Автореферат и диссертация по медицине (14.03.01) на тему:Клеточная терапия травмированного участка спинного мозга

На правах рукописи

4044757

Кудрова Юлия Николаевна

Клеточная терапия травмированного участка спинного мозга (экспериментально-морфологическое исследование)

14.03.01. - анатомия человека

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 АПР 2011

Саранск 2011

4844757

Работа выполнена в НОУ ВПО «Самарский медицинский институт «Реавиз»

Научные руководители:

- доктор медицинских наук,

профессор Игорь Иванович Марков;

- заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Виктор Михайлович Чучков.

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук,

профессор Эдуард Салихович Валишин;

- доктор биологических наук,

профессор Виктор Владимирович Валиуллин

Ведущая организация:

ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» г. Уфа.

Защита диссертации состоится «20» мая 2011г. в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д 212.117.01 при ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарёва» по адресу: 430000, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарёва» по адресу: 430000, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

Автореферат разослан «-/У» апреля 2011 года.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор В.П.Балашов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .

Актуальность темы

В настоящее время не существует действительно эффективных методов лечения травматического повреждения спинного мозга (Шевелев И.Н., с соавт., 2000). И это при том, что за последние 70 лет спинальный травматизм вырос более, чем в 200 раз (Fawcett J.W., 2006). Частота возникновения подобных травм по разным оценкам колеблется от 11 до 112 на 100 000 человек. Последствиями являются парез или паралич конечностей и дисфункция тазовых органов. Особенностью проблемы является то, что спинальному травматизму в основном подвержены молодые, экономически и социально активные люди. Вовлеченность этой категории граждан значительно увеличивает экономический ущерб.

Благодаря достижениям нейрохирургии, фармакологии и реабилитации в последние годы значительно увеличилась продолжительность жизни спинальных больных. Однако, сегодня главным в лечении и адаптации больных к новым условиям все еще является не восстановление утраченных, а обучение пользованию сохранившимися функциями. Таким образом, в практической медицине ощущается острая нехватка эффективных методов лечения и реабилитации больных с травмой спинного мозга (Horwitz Е.М., 2001).

Самым серьезным вторичным эффектом спинномозговой травмы (СМТ) является образование рубца. В процессе участвуют самые разнообразные клетки: астроциты, микроглия, макрофаги, фибробласты и шванновские клетки (Boddoo М. et al., 2003). Рубец является механическим барьером, препятствующим восстановлению целостности спинного мозга. Кроме того, рубец содержит ингибиторы роста аксонов (Silver J., MillerJ.H., 2004; Fawcett J.W., 2006). Предотвращение образования рубца или его деградация, также могут являться целью клеточной терапии. Резидентные и привлеченные воспалительные клетки (нейтрофильные гранулоциты, микроглия, макрофаги и Т-клетки) могут вызывать разнонаправленные реакции (Jones T.B. at.al., 2005). Однако, есть основания полагать, что применение макрофагов может стимулировать удаление фрагментов рубца и тем самым способствовать очистке поврежденного участка. Появление современных клеточных технологий позволяет надеяться на возможность восстановления дефектов нервной ткани путем трансплантации стволовых клеток. Клеточная трансплантация может иметь кроме замены погибших клеток и другие цели. Это, прежде всего, создание благоприятного микроокружения для предотвращения образования глиального рубца и дегенерации нейроцитов, а также стимуляции их регенерации. Таким образом, основой терапии СМТ должна стать комбинация методов, направленных как на регенерацию, так и на блокирование вторичных

изменений. Однако, заместительная клеточная терапия находится только на стадии становления. Оптимальный источник клеток, методы культивирования, способы введения в травмированный организм до конца не определены и остаются предметом многочисленных исследований (РпеЬе М.М., е! а1., 2007).

Цель исследования - экспериментально-морфологическое обоснование различных способов клеточной терапии травмированного участка спинного мозга.

Задачи исследования.

1. Получить и культивировать мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и активированные макрофаги. Проанализировать мультипотентность полученных МСК.

2. Разработать модель спинальной травмы у экспериментальных животных, имитирующую ушиб спинного мозга у людей.

3. Применить МСК и активированные макрофаги в отдельности и в сочетании для восстановления травмированного участка спинного мозга.

4. Оценить уровень смертности и эффективность восстановления структуры и функции травмированного спинного мозга.

5. Изучить полученный экспериментальный материал (МСК, фрагменты спинного мозга в области травмы) с помощью гистохимических и иммуногистохимических методов исследования.

