Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммуноферментная диагностика парвовирусной инфекции крупного рогатого скота

ВСЕРОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИ И НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я. Р КОВАЛЕНКО

ЩЕРБАКОВА Татьяна Борисовна

ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРВОВИРУСНОИ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(16.00.03 — Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

На правах рукописи

Москва — 1993

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко.

Научный руководитель: лауреат Премии Совета Министров СССР, доктор ветеринарных наук, профессор Юров К. П.

доктор ветеринарных наук, профессор (ВИЭВ) Орлянкин Б. Г.

кандидат ветеринарных наук (МВА) Троценко Н. И.

Ведущая организация: Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Защита диссертации состоится « /6 » в ¡учасов на заседании Специализированного Совета К 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

кандидат ветеринарных наук Ф. Г. Терешков

-1 -

I. ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Проблемы инфекционной и в особенности вирусной патологии молодняка и органов воспроизводства у коров имеют большое народнохозяйственное значение. Респираторные и желудочно-кишечные болезни телят особую значимость получили в связи с созданием крупных животноводческих комплексов.

Сложная этиология так тазывгемнх"пкевмоэнтеритов"существен-но затрудняет диагностику этих болезней, а, следовательно, их лечение и специфическую профилактику.

Одними из вирусных агентов, вызывающих заболевания телят, являются парвовирусы крупного рогатого скота. Эти вирусы участвуют также в патологии органов воспроизводства, обусловливая эмбриональную смертность и нарушение оплодотворяемости животных (Bachmenn P.A., 1971; Bogine A.B. et al., 1981; Thorscn J.,1934).

Однако, парвовирусная инфекция KPC остается до сего времени малоизученной. Как показала работы сотрудников лаборатории вирусология ВИЭВ, помимо известных в мире 2-х серотилов парвовиру-сов, .в нашей стране широкое распространение имеет парвовирус, антигенно отличающийся от них. Этот штамм парвовируса был выделен от теленка в пэриод вспышки в хозяйстве острого респираторного заболевания. Проведенные экспериментальные исследования выявили выраженнуи вирулентность вируса для телят и его широкое распространение-среди крупного рогатого скота (Крюков H.H. и соавт., 1988). Дальнейшее изучение инфекции оказалось затруднительным вследствие отсутствия кадежого метода лабораторной экспресс-диагностики.

. Цель работы. Целью настоящей работы являлась разработка , имцуноферментной диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота, вызванной 3-им типом парвовируса (штамм В-2).

Задачи исследования.

1. Выбор опгишльной клеточной системы для культивирования парвовируса КРС 3 серотипа (штамм В-2).

2. Разработка схемы очистки и концентрирования парвовирус-ного антигена, обеспечивающей максимальную чувствительность реакции ИФА. i

3. Разработка схемы получения специфических иммуноглобулинов к парвовирусу КРС 3-го типа (штамм В-2).

4. Приготовление иммунопероксидазного конызгата на основе этих иммуноглобулинов. ' л'. '

5. Определение.оптимальных условий проведения ИФА для выявления парвовирусного антигена в вселениях животных (кал, носо- . вая слизь).

6. Изучение оптимальных условий проведения ИФА для индикации антител к парвовирусу КРС 3-го типа в сыворотке крови.

7. Проведение сравнительного изучения различных вариантов ИФА и традиционных методов лабораторной диагностики на основе материала из неблагополучных по респираторным и желудочна-шпёч-: ним заболеваниям телят хозяйств.

Научная новизна работы. Изучены условия проведения вариантов иммуноферментного анализа для выявления парв'овируса КРС 3-го типа и антител к нему о учетом физико-химических особенностей /.. возбудителя. , V ••'.' ■ .. ■■ •

Разработана методика, позволяющая добиться максимального выхода клеточно-аесоциированного вируса й вирусных антигенов.

Установлено, что для выявления антигена парвовируса КРС 3-го типа оптимальным вариантом ИФА является "сэндвичи-метод, который позволяет определять вирусный белок в количестве 0,03 мкг/мл, что соответствует примерно 4-4,5 lg "ЩЛ^/мл инфекционного ви-, руса. ,

Установлено» что для выявления антител к парвовирусу КРС 3-го типа оптимальным вариантом Ш>А является блокирующий вариант "сэндвич"-метода, который обеспечивает достаточную чувствительность и воспроизводимость результатов независимо от степени очистки антигена и адсорбирующих свойств твердой фазы.

Впервые показано, что имадноферментный анализ является специфическим .экспресс-методом, который может быть использован для массовых прямых и ретроспективных исследований на парвови-русную инфекцию крупного рогатого скота, вызываемую 3-им типом парвовируса. *

Практическая ценность работы. Разработаны технологически приемлемые схемы получения антигена для ИФА, перспективные для .' использования в широкомасштабном производстве, а также схема получения специфических иммуноглобулинов для приготовления на их основе ищунопероксидазно'го коньюгата.

Предложены оптимальные условия выявления антигена парвови-руса КРС 3-го типа и антител к нему методом иммуноферментного анализа.

Разработанная методика апробирована в условиях неблагополучных хозяйств. Показана ее достаточная чувствительность и специфичность. ..

Апробация работы. Материалы доложены и получили положительную оценку на меялабораторном совещании сотрудников и Ученом Совете Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии (1992, 1993 гг.).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации два работы приняты в печать и составлены "Методические рекомендации по применении имгсунофермзнтного анализа для диагностики ларвовирусной инфекции крупного рогатого .скота, вызываемой 3-м типом парво вируса", рассмотренные й одооренкые методической лгамис-

сией ВИЭВ С протокол Я 10 от 26 августа 1993 г.). .

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 9 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 200 источников, из них 97 отечественных и 103 зарубежных авторов,

2. СОБСТВЕННЕЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ..

2.1. Материал и методы. - -

Работа выполнена в течение 1989-1992 гг. в отделе вирусологии Всероссийского научно-исследовательского института экспе- \ риментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.(ВИЭВ). {

Вирус. В работе использовали эпизоотический штамм В-2 пар-вовируса КРС, выделенный в нашей стране в 1972 г. в отделе вирусологии ШЭВ (З.Ф.Зудилина и соавт., 1976) из носовой слизи больного теленка во время вспышки острого респираторного заболеваний" в откормочном хозяйстве "Вороново". Штамм вируса поддерживали культивированием в клеточных культурах и сохраняли в лиофилизи-рованном состоянии. • •. ■.

Культуры клеток. Для размножения и накопления, титрования парвовируса использовались следатацие перевиваемые культуры клеток: трахеи эмбриона коровы (ТР), сердце ягненка (СЯ), почки эмбриона свиньи (СПЭВ), щитовидной железы свиньи (ОД), почки сирийского хомячка (ВНЮ. Все 1<ультуры клеток (кроме ВНК) были получены в лаборатории технологии культур тканей и питательных сред ВИЭВ. Культура клеток ВНК культивировалась в отделе вирусологии.

Определение инфекционного титра вируса. Инфекционный титр вируса определяли по цитопатическому действию в культуре клеток, выращенной на пробирках (0.Г.Анджапаридзе, 1962; З.Лярски, 1980).

Реакция нейтрализации в культуре клеток. Для определения титра антител в гипериммунной, контрольных к полевых сыворотках крови проводили реакцию нейтрализации в культуре клеток по методу разведения сывороток с постоянной дозой вируса (В.Н.Сюрин и др., 1986).

Выделение и идентификация вируса. Выделение парвовируса КРС из материала от зараженных телят и от больных из неблагополучных хозяйств (кал, носовая слизь) и идентификацию его проводили используя методические рекомендации Крюкова К.Н. и соавт. (1988).

Концентрирование вируса. Концентрирование парвовируса КРС проводили методом осаждения лолиэтиленгликолем 6000 (Leberman R., 1966).

2.1.8. Очистка вируса.' Для разрушения крупных конгломератов суспензию ресуспензированногэ вируса подвергали зашраживанию-оттаиванкю. Для получения наиболее активного антигена для ША использовали несколько способов очистки вируса:

. I. Обработка Еируеа ультразвуком в течение 5-7 минут и осветление его центрифугированием.

2. Обработка ел рус а фреоном ИЗ по метода' Н. К. Климова и соавт. (1961).

. 3. Обработка вируса, очищенного фреоном, хлороформом .по методу Pyi а. .(1951).

. 4. Очистка вируса, обработанного фреоном, методом градиентного ультрацентрифугирования.

Полученные антигены расфасовывали в пробирки по 0,3 см3 и хранили при -25°С. Перед фасовкой каждого антигена определяли его

инфекционный титр и содержание белка по Бредфорду.

Экспериментальные животные. Для получения гипериммунной сыворотки к парвовирусу 3-го типа использовали кроликов породы шиншилла в возрасте 8 месяцев, массой 3-3,5 кг. Для экспериментального заражения парвовирусом с целью получения сыворотки, содержащей антитела к парвовирусу, а также проб фекалий и носовой слизи, содержащих парвовирус, использовали трех телят 5-6-месячного возраста, серонегативных к парвовирусу 3-го типа.

Сыворотки. В иммуноферментном анализе использовали в качестве контрольных сыворотки от иммунизированных и серонегативных телят в отношении штамма В-2 парвовируса КРС и пробы сыворотки крови крупного рогатого скота из трех хозяйств Троицкого района Челябинской области, неблагополучных по пневмоэнтеритам.

Патологический материал.

В ИФА для выявления антигена в выделениях животных исследовали пробы фекалий и носовой слизи от телят, полученных но заражения и после, в течение 8 дней и от больных телят из тех же хозяйств, что и сыворотки. Из проб готовили 10/о суспензии на фосфатно-солевом буфере (ФСБ).

Гипериммуннуто сыворотку к парвовирусу КРС 3-го типа получали на кроликах. В качестве антигена использовали 60 мкг парвови- , руса концентрированного и очищенного в градиенте сахарозы (пр • 30 мкг на одно введение). Кроликов иммунизировали по методу Гор-виц М. и Шарфф М.,' 1979 г.

Выделение иммуноглобулинов класса б кроликов. Иммуноглобулины из сыворотки крови кроликов выделяли высаливанием сульфатом аммония. Сыворотку предварительно обрабатывали 0,75% раствором ривонола по методу Бргока И. (19?9г) для удаления белковых фракций, кроме о . Активность иммуноглобулинов проверяли в реакции нейтрализации, количество белка - по Бредфорду.

Получение иммунопероксидазного конгтогата. Иммуноферментный конъюгат на основе специфических иммуноглобулинов к парвовнруеу КРС 3-го типа получали по метода периодатиого окисления, описанного Wilson М.В., Kakana P.K. CI978), Использовали пероксидазу хрена фирмы Арго г. Ярославля (Rz = 3,24).

Условия постановки Шк. ШФА разрабатывали в двух вариантах:

1) тест-система для выявления антигена в выделениях животных (кал, носовая слизь);

2) тест-система для обнаружения антител в сыворотке крови к данному антигену.

Иммукоферментный анализ антигена проводили методом двойных антител ("сэндвич"-вариант) по Ellens D.j. et ai. (1978). Этот метод затем сравнивали по чувствительности с методом прямой сорбции исследуемого антигена по Voller A.D. et ai.(l976).

Иммукоферментный анализ антител проводили блокирующим вариантом "сэндвич"-метода ИФА, разработанного Yolken R.H. et ai. (1978). Этот метод сравнивали по чувствительности с непрямым методом ИФА по Voller A.D. et ai. (1979).

В качестве контрольного антигена использовали парвовирус КРС 3-го типа, (штамм В-2), очищенный в градиента сахарозы. В качестве испытуемых антигенов в ИФА антител использовали антигены, полученные различными способами:

1) обработанный ультразвуком и осветленный центрифугированием; ■

2) обработанный фреоном ИЗ;

3) обработанный фреоном ИЗ и хлороформом..

В качестве отрицательных антигенов (контрольного и испытуемых) использовали полиэтилекгликолэвнй яощентрат нультуральной жидкости незаражекной культуры клеток СПЭВ, очищенный в градиенте сахарозы, а также обработанный способами, описанными выше.

Контрольные (полокительные и отрицательные) сыворотки получали от телят, зараженных экспериментально, :. серонегативных к парвовирусу КРС (шт. В-2).

При проведении анализа использовали конъюгат на основе специфических антител к парвовирусу КРС 3-го типа, приготовленный в отделе вирусологии ВИЭВ, и ангивидовой конъюгат на основе антител к Ig 5 крупного рогатого скота, полученный из НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи.

ИФА проводили на полистироловых плашках Ленинградского завода полимеров.

Приготовление иммуносорбента осуществляли методами простой сорбции в буферном растворе, высушиванием на дистиллированной воде и на 1% бикарбоната аммония.

Для блокировки свободных активных центров лунок испытывали 1% раствор БСА, 0,5% раствор желатина, 5% раствор эмбриональной сыворотки КРС, Ъ% раствор лошадиной сыворотки.

Разведение реагентов ИФА (антигена, сывороток, супернатан-тов, конъюгата) осуществляли на фосфагно-солевом буфере с различным срдержанием хлорида натрия. Оптимальную концентрацию компонентов реакции подбирали методом титрования. В качестве промывочного раствора также использовали ФСБ с 0,5% Твина-20 и различным содержанием хлорида натрия. , .

Инкубацию реагентов на разных стадиях анализа осуществляли в течение 30 минут, I и 2 часов.

Для проявления реакции использовали субстратную смесь: 0,4 мг/мл ортофенилендиамина (ОФД) и 0,06% HgOg в цитратно-фос-фятном буфере pH 5,0. Проявляли реакцию в течение от 5 до 30 мин. и I ч. Учет реакции проводили на автоматическом считывающем фотометре "Multisican" при длине волны 492 нм и визуально..

Для сравнения полученных результатов использовали показа-

тель, представляющий собой отношение величины оптической плотности положительного образца (Р) к величине оптической плотности отрицательного ( Ii ): Р/н и, наоборот, N/P.

2.2. Результаты исследований

Культивирование парвовируса КРС 3-го типа и выбор оптимальной клеточной системы. Перед нами стояла задача подобрать клеточную систему, которая отвечала бы следующим требованиям: это должна быть гетерогенная клеточная линия, что исключало возможность неспецифических реакций за счет антител к клеточным белкам; клетки должны Нормировать достаточно плотный монослой в течение 1-2 суток, что обеспечивало бы максимальный выход вируса.

В опытах использовали следующие культуры клеток: клетки сердца ягненка (СЯ), щитовидной железы свиньи (ЩЖС), почки эмбриона свиньи (СПЭВ), почки сирийского хомячка (ВНЮ. Исходный зирус культивировался на культуре клеток трахеи эмбриона коровы (TP), инфекционный титр его составлял 5 ig ТЦДсф/мл. Адаптацию парвовируса к культурам клеток проводили методом серийных пассажей. Сформировавшийся монослой клеток заражали парвовирусом ' в дозе 0,5 ТЦД/клетка. После адсорбции вируса в течение 30 мин., в матрасы с культурой заливали поддерживающую среду. Инфицированные клеточные культуры инкубировали в термостате при 37°С 2448 часов. Полученные результаты представлены в таблице I.

Таблица I

Культура клеток !Титр парвовируса, 18ТЦДсл/мл1 Количество ■ _:_!_ 1 пассажей_,

TP (исходная ' 5

СЯ 6,5-7 4

ВНК 6 ' 2

ЩЖС 4,5 3

СПЭВ v _ .6 - 6,5 4 •

Непригодной для культивирования парвовируса оказалась культура клеток ЩЖС, так как максимальный титр парвовируса на ней был на 2,5-1,5 ниже, чем на других культурах. Наивысший инфекционный титр парвовируса был получен на культуре СЯ, но эта культура клеток плохо адаптировалась к питательным средам и имела довольно длительный период формирования монослоя - 3-5 дней. Поэтому нами была выбрана культура клеток СПЭВ, как наиболее полно отвечающая нашим требованиям. Период формирования монослйя культуры 1-2 дня, она быстро адаптируется к различным питательным средам и дает достаточно высокий выход парвовируса - 5-6,5 18 ГЦДсф/мл.

Концентрирование и очистка парвовируса КРС 3-го типа. По мере накопления вируссодержащей жидкости до трех литров с инфекционным титром не ниже 6 ТЦД^ф/мл проводили концентриро-. вание парвовируса полиэтиленгликолеы с молекулярной массой 6000.

Одной из главных задач наших исследований было получение антигена для ИФА способом очистки, не требующим значительных материальных затрат. А все предлагаемые способы, как правило, предполагают наличие дорогостоящего оборудования. Поэтому было решено исследовать в ИФА антигены, полученные разными методами очистки концентрированного парвовируса, и сравнить их между собой.

В качестве контрольного антигена принимали препарат, приготовленный из концентрированного вируса, обработанного фреоном ИЗ и очищенного в градиенте сахарозы. Инфекционный титр его составлял 7,5 иТЦ^о/мл.

Антигены, полученные другими методами очистки, имели следующие инфекционный титр и содержание белка:

I) концентрированный парвовирус, обработанный у/з и осветленный центрифугированием 7 1л 'ЩЦ^о/мл и 500 мкг/мл;

2) концентрированный парвовирус, обработанный фреоном ИЗ, -7,5-8 1е ТЦД^о/мл и 130 мкг/мл;

3) концентрированный парвовирус и обработанный фреоном ИЗ и хлороформом, - 7,5-8 ^ТЦВ^о/мл и 100 мкг/мл.

Оптимизация условий иммуноферментного анализа для

выявления антигена парвовируса крупного рогатого скота

Специфические иммуноглобулины к парвовирусу КРС 3-го типа, полученные из гипериммунной сыворотки кролика, имели концентрацию по белку 8 мг/мл и титр в реакции нейтрализации 1:4096. Часть иммуноглобулинов использовали как "посадочные" антитела, часть - для приготовления коныогата. Активность полученного конъ-югата определяли методом титрования на полистироловых плашках с кммобилизированным контрольным парвовирусным антигеном. За титр коныогата принимали наибольшее его разведение, дающее яркую окраску продукта реакции (1:256). Рабочее разведение конъюгата брали на один порядок ниже предельного титра (1:130).

Для выявления антигена парвовируса КРС 3-го типа в патма-териале (кал, носовая слизь) от больных животных применяли "сэн-двич"-метод ИФА, который был оптимизирован по основным параметрам с использованием контрольного антигена.

Первоначально была определена оптимальная концентрация специфических иммуноглобулинов, необходимая для покрытия лунок полистироловых планек (твердая фаза), и определены условия сорбции 18.

Иммуноглобулины сорбировали на плашки в 0,01 М натрий-карбонатном буферном растворе с рН 9,6 в двух режимах: I) при 4°С в течение 18 ч и 2) 3 ч при 37°С и 16-18 ч при 4°С.

Кроме этого проводили высушивание иммуноглобулинов, растворенных в дистиллированной воде и в Й растворе бикарбоната аммония.

Иммуноглобулины в концентрации 200 мкг/мл титровали методом двукратного разведения до концентрации 1,5 мкг/мл. После адсорбции ig плашки промывали 3-4 раза по 5 минут промывочным раствором - 0,01 М ФСБ с 0,05% Твина-20. Блокировку мест неспецифической сорбции проводили раствором инертного'белка на ФСБ в течение 30-40 минут в термостате. После отмывки в лунки вносили антиген (положительный и отрицательный в разведении 1:100) 0,3 мкг/мл на ФСБ. Инкубацию проводили в течение 1-1,5 ч при 37°С. Затем вновь проводили отмывку и вносили в лунки коныогат в рабочем разведении 1:130. После инкубации в течение I ч при 37°С и отмывки реакцию проявляли субстратной смесью.

Результаты исследования показали, что высушивание раствора антител в 1% бикарбоната аммония на полистироловых плашках в концентрации 6-7 мкг/мл позволило получить высокое значение показателя 2/N при минимальном неспецифическом фоне и обеспечивало хорошую воспроизводимость результатов.

Из нескольких испытанных: растворов инертных белков для блокировки свободных активных центров твердой фазы были выбраны . 0,5% раствор желатины и 5% раствор эмбриональной сыворотки КРС. Замена стадии блокировки введением инертного белка в раствор антигена или повышение концентрации ионов ci~ в отмывочном растворе резко снижало значение показателя P/N. • .,

Затем было изучено влияние содержания детергента (Твина-20) и ионов в буферном растворе для разведения антигена на

скорость взаимодействия антигена с иммобилизированными антителами.

При использовании ФСБ с содержанием хлорида натрия 0,15-0,5М без детергента уже через 60 минут значение показателя Е/и было максимальным, в отличие от применения фосфатно-солевого буфера с детергентом и высокой концентрацией ионов С1 для разведения антигена.

Определение оптимального рабочего разведения конъюгата проводили в стандартных условиях по другим компонентам анализа и с разведениями конъюгата 1:50, 1:100, I: 200, 1:300. Для разведения коныогата использовали 0,01 М ФСБ с содержанием Твика-20 0,05%, 0t02b% и без него. Уменьшение концентрации детергента в растворе до концентрации 0,025$ позволило увеличить рабочее разведение коныогата с 1:130 до 1:200. Отсутствие детергента в растворе снижало показатель P/N за счет увеличения фонового окрашивания.

Время связывания конъюгата с комплексом антитело-антиген было определено в пределах 60 минут.

После оптимизации основных параметров ИФА фоновое окрашивание контрольных лунок (контроль антигена, конъюгата и иммуноглобулинов) оставалось на высоком уровне, в результате чего показатель Р/К был недостаточно высоким для визуального учета реакции.

В связи с этим был испытан отмыбочный раствор, содержался 0,5 М хлорида натрия, а также увеличено количество отмывок после инкубации с коньюгатом с трех до четырех и добавлено еще две отмывки ФСБ без детергента. Применение такого отрывочного раствора и схемы отмывки снизило фоновое окрашивание в контрольных лунках до показателя 0,125-0,110, т.е. в два раза. В результате показатель Р/К повысился до 8-9.".Такое различие в окраске положительного и отрицательного образцов дает возможность проводить визуальный учет реакции, что является ценным в условиях лабораторий, не имеющих аппаратуры для учета результатов анализа.

Время инкубации с субстратной смесью подбирали исходя из данных других исследователей, по которым оно составляет 30 ш - I час и более. Снятие диффузных ограничений (встряхивание плаи-ки во время проявления реакции), возникающих за счет особенное-

гей анализа на твердой фазе, значительно ускорило, ход реакции и позволило сократить время инкубации с субстратом до 15 минут.

Так как в вццелениях животных помимо инфекционного агента (парновируса) содержатся и другие компоненты белкового происхождения, которые могут неспецифически адсорбироваться на твердой фазе и взаимодействовать с компонентами реакции, Для приготовления 10? суспензии из кала и носовой слизи здоровых и экспериментально зараженных телят был испытан 0,01 М ФСБ с содержанием хлорида натрия в количестве 0,5 М и с 0,05^ Твина-20 и без него. Наиболее приемлемый буферный раствор для приготовления суперна-тантов из кала-ФСБ, содержащий 0,05% Твина-20. При использовании этого раствора оптическая плотность (ОП) отрицательного образца соответствовала ОП контрольного отрицательного антигена, а при использовании буферного раствора, не содержащего детергента, наблюдалось значительное фоновое окрашивание отрицательного образца, в 2-3 раза превышающее ОП контрольного отрицательного антигена. Исследования супернатантов из носовой слизи телят показали, что для их приготовления можно использовать буферный раствор без детергента.

Определение специфичности и чувствительности "сзцдвич"-ме-тода Шк для выявления парвовируского антигена. Специфичность ИФА определяли, используя гетерологичные вирусы, вызывающие сходные клинические признаки у больных тавотных. Это парвовирус'"КРС $-го серотипа (штамм Хаден), вирус инфекционного ринотрахеита КРС, вирус диареи КРС, вирус, парагриппа-3, короновирус и ротави-рус телят. Были также использованы вирусы семейства Рагустг!-аае рода рагуоу!гиа - парвовирус гусей, парвовирус свиней. В качестве, заведомо отрицательного контроля брали культур алы!ую ■ ,' жидкость кеинфицированных клеточных культур. Проведенные иссле- •. дования показали отсутствие неспещфическкх перекрестных взаимо-

действий с другими вирусами (ОП ^ 0,120-0,110), что.свидетельствовало о специфичности "сэндвич'.'-метода ИФА, разработанного для выявления парвовируса КРС 3-го типа.

Чувствительность разработанного метода ИФА оценивали с помощью титрования контрольного антигена, полученного методом очистки парвовируса в градиенте плотности сахарозы. Результаты проведенного исследования представлены на рисунке I. Из графика видно, что метод имеет линейную зависимость от 30 мг/мл до 470 мг/мл вирусного белка. Предел чувствительности разработанного метода ИФА составляет 0,03 мкг/мл или 1,5 нг вирусного белка.

При исследовании культуральной жидкости на наличие вирусных антигенов в разработанном "сэндвич"-варианте ИФА удалось выявить парвовирус с инфекционным титром 4,0 1вНЩо/мл - 4,5 Т1Що/т.

Оценку чувствительности данного метода ИФА проводили так же в сравнении с другим методом ИФА выявления антигена, с так называемым "прямым" методом, основанным на сорбции исследуемого антигена на твердую фазу и выявлении его коныогатом.

Из полученных результатов (рис. I) можно сделать вывод, что прямой метод ИФА для выявления антигена уступает по чувствительности исэндвич"-методу ИФА, разработанному нами, в 15 раз.

Результаты ИФА были подтверждены выделением парвовируса в чувствительной культуре клеток из всех проб кала и носовой слизи от экспериментально зараженных телят, положительных в ИФА.

Оптимизация условий иммуноферментного анализа для выявления антител к парвовирусу крупного рогатого скота. Для выявления антител к парвовирусу КРС 3-го типа использовали блокирующий вариант "сэндвич"-метода, основанный на взаимодействии антигена, связанного специфическими антителами, иммобилизированными на твердой фазе, с антителами исследуемой сыворотки, которые блокируют антигенные детерминанты и конъюгат не может выявить антиген, ""о

РАЗВВДЕНШ АНТИГЕНА

Рис.»'1- ОПЩШЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛШХ'Ш МЕТОДОВ им да вшвль-НШ АНТИГЕНА. ■

1- "СЭНДВИЧ"-!ШОД им

2- ПРЯМОЙ МЕТОД Шк '

--

проявляется в отсутствии окрашивания субстрата - положительный результат.

На этом этапе исследований отрабатывали условия инкубирования сывороток (положительной и отрицательной) с антигеном, связанным с твердой фазой через специфические антитела. А также определяли концентрации антигена, при которой гипериммунная сыворотка блокировала бы этот антиген полностью и слабоположительная - не менее чем на 50$ (отношение N/р должно быть 2,1). Результаты исследований показали, что оптимальным разведением антигена является 1:32. Время, необходимое для взаимодействия специфических антител сыворотки с антигеном составляет 1,5 часа. Исследовать сыворотки можно начиная с разведения 1:20-140, при таком разведении неспецифическая блокировка антигена минимальная.

Определение специфичности и чувствительности блокирующего метода ИФА для выявления антител. Для определения специфичности разработанного метода ИФА использовали сыворотки КРС, содержащие антитела к вирусу инфекционного ринотрахеита, вирусу парагриппа-3, возбудителю вирусной диареи КРС, ротавирусу, коронавирусу КРС и парвовирусу КРС I серотипа (штамм Хаден). Со всеми сыворотками были получены отрицательные результаты,.

Чувствительность разработанного метода ИФА для выявления антител к парвовирусу КРС 3-го серотипа определяли в сравнении б реакцией нейтрализации в культуре клеток. Разработанный метод ИФА по чувствительности превосходит реакцию нейтрализации в 20 раз и имеет с ней тесную корреляцию 0,95 при р <i0,05.

Для сравнения чувствительности блокирующего варианта "сэнд-вич"-метода с другими методами ИФА был выбран непрямой метод ИФА, который был стандартизирован по основным параметрам.

. Затем была определена чувствительность непрямого метода ИФА методом титрования положительной, слабоположительной и отрица-

тельной сыворотки . Чувствительность непрямого метода в

2 раза выше, чем блокирующего метода и время, необходимое на проведение анализа, на I час меньше. Но, вместе с тем, концентрация антигена по белку, необходимая для сорбции, в 3,7 раза больше и воспроизводимость результатов намного хуже, чем в блокирующем методе.

Испытание антигенов для №А, полученных альтернативными способами очистки парвовируса крупного рогатого скота 3-го типа. После отработки оптимальных условий проведения блокирующего метода ИФА.антител была проведена оценка антигенов, полученных несколькими способами очистки в сравнении с антигеном, полученным стандартным методом. Результаты исследований приведены в таблице 2, из которой видно, что наибольшее рабочее разведение имеет антиген, очищенный фреоном и хлороформом. У антигена, полученного обработкой у/з и осветленного, рабочее разведение было самым низким. Примерно одинаковая активность была у антигенов, очищенного только фреоном ИЗ, и контрольного.

Оценка специфичности и чувствительности диализа с полученными антигенами показала, что метод очистки антигена не влиял на эти свойства блокирующего метода ЦФА. Поэтому при испытании разработанного метода для выявления•антител в качестве антигенов использовался в основном парвовирус концентрированный и обработанный фреоном и хлороформом. Этот способ, позволяющий получить достаточно активный антиген, поможет снизить затраты на производство компонентов для ИФА,. ' ,

Испытание разработанных тест-систем ИФА для диагностики

парвовирусной инфекции Для испытания разработанных методов ИФА (для выявления антигена и антител к нему было исследовано 33 пробы кала ог телят с признаками диареи, 23 пробь носовой слкзи от телят с поражением

Таблица 2

Результаты исследований антигенов в блокирующем мотодо ISA

SSI П0ЛУ™ I I^V шщен-j . »/Р ! »/* сл.пол.

I. Очисткой концентрированного парвови-■ руса в градиенте . плотности сахарозы - контрольный антиген 1:32 I мкг/мл 8,1+0,45 2,3+0,28

П. Обработкой концентрированного парво-вируса у/з и осветленного при 7 тыс. об/миЙ 1:16 15 мкг/мл 8,0+0,54 2,3+0,81

Ш.Обработкой концентрированного парво-вируса фреоном 1ГЗ 1:32 4,1 мкг/мл 8,7+0,39 2,1+0,53

ХУ.Обработкой концентрированного парво-вируса фреоном ИЗ и хлороформом 1:64 3,1 мкг/мл 8,2+0,65 2,3+0,45

органов дыхания и 134 пробы сыворотки крови от клинически здоровых животных из трех хозяйств Троицкого района Челябинской ' области, неблагополучных по пневмоэнтеритам.

Одновременно в тех же пробах сыворотки крови определяли наличие и титр вирускейтрялизущих антител. Положительные пробы кала и носовой слизи в ИФА исследовались методом выделения пар-вовируса на чувствительной культуре клеток.

Исследование проб выделений от больных телят показало, что среди животных с'признаками диареи в 21,2$ пробах кала методом ИФА бш выявлен парвовирус. Выделить парвовирус в культуре клеток не'удалось ни из одной пробы кала. В двух пробах носовой слизи в ИФА был получен. положительный результат с неразведеншм супернатантом и выделить вирус на культуре клеток не удалось.

При исследован»® сывороток крови от телят и телок перзд случ- . кой антитела к парвовирусу в №$V были обнаружены у Ъ0% животных. Результата были подтверждены в реакции нейтрализации. Совпадаете сть результатов ИФА с РН составляет 93^.

о

ВЫВОДЫ

1. С целью проведения экспресс-диагностики и широкомасштабных ретроспективных исследований в хозяйствах,- неблагополучных по массовым заболеваниям молодняка л органов воспроизводства у ко- . ров разработан тмуноферментный анализ для диагностики парво- .. вирусной инфекции крупного рогатого скота , вызываемой вирусом. 3-го типа.

2. С учетом физика-химических особенностей возбудителя . предложены оптимальные варианты проведения иммунсферментной реакции: париовирусный антиген следует выявлять, используя "савдвга" -метод, для обнаружения вяруссяеш.'фкчесыас антител предлагается применять блокирующий вариант "сеццвич"-метода ШЛ.

3. Разработана технологичная, криешемая дая промышленного.. -производства схема получения шретвирусного антигена дая нклуно--' -ферментного анализа. • - ' •

4. Устаго&гего, что разработанный дая выявления .антигена ... гар^эвлруса КРС 3-го теш,"сэндвич"-метод ИМ позволяет ыиэлягь. вирусный белок в количестве 0,03 ыкг/ыл. Чувствительность.дйнко-го метода превосходит прямой метод иммукоферлеигпого. анализа. антигена в 15 pan, •

5. Выяснено, что предложенный, блокирующий, вариант "сэндвет" -метода ЙЬА дая выявления ант аз ел к. карвовзрусу. 3-го тела по. чувагвигадькостк практически не уступает. напрвю«у мегоду. - ИФА и '. в 20 раз болеа чувоавтелак, чем реакция неГгтральэадЕа.-.. •

; - 21 -

6. Иссдедовангя в хозяйствах Челябинской области, неблагополучных по респираторным и желудочда-юшвчным заболеваниям, показали, что в патматериале от больных телят с диареей парвовирус. был обнаружен в 21,1$ проб, а антитела к парвовирусу в среднем, у 27,6$' животных. Максимальное количество серо позитивных животных - 505? было внявшего в ОПХ Троицкое, а минимальное - 4,3$ в- совхозе им. Ленина.

. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ '

По материалам диссертации составлены "Методические реномад-■ дацш по применении ишуноферментдаго анализа дня диагностики парвовирусдай инфекции крупного ¡рогатого скота, вызываемой З-им типом парвовируса", рассмотренные и одобренные методической комиссией БИЭВ ( протокол * 10 от 26 августа 1993 г.) .

СПИСОК ОПУМИГОМШШХ РАБОТ-

I. Щербакова Т.Б., Юров К.П. Применение иммуноферментного анализа для выявления парвовируса крупного рогатого скота :3-го типа / штамм В-2 / // ВИЭВ-Мэсява,1993.-Дед. в ВНИИГЭИатроцром.

. 2, Щербакова Т.Б., Юров К.П. Разработка ИФА для диагностики парвовируспой инфекции крупного- рогатого скота// Штерна л ы кон-, ференции по болезаям. молодняка. -3993. /в печати /.

Подписано в печать Г?, J£>, ¡9üS г,__Т»,-). JOQ

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕТИТ»