Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Прогнозирование фармакокинетических взаимодействий лекарственных веществ и наносистемы на основе перфторуглеродных соединений

005009813

На правах рукописи

ПШЕНКИНА Надежда Николаевна

ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ И НАНОСИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ПЕРФТОРУГЛЕРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 С 0ЕЗ 20:2

Санкт-Петербург - 2012

005009813

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории лекарственной и экологической токсикологии научно-исследовательского центра ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации.

Научный консультант:

академик РАМН, Заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор медицинских наук, профессор Софроиов Генрих Александрович

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Игнатов Юрин Дмитриевич

доктор медицинских наук, заслуженный работник высшей школы, профессор Дьячук Георгий Иванович

доктор биологических наук Кузнецова Ирипа Николаевна

Ведущее научное учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова

РАМН»

Зашита состоится 22 марта 2012 г. в 11.00 часов на заседании совета по зашите докторских и кандидатских диссертаций Д 001.022.03 при Учреждении Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН» (197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН»

(197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12).

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Пучкова Людмила Валентиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из проблемных областей современной фармакологии является анализ фармакокинетического взаимодействия лекарственных средств и разработка схем рациональной фармакотерапии при комплексном назначении лекарственных препаратов. Актуальность проблемы обусловлена сложившейся практикой полифармакотерапии различных заболеваний и патологических состояний, а также многообразием лекарственных средств на современном фармацевтическом рынке, что делает проблему анализа лекарственных взаимодействий чрезвычайно сложной для решения. С внедрением в медицинскую практику продукции нанотехнологий к существующим аспектам проблемы в ближайшее время может добавиться новый, который можно обозначить как взаимодействие наночастиц и фармакотерапевтических средств в условиях их совместного назначения.

В настоящее время данная проблема еще не проявила себя в полной мере по ряду причин. Во-первых, большинство препаратов на основе наноматериалов находятся в стадии экспериментальной разработки, и клинический опыт их применения практически отсутствует или является недостаточным. Во-вторых, при создании нанопрепаратов, как правило, основное внимание разработчиков сосредоточено на повышении специфической активности создаваемых продуктов, как то адресность доставки лекарств, эффективность газотранспорта и др. (Freitas R.A., 2005; Шляхто Е.В. и др., 2009; Пиотровский Л.Б., 2009; Арчаков А.И., 2010). При этом в стороне остается вопрос о возможности взаимодействия наносистем с малыми молекулами, циркулирующими в кровотоке, в том числе с лекарственными веществами и биологически активными соединениями. Результатом таких взаимодействий может стать модификация параметров фармакокинетики лекарств, изменение эффективных доз, искажение фармакодинамических эффектов, появление побочных реакций, а также нарушение гомеостаза биологически активных молекул.

Проблема фармакокинетических взаимодействий лекарственных веществ и наносистем является новой и требует разработки подходов к ее анализу, поскольку объектом исследования является особый вид лекарственных взаимодействий, который ранее не изучался. Представляется, что важную роль во взаимодействии наночастиц с малыми молекулами будут играть поверхностно-активные процессы, в частности адсорбция, поскольку высокая сорбционная активность является характерным свойством наночастиц в целом (Белоусов А.Н., 2003; Belgorodsky В. et al., 2005; Тугельян В.А., 2008; 2010).

Многообразие лекарственных веществ делает нерешаемой задачу экспериментальной оценки всех возможных комбинаций лекарств и нанопрепаратов в условиях их совместного применения. Представляется, что поиск путей решения проблемы следует искать в раскрытии общих

закономерностей явления и построения на их основе моделей, позволяющих прогнозировать тенденции фармакокинетических изменений в условиях in vivo.

Разработке методической базы для исследования биологического действия наноматериалов уделяется большое значение в современной фармакологии и токсикологии. Так, «Концепция токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов» (2007) подчеркивает, что для оценки биологических эффектов наноматериалов, помимо исследований на животных, необходимо использовать современные достижения биоинформатики, а также модельные эксперименты in vitro и in vivo. Вместе с тем, зачастую остается открытым вопрос экстраполяции результатов, полученных в экспериментах на модельных системах, на уровень целого организма. Представляется, что проведение комплексного исследования на разных уровнях организации живых систем с последующим анализом взаимосвязей между полученными данными будет способствовать поиску конструктивных решений в этом направлении. В частности, комплексный разноуровневый анализ влияния наносистемы на параметры фармакокинетики лекарственных веществ позволит не только выделить процессы, определяющие характер взаимодействий, но также будет способствовать установлению общих закономерностей и позволит выйти на уровень прогнозирования эффектов интерференции в условиях целого организма.

Предиктивная методология интенсивно развивается в фармакологических исследованиях последних лет (Бородина Ю.В. и др., 2003; Chang С. et al., 2009; Kharkar P.S., 2010). Современные информационные технологии позволяют не только анализировать большие массивы данных, но и создавать виртуальные молекулярные модели высокой сложности. Интеграция знаний квантовой и физической химии в различного рода программные продукты дает возможность выполнять расчеты физико-химических свойств соединений in silico (с помощью компьютера) на основе лишь знания химической структуры. Краеугольным камнем предиктивной методологии является количественный анализ связи «структура - активность» (Quantitative Structure Activity Relationships, QSAR) в различных его модификациях (Poroikov V. et al., 2003; 2005;2007; Fjodorova N. et al., 2008; Baskin I. et al., 2008; Hardy B. et al., 2010). Технологии in silico находят широкое применение при прогнозировании параметров фармакокинетики, что позволяет на ранних этапах разработки лекарственных средств отбраковывать соединения с заведомо неприемлемыми характеристиками абсорбции, распределения, метаболизма, элиминации или токсичности (Absorption - Distribution - Metabolism - Excretion - Toxicity, ADMET) (Hou T. et al., 2003, 2007; Geerts T. et al., 2011).

Применение технологий высокопроизводительного скрининга, в том числе с использованием методов in silico, многократно повысило эффективность разработки новых лекарственных средств и способствовало прорыву в области фармацевтики. Вместе с тем, среди огромного количества публикаций,

обращающихся к использованию QSAR-технологий и к прогнозированию ADMET-профиля, относительно небольшая часть работ посвящена фармакокинетическому анализу лекарственных взаимодействий. Вопросы фармакокинетического взаимодействия лекарственных веществ и наносистем в литературе практически не отражены.

При проведении настоящего исследования в качестве модельного прототипа наносистемы был выбран отечественный препарат «Перфторан», представляющий собой наноэмульсию перфторуглеродов. Перфторан зарегистрирован в Российской Федерации в качестве трансфузионного средства с газотранспортными свойствами. На сегодняшний день российский перфторан

- это единственный в мире искусственный кровезаменитель, прошедший все фазы клинических испытаний и разрешенный для медицинского применения. В лечебных учреждениях России и стран СНГ накоплен значительный положительный опыт применения перфторана в хирургической практике, в комплексной терапии неотложных состояний, в клинике внутренних болезней, в онкологии, трансплантологии, токсикологии и других областях медицины (Богданова JI.A. и др., 2004; Шилов В.В. и др., 2004; Мороз В.В. и др., 2007; Кричевский A.JL, Галеев И.К., 2007; Усенко Л.В. и др., 2007; Селиванов Е.А. и др., 2008).

Идентификация перфторана как наносистемы представляется вполне правомочной. Во-первых, по своим размерным параметрам эмульсия перфторан удовлетворяет критериям, предъявляемым к наночастицам, а именно - размер хотя бы в одном из измерений менее 100 нм (Концепция токсикологических исследований ..., 2007). По данным малоуглового рентгеновского рассеяния, частицы эмульсии представляют собой сферы диаметром, в среднем, 50-70 нм (Вазина А.А. и др., 2004). Во-вторых, перфторан обладает рядом свойств, которыми не обладают входящие в его состав компоненты в форме сплошных фаз (Терешина Е.В., 1994, 2002; Rafikova О. et al., 2004; Кузнецова И.Н., 2007; Иваницкий Г.Р., 2008; Воробьев С.И., 2010). Перечисленные доводы позволяют рассматривать наноэмульсию перфторан как адекватный модельный прототип наносистем для исследования взаимодействий наночастиц и фармакотерапевтических средств в традиционных лекарственных формах. Важным обстоятельством, обусловившим выбор перфторана в качестве модельной наносистемы, является и то, что кровезаменитель производится промышленным способом (ОАО НПФ «Перфторан», Пущино, Московская обл.), что служит гарантией качества и стандартизации препарата.

Учитывая обширный клинический опыт и разнообразие показаний к назначению перфторана, в том числе в интенсивной терапии и при неотложных состояниях, анализ фармакокинетического взаимодействия наноэмульсии и лекарственных веществ приобретает не только фундаментальное, но и вполне отчетливое прикладное значение.

Применение системного подхода к анализу взаимовлияния перфторана и лекарственных веществ позволит не только выделить факторы, определяющие

их фармакокинетическое взаимодействие, но и рассмотреть эффекты во взаимосвязи и взаимообусловленности как основу для формирования прогнозирующей модели. Проведенный анализ будет способствовать формированию представлений о механизмах лекарственных взаимодействий наночастиц и фармакотерапевтических средств, а также позволит раскрыть их зависимость от индивидуальных характеристик лекарственных соединений.

Цель исследования: экспериментально-теоретическое обоснование

подходов к прогнозированию фармакокинетических взаимодействий наноэмульсии перфторуглеродов (перфторана) и лекарственных средств в условиях совместного назначения.

Задачи исследования:

1. Исследовать фармакокинетику лекарственных веществ при сочетанном введении с наноэмульсией перфторуглеродов в экспериментах на животных и охарактеризовать эффект фармакокинетического взаимодействия.

2. Охарактеризовать взаимодействие лекарственных веществ с наноэмульсией перфторан и с естественным транспортным белком крови альбумином в модельных экспериментах in vitro. Сравнить параметры взаимодействия лекарственных веществ с наноэмульсией и с альбумином.

3. Проанализировать зависимость изменений фармакокинетики лекарственных веществ от параметров взаимодействия с перфтораном, с альбумином и от физико-химических свойств лигандов.

4. Разработать подход к прогнозированию изменений фармакокинетики лекарственных веществ под влиянием наноэмульсии перфторан с использованием всей совокупности данных, полученных in vivo, in vitro и in silico.

5. Сформулировать предложения по предупреждению негативных проявлений лекарственных взаимодействий при совместном назначении фармакотерапевтических средств и наноэмульсии перфторан.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фармакокинетическое взаимодействие лекарственных веществ и наноэмульсии перфторуглеродов перфторана в условиях сочетанного введения проявляется на этапе транспорта и распределения в форме увеличения, уменьшения или отсутствия изменений суммарной наблюдаемой концентрации лекарств в крови животных.

2. Наноэмульсия перфторуглеродов in vitro обладает селективной адсорбционной активностью в отношении лекарственных веществ, которая определяется липофильностью и полярными свойствами лигандов, и проявляется перераспределением свободных лигандов в диализной системе в зависимости от характера взаимодействия лигандов с частицами наноэмульсии.

3. Перфторан и альбумин обладают сопоставимыми значениями констант сродства к лигандам и показателями сорбционной емкости, что создает предпосылки для конкуренции между ними за связывание лекарственных веществ. Адсорбция свободных лигандов частицами наноэмульсии приводит к

изменению равновесных концентраций в системе «альбумин - лиганд -перфторан» и является движущей силой перераспределения лекарственных соединений.

4. Характер фармакокинетических изменений на этапе транспорта и распределения лекарственных веществ в условиях их сочетанного применения с наноэмульсией перфторуглеродов определяется совокупностью параметров адсорбции частицами наноэмульсии, связывания с альбумином и комплексом физико-химических свойств лигандов.

5. Уравнения регрессии, разработанные на основе физико-химических свойств лигандов, параметров их адсорбции перфтораном и характеристик связывания с альбумином, позволяют прогнозировать направленность изменений концентраций лекарственных веществ в крови в условиях их совместного применения с наноэмульсией перфторуглеродов.

Научная новизна исследования

Впервые установлено и количественно охарактеризовано явление фармакокинетической интерференции наноэмульсии перфторуглеродов и лекарственных веществ в условиях их сочетанного назначения.

Теоретически обосновано и экспериментально подтверждено, что в основе модифицирующего влияния перфторана на параметры распределения лекарственных веществ лежит селективная адсорбционная активность эмульсии перфторуглеродов.

Впервые исследована и охарактеризована адсорбционная способность перфторана в отношении лекарственных веществ, обладающих различными физико-химическими свойствами, и проанализирована зависимость между свойствами лигандов и их адсорбционной способностью. Показано, что, в зависимости от физико-химических свойств, лекарственные вещества могут активно адсорбироваться наночастицами эмульсии перфторуглеродов, быть индифферентными по отношению к ней, либо проявлять отрицательное сродство к эмульсии.

Установлена и количественно охарактеризована в условиях сочетанного применения перфторана и лекарственных веществ обусловленность паттернов фармакокинетических изменений физико-химическим профилем лекарственных веществ, а также характером их взаимодействия с частицами наноэмульсии и с сывороточным альбумином.

