Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Профилактика нарушения окислительно-восстановительных процессов и процессов перекисного окисления липидов у собак при стрессе

«.иоииэиъь эдпьтзъзьипьшшъ ъшиигигпь&зпьъ «.ивиивиъь ««шьаизъвьиачиъ ичиаьим1

ЗЬпшц(ф (чшЦтЬры)

ичгвзваъ аг»пьг апрьгяь

оеиь'шчьгиадъчъииъ ъч лиг'пьгь «к»гпеиь'шв1шъ •пговьоъьгь ьлплагпмгььгь чиъьшгадцпьис съьгкипз озгьиивьъ "твит/ььгпмг

и/шиЬил^плтр^гнЬ сЮ-00,02.— иЬ1с|шЪ|11)Ьр|> ифтшршЪшр^гиЬ, пптц-

ршршЬтр ;тЪ, 1|шпп1Ц1|ш& ршрш1п||,м'и Ь

ШаииЪшртйш^шЪ д{илшр]ш1Л1Ьр)1 рЬ1|1(ШЙпф ч[тш!)ш1| шши^шЪ)! Ьш]д^ш1| ш1лЫ]ш)<>пит|»]ш\1

иъчишы-г

ЬришЬ - 1997

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ АРМЯНСКАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

На np.ip.ix I МКРТЧЯН АРТУР РОБЕРТОВИЧ

ПРОФИЛАКТИКА НАРУШЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИЛОН У СОБАК ПРИ СТРЕССЕ

Специальность «К? 00.02. - Патология, онкология

МОрфОЛОГИЯ «И!!ОТ1Ш*

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Ереван - 1997

ш)иш. пш^п^ЬишршЪпф Ц Ьр1хшЬ^

и. ш1л|шЬ щЬшшЦиЬ рй^ш^шЪ Ьш^шишршЬ)! (¡Ь^ЬшЬтр -

^ЬЬишищшЬшЦшЬ |Ыр[)л1Л)Ьрл1 |1:

(Ц)и1ш1{ши цЬЦшЦшрЪЬр' ц1илшр1шЬ 4шии1ш1|ш4пр цпр4()*,

шЬшиЪшршс!. 1 црлфЬипр

чгьчпгоиъ 1Гщрчшр1)№ш иЬрч^ф

иЫшшршЬ. 4))1Л. 1 л^шпр, щрпфЬипр

иъичпъвиъ Циодш т>Ьр[1

*11ш;шпишЦшЪ ц1и)1)1|(1ш1ипа'ЬЬр'' иЛшиЪшртЙ. црт. чг^шпр. ЧцрпфЬипр

ииьгаэрьчваъ ч. а.

иЬ1>ишрш1]. ц|чл. >)п1{тпр, щрпфЬипр

иьеиы.виъ и. ииш$ш(лшр 1{шя(Гш1{Ьр(цп(р{шЪ - ЬркшЬ^ и.гьризль шЦшЪ щьиш^шь

-/г

»¿ШШДЩк.1997р.п.. ¿<Ш ишцЬицртшЦшЪ ^прЬр^!, 022 {ЪШМштЫ 1375025, ЬришЪ. БЬр)ш1|р 74)

ишЬ\1ш|ипишр|шЪс с йшЬпрцЛищ ¿4Ц-|| цршцшршЬли)

■/0 »¿лбу&^ейрюм».

ишиЬшЩилшЦшЪ црт.ешринчцшр » ОЩ-Р. СиШЦвШ, ЧДГ.

Работа выполнена на кафедре Физиологии, патофизиологии 1 радиобиологии Армянской сельскохозяйственной академии и на кафедре ►ббтей и биоорганической химии Ереванского государственное медицинского университета им.М.Гераци.

аучные руководители:

Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки РА, доктор ветеринарных наук, профессор ГРИГОРЯН Маргарита Сергеевна. Доктор биологических наук, профессор МЕЛКОНЯН Магда Мгеровна

доктор ветеринарных наук, профессор СПФРЙЗБЕКЯН В.И. Доктор биологических наук, профессор МИКАЕЛЯН Э.Н.

Ведущее предприятие - Кафедра патофизиологии Ереванского государственного медицинского университета им.М.Гераци.

Зашита состоится 1997 г. в час. на заседа-

нии Специализированного Совета 022 Армянской сельскохозяйственной академии (375025, Ереван, ул. Теряна 74).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Арм.с/х академии Автореферат разослан

{&_ РАгжи^/сс^997 г

Ученый секретарь

специализированного совета

к.в.н. А.М.Бадалнн

1. ОБИЯЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В на стоянк е время объем информации по различным аспектам проблемы стресса необычайно расширился. Имеющийся Фактический материал, содержит данные. свидетельствующие о глубоких Функциональных и органических изменениях. происходящих в организме человека и животннх в уел-пнях стресс-реакции.

Общепринято считать, что по своей биологической сущности стресс является адаптивной реакцией организма, однако в определенных условиях она может способствовать, и. ла.т.е стать причиной возникновения Различных заболеваний. Это положение побудило ученых вести поиски путей и средств. - предотвращающих или сп-ани-чнвакшжх возможные негативные последствия стресс-реакции. Р :->той связи возникло новое направление - Фармакологическая регуляция стресса при помоши различных средств.

Как показывают имеющиеся данные литературы ?ти срсдст! 1 могут быть использованы в целях повышения обшей резистентности организма. увеличения энергетической потенции клеток. снижения уровня свободнораликального окисления (ПРО) п тканях и многое другое.

В свете приведенного имея ввиду все расширяют* <■ ся использование собак в жизни общества, а также и то, что испольт-мние собак нередко происходит в экстремальных условиях (войны - горячие точки. землетрясения. пожары, наводнения и т.п.!, лелает настоятельно необходимым глубокое и разносторонне изучение изменений. происходящих в организме собак в условиях стресс-реакции и не менее важное изыскание средств и способор направленного

ьозхкне-твии не) течение стресс-реакиии. предупреждение и коррекция 1н желательных последствий стресса.

У митинг» я все вышесказанное а настоящее время представляются .актуальными исследования, направленные на глубокое изучение процессов , происходящих в организме собак при стрессе - в том числе со.чиннне окислительно-восстановительных процессов и процессов п.-И г.иснсн о оксилс-ния липидов (ПОЛ) - как важных составных обмена 1« шесть и энергии, а также поиск средств, с помошью которых стала бы возможной профилактика стресса и его последствий, важное! 1 которых диктуется разносторонней потребностью использования '"бак в экстремальных условиях.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение влиянии экстракта элеутерококка на. некоторые показатели окислитель-цп-ьосстаноьительных процессов и процессов ПОЛ как у интактных животных, так и у животных в условиях стресса.

Основные задачи.

1. Провести определение показателей окислительно-восстано-ьитслмшх процессов на примере количества эритроцитов. гемоглобин.1». гсматокритного числа, содержания сахара и активности ката-лази крови, а также величины интегральных показателей (температур.», пульс. дыхг»ние)

1.1. у крыс в условиях стресса, вызванного вибрационным, вибр.ишонно-акустистическими Факторами;

1.2. у собак - при иммиоилизаиионном стрессе.

2. Исследовать влияние экстракта элеутерококка на вышеуказанные показатели у интактнил животных и в условиях стресса.

3. Провести определен!. нижеследующих показателей ПОЛ на примере следующих пока за те-;.: и:

я) аскорбатзависимое ПОЛ (ЛЗП> в мембранах эритроцитов и митохондриях головного мозга и печени:

б) НАДФН-зависимое ПОЛ (НЭП) в мембранах эритроцитов и митохондриях головного мозга и печени:

в) содержание ацилгидроперекисей (ПГП) в плазме крови, мембранах эритроцитов и митохондриях головного мозга и печени:

г) содержание диеновых кон-могатов (ДК) в плазме крови, мембранах эритроцитов и митохондриях головного мозга » печени:

д) содержание шиффовых оснований (ШО) в плазме крови, мембранах эритроцитов и митохондриях головного мозга и печени:

е) содержание сС -токоферола ( Л. -ТФ) в плазме крови, мембранах эритроцитов и митохондриях головного мозга и печени

3.1. у крыс в условиях стресса, вызванного вибрационным. вибрационно-акустистическими Факторами:

3.2. у собак - при иммобилизационном стрессе.

4. Изучить влияние экстракта элеутерококка на вышеуказанные показатели у интактных животных и в условиях стресс.1.

Научная новизна работы. Нами впервые в систематических исследованиях на крысах и собаках установлено регуляторное влияние экстракта элеутерококка на показатели окислителык»-иосстаног.и-тельных процессов и процессов ПОЛ в условиях стресса, вызванного вибрационным и комбинированным вибрационно-аку стичс-ским факторами у крыс, и имммобилизационным (жесткая фиксация! у собак.

Нами показано, что предварительное введение экстракта элеутерококка предотвращает развитие гипергликемии, возрастание активности каталазы, развитие анемического синдрома, увеличение фоновых липидных перекисей (ФЛП) в плазме крови, возрастание интенсивности индуцированных процессов ПОЛ, увеличите содержания

ЛГИ и ДК, изменение содержания ШО и эндогенного антиоксиданта -токоферола в плазме крови, вышеуказанных мембранных структура л.

Нами получены новые данные, показывающие, что предварительно введенный экстракт элеутерококка ведет к нормализации показателей окислительно-восстановительных процессов и процессов ПОЛ, что I; известной мере будет способствовать восстановлению нарушенного при стрессе гомеостаза организма, что позволит более эф-Фектиьно исп•.'.газовать собак соответствующими службами в экстремальных условиях, а также избежать возможность того, чтобы стрссс стал пусковым механизмом какой-либо патологии.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты приведенного исследования расширяют имевшиеся представления об изменениях, происходящих в Физиологических и биохимических процессах организма в условиях стресса у собак, тем самым обогащая новыми данными общее учение о стрессе и кинологию - основу современного собаководства. Установленное нами влияние экстракта элеутерококка на показатели окислительно-восстановительных про-1К-сс. ь и процессов ПОЛ у собак при стрессе найдут широкое применение в практике собаководства, и, в особенности, при использо-ьашш собак разными службами в экстремальных условиях.

2. ОБЪЕКТ В МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

У всех животных нами изучались показатели окислительно-восстановительных процессов и процессов ПОЛ.

Подсчет количества эритроцитов проводился по Горяеву в двух параллельных камерах. Содержание гемоглобина определялось по Са-ли.

Определение гематокритного числа проводилось при помощи прямого гематокрита одновременно в двух параллельных трубках при 500 об/мин.

Содержание глюкозы в крови определялось методам Гультмана в модификации Хиварина Никкила (Колб В.Г.. Камышников P.C.. 1982). В основе этого метода лежит определение интенсивности раствора, образующегося при взаимодействии ортотолуидина с глюкозой.

Активность каталазы в крови определялась метолом А.Н.Баха и С.Г.Зубковой (Предтеченский В.Е., i960). Метод заключается в разложении каталазой перекиси водорода, что и определяется при титровании перманганатом калия.

Определение индуцированного ПОЛ (АЭП и НЭП) г гомогс-натах тканей, в мембранах эритроцитов, мембранах митохондрий проводилось методом Ю.А.Владимирова и А.И.Арчакова. основанного на цветной реакции малонового диальдегида (МДА) с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), оптическую плотность окраски измеряли при длине волны 535 нм.

Определение уровня ФЛП (ТБК-активных продуктов) в тканях и плазме крови проводилось по методу, описанному Yonhlokn. Knwnda и основано на определении ТБК-окрашенных продуктов в бутанольнпй Фазе, т.е. промежуточных или вторичных продуктов переокисления липидов (МЛН и других карбонильных соединений). образующихся в результате распада гидроперекисей полиненасыш<нних жирных кислот .

Содержание АГП и ДК определялось спектрофотом( трнчески.

Для определения ДК в гомогенатах тканей и цельной крови бил )н-Ц|<Л1.:зоьан метод Планера с модификациями. ДК определялись сп.-кчрофотометрически по максимуму в спектре поглощения при длине ьчлни 233 им.

Оид«ржание ШО и sC -токоферола определяли флюорометрически. сС -токоферол в гомогенатах печени, мозга, плазмы крови, в мембранах эритроцитов, микросом и митохондрий определяли флюоро-метричс-ским способом на флюоресцентном спектрофотометре Hitachi (модель МРГ 2А) при максимуме флюоресценции 330 нм.

Результаты исследований подвергались статистической обра-ooTKt по И.Л. Ойвину (1960).

