкоплодной.

6. Результаты исследований показателей качества ЛРС «Чистотела большого трава» и лекарственного средства «Маклейи настойка».

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Государственная регистрация № 012001053332) и республиканских программ:

Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме: «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277).

Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 01990007536).

Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на X и XI Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2005; 2006); Всероссийской научно-практической конференции «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» (Томск, 2006); Межвузовской конференции молодых ученых «Аспирантские чтения» (Самара, 2006); XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007); XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007); V Международной конференции «Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы» (Минск, 2007); III Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2007).

Основное содержание работы опубликовано в 9 научных работах.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 31 рисунок. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 4-х глав, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 208 источников, из которых 28 — на иностранных языках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В результате сравнительного изучения химического состава травы чистотела большого и травы маклейи мелкоплодной, культивируемой в Самарской области, выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединений, относящихся к алкалоидам и флавоноидам.

2. Выделенные вещества идентифицированы с использованием ТСХ-анализа, УФ-, 'Н-ЯМР-спектроскопии и различных химических превращений как алкалоиды коптизин, берберин, сангвинарин, хелеритрин и флавоноиды рутин, нарциссин и агликон изорамнетин. Флавоноиды нарциссин и рутин впервые описаны для травы чистотела большого и маклейи мелкоплодной соответственно.

3. Предложены новые подходы к стандартизации сырья и препаратов травы чистотела большого, заключающиеся в использовании в методиках ГСО коптизина с учетом принципа унификации методик в ряду JIPC-субстанция-лекарственная форма.

4. Разработаны методики качественного анализа травы чистотела большого, настойки чистотела и травы маклейи мелкоплодной, основанные на обнаружении доминирующих алкалоидов с использованием ТСХ-анализа, УФ-спектроскопии и ГСО коптизина и PCO сангвиритрина соответственно.

5. Разработаны методики количественного определения суммы алкалоидов в траве чистотела большого и «Чистотела настойке» с использованием ГСО коптизина методом УФ-спектроскопии (аналитическая длина волны 360 нм).

6. Разработаны методики качественного и количественного анализа алкалоидов в препарате «Маклейи настойка» методом ТСХ-анализа и УФ-спектроскопии с использованием PCO сангвиритрина.

7. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в траве чистотела большого и траве маклейи мелкоплодной методом дифференциальной спектроскопии с использованием PCO рутина.

8. В качестве нижнего предела содержания суммы флавоноидов в траве чистотела большого и траве маклейи мелкоплодной предложен показатель «не менее 0,50 %» и «не менее 2,50 %» соответственно.

9. На основании экспериментальных данных, полученных в ходе микроскопических, химических и аналитических исследований разработаны проекты ФС «Чистотела трава», «Коптизин - стандартный образец» и проект ФСП «Чистотела настойка» для вкючения в Российскую Государственную фармакопею XII издания.

10. В проект ФС «Чистотела настойка» в разделы «Подлинность» и «Количественное определение» введены новые методики качественного и количественного анализа препарата, в которых предложено использовать ГСО коптизина.

11. На основании химических, аналитических, технологических и микробиологических исследований обоснована целесообразность разработки нового антимикробного лекарственного средства «Маклейи настойка».