Знание причинно-следственных связей, лежащих в основе фармакокинетического взаимодействия лекарственных веществ и наносистем, позволяет не только понять механизм данного явления, но и дает возможность им управлять, то есть прогнозировать результирующий биологический эффект.

Результаты проведенного исследования служат экспериментальнотеоретическим обоснованием постановки новой проблемы фармакологии и наномедицины, которую можно определить как исследование взаимодействий наносистем с малыми молекулами в условиях их совместной циркуляции в организме.

Практическая значимость

На основе эмпирических исследований и статистического анализа разработаны и внедрены методические рекомендации для клинической практики, направленные на предупреждение нежелательных эффектов фармакокинетического взаимодействия лекарственных веществ и перфторана в условиях их совместного назначения.

Разработан комплексный подход к прогнозированию эффектов фармакокинетической интерференции лекарственных веществ и наносистем, опирающийся на максимальное использование данных, полученных в опытах от vitro и рассчитанных методами in silico, и в конечном итоге устанавливающий зависимость фармакокинетических откликов на этапе транспорта и распределения от физико-химических свойств лигандов.

Разработанная методология прогнозирования фармакокинетической интерференции направлена на создание схем рациональной фармакотерапии с использованием наноматериалов, повышение эффективности лечения и снижение нежелательных проявлений лекарственных взаимодействий, что будет способствовать внедрению в медицину и фармакологию инновационных разработок, основанных на достижениях нанотехнологий и наномедицины.

Принципы анализа и прогнозирования, положенные в основу разработанного методического подхода, могут быть использованы при оценке взаимодействий лекарственных веществ с другими наносистемами, а также при исследовании совместных эффектов лекарственных соединений и наносистем на уровне фармакокинетических процессов абсорбции, метаболизма, экскреции.

Полученные в работе данные о сорбционных свойствах перфторана могут послужить основой для дальнейших разработок, открывающих новые области применения наноэмульсий перфторуглеродов в качестве систем доставки лекарств в ткани с нарушенной микроциркуляцией, в качестве диагностических зондов в эндовидеотехнологиях, в составе средств экстракорпоральной детоксикации организма и др.

Личный вклад

Автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, планирование и организация научной работы. Во всех работах, выполненных с соавторами, автору принадлежит постановка задачи, концепция основных методов, анализ полученных результатов, непосредственное участие во всех проведенных исследованиях. Основные результаты, представленные в диссертации, получены самим соискателем.

Апробация работы

Основные результаты исследования доложены на следующих научных конференциях: Всероссийская научная конференция «Физиологически

активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине» (19-20 июня 2001, СПб); 2 Международная

конференция «Клинические исследования лекарственных, средств в России» (20-22 ноября 2002, Москва); International Visions on Blood Substitutes / Comprising the 5th International Symposium on “Current Issues in Blood Substitute Research” and the 4th International Course on “From Structural Genomics to Drug Discovery” (September 17-20, 2006, Parma, Italy); Междисциплинарный

симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (17-27 сентября 2006; 17-28 сентября 2007; Судак, Украина); Всероссийской конференции с международным участием «Реаниматология -наука о критических состояниях» (15-17 ноября 2006, Москва); 8th Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics (August 29 -September 1, 2007, Amsterdam, Netherland); II Санкт-Петербургский

Международный экологический форум «Окружающая среда и здоровье человека» (1-5 июля 2008, Санкт-Петербург); 2 Всероссийская конференция с международным интернет-участием «От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий к наноиндустрии» (8-10 апреля 2009, Ижевск); III Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (1-4 октября 2009, Ростов-на-Дону); II World Congress of the International Academy of Nanomedicine (October 3-6, 2010, Antalya, Turkey); III Международный форум по нанотехнологиям (1-3 ноября 2010, Москва); V Конгресс фармакологов «Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология» (13-14 октября 2010, Санкт-Петербург); Российская научная конференция с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (19-20 мая 2011, Санкт-Петербург); Российская научно-практическая конференция «Актуальные проблемы трансфузиологии» (7 октября 2011, Санкт-Петербург), на заседаниях Ученого совета НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (25 мая 2010) и Ученого совета научно-исследовательских лабораторий и научно-исследовательского центра Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (16 июня 2010).

Реализация результатов исследования

На основании результатов проведенного исследования разработаны «Методические рекомендации по оптимизации схем сочетанного применения перфторана и лекарственных средств в клинической практике», утвержденные начальником Главного военно-медицинского управления МО РФ (2010). Методические рекомендации разосланы в лечебные учреждения Министерства обороны РФ, в научно-исследовательские институты, учреждения гражданского здравоохранения, в основные библиотечные фонды страны.

Результаты работы внедрены в практическом здравоохранении и в учебном процессе на кафедрах фармакологии и военной токсикологии и медицинской защиты Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова при преподавании разделов фармакокинетики и нанотоксикологии.

Публикация результатов исследования

Результаты исследования нашли отражение в 47 научных и научнометодических публикациях, из них - 13 в рецензируемых изданиях,

рекомендованных ВАК для публикации основных результатов диссертационных исследований.

Связь диссертационного исследования с плановой тематикой научноисследовательской работы учреждений. Материалы диссертации получены автором при выполнении плановых научно-исследовательских работ Военномедицинской академии им. С.М. Кирова («Разработка тактико-технических требований к перфторуглеродсодержащим газотранспортным средствам», 2000; «Экспериментальное исследование влияния перфторана на процессы связывания лекарственных препаратов транспортными белками крови», 2005; «Оптимизация схем комплексного применения перфторана и лекарственных средств на основе исследования их фармакокинетической интерференции», 2009; «Анализ современного опыта клинического использования кровезаменителей с газотранспортными свойствами и перспективы совершенствования технологий их комплексного применения в лечебных учреждениях МО РФ», 2010) и отражены в отчетах о НИР.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 293 страницах машинописного текста и состоит из введения, двух глав обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации приведены 40 таблиц и 39 рисунков. Список литературы содержит 280 источников, из них 93 отечественных и 187 зарубежных публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве модельного прототипа наносистем в работе использовали наноэмульсию перфторуглеродов с коммерческим названием «Перфторан» (производства ОАО НПФ Перфторан, Россия) в лекарственной форме 10% эмульсия для инфузий во флаконах 200 мл. Перфторан зарегистрирован в Российской Федерации как кровезаменитель с газотранспортной функцией. Инфузии перфторана показаны при острой и хронической гиповолемии различного генеза, при нарушениях микроциркуляции и периферического кровообращения, для регионарной перфузии и противоишемической защиты донорских органов.

Состав перфторана. 100 мл эмульсии содержат: перфтордекалина (ПФД) -13 г, псрфтор-Ы-4-(метилциклогсксил)-пиперидина (ПМЦП) - 6.5 г, проксанола

- 4 г, натрия хлорида - 0.6 г, калия хлорида - 0.039 г, магния хлорида - 0.019 г, натрия гидрокарбоната - 0.065 г, натрия фосфата однозамещенного - 0.02 г, глюкозы - 0.2 г, воды для инъекций - до 100 мл.

Частицы эмульсии перфторана состоят из перфторуглеродного ядра (смесь ПФД и ПМЦП в отношении 2:1), окруженного слоем поверхностно-активного вещества проксанола. Диаметр частиц составляет в среднем 50-70 нм, что позволяет отнести перфторан к наноэмульсиям. Перфторуглероды, входящие в состав наноэмульсии, химически инертны, не вступают в химические реакции,

не метаболизируются ферментами системы биотрансформации, выводятся в неизмененном виде с выдыхаемым воздухом (Воробьев С.И., 1994; Иваницкий Г.Р., 2001).

В работе изучено 110 лекарственных веществ, 20 из них исследованы в экспериментах на животных, 50 - в опытах in vitro, 60 препаратов служили независимой выборкой для прогнозирования.

В опытах in vitro и in vivo были использованы следующие лекарственные препараты и субстанции: амнкацина сульфат (лиоф. д/р-ра для в/м введ.; Красфарма, Россия), амитриптилина гидрохлорид (р-р для в/м введ. 10 мг/мл; Московский эндокринный завод, Россия), ампициллина тригидрат (пор. д/р-ра для в/в и в/м введ.; Красфарма, Россия), атенолол (субстанция; Sigma, США), бендазола гидрохлорид (дибазол; р-р для в/в и в/м введ. 1%; Ай Си Эн Октябрь, Россия), бензилпенициллина натриевая соль (пор. д/р-ра для в/в и в/м введ.; Синтез АКО, Россия), варфарин (субстанция; Sigma, США), верапамила гидрохлорид (р-р для в/в введ. 2,5 мг/мл; Биосинтез, Россия), вннпоцетин (конц. для пригот. р-ра д/инф. 0,5%; Мосхимфармпрепараты, Россия), галантамин (субстанция; Sigma, США), гентамицина сульфат (р-р для в/в и в/м введ. 40 мг/мл; Биохимик, Россия), дексаметазон (р-р для в/в и в/м введ.4 мг/мл; KRKA, Словения), диклофенака натриевая соль (р-р для в/м введ. 25 мг/мл; Сотекс ФармФирма, Россия), диоксидин (р-р для в/в введ. и наружн. прим. 0,5%; Дальхимфарм, Россия), дифенгидрамнна гидрохлорид (р-р для в/в и в/м введ. 1%; Верофарм, Россия), дротаверина гидрохлорид (но-шпа; р-р для в/в и в/м введ. 20 мг/мл; Chinoin, Венгрия), ибупрофен (субстанция; Sigma, США), имипрамина гидрохлорид (мелипрамин; р-р для в/м введ. 12,5 мг/мл; Egis, Венгрия), кетопрофен (кетонал; р-р для в/в и в/м введ. 50 мг/мл; Lek, Словения), кеторолак (р-р для в/в и в/м введ. 30 мг/мл; Синтез АКО, Россия), клемастина фумарат (тавегил; р-р для в/в и в/м введ. 1 мг/мл; Nycomed, Австрия), кофеин (субстанция; Sigma, США), лидокаина гидрохлорид (р-р д/инъекц. 10%; Биохимик, Россия), метамизол натрия (анальгин; р-р для в/в и в/м введ. 50 %; Верофарм, Россия), метоклопрамида гидрохлорид (р-р для в/в и в/м введ. 5 мг/мл; Московский эндокринный завод, Россия), метопролол (субстанция; Sigma, США), метронидазол (метрогил; р-р д/инф. 5 мг/мл; Unique, Индия), нимодипин (нимотоп; р-р д/инф. 0,2 мг/мл; Bayer Health С are AG, Германия), офлоксацин (офло; р-р д/инф. 2 мг/мл; Unique, Индия), папаверина гидрохлорид (р-р д/инъекц. 2%; Биосинтез, Россия), пентоксифиллин (р-р для в/в введ. 20 мг/мл; Новосибхимфарм, Россия), пирацетам (р-р для в/в и в/м введ. 200 мг/мл; Синтез, Россия), пирензепина дигидрохлорид (гастроцепин; р-р для в/в и в/м введ. 5 мг/мл; Boehringer Ingelheim Espana, Испания), пирлиндол (субст.-пор.; Усолье-Сибирский ХФК, Россия), прокаина гидрохлорид (новокаин; р-р д/инъекц. 5 мг/мл; Верофарм, Россия), прометазина гидрохлорид (пипольфен; р-р для в/в и в/м введ. 25 мг/мл; Egis, Венгрия), пропранолол (субстанция; Sigma, США), ранитидина гидрохлорид (ацилок; р-р для в/в и в/м введ. 25 мг/мл; Wave Pharmaceuticals,

Индия), теофиллин (субстанция; Sigma, США), фенилбутазон (субстанция; Sigma, США), фторурацил (р-р для в/в введ. 50 мг/мл; ЛЭНС-Фарм, Россия), фуросемид (р-р для в/в и в/м введ. 10 мг/мл; Мосхимфармпрепараты, Россия), хлорамфеникол (левомицетин; капли глазн. 0,25%; Синтез АКО, Россия), хлоропирамина гидрохлорид (супрастин; р-р для в/в и в/м введ. 20 мг/мл; Egis, Венгрия), цефазолина натриевая соль (пор. для пригот. р-ра для в/в и в/м введ.; Биохимик, Россия), цефотаксима натриевая соль (пор. для пригот. р-ра для в/в и в/м введ.; Биохимик, Россия), ципрофлоксацина гидрохлорид (р-р д/инф. 2 мг/мл; Синтез АКО, Россия), эмоксипина гидрохлорид (р-р д/ин. 1%; Московский эндокринный завод, Россия), эналаприла малеат (субстанция; Sigma, США), этамзилат (дицинон; р-р для в/в и в/м введ.; Lek, Словения).