Схема исследований. Объектом исследований были крысы-самцы kiu'Cwi 150-200 г и беспородные, собаки-самцы массой 15-20 кг, содержащиеся в обычных условиях вивария. Под опытом находились 64 <:.1;Л1К крысы и 8 собак. Крысы и собаки содержались соответственно и одинаковых условиях и на обычном рационе для данного вида животно! о.

Подопытные крысы были разделены на восемь групп: и;уния группа - контрольная.

ьторлл группа - получала экстракт элеутерококка из расчета 0.07!. мл на одно животное в течение семи дней,

г[ч.ц.ц групп.? - получала экстракт элеутерококка из расчета 0.07 5 мл в течение двух дней,

чгтн1рт;1И группа - при помощи шюттель аппарата подвергалась действию горизонтальной вибрации (112 качательных движений камер ь мин) ,

пития группа - была подвергнута комбинированному действию вибрационного (в тех же условиях, что и крысы четвертой группы)

и акустического (91 дБА с максимальной энергией в области средних и высоких частот) факторов,

шестая группа - до того, как подвергнуться действию вибрл-онного фактора получали в течение семи дней экстракт элеутерококка в вышеуказанной дозе,

седьмая группа - до того, как подвергнуться комбинированному действию вибрационного и акустического факторов получали в течение семи дней экстракт элеутерококка в вышеуказанной дозе.

роемая группа - до того, как подвергнуться комбиниророван-ному действию вибрационного и акустического факторов получали экстракт элеутерококка в вышеуказанной дозе в течение двух дней.

Иммобилизационный стресс у собак вызывали путем жесткой фиксации их на специальном станке (в нашей модификации) в продолжение двух часов. Определение показателей кропи проводилось до и после иммобилизации. В целях предотвращения происходящих нарушений при стрессе нд примере изучаемых нами показателей подопытным собакам задавали внутрь экстракт элеутерококка из расчета 0,5 мл на 1 кг веса в течение семи дней. Для определения результатов этой части исследований забор крови проводили также до и после повторной иммобилизации.

Кровь, мозговую и печеночную ткани брали у крыс после дг-ка-питации, у собак забор крови проводили путем катетеризации передней наружной плюсневой вены.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Динамика некоторых показателей крови животных и условиях стресса

Из имеющихся литературных данных известно, что действие на организм животных различных Факторов среды в чрезвычайных размерах сопровождается резко выраженными изменениями в периферической крови.

По данным других исследователей ь различных стрессовых ситуациях. обусловливающих длительное напряжение организма, развивается анемический синдром, характеризующийся уменьшением количества эритроцитов крови и нарушением энергетического обмена в них.

В сьете сказанного в первой серии экспериментов нами были предприняты исследования по изучению количества эритроцитов, содержания гемоглобина и гемотокритного числа крови белых крыс, поды, ['гнутых действию вибрационного и комбинированному действию ыи.р.ишонного и акустического факторов. Исследования были проведена как до, так и после двухчасового действия стрессоров.

1*0 второй серии экспериментов те же параметры были изучены на собаках, подвергнутых жесткой иммобилизации в течение двух часоь. Определение избранных нами показателей крови проводилось у жинотних как до, так и после иммобилизационного стресса.

После двухчасового действия вибрации у крыс четвертой группы количество эритроцитов изменилось незначительно, а содержание гемоглобина и гематокритное число уменьшились и составили соот-ытственно а0 + 2 при контроле 86.3 ± 2 или на 7.3% и

35,8 + 0.3 при контроле 38.5 + 0.5 или на 7.2%. После двухчасового действия комбинированного вибрационно-акустического Фактора у крыс пятой группы количество эритроцитов уменьшилось и составило 3,162 ± 2,3 при контроле 3,523 ±1,0 или на 10,3%. Содержание гемоглобина и гематокритное число уменьшились и составили соответственно 80 ± 1,5 при контроле 86.3 + 2.2 или на 7,3% и 37 + 0,5 при контроле 38.5 ± 0,5 или на 3.9г (табл.И.

Таким образом комбинированное действие вибрационного и акустического Факторов вызывает более глубокие изменения в количестве эритроцитов, чем действие одного вибрационного фактора.

После двухчасового иммобилизационного стресса у собак количество эритроцитов уменьшилось по сравнению с исходным. Так. до иммобилизации количество эритроцитов составляло 4,233 ± 4,9, а после иммобилизации - 3,58 ± 5. Заметно было снижено содержание гемоглобина и гематокритного числа, составив соответственно 88.7 + 2,2 при исходном _ 103 ± 2,4 и 39,8 ± 0,9 при исходном 46 ± 0,9 (табл.21.

Согласно современным данным сокращение числа эритроцитов происходит вследствие усиления эритродиереза и гемолиза, генез которого связан со специфическими гуморальными гемолитическими комплементзависимыми Факторами, активизация которых при стрессе происходит, по-видимому, в результате последовательно возникающих взаимообусдавливающих патологических процессов. в том числе гипоксии, нарушения микроциркуляции, возрастания ПОЛ и других метаболических сдвигов. Очевидно, что снижение показателей гемоглобина и ! емлтокритного числа имеют тот же гг н<.

Таблица 1

|С(1Г|](Ы1 Г Р 1 а 1 а I 1 10 1* 1 I

тштыь ] (1 -1) 2 || - 1) 1 (о - 81 4 1а - I) 5 (1 - 11 6 (о - >1 1 1в - «1 0 и - Л

Эс^троилтн э (ш/га ) ).52 ! 1«.« 4.425 1 11.* - 3.321 ! 5.9 1 3.16 1 2.3 а 4.11 ! 33.4 > 5.23 ! 0.0 -

Гшгюбн 1(1. СаШ 86.3 ! 2.2 »1.5 ! 3.3 - I >0 1 2.1 I >0 ! 1.5 б 99.7 ! 1.4 1 115 ♦ 1.5 -

Геитщ-юе Ч1сю (II 3«.} ! 0.5 42 ! :.< - а 35.1 ! 0.1 > 37 ! 0.5 6 45,5 ! 1.5 43.5 ! 0.9 -

(ШММ (и. 1ПШ0С71| 11.1 ! 0.5 11.1 1 в.Э 21.3 1.3 11.1 • (.3 > 22,7 0.3 17.1 1 (.3 И.1 1 0.3 17.3 1 0.5

Гамм (110П/1.1 1.6 ! 0.07 1.5 »0.01 1,8 ! 0.07 1 3.6 1 1.2 1 10.0 ! 0.5 1.5 » 0,2 > 4.0 1 0.1 1 3.5 ! 0.09

Динамика некоторых показателей крови белых крыс в условиях действии вибрации, комбинированного вибрационно-акуетичеекого действия и на Фоне введения экстракта элеутерококка (И ± т) (п - количество животная)

Примечание: а, б, в - здесь и в последующих таблицах показатели достоверности, соответственно р<0,01, 0,001, 0,05.