6. Выявить наиболее эффективный из предлагаемых способов клеточной терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Мезенхимальные стволовые клетки оказывают регуляторный положительный эффект на процессы репарации в зоне спинальной травмы.

2. Активированные макрофаги уменьшают зону вторичного повреждения при спинномозговой травме и препятствуют образованию глиального валика и соединительнотканного рубца.

3. Совместное применение активированных макрофагов и мезенхимальных стволовых клеток является наиболее эффективным способом восстановления структуры и функции спинного мозга.

Новизна исследования.

Научная новизна исследования заключается в использовании комбинированного метода восстановления морфофункциональной целостности спинного мозга, сочетающего в себе создание в области

поражения условий для регенерации (блокирование образования рубца, очистка раны от фрагментов миелина) и предоставления материала для регенерации в виде МСК.

Научно-практическая значимость.

Несмотря на то, что направление, изучающее стволовые клетки (СК) является на сегодняшний день активно развивающимся, а сами стволовые клетки получены из различных источников и активно используются как в экспериментальных, так и в клинических целях, в биологии СК остается ещё много пробелов. Данное исследование внесет определенную лепту в понимание механизмов деятельности СК in vivo. В дальнейшем оно может явиться основой для разработки новых методов лечения пациентов с травмами спинного мозга с применением клеточных технологий.

Апробация работы.

1. Конференция студентов и молодых ученых (Ижевск, 2008, 2009,2010 г.г.).

2. Всероссийская конференция «Стволовые клетки и перспективы их применения» (Москва,2008г.).

3. 10-ый Всероссийский форум «Образовательная среда - 2008» (Ижевск, 2008 г.).

4. Заседание Удмуртского отделения ВНО АГЭ (Ижевск, 2010г.).

5. Межкафедральное совещание кафедр морфологии НОУ ВПО «Самарский медицинский институт «РЕАВИЗ» (Самара, 2010 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, из них 4 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка используемой литературы, включающего 127 отечественных и иностранных источников. Материал изложен на 106 страницах машинописного текста, обобщен в 4-х таблицах и проиллюстрирован 55 фотографиями.

Личное участие автора в выполнении работы. Регулярное наблюдение за животными, изготовление гистологических препаратов, а также математическая обработка, интерпретация и оформление результатов работы в виде публикаций и диссертации выполнены лично автором. Работа, связанная с забором мезенхимальных стволовых клеток, выделением, культивированием и стимуляцией клеток для получения активированных

макрофагов, проведена совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной биологии и клеточных технологий ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет».

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материал и методы исследования.

Получение и культивирование первичных клеточных культур МСК мыши.

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга получали от мышей линии С57В1/6. Самцов 8-10 недельного возраста после полной анестезии умертвляли с помощью цервикальной дислокации. Извлекали бедренные и большие берцовые кости, освобождали их от мягких тканей. Эпифизы полученных костей отделяли, а диафизы промывали средой DMEM (Gibco), содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (КРС) (ES-grade, Gibco), 100 ед./мл пенициллина (Gibco), 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco), 12 мМ L-глютамина (Gibco) (ростовая среда). Выделенные из диафизов костей клетки помещали в конические пробирки, содержащие 5 мл ростовой среды, и центрифугировали 10 мин при 400g. Осадок из каждой пробирки ресуспендировали в ростовой среде до концентрации 1х10б кл/мл и высаживали на 75-см2 культуральные флаконы. Через 48 часов не прикрепившиеся клетки удаляли, а во флаконы добавляли 20 мл свежей ростовой среды. Прикрепившиеся клетки культивировали в течение 2 недель, меняя ростовую среду каждые 3-4 дня. При достижении монослоя клетки снимали с подложки путем промывания 0,25% раствором трипсина (Gibco)B смеси с раствором Версена (Gibco) в соотношении 1:1. Затем во флакон добавляли 2 мл вышеуказанной смеси и инкубировали при 37°С 5-10 мин. Клетки переводили в суспензию и осаждали центрифугированием при 400g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в ростовой среде с концентрацией 104 кл/мл. Культивирование проводили в С02-инкубаторе при 5% С02 и температуре 37°С. После четвертого пассажа к ростовой среде добавляли базальный фактор роста фибробластов (bFGF, Sigma) до концентрации 10 нг/мл. Для введения оперированным животным использовали клетки 5-8 пассажей.

Для определения полипотентности стволовых клеток стимулировали их дифференцировку в различных направлениях и идентифицировали конечный результат с помощью иммуногистохимических реакций на тканевые маркеры.