Для расчетов и прогнозирования были использованы следующие лекарственные вещества (в соответствие с генерическими названиями): амиодарон, ацегаминофен, бромокриптин, галоперидол, диазепам, дилтиазем, доксициклин, домперидон, дроперидол, зопиклон, идарубицин, изониазид, индометацин, итраконазол, каптоприл, кетоконазол, кетотифен, клоназепам, клонидин, кодеин, лизиноприл, лоперамид, лоратадин, мидазолам, морфин, налидиксовая к-та, напроксен, нитразепам, нифедипин, нифлуминовая кислота, пефлоксацин, пироксикам, правастатин, прокаинамид, пропофол, рибавирин, сальбутамол, сульпирид, теноксикам, тиопентал Na, трамадол, триметазидин, фамотидин, фенитоин, фенобарбитал, феноксиметилпенициллин, фентанил, флунитразепам, фозиноприл, хлордиазепоксид, хлорохин, цетиризин, цефадроксил, цефиксим, цефтриаксон, цефуроксим, циметидин, циннаризин, цитарабин, этакриновая кислота, этопозид.

Экспериментальные данные по связыванию лекарственных веществ с альбумином и адсорбции их частицами наноэмульсии перфторан были получены в опытах in vitro.

Данные о фармакокинетическом взаимодействии перфторана и лекарственных веществ получены в опытах на 60 беспородных кроликах-самцах массой тела 2,8-3,5 кг. Животные поступали из питомника РАМН «Рапполово» (Ленинградская обл.) и из питомника Военно-медицинской академии. Вновь поступившие животные находились на карантинном наблюдении в течение 2-3 недель. Кролики содержались в клетках по 1 животному. Условия содержания обеспечивали нормальный биологический фон и полностью соответствовали требованиям Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) от 06.04.1973 г. Рацион питания соответствовал Приказу М3 №1179 от 1983 г. Кормление осуществлялось ad libitum, в первой половине дня при свободном доступе к воде.

В экспериментах на кроликах перфторан всегда вводили внутривенно струйно медленно в постоянной дозе 5 мл/кг массы тела животного. Кроликам контрольной группы для создания равных условий гемодилюции в том же объеме вводили внутривенно физиологический раствор.

Кровь для количественного анализа лекарственных веществ отбирали из краевой вены уха кроликов через 0,08 - 0,25 - 0,5 - 1,0 - 1,5 - 3,0 - 5,0 - 24 часа после введения лекарственных препаратов.

При исследовании фармакокинетических взаимодействий перфторана и лекарственных средств перфторан вводили внутривенно (5 мл/кг) и сразу после окончания инфузии внутривенно или внутримышечно вводили исследуемые лекарственные вещества в следующих дозах: амитриптилин (6,0 мг/кг, в/м), ампициллин (100,0 мг/кг, в/м), бендазол (5,0 мг/кг, в/в), верапамил (0,5 мг/кг, в/в), диклофенак (5,0 мг/кг, в/в), дифенгидрамин (2,0 мг/кг, в/в), дротаверин (6,0 мг/кг, в/в), имипрамин (2,5 мг/кг, в/м), кетопрофен (20,0 мг/кг, в/м), кеторолак (3,0 мг/кг, в/в), клемастин (1,0 мг/кг, в/в), метоклопрамид (2,0 мг/кг, в/в), офлоксацин (4,0 мг/кг, в/в), пентоксифиллин (10,0 мг/кг, в/в), прометазин (2,5 мг/кг, в/в), ранитидин (25,0 мг/кг, в/в), хлоропирамин (4,0 мг/кг, в/в), цефазолин (20,0 мг/кг, в/в), цефотаксим (25,0 мг/кг, в/в), ципрофлоксацин (4,0 мг/кг, в/в).

Исследование сорбционной способности перфторана в отношении лекарственных средств проводили в экспериментах in vitro с помощью равновесного диализа. В качестве полупроницаемой мембраны служили диализные мешки шириной 25 мм с размером пор 12-14 кДа производства «Orange Scientific» (Бельгия).

При проведении диализа во внутреннюю камеру вносили 5 мл перфторана и 0,5 мл раствора лекарственного вещества в диапазоне конечных концентраций в диализной системе от 12,5 до 100 мкМ. После преинкубации перфторана с лекарственным веществом пробы диализировали против 20 мл У15 М Ыа-фосфатного буфера pH 7,4 при комнатной температуре в течение 18 часов. В контрольных пробах вместо перфторана использовали фосфатный буфер.

После завершения диализа концентрации лекарств в диализате контрольных и опытных проб определяли по поглощению в области специфического максимума, который предварительно определяли для каждого исследуемого препарата. Количество связанного лекарства С, рассчитывали как разность между полной концентрацией, внесенной в диализную систему, и концентрацией свободного препарата, определяемого в диализате:

Ci=L4-L,(Vx + V2) ^ (1)

о

где L0 - общая концентрация лекарства внесенного в систему; Z,; -концентрация свободного лекарства, определяемая во внешней камере (в диализате), V/ и V2 -объемы внутренней и внешней камер, соответственно.

Для расчета констант взаимодействия лигандов с частицами наноэмульсии и определения количества адсорбированных лигандов использовали метод Скетчарда, позволяющий получать искомые величины путем графического решения уравнения:

(2)

где Ci - концентрация образовавшегося лиганд-перфторанового комплекса, Z,, -концентрация свободного лиганда, Ro - полная концентрация перфторана, п -количество молекул лиганда, связавшегося с 1 частицей эмульсии.

Исследование связывания лекарств с альбумином в опытах in vitro проводили с помощью анализа концентрационного тушения природной флуоресценции белка при связывании с лигандами (Лакович Дж., 1986; Seetharamappa J., Kamat В.Р., 2004; Zhang Y.Z. et al., 2008).

В экспериментах использовали кристаллический бычий сывороточный альбумин (BSA) фирмы “Sigma” (фракция V по Кону, свободный от протеаз и у-глобулина). Альбумин использовали в постоянной концентрации 10 мкМ, приготовленной на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4. На том же буфере готовили разведения лекарственных веществ. В случае плохой водорастворимости разведения лекарственных субстанций готовили с использованием ДМСО, присутствие которого не оказывает собственного влияния на процесс связывания лигандов с альбумином. Лекарственные вещества при исследовании связывания с альбумином использовали в постоянных концентрациях 2,5 - 5,0

- 10 - 20 - 40 - 80 - 160 - 320 мкМ. Анализ связывания лигандов с альбумином проводили при 25°С и при 37°С, что позволило, помимо кинетических параметров связывания, получить термодинамические характеристики лиганд-альбуминового взаимодействия.

Измерения флуоресценции проводились на спектрофлуориметре Hitachi модель MPF-4, снабженном ксеноновой лампой, с использованием кварцевой кюветы размером 1 см в термостатированной ячейке. Длина волны возбуждающего света составляла 290 нм, длина волны эмиссии - 340 нм.

Для расчета констант сродства лигандов к альбумину использовали графическое решение уравнения Штерна-Фольмера, приведенного к логарифмическому виду (Лакович Дж., 1986; Jiang М. et al., 2004):

где К - константа взаимодействия и п - число центров связывания. График,

ординат в точке \о^К, а угол наклона численно равен количеству центров связывания лиганда п.

Для расчета термодинамических параметров связывания (изменения энтальпии и энтропии) использовали уравнение Вант-Гоффа:

где ДН и ДБ, соответственно, изменение энтальпии и энтропии, К - константа взаимодействия, Я - универсальная газовая постоянная, Т - температура

(3)

построенный в координатах

осью

реакционной смеси в градусах Кельвина. Решение получали графическим путем построением графика в системе координат InК от i Наклон графика

АН AS

дает отношение-------, а отрезок на оси ординат - отношение —.

R Я

Анализ сайт-специфического связывания лигандов с основными сайтами альбумина проводили с помощью метода компьютерного биомоделирования in silico, используя программное обеспечение, разработанное компанией Quantum Pharmaceuticals (http://q-pharm.com), при непосредственном участии специалистов компании. Расчет свободной энергии комплекса (AG) выполняли методом стыковки (docking) лигандов с участками 2BXD и 2BXF молекулы альбумина, в рамках пространственной сетки размером 20x20x20 А, ориентированной по центральному атому лиганда в соответствующем связывающем центре. Результаты, полученные в результате стыковки лигандов с центрами связывания альбумина, приводили к значениям логарифма константы взаимодействия log Кыь.

Количественный анализ лекарственных веществ в плазме крови кроликов проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления в обращено-фазном варианте по оригинальным методикам. Подбор метода анализа, оборудования и условий хроматографического разделения проводили в соответствие с рекомендациями, изложенными в методических пособиях по хроматографии (Коган Л.А., 1975; Митрука Б.М., 1978; Хайвер К., 1993).

Подготовку проб для определения плазменной концентрации ампициллина, офлоксацина, пентоксифиллина, ранитидина, цефазолина, цефотаксима и ципрофлоксацина проводили по одинаковой схеме. В 0,5 мл плазмы добавляли по 100 мг кристаллического NaCl для солевой денатурации белка и освобождения связанного препарата. Белки плазмы осаждали добавлением 0,5 мл 50% ТХУ. Пробы охлаждали и центрифугировали в течение 15 мин при 8000 об/мин и температуре +5°С. Супернатант отбирали и использовали для хроматографического анализа.

Определение проводили на жидкостном хроматографе “Perkin-Elmer”, модель 601 (США), на колонке Bondapac CIS длиной 250 мм и диаметром 4 мм. Скорость подвижной фазы ацетонитрил : вода (45:55) составляла 1 см3/мин. Детектирование осуществляли на проточном ультрафиолетовом детекторе при длине волны Х=254 нм. Количество свободного препарата в крови определяли методом абсолютной калибровки. В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали препарат той же партии.

Для определения плазменной концентрации амитриптилина, бендазола, верапамила, диклофенака, дифенгидрамина, дротаверина, имипрамина, кетопрофена, кеторолака, клемастина, метоклопрамида, промегазина и хлоропирамина подготовку проб проводили следующим образом. К 2 мл плазмы добавляли 350 мг кристаллического хлорида натрия, перемешивали до

растворения соли. Вносили по 0,1 мл раствора внутреннего стандарта в концентрации 0,5 мг/мл. В качестве внутреннего стандарта для определения дротаверина использовали кеторолак, и наоборот; дифенгидрамина, прометазина - хлоропирамин; амитриптилина, хлоропирамина -дифенгидрамин; бендазола, имипрамина, клемастина, метоклопрамида -прометазин; верапамила - папаверин; диклофенака - кетопрофен, и наоборот. В предварительно проведенных исследованиях по подбору оптимальных условий экстрагирования препаратов из плазмы было получено, что максимальный выход дротаверина, кеторолака, кетопрофена и диклофенака происходит в кислой среде, остальных препаратов - в щелочной. Необходимую реакцию смеси получали внесением в образцы по 0,2 мл конц. НС1 или по 0,3 мл 25% NH4OH, после чего добавляли по 6 мл хлористого метилена. Встряхивали в течение 7 мин, затем центрифугировали 15 мин при 6000 об/мин и температуре +5°С. Отбирали нижнюю органическую фазу, досуха упаривали в токе азота. Сухой остаток растворяли в 0,5 мл этанола. Для анализа с помощью петлевого дозатора в хроматограф вносили пробу объемом 25 мкл.

Определение проводили на жидкостном хроматографе производства фирмы “Perkin-Elmer”, модель 601 (США), на колонке Lichrosorb Cig длиной 250 мм и диаметром 4,6 мм. В качестве подвижной фазы использовали смесь, содержащую 35% ацетонитрила, 25% 0,05 М TRIS буфера pH 7,4 и 40% воды. Скорость подачи элюента на колонку составляла 1 мл/мин. Детектирование проводили на спектрофотометрическом детекторе LC-55 (Beckman), совмещенном с хроматографом, при длине волны Х=254 нм.

Физико-химические параметры лекарственных веществ были взяты из электронных баз данных DrugBank (http://www.drugbank.ca) и PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov), а также получены расчетным путем с помощью web-калькулятора Molinspiration (http://www.molinspiration.com), позволяющего на основе структурной формулы вещества рассчитать следующие параметры: логарифм распределения в системе октанол/вода LogP, молекулярная масса MW, площадь топологической полярной поверхности TPSA, число доноров Don и акцепторов водорода Асс, число вращающихся связей Rot, молекулярный объем Vol.

С помощью программного обеспечения, разработанного компанией Quantum Pharmaceuticals (http://q-pharm.com, Москва) и при участии специалистов компании были рассчитаны параметры растворимости лекарственных соединений в воде LogSmo и в неполярном растворителе диметилсульфоксиде LogSDMso, а также значения логарифма констант ионизации молекул рКа. Из электронной базы данных DrugBank были взяты сведения о температуре плавления tm исследуемых лекарственных соединений.

Данные о физико-химических свойствах молекул были рассчитаны для всех 110 препаратов, использованных в работе. .

Методы статистической обработки результатов исследований. Для

математической обработки результатов наблюдений использовали возможности приложения Microsoft Excel пакета программ Microsoft Office.

Статистический анализ результатов исследования выполняли с применением пакета прикладных программ SPSS, версия 17 (Юнкеров В.И., Григорьев С.Г., 2002; Наследов А., 2008). В работе использовали следующие виды статистического анализа:

- многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA);

- многофакторный линейный регрессионный анализ;

- дискриминантный анализ;

- корреляционный анализ с вычислением параметрических корреляций Пирсона и непараметрических корреляций Спирмена и Кендалла;

- непараметрический анализ с помощью критериев Уилкоксона и критерия знаков для парных выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На предварительном этапе исследования проведена оценка влияния перфторана на фармакокинетику липофильного препарата дротаверина и гидрофильного - цефазолина. Задачей данного раздела исследования было выяснить существование эффекта фармакокинетического взаимодействия как такового, а также оценить его зависимость от путей поступления лекарственных веществ и от сроков их совместного введения с наноэмульсией перфторан. Фармакокинетические эффекты перфторана исследовали на модели его сочетанного введения с лнпофильным лекарственным веществом дротаверином и с гидрофильным препаратом цефазолином. Перфторан во всех опытах вводили внутривенно болюсно медленно в постоянной дозе 5 мл/кг.

В экспериментах на кроликах использовали следующие схемы совместного введения перфторана и дротаверина:

- дротаверин, 2 мг/кг, в/в - сразу после инфузии перфторана (в другую вену); за 0,5 ч до инфузии перфторана (рис. 1а);

- дротаверин, 5 мг/кг, в/м - сразу после инфузии перфторана; через 1 ч после инфузии перфторана (рис. 16);

- дротаверин 10 мг/кг, per os - сразу после инфузии перфторана; за 1 ч до инфузии перфторана (рис. 1в);

- дротаверин и перфторан смешивали до введения и вводили внутривенно в одном шприце; доза дротаверина - 2 мг/кг, перфторана - 5 мл/кг (рис. 1г).

Эксперименты с дротаверином показали, что при сочетанном введении перфторана и лекарственного вещества фармакокинетика последнего претерпевает существенные изменения, которые проявляются на этапах абсорбции и распределения лекарственного препарата накоплением дротаверина в крови и увеличении сроков его элиминации. Наиболее отчетливо изменения фармакокинетики выражены при введении дротаверина сразу после инфузии перфторана при всех использованных путях поступления. При

инфузии перфторана спустя 0,5-1 ч после введения дротаверина наблюдается та же тенденция в изменении концентраций лекарственного вещества в крови, но в менее выраженной форме.

а) б)

в) г)

Рисунок 1 - Динамика концентраций дротаверина в крови кроликов при разных путях и последовательности его введения в сочетании с инфузией перфторана (ПФ), 5 мл/кг

По оси абсцисс - время после введения дротаверина, ч. По оси ординат - концентрации дротаверина в плазме крови кроликов, мкг/мл (на рис. 1 в концентрация перфтордекалина ПФД приведена в мг/мл плазмы). а) дротаверин 2 мг/кг, в/в, раздельно с ПФ (в разные вены); б) дротаверин 5 мг/кг, в/м; в) дротаверин 10 мг/кг, per os; г) дротаверин 2 мг/кг и ПФ 5 мл/кг, в/в (в одной системе).

В скобках приведен интервал времени между введением препаратов.

При внутривенном ведении дротаверина сразу после инфузии перфторана отмечено изменение хода концентрационной кривой и появление дополнительного максимума, не характерного для динамики концентраций при данном пути введения. Полученные результаты свидетельствуют о перераспределении дротаверина под влиянием перфторана и о вмешательстве наноэмульсии в процессы транспорта и распределения лекарственного препарата.

В объяснение данного эффекта была выдвинута гипотеза, согласно которой наноэмульсия проявляет сорбционную активность в отношении дротаверина, в результате чего сорбционная емкость крови увеличивается и происходит перераспределение лекарственного вещества при внутривенном введении, усиление абсорбции при внутримышечном и пероральном поступлении, а также увеличение времени циркуляции лекарственного вещества в кровотоке.

Подтверждением выдвинутого предположения о сорбционной активности наноэмульсии служат результаты экспериментов, приведенные на рисунке 1г. В этих опытах дротаверин и перфторан смешивали до введения и вводили в дозе, эквивалентной той, что была использована в эксперименте, отраженном на рисунке 1а. На рисунке 1г, помимо концентраций дротаверина приведена динамика концентраций перфтордекалина (ПФД), основного компонента наноэмульсии перфторан. Как видно, профиль концентрационной кривой дротаверина практически повторяет таковой для ПФД. Полученные результаты можно рассматривать как свидетельство того, что перфторан и дротаверин циркулируют как единый комплекс.

В следующей серии экспериментов изучали влияние перфторана на фармакокинетику цефазолина. В данном случае использовали два варианта постановки опытов - введение цефазолина в/в либо в/м в дозе 20 мг/кг сразу после инфузии перфторана (5 мл/кг). Анализ параметров фармакокинетики цефазолина показал, что на фоне введения перфторана усиливается процесс перехода препарата из крови в ткани при внутривенном пути его поступления. При внутримышечном введении не отмечено изменений параметров фармакокинетики цефазолина.

Таким образом, предварительные исследования показали, что фармакокинетическое взаимодействие наноэмульсии и лекарственных веществ существует. Оно отчетливо проявляется на этапе транспорта и распределения лекарственных веществ, при этом наиболее выраженные изменения наблюдаются при внутривенном введении лекарственного препарата сразу после окончания инфузии перфторана. В основе модифицирующего влияния наноэмульсии, по-видимому, лежит ее сорбционная активность. Эффект фармакокинетической интерференции является неоднозначным и зависит от свойств лекарственных веществ.

Дальнейший анализ имел целью установить закономерности, лежащие в основе фармакокинетических взаимодействий лекарственных веществ и наносистемы, и на их основе разработать модели, позволяющие прогнозировать эффекты фармакокинетической интерференции на этапе транспорта и распределения.

Проведенное исследование носило комплексный характер и включало анализ взаимодействий на разных уровнях организации живых систем. Блок-схема, иллюстрирующая основные структурные элементы исследования, представлена на рисунке 2. Структура исследования содержит 4 блока данных,

каждый из которых включает комплекс параметров, характеризующих взаимодействие лекарственных веществ с наноэмульсией (блок 2) и с альбумином (блок 3), данные по исследованию фармакокинетики в опытах на животных (блок 4), а также сведения о физико-химических свойствах лекарственных веществ (блок 1). Важной составной частью работы является анализ взаимосвязей между блоками параметров, причем как между отдельными блоками данных, так и между комплексом параметров в целом. Такой анализ включает оценку зависимости параметров связывания лекарств с альбумином (или с перфтораном) от физико-химических свойств лигандов; зависимости изменений параметров фармакокинетики от характеристик связывания лекарств с альбумином или адсорбции перфтораном; а также анализ зависимости фармакокинетического ответа от всего комплекса полученных параметров.

Рисунок 2 - Блок-схема, иллюстрирующая структуру исследования

В конечном итоге перед исследованием ставилась задача получить такую математическую зависимость, которая позволяла бы прогнозировать характер изменений фармакокинетики лекарств при сочетанном введении с перфтораном на основе лишь сведений о структуре и физико-химических свойствах лигандов.

Анализ и прогнозирование сорбционной активности перфторана в отношении лекарственных веществ

Сорбционную активность перфторана исследовали в экспериментах in vitro с помощью равновесного диализа на модели взаимодействия с перфтораном 50 лекарственных веществ, принадлежащих к различным фармакологическим группам и обладающих широким спектром физико-химических свойств.

В результате исследования выявлено три характерных типа взаимодействия лигандов с наноэмульсией: позитивное, нейтральное и негативное. Перфторан-позитивное связывание характеризовалось адсорбцией

примерно 50% лиганда. При перфторан-негативном взаимодействии отмечалось вытеснение лигада из компартмента, содержащего наноэмульсию, в результате чего наблюдали кажущееся увеличение концентрации свободного лиганда. Графики Скетчарда, полученные при анализе адсорбции некоторых исследованных веществ приведены на рисунке 3.

пирацетам = 0,001х - 0,195 атснолол = -0,(Ю7х + 0,431 пенициллин = -0,001 х + 0,140 кетопрофсн = -0,01х + 1,24 иапаверин = -0,02х + 3,88 фснилоугазон= -0,04х + 4,58

2,0 -

-100

пирацетам

-1,0

^снилбугазон

V

ч

кстопрофсн

\

папаверин

атснолол

...... бензилпешщиллин

\

50 100 150

Сі, мкМ

Рисунок 3 - Графики Скетчарда для взаимодействия некоторых исследованных лигандов с перфтораном

По оси ОХ - концентрация связанного лиганда (мкМ); по оси ОУ~ отношение концентрации связанного лиганда к концентрации свободного.

На рисунке 3 фенилбутазон и папаверин демонстрируют пример лигандов, активно адсорбирующихся частицами наноэмульсии. На графике Скетчарда они дают прямые с большим отрицательным углом наклона, пересекающие ось ординат в области высоких значений, что соответствует константам взаимодействия (Крр) на уровне 104 М"1. Графики для атенолола, кетопрофена и бензилпенициллина имеют небольшой отрицательный наклон и лежат в положительной области вблизи начала координат. Наконец, для пирацетама график Скетчарда имеет положительный наклон и располагается в отрицательной области системы координат. В результате величина Крр для пирацетама приобретает отрицательные значения.

На основе совокупности полученных данных (значения констант взаимодействия Крр, число адсорбированных молекул лиганда в расчете на 1 частицу наноэмульсии п, степень связывания %) был проведен дискриминантный анализ, в результате которого исследованная выборка распределилась на три группы, в соответствии с типом взаимодействия (табл.1).

Таблица 1 - Усредненные внутригрупповые значения параметров взаимодействия лекарственных веществ с перфтораном и статистика межгрупповых различий

Группы Кол-во Параметры взаимодействия лигандов с перфтораном

в группе ЯрИМ-') п %

1 16 2,9-104±3,7-103 159,6 ± 18,8 51,9 ±4,8

2 17 3,8-103 ± 1,1 * 103 125,7 ±32,8 15,8 ±3,3

3 17 —5,9 ■ 103 ± 2,5 -103 61,6 ±22,9 -3,2 ±3,1

'1.2 6,27 0,90 6,23

11 ■3 7,63 3,31 9,66

12 -3 3,53 1,60 4,22

Условные обозначения:

Крр - константа взаимодействия с лигандов перфтораном; п - число связанных молекул лиганда в расчете на частицу эмульсии; % - степень связывания, выраженная в процентах.

11-2,' >1-1: *2-з - г-критерий Стьюдента оценки значимости различий между 1-й и 2-й группами, 1-й и 3-й; 2-й и 3-й, соответственно.

В нижней части таблицы 1 приведены значения /-критерия Стьюдента для межгрупповых сравнений по каждому показателю. Как видно, сформированные группы имеют отчетливые межгрупповые различия с высоким уровнем значимости практически по всем исследованным параметрам. Поименный перечень препаратов в соответствии с их. принадлежностью к выделенным группам представлен в таблице 2.

Таблица 2 - Распределение лекарственных веществ по группам в зависимости от параметров их взаимодействия с перфтораном

1 группа (перфторан-позитивные) п= 16 2 группа (нейтральные) п= 17 3 группа (перфторан-негативные) п= 17

1 2 3

Амитриптилин Атенолол Амикацин

Бендазол Г алантамин Ампициллин

Варфарин Дексаметазон Бензилпенициллин

Верапамил Диоксидин Г ентамицин

Винпоцетин Дифенгидрамин Кофеин

Диклофенак Кеторолак Метамизол Ыа

Дротаверин Лидокаин Метронидазол

Ибупрофен Метоклопрамид Офлоксацин

Имипрамин Метопролол Пентоксифиллин

Кетопрофен Пропранолол Пирацетам

Клемастин Ранитидин Пирензепин

Продолжение таблицы 2

1 2 3

Нимодипин Фуросемид Прокаин

Папаверин Хлорамфеникол Теофиллин

Пирлиндол Хлоропирамин Фторурацил

Прометазин Эмоксипин Цефазолин

Фенилбутазон Эналаприл Цефотаксим

Этамзилат Ципрофлоксацин

Оценку зависимости параметров связывания лекарственных веществ с перфтораном от физико-химических свойств лигандов проводили в ходе корреляционного анализа. Установлена положительная корреляция между адсорбцией и липофильностью лекарственных веществ LogP, отрицательная — между сродством к перфторану и водорастворимостью лигандов LogSH2o, а также параметрами, характеризующими их полярные свойства (TPSA, Don, Асс).

Регрессионный анализ зависимости константы сродства лигандов к перфторану от физико-химических свойств показал, что при очевидной значимости для данного взаимодействия липофильных свойств лигандов, уравнение регрессии, составленное на основе одного лишь параметра LogP дает довольно низкий коэффициент детерминации (R2 = 0,46). Включение в уравнения регрессии дополнительных переменных, полученных путем математических преобразований исходных параметров (возведением в степень, вычислением соотношений между отдельными физико-химическими параметрами и т.д.), позволило существенно повысить достоверность прогноза значений Крр на основе физико-химических свойств. В результате было разработано около 30 уравнений регрессии различной сложности и статистической значимости, из которых был отобран ряд уравнений, обладающих наилучшими статистическими характеристиками. Среди них уравнение (5), устанавливающее квадратичную зависимость KpF от липофильности и константы ионизации молекул лигандов, с коэффициентом детерминации R2 = 0,81:

К„ = —3 -104 + 3,4-103£ogP-(l+0,25-Io£P)+7-103 ■ рК„ - (1 - ОД ■ ) -3,4-103 •LogSlno (5)

Полученные данные свидетельствуют о том, что зависимость адсорбции лекарственных веществ частицами наноэмульсии носит сложный характер, определяется липофильностью и полярными свойствами молекул, может прогнозироваться на основе физико-химических свойств лигандов.

Анализ и прогнозирование взаимодействий лекарственных веществ с сывороточным альбумином

Сывороточный альбумин является основным белком крови, осуществляющим транспорт лекарств и во многом определяющим параметры фармакокинетики на этапе распределения. Связывание лигандов с альбумином носит сложный характер, поскольку на молекуле белка существует несколько центров связывания лигандов (Kragh-Hansen U. et al., 2002). Основными центрами связывания лекарственных веществ считаются центры I и II по классификации Sudlow, маркерами которых являются варфарин и диазепам, соответственно (Sudlow G. et al., 1975). Несмотря на детальную изученность альбумина, прогнозирование параметров связывания лигандов имеет определенные трудности в силу большой гетерогенности молекул, вступающих во взаимодействие с белком.

Учитывая значимость транспортной функции альбумина на этапе распределения лекарственных веществ, цель настоящего раздела работы заключалась в получении разносторонних характеристик взаимодействия лигандов с альбумином, анализе их зависимости от физико-химических свойств лигандов и в разработке уравнений регрессии для прогнозирования данного взаимодействия.

Связывание 50 лекарственных веществ с альбумином исследовали in vitro с использованием метода флуоресцентной спектроскопии, основанного на тушении нативной флуоресценции белка при взаимодействии с лигандами. Анализ проводили при разных температурах, что позволило получить не только кинетические (константа сродства Kajb, число мест связывания и), но и термодинамические параметры взаимодействия (изменение свободной энергии AG, энтальпии АН и энтропии AS при образовании лиганд-протеинового комплекса).

Комплексный анализ механизма взаимодействия лекарств с альбумином с использованием кинетического и термодинамического подходов показал, что связывание имеет сложный характер. При одинаковом значении константы сродства лигандов к альбумину связывание может происходить как за счет гидрофобного взаимодействия, так и за счет водородных, донорно-акцепторных и вандерваальсовых связей. Полученные данные были проанализированы с позиций концепции P.D. Ross и S. Subramanian (1981), которая позволяет судить

о типе химических связей, вовлеченных в образование лиганд-протеинового комплекса, по характеру изменений энтальпии и энтропии в ходе реакции. В результате были выделены три типа взаимодействия лигандов с альбумином. В первом случае связывание происходило с преимущественным изменением энтальпии, во втором - движущей силой является изменение энтропии, а в третьем - происходит равнозначный вклад изменений как энтальпии, так и энтропии. Дискриминантный анализ позволил сгруппировать препараты по термодинамическому типу взаимодействия с альбумином (табл. 3).

Таблица 3 - Перечень лекарственных веществ в соответствие с группировкой по типу взаимодействия с альбумином

Энтальпийный тип Энтропийный тип Равнозначный тип

п= 14 п = 16 п = 20

Амитриптилин Бендазол Амикацин

Бензилпенициллин Верапамил Ампициллин

Варфарин Винпоцетин Атенолол

Дексаметазон Галантамин Г ентамицин

Дифенгидрамин Диклофенак Кофеин

Дротаверин Диоксидин Лидокаин

Имипрамин Ибупрофен Метоклопрамид

Нимодипин Кетопрофен Метопролол

Прометазин Кегоролак Метронидазол

Пропранолол Клемастин Офлоксацин

Фенилбутазон Метамизол Ыа Пентоксифиллин

Цефазолин Папаверин Пирацетам

Ципрофлоксацин Пирлиндол Пирензепин

Эмоксипин Фуросемид Прокаин

Хлорамфеникол Ранитидин

Цефотаксим Теофиллин Фторурацил Хлоропирамин Эналаприл Этамзилат

Среднегрупповые значения показателей взаимодействия лигандов с альбумином и /-критерии для межгрупповых сравнений приведены в таблице 4.

Таблица 4 - Межгрупповая статистика параметров взаимодействия лекарственных веществ с альбумином

Группы по термодинамическому типу взаимодействия Параметры взаимодействия с альбумином

1о8/С,№ АН, кДж-М-1 \АН\ / \ТЛ5\

1. Энтальпийный тип 4,70 ±0,20 -56,55 ± 9,44 2,49 ±0,45

2. Энтропийный тип 4,77 ± 0,25 37,13 ± 11,8 0,55 ± 0,05

3. Равнозначный тип 2,33 ±0,15 -5,41 ± 13,8 1,03 ±0,10

и-2 -0,24 -6,19 4,29

(1-3 9,56 -3,06 3,16

8,46 2,34 -4,42

Сопоставление термодинамических характеристик взаимодействия со степенью связывания лекарств с белком показало, что высокоизбирательное связывание может происходить как по энтальпийному, так и по энтропийному типу. Тогда как при слабом связывании с альбумином изменение энтальпии и энтропии происходит в равной степени. Как показали результаты компьютерного моделирования (докинга), высокоизбирательное связывание лигандов с I или со II центрами альбумина может происходить как по энтальпийному, так и по энтропийному типу. Лиганды третьего термодинамического типа (равнозначный тип) взаимодействуют с обоими центрами альбумина с низким сродством.

Корреляционный анализ связи между параметрами взаимодействия лекарств с альбумином и физико-химическими свойствами лигандов выявил положительную корреляцию между связыванием и липофильностью веществ, отрицательную - между связыванием и водорастворимостью и донорно-акцепторным потенциалом молекул лекарств. С учетом результатов корреляционного анализа проведен множественный регрессионный анализ, который позволил создать ряд уравнений регрессии, математически описывающих зависимость logКац от физико-химических свойств лигандов, например, уравнение 6:

hgKalb = 1,25 + 0,9-LogP+2,6-l0-zTPSA-0,2-Rot (6)

В соответствии с полученными уравнениями регрессии были проведены расчеты logKaib Для выборки из 60 препаратов, не исследованных в эксперименте. Сопоставление рассчитанных значений logA^/* с данными литературы выявило высокую сходимость (81%) прогнозируемых и литературных данных.

Таким образом, в данном разделе работы была установлена математическая зависимость константы связывания лекарственных веществ с альбумином logКац от физико-химических свойств лигандов, а также получен набор кинетических и термодинамических характеристик лиганд-альбуминового взаимодействия, которые в дальнейшем были использованы в качестве предикторов при разработке модели, прогнозирующей изменения фармакокинетики in vivo.

Сравнительный анализ взаимодействия лекарственных веществ с альбумином и с перфтораном

Поскольку в условиях организма наночастицы эмульсии и альбумин будут совместно циркулировать в кровотоке, представлялось важным в сравнительном аспекте оценить их сродство к лекарственным веществам и определить взаимоотношения в системе «перфторан - лиганд - альбумин».

Результаты анализа адсорбции лекарственных веществ перфтораном и связывания с альбумином показали, что константы взаимодействия лигандов с частицами наноэмульсии и с белком сопоставимы по своим значениям.

Поскольку привести полученные результаты в полном объеме не представляется возможным, в таблице 5 эти параметры представлены для ряда препаратов исследованной выборки.

Таблица 5 - Константы взаимодействия некоторых исследованных лигандов с перфтораном (Кгг) и с альбумином {Ка1ь)

Лекарственные вещества КрГ, М' -1 Ка1Ь, М

Бендазол 5-104 1-104

Варфарин 2-104 8 -105

Верапамил 4-104 3 104

Диклофенак 5-104 1-105

Дротаверин 6-104 8-105

Ибупрофен 1-104 2-106

Имипрамин 3-104 2-104

Клемастин 4-104 2-104

Нимодипин 1-104 1104

Прометазин МО4 з-ю4

Сравнение перфторана и альбумина по показателю сорбционной емкости показывает, что они обладают сопоставимыми значениями этого параметра. Исходя из того, что диаметр частиц перфторана составляет 50-70 нм, можно подсчитать, что в 1 л 10%-ной эмульсии содержится примерно 1,5-1018 частиц (Иваницкий Г.Р., 2011; Воробьев С.И., 2008). Если 1 частица наноэмульсии способна адсорбировать около 150 молекул лиганда (табл. 1), то литр перфторана будет адсорбировать 3 ■ 1020 молекул лекарственного вещества, что в концентрационном выражении составляет 5-10-4 М. Для сравнения 1 литр альбумина в физиологической концентрации (соответствует примерно 0,6 мМ) при 100%-ном насыщении одного связывающего центра (чего в реальных условиях не достигается) может связать примерно 6-10‘4 М лекарственного вещества. Как видим, по параметрам сродства к лигандам и по сорбционной емкости наноэмульсия перфгоран представляет собой систему, способную конкурировать с естественным транспортером альбумином, и оказывать влияние на фармакокинетические процессы распределения лекарств в организме.

Наличие конкурентных отношений между перфтораном и альбумином наглядно демонстрирует график, представленный на рисунке 4. Перфторан и альбумин по условиям опыта были отделены друг от друга полупроницаемой мембраной, исключающей непосредственный контакт между ними. По одну стороны мембраны альбумин находился в комплексе с дротаверином, по другую - чистый перфторан. Верхняя кривая на рисунке 4 показывает зависимость доли связанного белка от концентрации лиганда до начала диализа против перфторана, а нижняя - после окончания диализа.

Как видно на рисунке 4, доля связанного альбумина после диализа против перфторана уменьшается

примерно в 2 раза. Объяснение данного явления может состоять в следующем: перфторан адсорбирует на поверхности своих частиц дротаверин, находящийся в свободном, не связанном с альбумином, состоянии. В результате концентрация

свободного лиганда

снижается, что приводит к изменению равновесия в системе [А] + [Ь] <-> [АЬ] и диссоциации лиганд-

альбуминового комплекса.

Так происходит до тех пор, пока в системе не установится новое

равновесное состояние. Подобный процесс, очевидно, имеет место и в

кровеносном русле в условиях совместного введения перфторана и

лекарственных соединений. Изменение равновесных концентраций свободных лекарственных веществ между кровью и тканями может являться движущей силой перераспределения лекарств и вызывать их отток из тканей в кровь.

Полученные результаты свидетельствуют, что между альбумином и перфтораном существуют конкурентные отношения за связывание лигандов. В связи с этим, при разработке моделей, прогнозирующих фармакокинетические взаимодействия на этапе транспорта и распределения, необходимо учитывать параметры взаимодействия лигандов как с перфтораном, так и с альбумином.

Исследование влияния перфторана на фармакокинетику лекарственных веществ в экспериментах на животных

Для исследования были взяты 20 препаратов, принадлежащих к различным фармакологическим группам, отличающихся по физико-химическим свойствам, и по параметрам взаимодействия с альбумином и с перфтораном. Перфторан вводили животным однократно в/в (5 мл/кг) и сразу после окончания инфузии -лекарственный препарат в/в или в/м в соответствующей дозе.

Примеры кривых, отражающих характерные типы фармакокинетических изменений под влиянием перфторана, приведены на рисунке 5.

Концентрация внесенного дротаверина, мкМ

Рисунок 4 - Изменение доли альбумина, связанного с дротаверином, после диализа дротаверин-альбуминового комплекса против перфторана

Диклофенак 5 мг/кг, в/в

Кетопрофен 20 мг/кг в/м

Кеторолак 3 мг/кг, в/в

Прометазнн 2,5 мг/кг, в/в

25

20

15

10

5

0

Опыт ' Контроль

Гч.

12 3 4

Цефотаксим 25 мг/кг, в/в

Верапамил 0,5 мг/кг в/в

Рисунок 5 - Динамика концентраций диклофенака, кетопрофена, кеторолака, цефотаксима, прометазина и верапамила в крови кроликов

«Контроль» - содержание лекарственных веществ в крови при раздельном введении; «Опыт» - содержание лекарственных веществ в крови при введении на фоне перфторана. По оси ординат - концентрация лекарственных веществ (мкг/мл плазмы).

По оси абсцисс - время после введения лекарства (ч).

Обращает внимание, что во многих случаях кривая зависимости концентрации от времени совершенно не соответствует классической кривой, описывающей кинетику лекарств при внутривенном введении. Часто наблюдаются значительные колебания концентраций, появление дополнительных максимумов. Для анализа таких кривых использование одно-или двухкамерных моделей фармакокинетики неприемлемо. В связи с этим для количественной оценки рассчитывали площадь под кривой за 5-часовой период наблюдения AUCs и время достижения половины концентрации, наблюдаемой за 5 часов, Т}0.

После статистической обработки полученных данных в соответствии с /-критерием Стьюдента по изменению площади под концентрационной кривой AUCS исследованные препараты разделились на три группы:

1 группа - увеличение концентрации препарата в крови под влиянием перфторана (амитриптилин, бендазол, верапамил, диклофенак, дифенгидрамин, дротаверин, имипрамин, кетопрофен, клемастин, офлоксацин, прометазин, хлоропирамин).

2 группа - отсутствие статистически значимых изменений концентрации (ампициллин, кеторолак, метоклопрамид, ранитидин, ципрофлоксацин).

3 группа - уменьшение концентрации препарата в крови под влиянием перфторана (пентоксифиллин, цефазолин, цефотаксим).

Следует отметить, что деление препаратов на группы по характеру фармакокинетического ответа в значительной мере коррелирует с распределением лигандов на группы по типу взаимодействия с перфтораном в опытах in vitro (см. табл. 2). Кроме того, лекарственные соединения, демонстрирующие увеличение содержания в крови под влиянием перфторана, обладали способностью эффективно связываться с альбумином (см. табл. 3 и 4).

Разработка уравнений регрессии для прогнозирования направленности изменений фармакокинетики лекарств при их сочетанном назначении

с перфтораном

При разработке уравнений регрессии для прогнозирования направленности фармакокинетических изменений под влиянием перфторана в качестве зависимой (прогнозируемой) переменной был выбран параметр, который получил условное обозначение tAucs. По смысловому значению он близок к широко применяемому в статистике /-критерию Стьюдента проверки значимости различий между двумя выборками. В контексте данного исследования параметр Iaucs означает, насколько значимы изменения наблюдаемой концентрации лекарства в крови AUCs под влиянием перфторана по сравнению с контролем (введение препарата без перфторана).

В качестве независимых переменных (предикторов) была использована вся совокупность данных, полученных в экспериментах in vitro при анализе связывания лекарственных веществ с перфтораном и с альбумином, а также 11 физико-химических характеристик лигандов, рассчитанных методами in silico.

При разработке уравнений регрессии стремились подойти к прогнозированию с разных сторон, используя как отдельные блоки параметров, так и их различные комбинации (табл. 6). Представляется, что такой подход позволяет получить совокупность уравнений, обеспечивающих объективность прогноза. Всего было сгенерировано около 30 уравнений регрессии различной сложности статистической значимости.

Таблица 6 - Уравнения регрессии, прогнозирующие значения параметра /лета для изменения наблюдаемой концентрации лекарств в крови А11С5

(7)

(8)

(9)

(10)

(И)

(12)

(13)

Несмотря на очевидную связь между сорбционной активностью наноэмульсии и изменениями концентраций лекарственных веществ в крови животных при сочетанном введении с перфтораном, уравнения регрессии,

Уравнения регрессии Я2

На основе параметров сорбции перфтораном

^ лис5 = 0,52 + 1,45-10"1 К„ 40,6

На основе параметров связывания с альбумином

(лис5 = -498 - 0,037АЯ +1,641о8 Ка1Ь 61,4

На основе параметров взаимодействия с альбумином и с перфтораном

1АиС5 =2,6+1,6-^Р-0,03 • АН - 0,7 -рКа 71,9

, /\ л, «г. > ^ 0,01-ГР5И \\-LogP ‘лиг* = 1,36 - 0,01 • АН - 0,9 • ]ог — АиСЪ Ьо^Р рКа 85,1

На основе физико-химических свойств и параметров адсорбции перфтораном

^„=0,2-5,5-10 -^ + №Р_°,18-^ рК„ Ьо8Р 70,3

На основе физико-химических свойств и параметров взаимодействия с альбумином и с перфтораном

/„га =6,2-1,6-108^^ -0,035-^ +0М-ВРГ 94,8

На основе физико-химических свойств

1,ис, = 3,3 +1,250,19- рК" 0,7-Дог 72,9

составленные на основе параметров адсорбции лигандов наноэмульсией, имели невысокие статистические характеристики. Так, уравнение (7) имело коэффициент детерминации R2 всего 40,6%. Прогноз, составленный на основе параметров связывания с альбумином, был более достоверным (R2 = 61,4). Наиболее высокие статистические показатели имели уравнения, разработанные на базе комплекса предикторов, включающих физико-химические свойства и параметры, полученные в экспериментах in vitro при исследовании адсорбции лекарственных веществ частицами наноэмульсии и при анализе связывания лигандов с альбумином. Сходимость расчетных значений параметра tAUCs , полученного с помощью уравнений (10) и (12), с экспериментальными данными составила 85,1 и 94,8%, соответственно.

Разработанные уравнения регрессии решают задачу экстраполяции данных, полученных в модельных экспериментах, на уровень целого организма. Они позволяют прогнозировать, как свойства и активность лекарственного вещества, выявленные в опытах in vitro или in silico, будут влиять на его активность in vivo.

Следует отметить, что полученные зависимости оперируют данными, полученными в результате конкретного эксперимента, и не могут иметь широкого применения другими исследователями. Вместе с тем, представлялось важным разработать уравнения регрессии, которые позволяли бы на основе общедоступных сведений (физико-химических свойств лекарственных соединений) прогнозировать направленность изменений плазменных концентраций лекарств под влиянием наноэмульсии перфторуглеродов. Как известно, достоверность прогноза в значительной мере зависит от численности используемой выборки. В то же время эксперименты на животных представляют собой самый трудоемкий этап исследований, сопряженный с определенными этическими проблемами.

Разработанные уравнения регрессии были использованы для расчета параметра 1Аиа для 50 препаратов с привлечением всей совокупности экспериментальных и расчетных данных. Расчеты выполнялись на основании уравнений (9) - (13), после чего было получено среднее прогнозируемое значение параметра tAUCs. Таким способом была получена расширенная экспериментально-теоретическая выборка, содержащая значения параметра Iaucs Для 50 лекарственных веществ. Проверка соответствия расчетных и экспериментальных значений tAucs в отношение 20 препаратов, исследованных на животных, дала 85% сходимость значений. Это позволило использовать расширенную выборку для дальнейшего регрессионного анализа, в ходе которого были установлены зависимости параметра tAucs непосредственно от физико-химических свойств лигандов.

Основные этапы разработки прогнозирующих уравнений регрессии схематически представлены на рисунке 6.

Рисунок 6 - Этапы разработки уравнений регрессии для прогнозирования направленности изменений концентраций лекарств в крови под влиянием

перфторана

Из числа разработанных уравнений регрессии были отобраны 3 математических зависимости, которые приведены в таблице 7. Полученные уравнения имели высокие значения коэффициента детерминации и критерия Фишера, что позволило применить их при прогнозировании фармакокинетических тенденций для 60 препаратов, которые не исследовались в экспериментах, но для которых были рассчитаны физико-химические параметры.

Таблица 7 - Уравнения регрессии, прогнозирующие значения параметра 1Аис5 на основе физико-химических свойств лигандов

(14)

(15)

(16)

По результатам прогнозируемых тенденций в изменении концентраций лекарств в крови под влиянием перфторана был проведен дискриминантный анализ, в результате которого препараты распределились на три группы в зависимости от характера прогнозируемых изменений (рис. 7). Для группировки препаратов были заданы граничные значения параметра tAucs-hues < -2,0 - прогнозируется уменьшение концентрации;

0 < | tAucs I < 2,0 - прогнозируется отсутствие влияния перфторана; hues — 2,0 — прогнозируется увеличение концентрации лекарства в крови.

Группы по изменению концентр аці-ш пекар ста в крови

О уменьшение нет эффекта ф увеличение О центроид группы

I I I 3 I

-10 -5 О 5 10

Функция 1

Рисунок 7 - Группировка препаратов по результатам дискриминантного

анализа

Перечень препаратов в соответствие с их принадлежностью к выделенным группам приведен в таблице 8.

Уравнения регрессии R2 F

hucs~ -0,045 +1,2 • LogP - ~~~± LogP 74,3 68,0

7,15 ■ LogP 0,15-pK, 4,15 TPSA t.„r,= 0,95 + — 5 —- - AUC5 pKa LogP MW 87,5 107,3

пОЙ 8 LogP Ofii-TPSA Q,\-pKa+0,%-{Don+Acc) t лігч — 0,o4 + — AUCS pK0 Acc LogP 88,7 88,7

Таблица 8 - Группировка препаратов в зависимости от прогнозируемого изменения концентраций лекарств в крови при сочетанном применении с перфтораном

Прогнозируемая направленность изменений концентраций в крови

Увеличение (п=54) Нет эффекта (п*48) Уменьшение (п=8)

Амиодарон Ампициллин Амикацин

Амитриптилин Ацетаминофен Атенолол

Бендазол Галантамин Гентамицин

Бензилпенициллин Дексаметазон Пентоксифиллин

Бромкриптин Диоксидин Рибавирин

Варфарин Доксициклин Цефтриаксон

Верапамил Зопиклон Цитарабин

Винпоцетин Идарубицин Этамзилат

Галоперидол Изониазид

Диазепам Кодеин

Диклофенак Кофеин

Дилтиазем Лидокаин

Дифенгидрамин Лизиноприл

Домперидон Метамизол натрия

Дроперидол Метоклопрамид

Дротаверин Метопролол

Ибупрофен Морфин

Имипрамин Налидиксовая кислота

Индометацин Офлоксацин

Итраконазол Пефлоксацин

Кетоконазол Пирацетам

Кетопрофен Пирензепин

Кеторолак Пироксикам

Кетотифен Прокаин

Клемастин Прокаин амид

Клоназепам Ранитидин

Клонидин Сальбутамол

Лоперамид Сульпирид

Лоратадин Теноксикам

Метронидазол Теофиллин

Мидазолам Трамадол

Напроксен Триметазидин

Нимодипин Фамотидин

Нитразепам Фенитоин

Нифедипин Фенобарбитал

Нифлуминовая кислота Феноксиметилпенициллин

Оксазепам Фторурацил

Папаверин Хлорамфеникол

Пирлиндол Цетиризин

Правастатин Цефадроксил

Прометазин Цефазолин

Пропофол Цефиксим

Пропранолол Цефотаксим

Тиопентал Цефуроксим

Фентанил Циметидин

Флунитразепам Ципрофлоксацин

Фозиноприл Эналаприл

Фуросемид Этопозид

Хлордиазепоксид

Хлорокин

Хлоропирамин

Циннаризин

Эмоксипин

Этакриновая кислота

1лис5= 4,75 ± 0,33 1лис5 = 0,24 ± 0,17 ?лис5 = —3,26 ± 0,66

Первую группу составили 54 препарата, для которых ожидается увеличение концентрации в крови в условиях совместного введения с перфтораном (табл. 8). Вторая группа включает 48 препаратов, концентрация которых не будет претерпевать изменений. Третью группу составили 8 препаратов, для которых прогнозируется усиление элиминации из крови под влиянием перфторана.

Как видно в таблице 8, среди препаратов, для которых прогнозируется тенденция к увеличению концентраций в крови при совместном применении с перфтораном, представлены кардиотропные, нейротропные, антигистаминные и противовоспалительные средства. Для противоопухолевых и антибактериальных препаратов, напротив, характерно либо усиление элиминации лекарственных веществ из кровотока под влиянием перфторана, либо отсутствие влияния кровезаменителя. С целью минимизации нежелательных эффектов фармакокинетической интерференции разработаны практические рекомендации.

Заключение

В результате проведенного исследования на модели взаимодействия наноэмульсии перфторуглеродов и лекарственных веществ выявлен и охарактеризован новый вид фармакокинетического взаимодействия, который на этапе транспорта и распределения заключается в возникновении конкурентных взаимодействий между наносистемой и сывороточным альбумином за связывание лигандов. Результатом этих взаимодействий является увеличение сорбционной емкости крови и уменьшение концентрации свободных лигандов, что приводит к изменению равновесных концентраций свободных лекарственных веществ между кровью и тканями. Сдвиг равновесных концентраций сопровождается перераспределением лекарственных соединений между центральным и периферическим компартментами организма и проявляется реабсорбцией лекарственных веществ в кровоток, увеличением плазменных концентраций и появлением дополнительных максимумов.

Проведенный анализ показал, что не все лекарственные вещества подвержены фармакокинетическому взаимодействию с наноэмульсией. Взаимодействие с перфтораном носит селективный характер и определяется липофильностью и полярными свойствами лигандов. По способности адсорбироваться на поверхности частиц наноэмульсии лекарственные вещества разделены на три группы: перфторан-позитивные, нейтральные и перфторан-негативные. Эти свойства в значительной мере определяют направленность фармакокинетических изменений, наблюдаемых при сочетанном применении перфторана и лекарственных соединений in vivo. Однако одних только сведений о параметрах адсорбции лигандов частицами наноэмульсии оказалось недостаточно для получения надежного прогноза в отношении фармакокинетических изменений в условиях организма. Привлечение для

разработки уравнений регрессии совокупности данных, полученных при анализе связывания лигандов с альбумином, позволило значительно повысить достоверность прогноза, что еще раз подтверждает значимость взаимоотношений между транспортным белком и наносистемой для результирующего эффекта фармакокинетического взаимодействия.

В результате не только определено новое направление исследований, которое можно обозначить как анализ взаимодействия наночастиц и лекарственных веществ в условиях их совместного назначения, но и предложен подход к разработке данной проблемы. Суть подхода заключается в комплексной оценке взаимодействий наносистемы и лекарственных веществ на разных уровнях организации живых систем, в привлечении экспериментальных и расчетных методов с целью получения всесторонних характеристик как самих веществ, так и исследуемых процессов, в выявлении закономерностей, лежащих в основе исследуемых взаимодействий, и в разработке на их основе математических моделей, основанных на общедоступных параметрах, и позволяющих прогнозировать тенденции фармакокинетических взаимодействий.

В настоящей работе объектом исследования служили фармакокинетические взаимодействия перфторана и лекарственных веществ, возникающие на этапе транспорта и распределения. Разработанная структура исследования может быть полностью воспроизведена при анализе взаимодействий лекарственных веществ с другими наносистемами, которые пригодны для внутривенного и парентерального введения. При этом могут быть использованы имеющиеся конститутивные характеристики лекарственных веществ, например, физико-химические свойства и параметры связывания с альбумином. Аналогичный принцип построения исследования может применяться для изучения взаимодействий наносистем и лекарственных веществ в проекции на другие этапы фармакокинетики. В зависимости от задач исследования содержание блоков данных будет меняться, но принцип комплексного использования модельных экспериментов и наблюдений in vivo может быть реализован и для решения таких задач, как анализ биодоступности или метаболизма. Так, для моделирования кишечной проницаемости широко используется культура клеток Сасо-2, а для анализа метаболизма -микросомальные фракции печени. Кроме того, в последние годы разработаны компьютерные программы, позволяющие расчетными методами получать параметры проницаемости и метаболизма. Безусловно, прогнозируемые тенденции должны иметь экспериментальное подтверждение, которое может быть получено в ходе комплексного исследования.

В целом результаты проведенного исследования будут способствовать разработке схем рациональной фармакотерапии с использованием наноматериалов, внедрению в медицину препаратов на основе нанотехнологий, а также целенаправленному подходу к разработке новых лекарственных форм на базе наносистем.

ВЫВОДЫ

1. Перфторуглеродная наноэмульсия перфторан способна изменять фармакокинетику лекарственных веществ при их сочетанном назначении. Фармакокинетическое взаимодействие наноэмульсии и лекарственных соединений отчетливо проявляется на этапе транспорта и распределения лекарственных веществ и выражается изменениями действующих концентраций лекарств в крови экспериментальных животных. Характер изменений фармакокинетики определяется сорбционной способностью наноэмульсии перфторуглеродов, зависит от физико-химических свойств лекарственных соединений и может прогнозироваться на их основе.

2. На примере липофильного препарата дротаверина установлено, что при его введении кроликам в сочетании с инфузией перфторана (5 мл/кг) фармакокинетические взаимодействия имеют место при внутривенном, внутримышечном и пероральном путях поступления лекарственного средства. При внесистемном введении дротаверина усиливается его абсорбция, а при внутривенном - происходит перераспределение лекарственного препарата между кровью и тканями; при всех использованных путях введения имеет место уменьшение объема распределения и снижение общего клиренса. Наиболее отчетливо явление фармакокинетической интерференции проявляется при введении дротаверина сразу после окончания инфузии перфторана. При инфузии перфторана через 30-60 мин после введения дротаверина изменения фармакокинетики менее выражены.

3. При исследовании фармакокинетики 20 лекарственных веществ в условиях их внутривенного либо внутримышечного введения кроликам сразу после окончания инфузии перфторана выявлены три типа фармакокинетического отклика: достоверное повышение, снижение или отсутствие изменений наблюдаемой концентрации лекарственных веществ в крови животных. В случае фармакокинетического взаимодействия отклонения хода концентрационной кривой от характерного вида начинают регистрироваться через 15 мин после введения лекарственных веществ и при увеличении концентраций часто сопровождаются появлением дополнительных максимумов.

4. Наноэмульсия перфторуглеродов в опытах in vitro проявляет селективную адсорбционную активность в отношении лекарственных веществ, которая выражается в перераспределении свободных лигандов в системе «диализирующий раствор - перфторан». По типу взаимодействия с перфтораном лекарственные вещества из числа 50 исследованных соединений делятся на эффективно адсорбируемые, слабо адсорбируемые и вытесняемые частицами наноэмульсии из компартмента, содержащего перфторан. Константы сродства для эффективно адсорбируемых соединений составляют порядка 104 М'1; для слабо адсорбируемых - порядка 102 М’1; для вытесняемых веществ константы имеют отрицательные значения порядка (-) 103 М'1. Разработаны

уравнения регрессии, позволяющие прогнозировать характер взаимодействия лекарственных веществ с перфтораном на основе физико-химических свойств лигандов.

5. Для лекарственных веществ, активно адсорбируемых наноэмульсией, характерно увеличение наблюдаемой концентрации в крови при введении лабораторным животным на фоне инфузии перфторана, а для соединений, характеризующихся отрицательными константами взаимодействия с наноэмульсией, характерно снижение концентраций лекарств в крови в условиях сочетанного назначения с перфтораном.

6. Высокоизбирательное связывание лигандов с альбумином характеризуется константами сродства 104+106 М'1, что соответствует степени связывания лекарственных веществ в крови на уровне 85-99%. Константы аффинитета при низкоизбирательном связывании составляют Ю'+Ю3 М"1 (соответствует степени связывания в крови менее 40%). Эффективное связывание лекарственных веществ с альбумином в опытах in vitro сопровождается преимущественным изменением либо энтальпии, либо энтропии, тогда как при связывании с низким сродством энтальпия и энтропия изменяются в равной мере. Степень связывания лигандов с альбумином зависит от физико-химического профиля соединений и может прогнозироваться на его основе с помощью уравнений регрессии.

7. Константы сродства лигандов к частицам наноэмульсии и к альбумину сопоставимы по своим значениям, что создает предпосылки для конкурентных отношений в системе «альбумин - перфторан» за взаимодействие с лекарственными веществами. Сорбционная емкость перфторана близка сорбционной емкости альбумина в физиологической концентрации. Это способствует формированию дополнительного пула лекарственных веществ, связанных с эмульсией, и приводит к изменению равновесных концентраций свободных лекарственных соединений.

8. Явление фармакокинетического взаимодействия лекарственных веществ

и наноэмульсии перфторуглеродов носит комплексный характер и определяется способностью лекарств адсорбироваться частицами наноэмульсии, параметрами взаимодействия лигандов с альбумином и физико-химическими свойствами лекарственных соединений. Использование при прогнозировании эффектов фармакокинетической интерференции in vivo в качестве

дескрипторов лишь параметров адсорбции лигандов перфтораном не позволяет получить достаточно достоверный прогноз (R2 = 40,6%). Дополнительное включение в уравнения регрессии параметров связывания лигандов с альбумином и физико-химических характеристик лекарственных соединений, сопровождается увеличением коэффициентов детерминации прогнозирующих математических моделей до 70-95%.

9. Разработан комплексный подход к прогнозированию эффекта

фармакокинетической интерференции, основанный на использовании совокупности данных, характеризующих физико-химический профиль

лигандов, особенности взаимодействия лекарственных веществ с эндогенной мишенью (альбумином) и с наносистемой (перфтораном) в модельной системе, а также на результатах анализа фармакокинетического взаимодействия в условиях целого организма. Подход включает установление зависимостей между отдельными блоками параметров и выявление взаимосвязей между всей совокупностью данных. Установленные зависимости положены в основу разработанных уравнений множественной линейной регрессии, прогнозирующих направленность изменений концентраций лекарственных веществ в условиях сочетанного введения с перфтораном на основе сведений о физико-химических свойствах лигандов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Минимизации нежелательных эффектов фармакокинетического взаимодействия лекарственных веществ и перфторана будут способствовать следующие рекомендации:

1. Первоначально следует определить характер ожидаемого влияния перфторана на действующие концентрации интересующего лекарственного соединения. Для этого следует, используя разработанные в данной работе уравнения регрессии и сведения о физико-химических свойствах лекарственного препарата, вычислить значения параметра 1Лис5- Необходимые физико-химические параметры можно почерпнуть в электронных базах данных или рассчитать самостоятельно с помощью молекулярного калькулятора.

2. Если рассчитанное значение /лею < -2, то для данного препарата ожидается ускорение элиминации из кровеносного русла при внутривенном введении и замедление поступления в кровь при внесистемном введении в сочетании с перфтораном. Если полученное значение находится в диапазоне -2 < 1лис5 < 2, то изменений фармакокинетики лекарства под влиянием перфторана не ожидается. Если величина рассчитанного параметра /лею > 2, то для данного лекарственного вещества прогнозируется увеличение действующей концентрации при совместном использовании с перфтораном. Эти препараты требуют к себе пристального внимания при использовании в схемах терапии совместно с перфтораном.

3. Лекарственные препараты, активно адсорбируемые эмульсией, рекомендуется вводить до начала инфузии перфторана. Интервал между введением лекарственного препарата и инфузией перфторана определяется периодом полураспределения лекарства. При инфузии кровезаменителя после введения лекарства с интервалом времени, соизмеримым с периодом полураспределения лекарственного вещества, модифицирующее влияние перфторана будет менее выраженным. Если сведения о фармакокинетике отсутствуют, можно придерживаться срока введения лекарства за 1 ч и более до инфузии перфторана.

4. При необходимости введения перфторан-позитивных веществ одновременно либо после инфузии кровезаменителя, целесообразно уменьшить

дозу лекарства. Следует иметь в виду, что в присутствии перфторана эффективность транспорта липофильных лекарственных соединений возрастает.

5. При недостаточной выраженности ожидаемого лечебного эффекта от введения лекарственного препарата на фоне инфузии перфторана не следует форсировать дозовую нагрузку во избежание развития постотдаленных эффектов передозировки в связи с возможностью пролонгирования фармакологического действия.

6. В связи с большой вероятностью образования комплексов между частицами эмульсии и липофильными лекарственными веществами, не рекомендуется вводить перфторан-позитивные препараты в одной системе с перфтораном. Данная предосторожность обусловлена тем, что вопросы стабильности эмульсии при образовании такого рода комплексов не исследованы.

СПИСОК ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых научных изданиях

1.Мурзина Е.В., Андреева Н.Б., Пшенкина Н.Н., Губанов А.И. Модификация кинетики метилового и этилового спиртов под влиянием перфторана // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2004. -№1 (11). - С. 47-52.

2.Пшенкина Н.Н., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Губанов А.И. Фармакокинетика ампициллина и амитриптилина в условиях предварительного введения перфторана // Вестник Российской Военномедицинской академии. - 2005. - №1 (13). - С. 54—57.

3.Пшенкина Н.Н., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Губанов

А.И. Анализ влияния перфторана на фармакокинетику некоторых лекарственных средств // Общая реаниматология. - 2007. - Т. 3, № 3/1. -С. 25-30.

4.Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Губанов А.И., Каширцева Е.В. Влияние перфторана на фармакокинетику диазепама при разных вариантах их сочетанного введения // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2007. -№4 (20). - С. 99-104.

5.Пшенкина Н.Н. Кинетический и термодинамический анализ взаимодействия лигандов с альбумином // Медицинский академический журнал. - 2010. - Т. 10, № 3. - С. 130-138.

6.Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В., Андреева Н.Б., Софронов Г.А. Исследование сорбции лекарственных веществ перфтораном // Общая реаниматология. - 2011. - Т. 7, № 2. - С. 63-67.

7.Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А. Анализ и прогнозирование сорбции лекарственных веществ перфтораном на основе физико-химических свойств лигандов // Общая реаниматология. - 2011. - Т. 7, № 3. - С. 56-60.

8.Селиванов Е.А., Пшенкина Н.Н., Мурзина Е.В., Софронов Г.А., Ханевич М.Д., Сарычев В.А. Кровезаменители с газотранспортной функцией на основе гемоглобина // Биомедицинский журнал Medline.ru. - 2011. - Т. 12. - С. 990-1013.1ЖЬ: http://www.medline.ru

9.Софронов Г.А., Ханевич М.Д., Манихас Г.М., Лисянская А.С., Селиванов Е.А., Феофанова А.В., Фадеев Р.В., Гипарович М.А., Пшенкина Н.Н., Диникин М.С. Особенности гемокомпонентной терапии у онкологических больных // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. - 2011. - Т. 170, № 3. - С. 64-68.

10. Пшенкина Н.Н. Прогнозирование связывания лекарственных веществ с альбумином на основе физико-химических свойств лигандов // Биомедицинский журнал Medline.ru. - 2011. - Т. 12. - С. 980-989. 1ЖЬ: http://www.medline.ru

11. Пшенкина Н.Н. Сывороточный альбумин: структура и транспортная функция // Биомедицинский журнал Medline.ru. - 2011. - Т. 12. - С. 1048-1066. и ЛЬ: http://www.medline.ru

12. Пшенкина Н.Н. Предиктивные технологии в исследовании новых лекарственных веществ // Биомедицинский журнал Medline.ru. - 2011. - Т. 12. -С. 1067-1091.1Л1Ь: http://www.medline.ru

13. Пшенкина Н.Н. Влияние перфторана на фармакокинетику гидрофильных лекарственных веществ // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2011. - Т. 74, № 12. - С. 23-26.

Публикации в профессиональных научных сборниках и научно-методических изданиях

14. Софронов Г.А., Шилов В.В., Андреева Н.Б., Васильева Т.П., Пшенкина Н.Н. и др. Методические рекомендации для постановки и проведения клиникоэкспериментальных исследований по изучению модифицирующего действия перфторана на фармакокинетику лекарственных препаратов // Применение перфторорганических соединений в экспериментальной и клинической медицине: Сборник методических рекомендаций / Под общей ред. акад. РАМН проф. Г.А.Софронова. - СПб: ВМедА- - 2002. - С. 5—20.

15. Плужников Н.Н., Софронов Г.А., Сосюкин А.Е., Головко А.И., Шилов

B.В., Андреева Н.Б., Пшенкина Н.Н. и др. Использование препарата

перфторан в схемах лечения отравлений дихлорэтаном. Методические рекомендации. // Применение перфторорганических соединений в экспериментальной и клинической медицине: Сборник методических

рекомендаций / Под общей ред. акад. РАМН проф. Г.А.Софронова. - СПб: ВМедА.-2002.-С. 21-30.

16. Софронов Г.А., Шилов В.В., Ханевич М.Д., Сосюкин А.Е., Матвеев

C.Ю., Скорик В.И., Андреева Н.Б., Судус А.В., Пшенкина Н.Н. и др. Применение препаратов на основе перфторуглеродных соединений при тяжелых гастродуоденальных кровотечениях, искусственном кровообращении в кардиохирургии и острых отравлениях липофильными ядами. Методические

рекомендации // Применение перфторорганических соединений в экспериментальной и клинической медицине: Сборник методических

рекомендаций / Под общей ред. акад. РАМН проф. Г.А.Софронова. - СПб: ВМедА. - 2002. - С. 31-52.

17. Васильева Т.П., Пшенкина Н.Н., Железкова Е.В., Кудряшова Л.И. Перфторорганические соединения в экспериментальной и клинической медицине: Информационный бюллетень 2000-2004 гг. II Под общей ред. акад. РАМН проф. Г.А.Софронова. СПб.: ВМедА. 2004. - 86 с.

18. Андреева Н.Б., Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В. Оценка

влияния внесения перфторорганических соединений в среду гемоконсервации на гематологические показатели донорской крови в процессе ее хранения // Актуальные вопросы профилактической медицины: Труды Научно-

исследовательского центра Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова / СПб: ВМедА. - 2008. - Вып. II. - С. 117-127.

19. Софронов Г.А., Пшенкина Н.Н., Андреева Н.Б. Методические рекомендации по оптимизации схем сочетанного применения перфторана и лекарственных средств в клинической практике // Методические рекомендации /М.: МО РФ. -2010. -32 с.

Труды в материалах научных конференций

20. Пшенкина Н.Н., Шилов В.В., Веселова О.М., Мурзина Е.В. Активность холинэстеразы в крови и тканях крыс, отравленных карбофосом, при включении перфторана в схему антидотной терапии // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в военной медицине: Материалы Всеармейской научной конференции, 8-9 октября 1997 г., СПб / Отв. ред. Г.А. Софронов. - СПб: ВМедА. - 1997. — С. 88-89.

21. Пшенкина Н.Н., Андреева, Н.Б. Веселова, О.М. Мурзина, Е.В. Глухова Ю.В. Влияние перфторана на содержание эндогенных нитратов в крови крыс // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине: Материалы Всеармейской научной конференции, 23-24 сентября 1999 г., СПб / Отв. ред. Г.А. Софронов. -СПб: ВМедА. - 1999. - С. 66-67.

22. Андреева Н.Б., Губанов А.И., Пшенкина Н.Н., Мурзина Е.В. Влияние перфторана на фармакокинетику ампициллина у кроликов // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине: Материалы Всероссийской научной конференции, 1920 июня 2001 г., СПб / Отв. ред. Г.А. Софронов. - СПб: ВМедА. - 2001. - С.Ъ-4.

23. Андреева Н.Б., Глухова Ю.В., Пшенкина Н.Н., Веселова О.М. Модификация фармакокинетики амитриптилина у кроликов в условиях предварительного введения перфторана // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине: Материалы Всероссийской научной конференции, 19-20 июня 2001 г., СПб / Отв. ред. Г.А. Софронов. - СПб: ВМедА. - 2001. - С. 4-6.

24. Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В., Андреева Н.Б. Оценка состояния донорской крови в условиях ее хранения с добавлением перфторуглеродов // Физиологически активные вещества на основе перфторуглеродов в экспериментальной и клинической медицине: Материалы Всероссийской научной конференции, 19-20 июня 2001 г., СПб / Отв. ред. Г.А. Софронов. - СПб: ВМедА. - 2001. - С. 58-60.

25. Андреева Н.Б., Пшенкина Н.Н., Мурзина Е.В., Губанов А.И., Веселова О.М. К вопросу о фармакокинетической интерференции перфторана и лекарственных средств // Клинические исследования лекарственных средств в России: Материалы 2 Международной конференции, 20-22 ноября 2002 г., М. / М.: 2002.-С. 21-22.

26. Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В., Андреева Н.Б. Влияние перфторана на радиационный апоптоз тимоцитов // Перфторуглеродные соединения в экспериментальной и клинической медицине: Материалы Российской научной конференции, 8-10 сентября 2004 г., СПб. / Отв. ред. Г.А. Софронов. - СПб: ВМедА. - 2004. - С. 102-103.

27. Пшенкина Н.Н., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Губанов А.И., Веселова О.М. Модификация перфтораном фармакокинетики лекарств // Современные проблемы военной и экстремальной терапии: Материалы Российской научнопрактической конференции, 29-30 ноября 2005 г., СПб // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2005. -№1.(14), Прил. - С. 251.

28. Pshenkina N.N., Sofronov G.A., Andreeva N.B., Murzina E.V., Veselova О.М. Modifying of drug pharmacokinetics by perfluorocarbon blood substitute // International visions on blood substitutes: Comprising the 5th International Symposium on “Current Issues in Blood Substitute Research” and the 4th International Course on “From Structural Genomics to Drug Discovery”, Parma, Italy, September 17-20, 2006 / Parma: Casa Editrice Graphital, 2006. - P. 81.

29. Пшенкина H.H., Софронов Г.А., Куропатенко M.B. Кровезаменители-переносчики кислорода для профилактической и интегративной медицины // От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине: Труды Международного междисциплинарного симпозиума, 17-27 сентября

2006 г., Судак, Украина / Отв. ред. И.В. Тимофеев, Н.Г. Перминова. -Новосибирск: НИИ катализа СО РАН. - 2006. - С. 58-60.

30. Pshenkina N., Andreeva N. Artificial blood substitutes may distort drugs pharmacokinetics // Abstracts of 8th Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics, 29 August-1 September, 2007, Amsterdam, The Netherlands // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. - 2007. - Vol. 101. - Issue SI. - P. 144.

31. Пшенкина H.H., Софронов Г.А., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М. Перфторуглеродная кровезамещающая наноэмульсия может изменять распределение и транспорт и лекарственных веществ // От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине: Труды Международного междисциплинарного симпозиума, 17-28 сентября

2007 г., Судак, Украина / Отв. ред. И.В. Тимофеев, Н.Г. Перминова. -Новосибирск: ООО «Комплекс». - 2007. - С. 98-100.

32. Пшенкина Н.Н., Веселова О.М., Мурзина Е.В., Андреева Н.Б. Влияние

перфторана на радиационный апоптоз тимоцитов и оксидативный стресс // Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии: Труды

Российской научной конференции, 29-30 мая 2008г., СПб / Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - № 3. (23) - Прил. 1. - С. 222-223.

33. Пшенкина Н.Н., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Каширцева Е.В., Губанов А.И. Взаимодействие перфторуглеродного кровезаменителя и лекарственных средств при их экспериментальном сочетанном применении // Окружающая среда и здоровье человека: Материалы

II Санкт-Петербургского международного экологического форума, 1-4 июля

2008 г., СПб / Отв. ред. Г.А. Софронов / Вестник Российской Военномедицинской академии. - 2008. - № 3. (23) - Прил. 2., Ч. I. - С. 154-155.

34. Софронов Г.А., Пшенкина Н.Н., Бурякова JI.B., Лазаренко Д.Ю. Искусственные кровезаменители-переносчики кислорода как альтернатива донорской крови и средство профилактики гемотрансмиссивных инфекций // Окружающая среда и здоровье человека: Материалы II Санкт-Петербургского международного экологического форума, 1-4 июля 2008 г., СПб / Отв. ред. Г.А. Софронов / Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - № 3. (23) - Прил. 2, Ч. II. - С. 348-349.

35. Пшенкина Н.Н., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Каширцева Е.В. Сорбционные свойства перфторуглеродной кровезамещающей наноэмульсии в отношении лекарственных веществ // Окружающая среда и здоровье человека: Материалы II Санкт-Петербургского международного экологического форума, 1-4 июля 2008 г., СПб / Отв. ред. Г.А. Софронов / Вестник Российской Военномедицинской академии. - 2008. - № 3. (23) - Прил. 2., Ч. II. - С. 491.

36. Пшенкина Н.Н. Перфторуглеродная кровезамещающая наноразмерная эмульсия с газотранспортными и сорбционными свойствами // От наноструктур, наноматериалов и нанотехнологий к наноиндустрии: Тезисы докладов 2 Всероссийской конференции с международным интернет-участием, 8-10 апреля 2009 г., Ижевск / Ижевск: ИЖ ГТУ. - 2009. - С. 96.

37. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А. Особенности перфторуглеродного кровезаменителя Перфторан с точки зрения наноразмерной структуры // Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: Материалы III Международной научно-практической конференции, 1-4 октября 2009 г., Ростов-на-Дону / Ростов н/Д. - 2009. - С. 269-270.

38. Pshenkina N.N., Sofronov G.A. Influence of Perftoran on plasma concentrations of drugs at their joint applying with blood substitute // II World Congress of the International Academy of Nanomedicine, October 3-6, 2010, Antalya, Turkey / Chief eds. T.S.M. Chang, G. Budak / Ankara: AG Design. - 2010.

- P. 85-86.

39. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А., Андреева Н.Б., Мурзина Е.В., Веселова О.М. Перфторуглеродные наноэмульсии: свойства, медицинское применение и перспективы его расширения // III Международный форум по нанотехнологиям, 1-3 ноября 2010, Москва (CD-диск).

40. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А. Новые комплексные препараты на основе кровезаменителей с газотранспортными свойствами // Инновационная деятельность в Вооруженных силах РФ: Труды Всеарм. научно-практической конференции, 25—26 ноября 2010 г., СПб / СПб: ВАС. — 2010. — С. 382—383.

41. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А. Способ прогнозирования фармакокинетических взаимодействий лекарств и надмолекулярных комплексов in vivo // Труды Всеармейской научно-практической конференции, 25-26 ноября 2010 г., СПб / СПб: ВАС. - 2010. - С. 383-386.

42. Пшенкина Н.Н., Софронов Г.А., Мурзина Е.В., Веселова О.М., Андреева Н.Б. Сорбционные свойства наноэмульсии Перфторан как фактор, определяющий изменения концентраций лекарств в крови // Рациональная фармакотерапия и клиническая фармакология: Сборник научных материалов V Конгресса фармакологов, 13-14 октября 2010 г., СПб / Отв. ред. А.К. Хаджидис /СПб.-2010.-С. 234-239.

43. Софронов Г.А., Пшенкина Н.Н. Анализ и прогнозирование влияния наноэмульсии перфторан на содержание лекарственных веществ в крови // Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии: Тезисы Российской научной конференции с международным участием, 19-20 мая 2011 г., СПб / Отв. ред. А.Н. Гребенюк / СПб: Фолиант. - 2011. - С. 22-23.

44. Мурзина Е.В., Пшенкина Н.Н. Состояние разработки и внедрения кровезаменителей на основе гемоглобина в нашей стране и за рубежом // Современные проблемы профилактической медицины: состояние и пути решения: Материалы Российской научно-практической конференции, 17-18 ноября 2011 г., СПб / СПб: ВМедА. - 2011. - С. 212.

45. Пшенкина Н.Н., Бурякова Л.В., Лазаренко Д.Ю., Мурзина Е.В., Веселова О.М. Вклад НИЛ лекарственной и экологической токсикологии НИЦ в исследование перфторуглеродных кровезаменителей // Актуальные проблемы трансфузиологии: Материалы Российской научно-практической конференции, 7 октября 2011 г., СПб / СПб: ВМедА. - 2011. - С. 89-90.

46. Некраш Н.А., Куликов А.Н., Пшенкина Н.Н. Применение

перфторуглеродных соединений в офтальмологии: некоторые результаты и перспективы // Актуальные проблемы трансфузиологии: Материалы

Российской научно-практической конференции, 7 октября 2011 г., СПб / СПб.: ВМедА.-2011.-С. 70-72.

47. Пшенкина Н.Н., Мурзина Е.В., Веселова О.М. Прогнозирование влияния перфторана на фармакокинетику лекарственных веществ при их сочетанном использовании с кровезаменителем // Актуальные проблемы трансфузиологии: Материалы Российской научно-практической конференции, 7 октября 2011 г., СПб / СПб: ВМедА. - 2011. - С. 87-88.

Подписано в печать 26.12.11 Формат 60х84'/|6 Цифровая Печ. л. 2.6 Уч.-изд.л. 2.6 Тираж 120 Заказ 07/01 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт»

(197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)