ТгТб.'Ии,-; "

Исследуемый показатель Контроль (п - 8) Опыт (п - 8) Контроль* адаптоген (п - 8) Опыт + адаптоген (п - 8)

Эритроциты 3 (млн/см ) 4,233 1 4.9 в 3.08 ± 4.6 4.31 ± 30 в 4.85 + 25

Гемоглобин (ед. Сали) 103 ±2,4 а 88,7 ± 2,2 98.8 ± 1.0 107 .8 1 Кб

Гематокрит-ное число (%) 46 ± 0.9 а 39,8 + 0,8 46.8 1 0.5 48.5 + П.5

Каталаза Сед. активности) 19.4 + 0.8 19.4 + 0.7 19,0 ± 0.5 18.Э 1 0.7 3.4 + 0.5

Глюкоза (ммоль/л.) 3,2 ± 0.8 в 5.8 ± 0,8 3,1 ± 0.6

Динамика некоторых показателей крови собак в условиях иммобилизационного стресса и на фоне введения экстракта элеутерококка

(М ± а) (п - количество животных)

3.2. Содержание сахара и активность каталазы в крови животных в условиях стресса

У человека и животных в стрессогенной ситуации глюкоза является наиболее важным источником немедленного получения необходимой энергии. И центральная нервная, и мышечная системы в качестве энергетического субстрата используют глюкозу для эффективного выполнения сьоих функций. Деятельность нервно-мышечной системы играет решающую роль в контролировании и проявлении поведенческих реакций человека и животных при стрессе.

Из многочисленных данных литературы известно, что гипергли-ксм>ы нвлис-тся основным постоянным признаком, развивающимся в организме при различных экстремальных ситуациях, обусловливающих активирование гипоталамо-гилофизарной системы и СйС. В то же время отмечено, что при длительном нахождении организме^ в условиях стресса или удлинении времени воздействия стресс-Фактора на организм наблюдается обратная картина - гипогликемия.

Каталаза является одним из ферментов, участвующих в процессах газообмена в организме животных.

Каталаза находится почти во всех тканях организма и участ-ьу< г в разрушении перекиси водорода, образующегося в результате тканевого дыхания, а также гидроперекисей, накапливающихся в мембранах клеток и клеточных органелах в условиях активирования ПОЛ ь различных стрессогенных ситуациях.

согласно данным литературы, при обездвиживании в организме как у животных, так и у человека имеет место нарушения как общего. т.;»к и местного тканевого дыхания.

В развитие наших исследований. .касающихся оксилнтсль-но-восстановителъных процессов при остром стмср. била т^чми динамика уровня глюкозы и активность каталазы в крови.

Наряду с изменением морфологических показателей крови под действием вибрационного и акустического факторов происходит повышение содержания глюкозы в крови, а также повышение активности каталазы. Так. при действии вибрации содержание глюкозы в крови повысилось и составило 3.6 ± 0,2 при контроле 1.6 ± 0.07 или на 12.5%. активность каталазы возросла и составила 18.1 ! 0.3 при контроле 17.8 ± 0.5 или на 1.7%. После комбинированно!о ви-браиионно-акустического действия содержание глюко-щ в крови повысилось и составило 10,0 ± 0.5 при контроле 1.6 + 0.07 или на 525%, активность каталазы возросла и составила 2.7 + 0.5 при контроле 17.8 + 0.5 или на 21.5% (табл.1).

. Как и следовало ожидать, после двухчасовой жесткой иммобилизации в крови собак происходит повышение содержания глюкозы и составляет 5.3 ± 0.8 при исходном 3,4 ± 0.8 или 53.1%. Одновременно происходит некоторое повышение активности каталазы (табл.2).

Таким образом, после двухчасового воздействия прмторов происходит повышение содержания глюкозы в крови, что является, следствием выброса катехоламинов в кровь - как реакция системы гипоталамо-гипофиз-надпочечники в этих условиях. Повышен«' активности каталазы объясняется постепенным истошением компенсаторных способностей организма к концу двухчасового действия стрессоров. нарушением как обшего. так и клеточнчо дыхания, наводнением тканей продуктами ПОЛ.

3.3. Интенсивность перекисного окисления липидов и содержание <?£, -токоферола в тканях животных в условиях стресса

ИОЛ - это физиологический, многоступенчатый процесс, в норме- протекающий во всех биомембранах, тесно связанный с их структурой и функцией.

Наиболее активно ПОЛ протекает в субклеточных образованиях (в микросомах, митохондриях), в которых содержатся электрон-транспортные системы.

Интенсификация ПОЛ является обязательным атрибутом стрессовой реакции. Активация ПОЛ - это неспециФический ответ клетки на любо*- предъявленное ей экстремальное воздействие, компонент пускового механизма перестройки метаболизма в стрессовой ситуации.

Накопление продуктов ПОЛ при гиподинамии и гипокинезии может омть обусловлено как усилением интенсивности их образования, так и понижением функциональной активности антиоксидантной зашиты KJKJKH.

Наиболее выраженным процессом пероксидации является развитие тканевой недостаточности <7Í- -токоферола, играющего ведущую роль и определении антиокислительной активности липидов различных пиилогических систем организма. Он является главным природным жирорастворимым антиоксидантом плазмы и клеточных мембран, его уровень строго коррелирует с уровнем липидов.

Регуляция сС -токоферолом скорости реакций СРО липидов на стадии зарождения цепи осуществляется двояко. Во-первых, участвуя ь Формировании мембран увеличивает плотность упаковки фосфо-липидов мембран, препятствует проникновению кислорода л образованию псрекисных радь;алов, уменьшает общую скорость oí деления и

тем самым стабилизирует мембраны. Во-вторых. <Х, -токоферол гасит активные Формы кислорода - синглетный кислород и супероксидный анион радикал.

Через 2 часа после действия вибрации содержание ФЛП в плазме незначительно повысилось по сравнение с контролем (на 6.5%).