Техника операций по нанесению травмы н введению клеток животным.

Для проведения анестезии использовали эфирный наркоз. Для предотвращения передозировки, было решено давать наркоз дробными долями, добавляя его в процессе операции. Для этого была использована резиновая маска. В результате такой процедуры мыши довольно быстро приходили в себя после операции. В целях уменьшения таких осложнений как вывих позвоночника в операциях применяли минимальное воздействие - ламинэктомию одного позвонка. Для улучшения фиксации места операции, при закрытии раны над нею сшивали длиннейшие выпрямители спины. Грузик бросали с высоты 13 см. У всех мышей непосредственно после операции развивался спастический паралич задних конечностей и дисфункция тазовых органов. МСК в количестве 1 млн вводили в область травмы в 0,1мл физиологического раствора, используя шприц и иглу для вкутрикожных инъекций. Для введения МФ применяли внутрикожную инъекцию в районе травмы.

Осмотр животных производили ежедневно. Животные со СМТ нуждаются в постоянном уходе. Нарушение иннервации тазовых органов приводит к застою мочи и кала, что может иметь летальные последствия. Эвакуацию мочи и кала проводили ежедневно путем массирования мочевого пузыря и толстого кишечника и осторожного выдавливания кала и мочи движением пальца в каудальном направлении. По 5-бальной системе регистрировали общую двигательную активность, которая часто менялась и не могла служить прогностическим признаком. Иногда мыши с высокой двигательной активностью (вероятно вследствие нее) получали вывих позвоночника в месте СМТ, что в дальнейшем приводило к сильнейшей дисфункции тазовых органов и животные погибали.

Наиболее объективными факторами, позволяющими оценивать ход восстановления после травмы, явились позиция задних лап, их чувствительность и непроизвольная, и произвольная активность. Сразу после операции и в течение 1-2 дней позиция конечностей в подавляющем большинстве случаев была симметричной. Конечности были вялыми, не реагировали на болевые раздражители и обычно не обладали никакой подвижностью. В дальнейшем положение менялось. Более чем в 90% случаев появлялась ассиметрия. Вероятно, появление ассиметрии является следствием развития вторичного повреждения, которое всегда распространяется с учетом анатомических особенностей спинного мозга.

Приготовление и окрашивание гистологических препаратов.

Для визуальной оценки течения репаративного процесса в зоне экспериментальной травмы, были использованы методы приготовления и анализа гистологических препаратов ткани спинного мозга. Извлечение, заливка и последующее микротомирование препаратов спинного мозга проводилась в фрагменте позвоночного столба, т.к. при репарации ткани спинного мозга в области травмы плотно сращивались с его оболочками и надкостницей. Для изготовления гистологических препаратов использовали три метода:

1. Окраска нейронов по Нисслю выявляет патологические изменения цитоплазмы нейронов (тигролиз, вакуолизация и др.). Метод включает следующие стадии: фиксацию взятого материала (спинной мозг мыши) в 96% спирте в течение 2 суток; стандартная проводка с заливкой в парафин; изготовление срезов и монтирование их на стекла; депарафинирование в ксилоле, окраска водным раствором толуидинового синего в разведении 1:1000 до сильно перекрашенного состояния; дифференцировка в 96% спирте до появления элементов нервной ткани; промывка в ксилоле и заключение в канадский бальзам.

2. Окраска эозином-гематоксилином для оценки общей картины. Использовали стандартную методику, которую заимствовали у Д.С.Саркисова (1996).

3. Импрегнация по Гольджи в модификации Бюбенета, которая позволяет избирательно выявить и проанализировать структурные элементы нервной ткани. Импрегнация включает следующие стадии: забор материала (фрагмент спинного мозга с позвонками); фиксация в 10% растворе нейтрального формалина не менее 2-3 недель с последующей промывкой; выдерживание в 2,5 % растворе бихромата калия и нитрате серебра (2,5% раствор на бидистиллированной воде) - по 2 суток; промывка в проточной воде с последующей спиртовой фиксацией; осветление в ксилоле; заливка в парафин. Из полученных препаратов изготавливали срезы толщиной 20-30 мкм на санном микротоме. Депарафинированые в ксилоле образцы заключали в канадский бальзам. Микроскопирование проводили на бинокулярном микроскопе Биолам. Срезы фотографировали с помощью цифровой фотокамеры Canon.

Статистическая обработка полученных результатов

По данным предварительных опытов и проведенной оценке смертности животных были рассчитаны выборки животных, необходимые для получения достоверных результатов. Доверительные интервалы рассчитаны для вероятности 95%.

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

1. Смертность мышей в процессе экспериментов.

Исследование провели на 57 самцах мышей. В ходе эксперимента была проанализирована общая смертность оперированных животных (табл.1). Незначительная часть животных (3,5%) погибла непосредственно после операции, вследствие передозировки наркоза или хирургических ошибок. Далее основной пик смертности наблюдался на сроках от 3 до 7 дней после операции. Всего в течение 7 дней погибло примерно 70% от всех погибших животных.

Вид вмешательства Кол-во мышей и § 15 Я л 3 На 7-ой день На 14-ый день На 21-ый день На 28-ой день Общая смертность

Смертност о а о * и а. И Абсолютное число ю

Абс. со Абс. ей Абс. т Абс. со Абс. ш

контроль 30 2 6,6 7 23,3 3 10 - 0 1 3,3 13 43,3

МСК 20 1 5 2 10 - 0 1 5 1 5 5 25

МСК совместно с активированны ми макрофагами 20 1 5 2 10 1 10 - 0 - 0 4 20

Активированн ые макрофаги 20 1 5 2 10 2 10 - 0 - 0 5 25

сумма 90 5 5,5 13 1А 6 6,7 1 1,1 2 2,2 27 30

(%) от общего числа погибших животных 18,5 48 22,2 3,7 7,4 100

В дальнейшем смертность значительно снижалась. Причиной смерти обычно служила восходящая урогенитальная инфекция. При вскрытии этих мышей обнаруживали переполненный мочевой пузырь с признаками инфекции и расширение почечных лоханок. Проводимый массаж мочевого пузыря, видимо, не всегда способен эвакуировать мочу из-за спазма сфинктеров.

Сравнение общей смертности показывает, что она варьировала от 30 до 50% в контроле и в различных опытах. Статистический анализ не

позволяет установить значимых различий между смертностью в контроле и у животных, которым вводили клетки. В контроле погибло 11 из 25 мышей (44% ± 13%), в опытах с клетками - 13 мышей из 32 (40%±Ю%) (доверительные интервалы рассчитаны для вероятности 95%). Таким образом, введение клеток в разных видах не влияет на общую смертность. Основньми причинами смертности при СМТ являются острые нарушения нервной регуляции, которые не могут быть купированы методами клеточной терапии, поскольку введенные клетки в течение 7 дней не способны успеть организовать новые структуры, дублирующие функции утраченных.

2. Критерии оценки восстановления после СМТ.

В результате СМТ происходит нарушение двигательных функций задних лап и хвоста, а также нарушение работы тазовых органов. После операции мыши перемещаются, используя только передние лапы. Возникают затруднения с дефекацией и мочеиспусканием. Возможно развитие гипертермии, болевого синдрома и многих других нарушений. Задние лапы теряют чувствительность.

Для характеристики каждого из нарушений существует множество критериев оценки. Было необходимо выбрать наиболее важные критерии, позволяющие проводить объективный количественный анализ. Возможность произвольных движений задними лапами является с нашей точки зрения одним из лучших критериев оценки восстановления после СМТ.

Также достоверно можно определять болевую чувствительность задних лап и их непроизвольные движения. Однако, как показали наши опыты, временная динамика этих признаков может быть весьма запутанной. Восстановление непроизвольной подвижности (например, дрожание) может быть как следствием активности нейронов в районе травмы, так и отражать процессы восстановления связей по длине спинного мозга. В противоположность этому, восстановление произвольной подвижности является прямым свидетельством восстановления продольных связей в спинном мозге.

Наблюдение за мышами производили ежедневно (в течение месяца после травматизации), но для количественной оценки восстановительных процессов выбрали 4 периода (1,2,3 и 4 недели).

3. Результаты опытов по лечению СМТ

Во время операции по нанесению травмы животным производили интраспинальное введение 0,5 млн МСК и в кожу в области травмы вводили 0,5 млн активированных макрофагов.

Как видно из таблицы 2, восстановление произвольных движений в контрольной группе не наблюдалось, в то время как в двух из трех опытных группах (МСК и совместное использование МСК и активированных

макрофагов) у ряда животных происходило восстановление произвольной подвижности задних лап.

Таблица 2. Результаты опытов по лечению СМТ различными способами клеточной терапии________

Кол-во животных в 7 суток 14 суток 21 сутки 28 суток

Вид вмешательст ва начале эксперимент а(после успешно проведение й операции) Н А Ч п А Н А Ч п А Н А Ч П А Н А Ч П А

Контроль 28 3 - - 4 2 - 5 3 - 4 4 1

Инъекция МСК 19 5 - 5 3 - 5 5 2 4 5 4

Инъекция Активированных макрофагов 19 3 3 1 4 2 1 3 2 1

Сочетанное введение МСК и активированных макрофагов 19 5 5 3 5 5 5 4 6 6

Сокращения: НА - непроизвольная активность конечностей и хвоста, Ч- чувствительность конечностей и хвоста, ПА - произвольная активность конечностей и хвоста.

Как видно из таблицы 2 в контроле наблюдали 1 случай восстановления произвольной подвижности задних лап. В опытах с введением клеток наблюдали 11 случаев восстановления произвольной подвижности из 51 (21,57%±9). Таким образом, клеточная терапия оказалась действенной. Наиболее эффективный результат получен с применением сочетанного способа клеточной терапии.

Анализ гистологических препаратов.

Забор материала для оценки динамики восстановительных процессов в травмированном спинном мозге проводили на 7, 14, 21,28 сутки :после операции. Также гистологические препараты изготавливали из материала погибших в ходе эксперимента животных, кроме тех, которые погибли во время операции и сразу после нее.

Через неделю после травмы значительных различий между образцами, взятых у животных разных групп (контрольная, экспериментальные с

введением МСК, активированных макрофагов и сочетанного введения МСК и активированных макрофагов) на первый взгляд не наблюдалось. В препаратах обнаруживались расширенные кровеносные сосуды, зоны кровоизлияний и участки концентрации иммунокомпетентных клеток. Т.е. видны были признаки аутоиммунной реакции с нарушением гематоэнцефалического барьера и миграцией в зону повреждения полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов. Однако, в препаратах с применением активированных макрофагов (монотерапия и сочетанное применение с МСК) преобладающими в зоне травмы были клетки моноцитарного ряда (вероятно, это были введенные макрофаги и привлеченные ими лимфоциты).

Через 2-е недели в зоне травмы наблюдается скопление глиальных элементов и формирование тонковолокнистых структур. Таким образом, намечается образование глиального валика и соединительнотканного рубца, который в дальнейшем препятствует прорастанию отростков сохранившихся нейронов. В контрольных препаратах эти структуры уже на второй неделе после нанесения травмы выглядят компактнее и плотнее, тогда как в экспериментальных образцах они рыхлые с неровными очертаниями. Кроме того, в контрольных препаратах отмечена большая площадь, занимаемая вновь образуемыми соединительнотканными и глиальными структурами, что является, вероятно, результатом вторичного повреждения нервной ткани в результате аутоиммунной реакции. Примечательно, что в препаратах с сочетанным применением МСК и активированных макрофагов наблюдаются скопления глиоцитов, но образование соединительно-тканных структур не отмечено.

Через 3-й недели после операции вблизи зоны повреждения наблюдаются признаки гипертрофии астроцитов и олигодендроглиоцитов. Глиальные элементы формируют скопления различной величины. В контрольных препаратах морфология астроцитов отличается значительным разнообразием, они имеют длинные, сильно ветвящиеся отростки. Олигодендроциты имеют необычную форму отростков с дополнительными разветвлениями.

Похожая картина наблюдается в препаратах всех исследуемых групп, но с разной степенью выраженности. В экспериментальных препаратах скопления состоят из меньшего количества глиальных клеток, чем в контроле. Их отростки короче и менее разветвленные, чем в препаратах без применения методов клеточной терапии. В контрольных образцах, напротив, наблюдаются плотные и крупные скопления астроцитов и олигодендроцитов.

В зонах повреждения и вблизи них наблюдается деформация, вакуолизация, сморщивание нейронов, причем в контрольных препаратах оно выражено сильнее, чем в экспериментальных образцах. В морфологии нейронов экспериментальных групп при введении МСК и активированных макрофагов в отдельности видимых различий не наблюдается. Здесь также встречаются деформированные и набухшие нейроны.

Применение стволовых клеток в сочетании с активированными макрофагами существенно изменяет патоморфологическую картину. Препараты спинного мозга данной экспериментальной группы содержат значительно большее число сохранившихся нейронов (особенно в зонах выше нанесенной травмы), среди которых наблюдается существенно меньше клеток с признаками деформации и набухания.

В нейронах часто обнаруживаются ядрышки, что свидетельствует об активном белковом синтезе, происходящем в этих клетках. При окраске по Нисслю, по-прежнему, выявляется выраженная гипертрофия астроцитов, ядра которых становятся сопоставимыми по размерам с ядрами нейронов.

Таким образом, применение стволовых клеток и макрофагов сопровождается снижением морфологических признаков повреждения нервных клеток с одновременной выраженной активацией олигодендроглии и астроцитов.

Через 30 суток в контрольных препаратах в области нанесенной травмы наблюдаются соединительнотканные образования, состоящие из толстых волокнистых, плотно расположенных структур (соединительнотканный рубец), на поверхности которых обнаруживались скопления глиальных элементов: астроцитов и олигодендроцитов (глиальный валик). В экспериментальных препаратах морфология травмированной области выглядит различно.

Признаки рубцевания проявляются во всех опытных группах, но с разной степенью выраженности. В препаратах с применением МСК и активированных макрофагов в отдельности границы глиального валика и соединительнотканного рубца не четкие и размытые, в отличие от идентичных образований в контрольных препаратах. В препаратах с применением комбинированной терапии соединительная ткань, образованная в зоне повреждения отличается тонковолокнистыми структурами, рыхло расположенными по отношению друг к другу. Здесь рубец занимает значительно меньшую площадь. В некоторых препаратах на данном этапе восстановления на продольных срезах обнаруживаются конусообразные структуры, похожие на пучки прорастающих нервных отростков, направленные в сторону травмированной области (сверху вниз).

Наиболее интересная картина морфологии травмированной области представилась в препаратах с применением комбинированной терапии (сочетанного введения МСК и активированных макрофагов). В некоторых из них соединительнотканных образований не обнаружилось, а зона травмы заполнена скоплениями глиальных и иммунокомпетентных клеток, среди которых наблюдаются разветвленные кровеносные сосуды. Так же как и в препаратах с применением монотерапии МСК и активированными макрофагами, в препаратах с применением сочетания клеток наблюдаются конусы прорастающих нервных отростков.

Таким образом, проведенный морфологический анализ препаратов доказывает стимулирующее влияние клеточной терапии стволовыми клетками и активированными макрофагами на поврежденные в результате травмы нервные структуры спинного мозга.

Применение макрофагов и стволовых клеток в отдельности, как

возможных активаторов процессов репарации в нервной ткани также

обнаруживает положительные эффекты, хотя они и менее выражены по сравнению с комбинированным методом терапии.

5.2. Обобщенные результаты экспериментов.

Таблица 3. Суммарные результаты опытов по лечению СМТ клетками.

Общее кол-во животных, участвовавших в эксперименте ев о X Я 3 ю Е В о я С и « й X к Кол-во животных с восстановленной чувствительностью Кол-во животных с восстановленной произвольной активностью

Экспериментальная группа §1 03 я Я 2 * 1 о и я Й" к т о и £ ё Абс. значение % от кол-ва животных в данной экспериментальной группе Абс. значение ! % от кол-ва животных в данной экспериментальной группе

Контроль 30 13 9 30 1 3,33

Введение МСК 20 5 13 65±18,3 6 30±4,7

Введение

активированных

макрофагов 20 4 5 25±7,4 2 10±1,1

Комбинированна я терапия 20 5 14 70±20,1 11 55±7.6

Сумма в экспериментальн ых группах: 60 14 32 53,3±15 19 31,6±4,5

Сумма во всех группах: 90 27 41 45,5 20 22,2

Для формирования общей картины полученных результатов приводится сводная таблица 3. Чувствительность задних конечностей восстановилась у 30% животных контрольной группы и у 53,3% животных всех экспериментальных групп. Достоверные различия данного показателя наблюдаются лишь в двух экспериментальных группах по сравнению с контрольной: с применением МСК и комбинированной терапии. Введение только активированных макрофагов в зону травмы не дает достоверно более эффективного восстановления чувствительности задних конечностей у животных данной группы по сравнению с животными контрольной группы. Однако результаты по восстановлению произвольной активности все же свидетельствуют о минимальном, но положительном эффекте терапии активированными макрофагами. Здесь результаты достоверно отличаются от контрольных. В общем произвольная чувствительность и произвольная активность задних конечностей восстановилась у 19 животных всех экспериментальных групп, тогда как в контрольной группе лишь у одной мыши. Результаты свидетельствуют, что наиболее эффективным способом клеточной терапии из оцениваемых в работе является комбинированный. В данной экспериментальной группе у 70% мышей возвращалась чувствительность конечностей, а у более чем 53% в дальнейшем восстанавливалась и их произвольная активность.

5.3. Сравнительный анализ эффективности способов клеточной терапии

Был произведен подсчет вероятностей восстановления произвольной двигательной активности при разных способах клеточной терапии (табл. 4). Терапия с помощью МСК дает эффект с вероятностью около 99%, другими словами эффективность МСК не вызывает сомнений. Наилучшие результаты были получены при использовании МСК совместно с активированными макрофагами (Р > 95%).

Монотерапия активированными макрофагами оказалась не эффективной. Как полагают, одной из основных причин плохой регенерации ЦНС является наличие в миелине, связанных с ним ингибиторов роста нейронов (Рго1уп5 С. й.а!., 2004). В результате СМТ в ране остается много

миелина, который длительно сохраняясь, препятствует регенерации. Именно с «уборкой» миелина связаны многочисленные попытки лечения СМТ с помощью активированных макрофагов, дендритных клеток и т.п. (Huang D.W. et al., 1999; Hirschberg D.L., Schwartz M, 1995; Rapalino О., 1998; Knoller М., et al., 2005). Помимо препятствий со стороны миелина, раневой процесс при СМТ характеризуется практически полным отсутствием самого субстрата регенерации, а именно, способных к пролиферации нейронов. Хотя со временем происходит восстановление многих нервных связей, однако это достигается в основном благодаря пластичности выживших нейронов (Jones Т.В., et al., 2005).

Табл. 4. Вероятности действенности различных способов терапии по восстановлению произвольной подвижности задних конечностей.

воздействие Восстановление произвольной подвижности Достоверность полученного результата

Контроль (вводился физиологический раствор) 1/28 (3,5%±1,9%)

Монотерапия МСК 6/19 (31,57% ±18,7%) (Р < 90%)

Активированные макрофаги 2/19 (10,52 % ± 2,9%) (Р = 90%)

Комбинированная терапия (МСК совместно с активированными макрофагами) 11/19 (57,89 % ± 20,1%) (Р > 99%)

Примечание: доверительные интервалы приведены для вероятности 95%.

По-видимому, использование макрофагов способно в определенной степени расчистить «плацдарм» для успешной регенерации, но в отсутствие клеток, способных к регенерации, никакого положительного эффекта не дает. При этом, в сочетании с введением МСК, терапевтический эффект нарастает.

СМТ развивается длительно. После первичного поражения развитие воспаления приводит к разнообразным изменениям, в том числе к индукции вторичного повреждения. При этом зона вторичного повреждения может существенно превосходить размерами зону первичного повреждения (Hulsebosch С.Е., 2002; Jones Т.В., et al., 2005). В этих условиях минимизация вторичного повреждения, безусловно, должна оказывать терапевтическое

действие. Мы полагаем, что клеточная терапия в наших опытах подействовала именно так, уменьшив область вторичного повреждения и

способствуя тем самым более быстрой мобилизации внутренних регенеративных резервов.

Считается, что для восстановления большинства функций поврежденного спинного мозга достаточно наличия всего 5-10% сохраненных аксонов (Jones T.B. et.al., 2005). При контузии спинного мозга первичной травме подвергаются не все нейроны и аксоны. Поэтому уменьшение вторичного повреждения может быть достаточным механизмом для успешного восстановления функций.

МСК обладают рядом иммуномодулирующих свойств и обладают способностью локально подавлять различные воспалительные изменения. Поэтому введение таких клеток интраспинально должно способствовать уменьшению воспалительного процесса и более быстрый его переход в регенеративную фазу, которая может достигаться за счет уже имеющихся in situ нервных клеток. В дополнение к иммуномодулирующим свойствам, любые клетки при массовом введении в ограниченную область создают в ней участок гипоксии, который может служить дополнительным сигналом для мобилизации собственных стволовых клеток из костного мозга мыши и тем самым способствовать процессам регенерации.

При заместительной клеточной терапии очень трудно установить реальную причину улучшения функций спинного мозга. Наличие клеток в месте введения и даже приобретение ими характерных маркеров нервной ткани, не доказывает вовлеченность введенных клеток в процесс восстановления функций. Именно поэтому, невозможно утверждать, что введенные МСК дифференцировались и функционально интегрировались в ткань спинного мозга. С другой стороны, рутинный гистологический анализ показал, что при введении стволовых клеток наблюдается ускорение нормализации структуры спинного мозга недалеко от района травмы. Таким образом, мы можем утверждать, что, вводимые нами клетки уменьшают вторичное повреждение.

Выводы

1. Метод клеточной терапии (с применением мезенхимальных стволовых клеток и активированных макрофагов в отдельности и в сочетании) не влияет на послеоперационную выживаемость животных.

2. Все предлагаемые способы клеточной терапии оказывают положительное воздействие на ткани спинного мозга после моделированной травмы, которое проявляется в частичном или полном восстановлении чувствительности и подвижности задних конечностей, тазовых органов.

3. Использование монотерапии спинномозговой травмы мезенхимальными стволовыми клетками достоверно эффективнее монотерапии активированными макофагами.

4. Введение в зону травмы спинного мозга мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и активированных макрофагов в сочетании является самым эффективным способом улучшения проводящей и двигательной функции спинного мозга у животных с параплегией задних конечностей.

5. Использование активированных макрофагов (как в отдельности, так и в комбинации с мезенхимальными стволовыми клетками) для повышения регенераторного потенциала спинного мозга после его травмы приводит к формированию в области повреждения соединительно-тканного рубца, проницаемого для прорастающих нервных отростков.

Практические рекомендации.

Очевидно, что квалифицированная хирургическая помощь при СМТ в большинстве случаев оказывается уже в хронической стадии травмы в специализированных клиниках. Эти операции направлены на устранение неблагоприятных результатов первичного заживления: восстановление ликворотока, дренирование кист и иссечение рубцов, препятствующих восстановлению функций. Часто требуется проведение повторных операций. Если этого не делать, то дальнейшее развитие собственной регенерации становится невозможным: кисты могут увеличиваться в размерах, повреждая новые нейроны, затруднение ликворотока блокирует трофику всего спинного мозга и может вести к развитию дегенеративных процессов, а рубец становится непреодолимым препятствием для регенерации продольных связей в спинном мозге.

На каком бы высоком техническом уровне не проводили повторную операцию, по своей сути - это очередная травма спинного мозга с соответствующим развитием вторичного повреждения. Мы, в нашей работе показали, что наиболее вероятным механизмом действия предложенной терапии является уменьшение вторичного повреждения нервной ткани.

Поэтому, мы полагаем, что любые операции на спинном мозге должны сопровождаться введением клеток. Подобные операции проводятся в плановом порядке, и время позволяет получить достаточное количество аутологичных МСК из костного мозга пациента. Однако не очевидно, что клеточная терапия хронической СМТ окажется такой же эффективной, как и в случае первичного повреждения. Проблема заключается в том, что в процессе развития первичной травмы иммунная система впервые «познакомилась» с ЦНС. В результате в крови пациента скапливается большое количество иммунорегуляторных клеток. Часть лимфоцитов входит в состояние анергии и благодаря этому не атакует ЦНС повторно. Измененный иммунный статус больных с хронической СМТ не позволяет однозначно ответить на вопрос об эффективности введения клеток. В связи с этим необходимо разработать модель хронической СМТ у животных и на этой модели провести аналогичные эксперименты. При благоприятном исходе таких экспериментов можно будет переходить к клиническим испытаниям.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кудрова Ю.Н. Некоторые вопросы определения расположения и развития стволовых клеток / Ю.Н.Кудрова, Т.Г.Глушкова и др. // Морфологические ведомости, 2007, № 1-2, с. 275 — 278.

2. Кудрова Ю.Н. Морфологическая характеристика репаративных процессов в травмированном спинном мозге при использовании стволовых клеток / Ю.Н.Кудрова, Т.Г.Глушкова // Морфологические ведомости, 2009, № 1-2, с. 17 - 18.

3. Кудрова Ю.Н., Глушкова Т.Г. Репаративные процессы в травмированном спинном мозге при использовании стволовых клеток / Ю.Н. Кудрова, Т.Г.Глушкова // Морфология, 2009, №4, с. 37.

4. Кудрова Ю.Н.Нейрогенная дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток / Ю.Н.Кудрова, Т.Г.Глушкова, В.И.Маркова // Морфологические ведомости, 2011, № 1, с. 107- 109.

Подписано в печать 05.04.2011 г. Формат 60x84 1/16. Объем 1,2 печ.л. Тираж 120 экз. Бумага офсетная. Печать оперативная. Заказ №. 1020

Отпечатано в типографии AHO «Издательство СНЦ РАН» 443001, Самара, Студенческий пер., За тел.: (846) 242-37-07