ф

уровень ^ -токоферола в плазме понизился на 25%. В мембранах эритроцитов интенсивность АЗП возросла на 44%. а интенсивность НЭП понизилась на 70,7% по сравнению с результатами, полученными у контрольных животных. Содержание первичных продуктов ПОЛ-АГП в мембранах эритроцитов увеличилось, уровень их составил 178*. В плазме уровень АГП возрос на 12,5%. Уровень конечных продуктов ПОЛ-ШО уменьшился в плазме на 75%.

Содержание ФЛП в митохондриях мозга и печени повысилось соответственно на 21,2% и 2,8%. Интенсивность АЗП в митохондриях мозга осталась неизменной, а в митохондриях печени повысилась на 7,8%. Интенсивность НЗП активировалась в митохондриях обоих исследованных органов, составив в митохондриях мозга 86.4%, а в митохондриях печени 20,5%. Содержание ДК уменьшилось в митохондриях обоих органов соответственно на 93,5% и 92,3%. Содержание АГП при этом возросло на 31,3% и 50% соответственно в мозге и печени. Уровень эндогенного антиоксиданта аС -токоферола резко возрос ъ митохондриях обоих исследованных органов и составил в митохондриях мозга 517%, в митохондриях печени 296%.

Через 2 часа после комбинированного действия вибрационого и акустического Факторов содержание ФЛП в плазме понизилось на 29Х по сравнению с контролем на фоне выраженного снижения содержания ^-токоферола (на 50%).

Р мембранах эритроцитов при этом интенсивность А'ЗП возросла почти на 104%. а интенсивность НЗП понизилась на 82% по сравнению с результатами, полученными у интактных животных. Содержание АГП и ЯК в мембранах эритроцитов значительно возросло: уровень ЛГП составил 2Я0%. ЛК - более чем 300% по сравнению с исходным уровнем. Уровень ЛГП и ШО в плазме несколько понизился соответственно на 4.1% и 33.3%.

При этом содержание ¿С -токоферола в мембранах эритроцитов возросло на 180% (табл.3). •

В результате комбинированного действия вибрационного и акустического Факторов у крыс четвертой группы содержание ФЛП в митохондриях мозга и печени повысилось соответственно на 57% и 13,5%. Интенсивность АЗП в митохондриях мозга несколько подавлена, а в митохондриях печени возросла на 26.3%, в то время как Ферментативные процессы ПОЛ активировались в митохондриях обоих исследованных органов. При этом в митохондриях мозга активность возросла почти на 60%, а печени - лишь на 14%.

Изменения в содержании ДК в митохондриях мозга недостоверны, так же как и в митохондриях печени. Особый интерес вызывает Факт резкого обогащения -токоферолом в пересчете на мг.бел-

ка митохондриальных Фракций обоих исследованных органов: уровень -токоферола в митохондриях мозга повысился более чем в пять раз, а в митохондриях печени - почти в три раза (табл.4).

При исследовании процесса ПОЛ в кре^ви наблюдался рост первичных продуктов этого процесса, АГП, ДК, активирование АЗП, что свиде'тельствует о развитии дисбаланса в механизмах регуляции и обеспечения стационарного уровня липопереокисления, характерного для нормально метаб'-лизируюших тканей. Вместе с тем. рост уровня ОЬ*. - токоферола в мембранах эритроцитов несомненно свиде-

Таблиц.э 51

1ссдетчЛ аоичапн 1ШрОН (« - 1! от (> • ?) ш:ти И - О ОПТ I иашш 1> - |)

МО I таз«е, шоп Ш/11. Г,1 ! Р.З а 2.2 ! 0,05 1.5 1 0.3 « 1.7 1 0.1

Ш 1 шбраш Н>тролти. 1«Ш 111/11. 2,5 1 0.6 1 5,1 1 0,1 3,5 1 0.6 1 1.13 1 1.01

131 8 ШбрЗШ ЦНРСШМ. шп Ш/и. 3.» 1 ОД 6 ел 1 0.03 О.Т 1 0.01 а 0.5 1 1.2

11 > «е»бртх )Р1ГЮШШ, ■■он/11 бела 1.09 1 0,01 • 2.1 1 0.3 1.01 1 0,01 1 1.55 1 0.03

(£.-!♦ 1 ШМЕ, ион/и 0,< 1 9,01 > 0,2 1 0,00 1.3 ! (.01 • 0.2 1 0.(1

иСЛ 1 тбраш ч>«тЖ1ш. шнЛг. бела 2,5 1 0,01 1 7,0 ! 0,02 1.( ! 0.1 1 I ! 0.05

вшмшоте-11(1 1 шж 1Г (»1 2,4 1 0,01 1 2,3 1 0.2 к |ссш- • 1 1.2 1 0.2

(иигирооенпс! 1 К|(РШ1 5ЦТ-РОС1ТО». II/«. бе на 0.9 1 0.01 1 1,15 ! 0,05 ■е кии. к 1(С1С1

■■Ише о(ю- 1)111 1 ШШ. »»■/и. 0.00) 1 0,0001 0,002 ! 0,1001 0,00» 1 0.0001 (.003 1 0.0001

Интенсивность перекисного окисления липидов в плазме и мембранах эритроцитов бели» крыс в условиях комбинированного вибрационного и акустического стресса 'и на фоне семидневного введения экстракта элеутерококка (Н í и) (п - количество животных)

Таблииа 4

■шмтеп и - 0 Опит 1» - 6) 1о»т[>ои ♦ ацптош (и - 8) Ош 1 аштеи (в - 0)

|0!Г кни «мг «ешь шозг печет «мг печея

«11. поп Ш/аг Смм 5.3 1 м 7,4 1 0,0! 5.6 1 0.03 > 8.« 1 0,2 3,1 1 0.01 2,1 1 0.01 6 17,2 ! 0,3 1<.3 1

1». иш Ш/1Г. 6«ш (.1 ! 0.01 3.2 ! 0,6 г 3,0 ! 0,01 <.01 1 0.3 2.16 1 0,01 1.6 1 0.6 6.« 1 1,1 5,7» 1

131. и«п Ш/х. 3.3 1 0.(1 5.6 1 0,2 6 5.3 1 0,01 1 6.2 1 0,2 2.1 1 0.01 4.1 1 0.2 б 0,5 1 0.1 14,3 1

||||11К 11П1ГШ. иш/яг. 6(1(1 1.07 ! 0,01 0.9 1 0,01 1 1.0 1 0,01 1 0.05 1 0,03 1.3 1 0,1 0,7 1 0.01 6 1.45 1 0,09 2,1 1

«1Ш/ИГ. МШ 1.0 1 1.05 1.51 1 0.05 1 0,3 1 0,01 ■ 1.(5 1 0,01 1,5 1 0,05 1,5 1 0,05 1 <,65 1 0,05 4,(5 1

Цмгиро ими«, и/и.кш 1.1 1 0.01 0.6 1 0,01 1 1,01 1 0.006 ■ 0.1 1 0.01 м 1СС1Ц. 1« кии, 6 2.25 1 0.2 2.8 1

«емнш. И./11 1,13 ! 0.001 0.02 1 0.001 1 0.0С ! 0,091 0,02 1 0,001 0,05 1 0.005 0,015 1 0,003 > 0.0Т 1 0,01 0.015 1

Интенсивность перекисного окисления дипидов о митохондриях мозга и печени белых крыс в условиях комбинированного вибрационного и акустического стресса и на Фоне семидневного введения экстракта элеутерококка

(Н * а) (п - количество животных)

тельствует о вовлечении в механизм реализации стресса Факторов^ направленных на Формирование более выраженной антиоксидантной и структурной зашиты клеток, что характерно в условиях стресса. Наблюдаемое при этом снижение уровня <?С -токоферола в плазме' несомненно является результатом целого ряда процессов, среди которых ведущими являются: затрата сС -токоферола в плазме на детоксикацию продуктов ПОЯ и перераспределение с преимущественным накоплением его в мембранных структурах, наиболее подверженных деструктивному воздействию продуктов СРО благодаря липидному компоненту мембран, основных субстратов ПОЛ.

Об этом свидетельствует значительный рост содержания ¿С-токоферола в мембранах эритроцитов.

Результаты исследований системы ПОЛ в митохондриях мозга и печени свидетельствуют о более выраженном активировании этого процесса после комбинированного воздействия вибрационного и акустического Факторов. При этом наблюдается накопление первичных продуктов ПОЛ-АГП на Фоне возрастания интенсивности индуцированных процессов ПОЛ и более выраженных в митохондриях печени. Обращает на себя внимание Факт почти трехкратного роста -токоферола митохондриальных фракций обоих исследованных органов на фоне незначительного роста ФЛП. что говорит об активном вовлечении антиоксидантной системы, и в частности, -токоферола, в обеспечение системной зашиты мембран, путем встраивания его в мембраны, помлио затрат на процессы детоксикации активных Форм кислорода, образование которых сопровождает развитие стресса.

После дь .■ часовой жесткой иммобилизации уровень ФЛП в плазме повысив на 22,7% по сравнению с контролем. Содержание еС-токоферола : плазме понизилось на 35,4%. Интенсивность АЗП в

мембранах эритроцитов возросла на 93,5%, а интенсивность 11311 понизилась на 16% по сравнению с контрольными данными. Содержание ДК ь мембранах эритроцитов увеличилось на 42,5% в то время как в плазме повысилось всего на 23.8%. Содержание ШО осталось неиз-мснниым в мембранах эритроцитов и понизилось в плазме на 37,5% по сравнению с исходным уровнем. При этом содержание -токо-

ферола в мембранах эритроцитов понизилось на 33.3% (табл.5).

Таким образом, двухчасовая жесткая иммобилизация вызывает активирование процессов ПОЛ в крови собак, о чем свидетельствует увеличение содержания ФЛП и ДК в плазме, накопление ДК и возрастание АЗП в мембранах эритроцитов.

3.4. Влияние жесткой иммобилизации на некоторые общеклинические показатели у собак

Известно, что клинические признаки болезни обычно не предшествуют структурно-биохимическим изменениям, а наоборот - следуют за ними.

Поэтому у животных некоторые обшеклинические показатели, такие как частота дыхания, пульса, температура тела были исследованы в динамике в течение всего эксперимента. Результаты исследований свидетельствуют, что у подопытных животных температура тела в течение всего эксперимента не меняется.

Изменения в частоте пульса обнаружены лишь через час после иммобилизации. Так, увеличение частоты пУльса после первого часа иммобилизации составило 5,3% по отношению к исходному уровню. К концу эксперимента (после двухчасовой иммобилизации) частота пульса возвратилась к исходному уровню.

Тлблииа 5

1сс(Ше!и1 та затеи. ЫТРОП (> - 31 От - о; 1мгрш 1 итоге: (» • 01 Ош 1 Ш1Шс| (1 - •)

410 1 таз«е. топ 118/11. М 1 0.2 а 5,4 1 0,06 3,5 ! 0.7 1 2.5 1 0.9

(110 I «е«6рШ1 ЗР1ТР0Ц1Т01, мои Ий/И. 2.015 ! 0,7 1 з.з 1 о.а «.5 1 0.3 1.5 1 0.5

130 1 шбраш ЭРИРШТО». »1)111И/Ш. 2.5 1 (Л 2.1 ! 0,7 0.5 \ 0.2 2.9 ! 9 1

П I «еибраш зргюшо», иш/м.бмм 0.1 1 1.(9 0,51 1 0.5 1.1 1 1.1 »Л * и

II > шазк. мри/» (.2 ! 0.» 5.2 1 0,3 5,5 ! 0,7 3.(25 ! 0.1

1«Цше осю-иш I набрана! )Р1ТР0«1Т0|, (1/1Г. беш 0.005 ! 0.003 0.005 1 0,(3 ( ,0125 1 0,007 1 0.12 1 (.0(3

||ЦсШ осю-Ш11 1 ишп. «1/«1 0,! 1 0,2 0,5 1 0.005 0.) ! 0,2 1.1 « 0.2

Х. Ц в «сабраш >Р1ТРС01Т01, |«т/аг. беш ).< 1 0.2 6 2,( 1 0.03 3.« ! 0,03 6 2.« ! 0.02

гС-Н 1 шж. Я1011/11 (.51 « (.1 0.315 1 0,1 (.1 ! 0.02 1 0.97 ! 9.(2

Интенсивность перекисного окисления липидов в плазме и мембранах эритроцитов собак в условиях нммобилизацион-ного стресса и . . фоне семидневного введения "экстрактл элеутерококка

(М ± ш) (п I личество животных)

Аналогичная закономерность отмечается в динамике частоты ли хания.

Так. после первого часа иммобилизации частота дыхания была увеличена по отношению к исходным показателям на 23.5%. после второго часа эксперимента - на 5.8%.

Учашение пульса у собак, по всей вероятности, происходит вследствие напряжения в деятельности сердечно-сосудистой системы.

Увеличение частоты дыхания, по-видимому, связано с уменьшением легочной вентиляции и снижением коэффициента использования кислородп тканями и клетками организма. Учашение дыхания несомненно связано также с развитием анемического синдрома, выражающегося в уменьшении количества эритроцитов. содержания гемоглобина и 14матокритного числа.

Таким образом, определение состояния вегетативных Функций. к частности температуры тела, частоты пульса и дыхания, как объективных обшеклинических показателей у животных. находящихся в условиях стресса, может дать возможность прогноза и предупреждения развития возникающих патологических процессов в указанных условиях.

3.5. Применение экстракта элеутерококка для профилактики острого стресса

Для профилактики острого стресса, п также с целью снижения патологических сдвигов и их коррекции. Пами был избран и испытан адаптогенный препарат - экстракт элеутерококка, обладающий широким спектром терапевтического и профилактического действия.

г целью разработки оптимальных профилактических доз экстракта элеутерококка для животных в условиях острого стресса.

нами били проведены опыты в трех сериях на белых крысах и собаках, содержащихся в условиях вивария.

Крисам шестой группы до действия вибрации и крысам седьмой группы до действия вибрационного и акустического Лакторов вводи ли экстракт элеутерококка в дозе 0.075 мл в течение семи дней, а крисам восьмой группы до действия вибрационного и акустического Факторов вводили экстракт элеутерококка в указанной дозе в течение двух дней. Собакам вышеуказанный препарат вводили до им-мобилизгшионного стресса в дозе 0.5 мл на кг веса ь течение семи дней.

Полученные результаты показали, что введение экстракта элеутерококка оказало благотворное влияние на организм. Животные, получавшие препарат, по внешнему виду и обшеклиническим показателям почти не отличались от контрольных.

При определении избранных нами показателей окислительно-восстановительных процессов отмечено, что после действия стрессоров на Фоне предварительного введения экстракта элеутерококка. они не претерпевали значительных изменений и практически мало отличались от контрольных данных. Профилактическое введение экстракта элеутерококка в указанной дозе в течение двух и семи дней до воздействия стрессоров привел к подавлению процессов ПОЛ в крови белых крыс и перераспределению сС -токоферола из плазмы в мембраны эритроцитов, в то время как у собак п, '.I семидневном введении экстракта элеутерококка угнетение процессов ПОЛ в крови происходило на Фоне повышения плазменного -токоферола

и уменьшения его содержания в меморанах эритроцитов, т.е. сдвиги в динамике изученных показателей носили противоположный характер по отношению к таковым при остром стрессе, что свидетельствует о

значительном регуляторном воздействии экстракта элеутерококка, задаваемого в указанной дозе и сроки, на процессы ПОЛ в крови подопытных животных в условиях острого стресса.

На"интенсивность процессов ПОЛ, протекающих в мембранных структурах внутренних органов белых крыс в условиях острого стресса, более выраженное регуляторное действие оказывало предварительное введение экстракта элеутерококка в течение двух дней, о чем свидетельствовало значительное замедление роста интенсивности процессов ПОЛ в мембранах митохондрий мозга и печени на Фоне повышения затрат °С -токоферола на детоксикаиию продуктов липопереокисеообразования в этих органах.

Сравнительная эффективность предварительного применения экстракта элеутерококка, по-видимому, связана с тем. что препарат благодаря своему многофункциональному воздействию оказывает регуляторное воздействие при развитии стрессового состояния у животных и приводит к более быстрому развитию процесса адаптации в экстремальных условиях.

Результаты проведенных исследований послужили основанием для рекомендации применения экстракта элеутерококка в питомниках служебного собаководства в течение семи дней в дозе (1.5 мл/кг до и после использования собак в экстремальных условиях.

Таким образом, можно заключить, что изменения, выявленные нами в организме животных, лроисходйвие в условиях острого стресса, являлись одним из проявлений стресс-реакции, возникающей вследствие резкого напряжения. Применение экстракта элеутерококка как апаптогенного препарата способствокс! ло сравнительно быстрому развитию процессов приспособления. уменьшению негатив-

них последствий остроге-^тресса, а, следовательно более эффективному использованию собак в экстремальных условиях.

Б. ВЫВОДЫ

1. В условиях стресса, вызванного у крыс вибрационным и акустическим факторами, а у собак - жесткой иммобилизацией, происходят существенные изменения в показателях окислительно-восстановительных процессов.

1.1. Уменьшается количество эритроцитов, содержание гемоглобина. гематокритное число, что указывает на развитие анемического синдрома.

1.2. Происходит повышение содержания глюкозы в крови, что является следствием активирования САС и свидетельствует о значительных сдвигах в углеводном обмене.

1.3. Возрастает актньность каталазы крови, что свидетельствует о нарушениях равновесия в системах, детоксицируюших активные продукты ПОЛ.

2. После двухчасового действия стрессора как у крыс, так и у собак происходят нарушения ПОЛ, направленные на формирование новых механизмов метаболизма в условиях острого стресса.

2.1. Активируются индуцированные процессы ПОЛ в мембранах эритроцитов и митохондриях мозга и печени.

2.2. Возрастает образование ФЛП и накапливаются первичные продукты липопереокисления - АГП и ДК в плазме крови, мембранах эритроцитов и митохондриях мозга и печени.

2.3. Уменьшается содержание конечных продуктов ПОЛ-ШО в плазме крови и увеличивается в мембранах митохондрий мозга и печени .

3. У собак в условиях жесткой иммобилизации наблюдается увеличение частоты пульса и дыхательных движений, свидетельствующее о Функциональных нарушениях сердечно-сосудистой и дыхательной систем.

4. Экстракт элеутерококка у интактных животных оказывает благотворное влияние на показатели окислительно-восстановительных процессов, регулирует - процессы ПОЛ. обогащая мембранные структуры организма эндогенным антиоксидантным -токоферолом в зависимости от сроков применения и вида экспериментального животного.

5. Предварительное введение экстракта элеутерококка крысам и собакам в продолжение двух и семи дней стимулирует окислительно-восстановительные процессы и регулирует процессы ПОЛ, ослабляет повреждающее действие стрессоров.

6. Эффективность регуляторного воздействия экстракта элеутерококка на процессы ПОЛ зависит от сроков применения этого адаптогена и вида подопытного животного. Для крыс оптимальным является применение экстракта элеутерококка в течение двух дней до воздействия стрессоров. Для собак рекомендуемая доза является эффективной при использовании данного препарата в течение семи дней до воздействия стрессора.

7. Профилактический прием экстракта элеутерококка ослабляет развитие стресса, негативные последствия его. способствует сравнительно быстрой адаптации животных в условиях стресс-реакции.

8. Полученные нами данные позволяют рекомендовать экстракт элеутерококка для профилактики стресс-реакции и его последствий у собак в экстремальных условиях, что позволяет эффективное использование собак соответствующими службами в необычных и экстремальных условиях.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Мелконин H.H., Мкртчян Я.Р., Закарян Г.В. и др. Метаболизм

липиаов и активность АТФ-аэ в условиях комбинированного воздействия шума и вибрации. //Проблемы биохимии, радиационной » космической биологии- Тез. докл.конф. Москва, Дубнз. 1ЭУ/ -

с. 31 .

Я. UXV. UllpmjjUlll, U.U. сц»|щпщш'й; Llinptiuuii|>\) щш|йшЫЛрпи| ш^Ьрш^шЪцЪи luIJ щрпуЬиЪЬр}» npn2 ушушЪ^^^гФ щрггф^цш^т^шЬ Jni/i: - аьцшш[)ц

г^тциллЬшЬиш^шЬ - ЬркшЪ, 1997» - tj. 3-4-'

3. U ft. Utipmjjuill: Up|шЬ npn2 ¿ЦшршЪшЦшЬ U ЦЫшшршЬшЦши угл фпфп^йшЬ ч рЪшй р^ш икЛрЬишфЬ цш jlJ шЪЬЬргт] U

ЧршЪу - аЬи^шьп^щ /¿.ицшитшЪ^ q ^м^штЪтСишЦшЬ

ш^ын - Ьришк 199?. - tt- 5-6:

U. ft. U<«rS3QUl

ОргфцшЦЬрш^шЪзЬ^шЬ Ь tfuipujtip|> qbpopufiJiiugüiuU ujpnghulibpfr faujliqtaprmlUbpJi IjuibfuaipqtiiiuilQ 2XibpJï if ma umphuuijjili uiuijifiulilitpnul

SIJJUÍJ Ъщшшш^ t4 ЬЬшшцтЫ»! ори^^ш^ЬрьиЦшЪ^ЪJшЪ

U АшрцЬрЬ Qbpopufiiujydujb ujpnybubbpnid inbqfi rubbyn^

)umbqujpnidbbpp (лшррЬр ишрЬиш j^li lyiujdujbbbpmil U tlbniuibpnljnljt> imnbyntpjrubp bp nh^i 21ш 1 ujpnybubbpf) 1|рш:

¿шцлЪр t. пр 1/>ршЫдцлр»та jfrb umpbuf) h^ J pm J « лрр ЬшЙш|и t huib^iyntri uíbujubu>iijiuhmpju)b J&2» рЬЦшй bb ^рршу^пь U

ш»\ qnpönbbbp, npnbß ршушишЦшЬ u>qibynipjnib bb

pnqbniiJ ^ЬЬцшЬ^ЬЬрЬ орцшЬ^ч^Ь Ч^рршу(шЬ U hujJujtjyiJiijft

4hppuiy(inb U ni Цш jfib u/qtbympjujl lyujjdujbbbpnnJ шЬц^ bb

ftibbliniJ о^иИш^Ьрш^шЬцЬйшЬ ujpnybubbpfi прп2 угиуиЛф2ЬЬр|>

Juuibqiupmdbbp шгкЬЬшЬЬр)) Jnin4 qujpqiubmd t iubbd[ilj u^b'ipnJ» aji|b{uibniJ t шр)шЬ ^ишяп^ш^шршр^ цшршЬшЦмрjnibp, pujpàpuibiuif t Цшинщшццф uj^in^nip jmbp, ЬиЦ шр|шЬ ufitfnil{n¿ J» pufju/bpbbpmd, qiM'lHÏ1 t Jbup rj й^илфпЬчрЬшЬЬртй blju»ni|md t

ЙшрцЬр/î рЬрп^и^шуишЬ lypnybubbpf) tul^mMiuynid« t>b¿p iJl^ujjmd t uinpbuiujhb цш|йшЬЬЬрт d opqujbbudni J inbtft mbbynq inipj

фпфп|ип1р jntbbbpf) du)ut>b:

O ball и 4ш<\шу 2bbpp du/pitjii/by l^rîi Jfíy oqmiiiq npôtjnid ЬЬ шшррЬр рЬш^ш^шпЬЬрт J, hb¿p hujtfuifu Lob q t nibbbniJ tpuinpbduit ujujjdiubbbpnid, puin b1^. ujpimupt>b dhsiuttwjph

uidbbopjuj qnpûnbbbph ¿шфшцшЬу tuqibynipjuiiíp итрЬишфЬ ilfiámíj шпш(шуЬп*\ muijduibbbprmf : Lfbp фпрДЬрпи/ Ьр^Йш|/|ш wbju/prfmyní d|iy шлш?шуш6 ütnpbuf» hbi/ibi}ujbpr>4 2l>bpf> opQuibfiydnid u>b^)> bb nibbbniü 0(и^^шЦЬрш1|шЪ()Ь|1шЬ ujpnybubbpfi (ишЬцшрш Jbbp, fibiujbu

buili ЙшрщЬр^ цЬрпри^шу^шЬ щрлуЬиЬЬр^» ш^л^шуп» J t

ЬЦштЦпи! шр]шЬ ufiäniljniij Ii ршцшЬрЬЬрт J:

tibminbpnt)nl|fi tpupuftftfß l^u/bju/ud t итрЬиш;^Ь ujiujduibbbpmd

шпш{шуш& фпфг>)игир]шЬЬЬрр opuhlunjbpuj^bqbJub щрпуЬиЬЬрпи] Ii (^шрцшЦпрп^ шццЬутр jnib t pm\bniü йшрщЬр^ цЬрпри^шуйшЬ

U4pnybübbpf» 4Гш, fb¿p рмц t шш^и ш|и ibitudfïjnyp шаш^шр^Ь^ Ьи^шщштидфшЬ Ôamajjrup jnibbbpm J t{fipumb[W hwJwp: