Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Исследование медуллярных механизмов формированиядыхательного ритма

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ

} и ** '

На правах рукопису

2 Ь НАР 1397

МАРЧЕНКО Вітаній Анатолійович

ДОСЛІДЖЕННЯ МЕДУЛЯРНИХ МЕХАНІЗМІВ ФОРМУВАННЯ ДИХАЛЬНОГО РИТМУ

і

І

14.03.03. - нормальна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

КИЇВ - 1997

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інстітуті фізіології ім. 0.0.Богомольця Національної Академії Наук України

Наукові керівниці: доктор біологічних наук,

професор

Микола Миколайович Преображенський

’ доктор медичних наук,

професор Михайло Михайлович Середенко

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Людмила Миколаївна Шаповал; кандидат медичних наук Олександр Володимирович Шаповалов

Провідна установа: Інститут фізіології

Державного університету ім. Т.Г.Шевченка

Захист відбудеться березня 199? р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при Інституті фізіології ім. 0.0.Богомольця НАН України за адресою: 252024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту фізіології ім.О.О.Богомольвд.

Автореферат розісланий ” АГ" ¿-и- 1997 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук

3.0.Сорокіна-Маріна

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Головна функція системи зовнішнього дихання визначається у підтриманні оптимального газового складу артеріальної крові і pH. Будучи однією з головних систем життєзабезпечення організму, система дихання функціонує у тісній взаємодії з серцевосудинною системою. Основним механізмом, який керуе діяльністю вентиляторного апарату, є система центральних нейронів понгомедулярного рівню, що забезпечує зміну фаз дихального циклу і має назву дихального центру.

Незважаючи на прогрес техніки експерименту, шр пов’язано з використанням штучно суперфузованих медулоспинальних препаратів і медулярних зрізів тварин перших днів життя (Su-zu, 1985; Smith et зі. 1S90), досі ряд важливих аспектів даної проблеми залишається невирішеним. Зокрема, залишається неясною природа первинних механізмів респіраторного ритмоге-незу. Однію з гіпотез, що пояснюють природу організації центральних механізмів генерації респіраторного ритму, в гіпотеза респіраторної мережі (Salmoirhai, Baiirrgarten, 1961; Cohen, 1979). Між тим існує думка, що дихальний ритм формується за рахунок функціонування особливих пейсмекерних нейронів (Onimaru et al. 1987, 1989; Smith et al. 1990, 1991). Проте, як показують роботи останніх раків (Richter et al. 1992; Di Fasquale et al. 1994; Johnson et al. 1994), пейсмекерні механізми мають більш важливе значення для респіраторного.рит-могенезу у тварин перших днів лиття, ніж у дорослих. Такий підхід обумовив появу компромісної точки зору (Di Pasquale et al. 1994), згідно якій у тварин першого дня життя основною ритмогенеруючою системою s преінспіраторні пейсмекерні нейрони рострального вентролатерального відділу довгастого

мозку (БЛБДМ), У той час як у більш старших тварин респіраторний ритм генерується за рахунок функціонування мережевих механізмів, розташованих на рівні каудального БЛБДм. Проте у даній роботі досліджувались щурята тільки першого дня лиття, у той час як ефективне функціонування реципрокних міжнейрон-них зв’язків респіраторної мережі починається у цих тварин з

4-5-го дня життя (Szchweitzer et al. 1392).

Останні роки (Koos et al. 1994; Schmidt et al. 1995) характеризуються підвищенням інтересу до центральних механізмів респіраторних реакцій в умовах гіпоксії. Особливу актуальність ця проблема нзбуває у зв’язку з необхідністю розробки методів запобігання різних форм порушення дихання, пов’язаних з гіпоксією у новонароджених і дітей перших днів лиття (Rodrigues-Alarcon et al. 1994). Увагу дослідників залучає також роль амінергічної і опіоідергічної систем у центральних механізмах регуляції дихання (Moss et al. 1986; Агі-ta, Oshiishi, 1991). Відомо, що опіоідергічні і серотонінер-гічні нейромедіаторні механізми безпосередньо відповідають за сполучені реакції дихальної і серцевосудинної систем на дію таких факторів , як больове подразнення (Loviok, Li, 1989) і гіпоксії (Huang et al. 1994) , а також до порушення дихання (тривалі апное) у дітей перших днів життя (Freohtl, 1978). Це може лежати в основі розвитку синдрому раптової смерті новонароджених (Worin et al. 1992; Storm et al. 1394; Caroff et al. 1994).

З’ясування цих питань, необхідних для розуміння становлення медулярних механізмів генерації і регуляції дихального ритму у перші дні новонародженості, визначило мети і задачі цього дослідження.

- з -

МЕТА РОБОТИ: дослідження медулярних механізмів форму-

вання дихального ритму у штучно суперфузованих (in situ) частково ізольованих медулоспинальних препаратів (ЧІМСП) щурят перших днів життя.

ЗАДАЧІ ДОСЛІДЖЕННЯ:

1. Провести дослідження електричної активності n.phre-nicus частково ізольованих медулоспинапьних препаратів при послідовних поперечних перерізах вентролатеральних відділів довгастого мозку.

2. Провести дослідження впливу блокаторів опіоідних і серотонінових рецепторів на респіраторну активність n.phre-nicus частково ізольованих медулоспинапьних препаратів.

3. Провести дослідження впливу гіпоксії на електричну активність n.phrerdcus частково ізольованих медулоспинапьних препаратів.

4. Провести дослідження частотних характеристик респіраторних нейронів вентролатеральних відділів довгастого мозку частково ізольованих медулослинальних препаратів.

5. Дослідити пейсмекерні властивості медулярних респіраторних нейронів вентролатеральних відділів довгастого мозку частково ізольованих медулослинальних препаратів.

НАУКОВА НОВИЗНА. Вперше показано, шр в ідентичних умовах експерименту у новонароджених щурят частота інспіратор-них розрядів у n.phrenicus і їх інтегральна інтенсивність, що відображає об'ємно-часові характеристики інспірації, s значно нижчою аналогічних показників у 4-5-денних тварин.

Виявлено, що у препаратів новонароджених щурят активність системи опіоідергічного контролю механізмів респіраторного ритмогенезу перевищує таку у 4-5-денних, у той час

як серотонінергічні вшшви, що відповідають за підтримання стабільного рівня збудженості респіраторної мережі більш виражені у останніх. Вперше доведено, що респіраторна активність, яка генерується ЧІМСП щурят перших днів життя, б ейп-ноеподібною, у той час як розвиток гаспінгподібної активності спостерігається тільки в умовах тривалої гіпоксії.

При дослідженні частотних характеристик преінспіратор-ник нейронів виявлена тенденція трансформації їх патернів з біфазного, що має два частотних максимуми - преінспіраторній і постінспіраторній, у новонароджених тварин, на монофазний, що має один преінспіраторний частотний максимум, у 4-5-ден-них щурят. Дослідження пейсмекерних властивостей респіраторних нейронів на основі їх стійкості до дії розчину зі зниженим вмістом Са2+, який надійно блокує синаптичну передачу, показало, що найбільш стійкими з них є преінспіраторні і експіраторні нейрони шурят 1-го дня життя. Менш стійкими ви-виявились аналогічні нейрони 4-5-денних щурят, у той час як інспираторні нейрони тварин обох груп такої стійкості не мали. Це може вказувати на важливу роль пейсмекерних механізмів у генерації респіраторного ритму у новонароджених тварин. У результаті відділення шляхом поперечних перерізів і ефектів електрокоагуляції зон ВЛВДМ, що містять преінспіраторні нейрони, показано, що ці ділянки мають важливе значення у підтриманні механізмів генерації респіраторного ритму у щурят 1-го дня життя у порівнянні з 4-5-денними.

ТЕОРЕТИЧНЕ ТА ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ РОБОТИ. Проведені дослідження стану центральних механізмів респіраторного рит-могенезу дозволяють розширити і доповнити відомості про природу генерації дихального ритму у тварин перших днів життя.

- б -

Дані про роль різних відділів вентролатеральної області довгастого мозку у механізмах генерації і регуляції респіраторного ритму можуть стати внеском у розвиток уявлень про організацію медулярної респіраторної мережі. Аналіз частотних характеристик респіраторних нейронів, а також. їх пейсмекер-них властивостей дозволяють більш конкретно судити про становлення і основні принципи функціонування респіраторної мережі у тварин перших днів життя.

Дані відносно принципів організації центральних мехаз-мів генерації і регуляції респіраторного ритму у тварин перших днів життя можуть слугувати основою для дослідження таких форм порушення дихання як тривалі апное у новонароджених дітей і розвиток синдрому раптової смерті новонароджених, ОСНОВНІ ПОЛОЖЕННЯ. ЩО ВИНОСЯТЬСЯ НА ЗАХИСТ:

1. Медулярні механізми формування дихального ритму у новонароджених тварин характеризуються визначеною нестабільністю їх функціонування , що вказує на істотну розбіжність у ступені зрілості респіраторної мережі у тварин різного віку.

2. Ростральні і проміжні відділи ВЛВДМ надають ріано-направлені впливи на медулярні механізми респіраторного рит-могенезу, що в значній мірі зумовлено існуванням систем опіоідергічного і серотонінергічного контролю над діяльністю респіраторної мережі.

3. У новонароджених тварин активність системи опіоідергічного контролю механізмів респіраторного ритмогенезу перевищує гаку у 4-5-денних, у той час як серотонінергічні впливи, що відповідають за підтримання стабільного рівню збудженості респіраторної мережі, у тварин першого дня життя ще недостатньо сформовані.

4. Проміжні відділи ВЛЕдМ, що містять преінспіраториі нейрони, грають важливу роль у підтриманні стабільного функціонування респіраторної мережі у тварин першого дня життя , що, можливо, зумовлено пейсмекерними властивостями преінспі-раторних нейронів. Для більш старших тварин дані структур не s необхідними для генерації дихального ритму.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Основні матеріали дисертації демонструвались. доповідались і обговорювались на міжнародній конференції "Rythrnog'enesis, Plasticity: Advantages arid limits

of new experimental approaches in Neurobiology" (Marseille, 1S34), II конгресі латофізіологів України (Київ, 1996), а також на сумісному засіданні секторів нейрофізіології і фізіології вісцеральних систем Інституту фізіології ім.

0.0.Богомольця НАН України (Київ, 1S97 p.).

ПУБЛІКАЦІЇ. За матеріалми дисертації опубліковано 6 наукових праць.

ДЕКЛАРАЦІЯ ОСОБИСТОГО ВНЕСКУ. Автором самостійно проведено експериментальне дослідження, обробку, аналіз і викладення результатів.

ОБСЯГ І СТРУКТУРА РОБОТИ. Дисертація викладена на 135 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 4 таблицями і 27 малюнками, складається із вступу, 4 розділів, висновків і списку цитованої літератури, який вмішує 9 вітчизняних і 176 зарубіжних джерел.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.

Для приготування частково ізольованих медулослинальних препаратів (ЧІМСП), що знаходяться in situ (Suzu, 1984, 1SS5), були використані новонароджені і 4-5-денні щуренята

лінії Вістер (49 і 47 тварин відповідно). Під глибоким ефірним наркозом здійснювалась задня лямінектомія і білатерально пересікалися всі дорсальні корінці. Потім розкривалась основа мозку, який пересікався по виходу корінців n. abducens (рівень" а"). Препзрувався та перерізався правий п. phreni-cus. У ряді серій виконувались поперечні перерізи вентрола-теральних відділів довгастого мозку (ВЛВДМ) між хемочутливи-ми зонами ”М" і "S" (рівень " b"), "S" і "L” (рівень "о"), що відповідає верхній межі жмутка філаментів корінця n.hypo-glossus , і по середині корінця n. hypoglossus (рівень"й")-

Суперфузуючий розчин являв собою насичений карбогеном (95 % Ой + 5 7. СОг на протязі 10 хв при 25-26 °С) модифікований розчин Кребса слідуючого складу (у мілімолях на 1л): NaCl - 124.0; КСІ - 5.0; KH2FO4 - 1.2; СаСІг - 2.4; MgS04 -1.3; ИаНСОз - 26.0; глюкоза - 30.0 (рН 7.4). Швидкість течії розчину складала 4.0 мл /хв. Для моделювання умов гіпоксії застосовувався тестучий ізокапнічний розчин, насичений сумішшю зі зниженим вмістом 0г (20 Z Ог + 75 % N2 + 5 X СОг).

Інспіраторні розряди (ІР) у вигляді електричних сигналів, що відводяться від n.phrenicus біполярно, подавались на підсилювач змінного струму, дискримінувались, подавались на амплітудно-частотний інтегратор (постійна часу 30.0 мс), а потім на 12-розрядний аналого-цифровий перетворювач (АДП), з'єднаний з персональним комп’ютером. Реєстрація позаклітинної активності респіраторних нейронів здійснювалася шляхом скляних мікроелектродів. Позаклітинні сигнали, що заздалегідь посилювались, дискримінувались і потім подавались на один з каналів АЦП. У зонах відведення здійснювалась елект-рокоагуляційна позначка (100 мкА - 10 с), після чого довгас-

тий мовок вирізався блоком і фіксувався у 10 % розчині формаліну протягом 4В год. З цих блоків на заморожуватиму мікротомі готувалися зрізи товщиною 30-50 мкм.

З метою дослідження пейсмекерних властивостей респіраторних нейронів застосовувалася методика (Опітаги еЬ аі. 1987) суперфуаії препарату тестуючим розчином з низьким вмістом іонів Са"+ (0.2 мМоль СаСІг) і високим - іонів М£2+ (0.5 мМоль МеСІг). Аналіз імпульсної активності стійких до дефіциту іонів Саг+ нейронів виконувався протягом 1 год після припинення ІР у п. рІтгепісиБ. Визначався час стійкості кожного з досліджених респіраторних нейронів до дії тестуючого розчину.

У ряді випадків, згідно з програмою експериментальної частини тонким (діаметр - 10 - 25 мкм) електродом, заповненим сплавом Буда, здійснювалася монополярна електростимуляція зон розташування преінспіраторних і області розташування інспіраторних і експіраторних нейронів прямокутними імпульсами струму тривалістю 5.0 мс (20 мкА).

У роботі використовувалися блокатор ^-опіатних рецепторів налоксон і блокатор серотонінових (5-НТа) рецепторів ме-тисергід ("Зібігіз", СТА). Аналіз експериментальних даних здійснювався з використанням критерію Ст’юдента для малих об’ємів експериментальних виборок (Р < 0.05). Оцінювались частота РІ5 хв-1, тривалість Ті, мс, інтегральна інтенсивність Бі і амплітуда Аі, ум.од. (1 умовна одиниця дорівнює інтегрованому електричному сигналу, який має амплітуду 5 мкВ при частоті 5 Гц) ІР. .

Дослідження імпульсної активності респіраторних нейронів здійснювалось на основі реєстрації їх розрядів протягом

20 респіраторних циклів. Частота розрядів преінспіраторних нейронів усереднювалась, оцінювався ступінь гальмування активності преінспіраторних і експіраторних нейронів протягом фази ІА у п. рітгепісиз.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Результати проведених експериментів показали, що у 4-

5-денних щурят частота дихальної ритміки, її тривалість і інтенсивність при будь-якій конфігурації препарату були вірогідно вищими, ніл у новонароджених тварин (табл.1). Після перерізу нижче хемочутливо'і зони "М" достовірно збільшувалася частота слідування і зменшувались тривалість, інтегральна інтенсивність і амплітуда ІР при одночасному збільшенні дисперсії цих величин. Результати перерізки між хемочутливими зонами "З" і "Ь" показали, що у піддослідних тварин обох груп достовірно знижувались частота, тривалість, інтегральна інтенсивність і амплітуда ІР при одночасному збільшенні дисперсій цих параметрів. Було також відмічено, що після перерізки нижче хемочутливо'і зони "З" респіраторний ритм зберігався тільки у 7 з 12 новонароджених щуренят. У 4-5-денних тварин дихальна періодика спостерігалась у всіх без виключення препаратах.

Суперфузія протягом 2 хв розчином, що містить 1.0 мкМоль налоксону, в умовах вихідної конфігурації препарату викликала достовірне збільшення частоти слідування ІР у тварин обох груп. Абсолютні величини приросту частоти ІР у групах виявились близькими, проте у новонароджених щурят цей приріст складав у середньому 124, а у 4-5-денних - тільки 57

а. У 4-5-денних щурят налоксон викликав достовірне зменшення

Табд. 1. Показники респіраторної активності медулоспинадьних препаратів при послідовних перерізах вентролатеральних відділів довгастого мозку у новонароджених (одноденних) і чотирьох-п'ятиденних шурят.

1 І Вік І тварин, 1 дні і І Рівень ¡перерізк 1 " < І Параметри респіраторної активності |

«і 1 ?і, І хв-1 » Ті, мо Зі, ум. од. і | ум.од.|

! 1 1 а 1 і 4.3 ± 0.3 571 ± 48 465 ± 29 41 ± 4 і

1 * + * •*с ★ }

1 1 і ь 112.8 ±2.3 436 ± 53 218 ± 34 і*? + 7 І 1^»* — ( І

1 + ** ■* "к {

1 1 1 с І 3.4 і ±0.8 412 ± 52 150 ± ЗО 26 ± 5 |

І 4-5 ! а і 111.6 ± 0.5 987 ± 73 1795 ± 40 91 ± 10|

1 * + * * + * |

І 4-5 ! Ь 119.1 ± 1.4 614 ± 71 952 ± 56 68 ± 8 !

1 * + * + * + ■А 1

1 4-5 і 1 с 1 І 5.1 _і_ , ± 0.7 429 ± 53 317 ± 32 39 ± б | і

Примітки: зірочками і хрестиками позначені вірогідна достовірні відрізненая між середніми і їх дісперсіяш відповідно (п - 12 - для новонароджених, п - 8 - для 4-5-денних тварин, Р < 0.05); а-с - рівні поперечних перерізів вентродзтеральних відділів довгастого мозку.

як амплітуди, так і інтегральної інтенсивності ІР у серед-

ньому на 24 і 31 % відповідно. Між тим у новонароджених тварин хоч і спостерігалася тенденція до зниження даних параметрів, достовірних відрізненії від їх контрольних величин виявлено не було. Після відділення хемочутливої зони "М" приріст частоти ІР під впливом нзлоксона у одноденних щурят у середньому склав 5.1, а у 4-5-денних - 3.1 хв-1, тобто 47 і 20 £ відповідно. Таким чином, відносне збільшення частоти ІР стало майже втричі меншім, ніж в умовах вихідної конфігурації препарату (розбіжності достовірні). Після відділення хемочутливої зони "З" приріст частоти ІР під впливом налок-сону відносно її вихідного рівня у одноденних щуренят у середньому дорівнював 1.5 хв-1, що склало 38 %.

Суперфузія протягом 2 хв розчином, що містить 10.0 мкМоль метисергіда, в умовах вихідної конфігурації препарату у тварин обох груп викликала достовірне зменшення частоти слідування ІР. Після відділення хемочутливої зони "М" зниження частоти ІР під впливом метисергіда у одноденних щурят у середньому склало 4.0 (37 7.), а у 4-5-денних - 9.4 (62%) хв-1. Таким чином, відносне зменшення частоти ІР у 4-5-денних тварин достовірно перевищувало аналогічний показник у новонароджених. Після відділення хемочутливої зони зменшення частоти ІР у результаті дії метисергіда у 4-5-денних щурят у середньому дорівнювало 2.0 хв-1, що склало 37 X. У новонароджених тварин будь-яких вірогідних змін ІА не було вивлено.

Короткочасна гіпоксія, що викликається експозицією су-перфузуючого розчину з вмістом 20 % 0г на протязі 2 хв, не викликала будь-яких достовірних змін характеристик ІА у п. рІітепісиБ у новонароджених щурят. У 4-5-денних тварин в аналогічних умовах було відзначено короткочасне (до ЗО с) поча-

стішдння IP з подальшим більш триваліш пригніченням (до 4 хе) - причому знижувались і частота, і амплітуда ІР. У ході дослідження впливу тривалої гіпоксії (до 20-30 хв) на характеристики респіраторних патернів встановлено, що у одноденних ЧШСП пригнічення ІР у n.phrenicus відбувалося поступово протягом 10-13 хв. У 4-5-денних щурят повне пригнічення ІА відбувалося за 4-6 хв, тобто, значно швидше. Як і у тесті з короткочасною гіпоксією, пригніченню ІА у 4-5-денних шурят передувало недовгочасне (до ЗО с) почащення ІР. Після повного пригнічення ІА у 10 а 13 4-5-денних щурят відзначалась поява у n. phrenictis різної за ступенем інтенсивності тонічної активності. У 5 препаратів одноденних шурят подібна тонічна активність була слабко вираженою і змінювалась розвитком нерегулярних низькоашлітудних IF короткої тривалості (283 ± 48 мс). Ці скорочені залпи були кваліфіковані як гас-пінг - розряди. У 6 4-5-денних шурят після фази тонічної активності була відзначена поява таких же нерегулярних низько-амплітудних гаспінг-розрядів скороченої тривалості (328 ± 67 мс). У 4 з цих препаратів на фоні гаспінг-патерну спостерігались окремі ейлное -подібні інспіраторні залпи. Як у новонароджених, так і у 4-5-денних щурят тривалість фази гас-пінг -розрядів складала не більше 5-8 хв, після чого яка-не-будь активність у n. phrenicus була відсутня. Після поперечних перерізів ВШДМ по середньому рівню виходу n.hypoglos-sus, що проекційно відповідає розташуванню "заслонки" (obex) дна 4-го шлуночка мозку, ми не виявили у контролі будь-якої фазної ІА у n.phrenicus у жодному з препаратів. Дроте у тесті з тривалою гіпоксією у n. phrenicus розвивалась незначна тонічна активність з подальшо» появою гаспінг-розрядів як

у новонароджених (3 з 14), так і у 4-5-денних (5 а 13) тварин. Тривалість таких гаспінг-розрядів у одноденних щурят скяадзлз 294 ± 67 мс, а у 4-5-денних - відповідно 317 ± 44 мс. Тривалість фази генерації гаспінг -розрядів у щурят обох груп була не більш 4 -6 хв, після чого будь-яка активність у п.phrenicus припинялась. Після поперечної перерізки ВЛВДМ по нижньому краю області виходу n.hypoglossus, що проекційно відповідає "письмовому перу" дна четвертого шлуночка мозку, ми також не виявили будь-якої фазной активності у n.phrenicus при суперфузії ЧІМСП стандартним розчином у жодному з випадків. Але у тесті в тривалою гіпоксією у частини досліджених препаратів (у 2 з 14 1-денних і 4 з 13 4-5-денних) у n.phrenicus були виявлені тільки слабі тонічні реакції без розвитку яких-небудь фазних розрядів.

При дослідженні частотних характеристик респіраторних нейронів було вивчено 53 преінспіраторних (26 - у новонароджених і 27 - у 4-5-денних ЧІМСП), 35 інспіраторних (17 - у

новонароджених і 18 - у 4-5-денних ЧІМСП) і 29 експіраторних нейронів (13 - у новонароджених і 15 - у 4-5-денних ЧІМСП). Патерни розрядів преінспіраторних нейронів характеризувались наявністю двох максимумів - преінспіраторного і постінспіра-торного - тобто безпосередньо перед початком інспіраторного розряду у n. phrenicus (за 150 - 300 мс) і у момент його закінчення, що узгоджується з даними робіт групи Онімару (Onirnaru et al. 1987, 1989). Усереднені значення частоти

преінспіраторного максимуму були достовірно вище-у 4-5-енних ЧІМСП, а їх дисперсії - нижче (18. 2 ± 4.7 с-1) у порівнянні з такими у препаратів новонароджених щурят (11.3 ± 5.8 с-1). У всіх зареєстрованих преінспіраторних нейронів

відзначалося зниження частоти розрядів у фазу інспірації -аж до повного їх зникнення у частини з них, знайдених у 4-5-денних препаратів. Середнб значення частоти розрядів у момент фази інспірації було достовірно вище у новонароджених ЧІМСП (3.4 ±2.1 о-1) у порівнянні з таким у 4-5-денних щурят (1.6 ± 0.8 о-1). Звертає на себе увагу також той факт, що серед всіх преінспіраторних нейронів, зареєстрованих у ЧІМСП новонароджених щурят, поотінспіраторний максимум був досить добре виражений у 14 одиниць, у той час як у 7 він мав тенденцію до зменшення, а у інших 5 нейронів і зовсім був відсутній. Між тим для преінспіраторних нейронів, зареєстрованих у ЧІМСП 4-5-денних щурят, поотінспіраторний максимум був досить добре виражений всього тільки у 6 одиниць, мав тенденцію до зменшення у 4 і був відсутній у 17 е них.

При дослідженні інспіраторних нейронів виявлено, що середнє значення частоти їх розрядів протягом всієї фази інспірації було достовірно вище у ЧІМСП 4-5-денних щурят, у той час як її дисперсія значно нижче (26.4 ± 3. 9 о-1) в порівнянні з аналогічними показниками у препаратів новонароджених тварин (19.8 ± 5.7 о-1). В експіраторних нейронах середнє значення їх частоти протягом межінопіраторної фази було достовірно вище у ЧІМСП 4-5-денних щурят, у той час як її дисперсія значно нижче (13.9 ±3.9 с-1) в порівнянні з аналогічними показниками у препаратів новонароджених тварин (9.3 ±4.6 с_і). Характерною особливістю експіраторних нейронів було зниження частоти їх розрядів у фазу інспірації, середне значення якої було достовірно вище у . новонароджених ЧІМСП (2.7 ± 1.9 о-1) в порівнянні з таким у препаратів 4-5-денних щурят (1.1 ±0.6 с-1). Морфологічний аналіз ділянок

відведення позаклітинної активності респіраторних нейронів показав, що вони відповідають ретрофаціальній зоні рострального БЛБДМ, яка містить, згідно Онімару та ін. (Oniinaru et аі. 1987, 1989), нреінспіраторні пейсмекерні нейрони, і Complex Pre-Botzinger каудального ВЛБДМ, який, згідно Сміта і Фельдмана (Smith еі аі. 1991), містить інсиіраторні умовно-пейсмекерні нейрони.

Електрична стимуляція зони розташування преінспіраторних нейронів показала, що у щурят обох груп викликана інспі-раторна відповідь у n.plirenicus виникала при нанесенні стимулу тільки у другій половині міжінспіраторної паузи. Проте стимуляція зони розташування виявлених нами інопіраторних і експіраторних нейронів викликала у ЧШСП обох груп інспірз-торну відповідь у n.plirenicus незалежно від того, у який момент інспіраторного циклу був нанесений стимул.

Після двосторонньої електрокоагуляції зони розташування преінспіраторних нейронів усі ЧІМСП 4-5-денних щурят відновили свою вихідну респіраторну активність, у той час як серед препаратів новонароджених тварин фазна респіраторна активність була відновлена тільки у 21 з 27 ЧІМСП. Між тим, двостороння електрокоагуляція області розташування інспіра-торних нейронів виявилася для всіх досліджених ЧІМСП новонароджених і 4-5-денних щурят невідтворюваною - жодний а них не відновив своєї вихідної респіраторної активності.

З метою з’ясування иейсмекерних властивостей респіраторних нейронів на стійкість до дефіциту Сай+ в середовищі, що надійно блокує синаптичну передачу, було протестовано 53 преінспіраторних (26 - у новонароджених і 27 - у 4-5-денних ЧІМСП), 35 інопіраторних (17-у новонароджених і 18 - у

4-5-денних ЧШСП) і 39 експіраторних нейронів (19 - у новонароджених і 20 - у 4-5-денних препаратів). З уоіх 35 досліджених інопіраторних нейронів жодний не виявив яких-не-будь ознак стійкості до дефіциту Са- всі вони припиняли свою активність майне одночасно зі зникненням фазних розрядів у n.phrenicus. Преінспіраторні нейрони виявилися більш стійкими до нестачі Саг+. Найбільш стійкі з них були у змозі генерувати спайкову активність протягом декількох десятків хвилин після зникнення інопіраторних розрядів у n.plirenicus. Проте час стійкості преінспіраторних нейронів до дефіциту Са2+ не перевищував 25 хв для 4-5-денних ЧШСП і 40 хв - для препаратів новонароджених тварин (табл. 2). Було також виявлено, що у процесі дії розчину зі зниженим вмістом іонів Са2-1" патерни розрядів преінспіраторних нейронів проходять фазу нерегулярної низькочастотної тонічної активності, що з’являється у міжпачечних інтервалах, яка потім знову набуває характеру пачечного патерну, який поступово трансформується у поодинокі розряди.

Дослідження динаміки розрядів експіраторних нейронів в умовах дефіциту Са2+ у середовищі виявило, що дані одиниці хоч і мають певний ступінь резистентності до дії тестуючого розчину, проте їх активність виявилась менш стійкою в порівнянні з преінспіраторніми нейронами. Це особливо характерно для ЧІМСП новонароджених тварин, у яких найбільш стійкі до дії тестуючого розчину преінопіраторніе нейрони виявляли свою активність протягом ЗО - 40 хв, у той час як максимальний термін стійкості експіраторних- нейронів не перевищував 15 - 25 хв (табл. 2). Аналіз патернів активності стійких до дефіциту Сз2+ експіраторних нейронів показав, що

Табл. 2. Динаміка стійкості респіраторних нейронів до дії розчину з низьким вмістом іонів Са2+.

1 | Вік І тварин, 1 дні 1 1 І Тип Інейро- | нів 1 1 Кількість стійких до дефіциту Са2+ | респіраторних нейронів у різні інтервали | часу (хв) їх тестувння І

і і 0-5|5-10ЦО-15 ! і і і і 15-20|20-25|25-30|30-35 і < і 35-401

1 1 1 ' І пре- 1 інсп ! І ' і 6 1 5 ! 4 1 І і і 3 і 1 з 1 і 1 І 2 1 і 1 1 2 1 1

І Іексп-і 1 1 7|5|4 2 1 І 1 1 1 0 1 о 0 1

І 4-5 пре-[ інсп 111 8 | 5 1 1 І І 2 | 1 1 і 1 0 1 1 1 о о 1

і г експ- і І і 121 4 і 3 » • 1 і 1 о І ! о і 1 о 1 о 1 1

Примітки:пре-інсп - преінспіраторні, екоп-і - експіраторні.

їх розряди проходять фазу відносно регулярної тонічної активності, середня частота якої перевищує вихідний рівень на

8.3 ± 4.2 і 12.7 ± 5.4 % у новонароджених і 4-5-денних ЧШСП відповідно. Звертав на себе увагу також той факт, що після фази підвищеної тонічної активності розряди експіраторних нейронів трансформуються у відносно регулярний пачечний тип, який у міру подальшої дії тестуючого розчину зменшується до регулярної низькочастотної імпульсної активності.

- 18 -

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ.

Дані цього дослідження дають основу вважати, що цілісність зв’язків з структурами проміжних відділів ВЛВДМ необхідна для підтримання більш високочастотного режиму діяльності генераторних структур бульбзрної респіраторної мережі. Результати проведених експериментів свідчать про те, що у підтриманні респіраторного ритму проміжні відділи ВЛВДМ у новонароджених тварин грають більш істотну роль у порівнянні а ЧІМСП 4-5-денних щурят. Як свідчать результати роботи, одним з нейромедіаторних механізмів, що забезпечують підтримання досить високочастотного і стабільного режиму діяльності бульбарної респіраторної мережі, є серотонінергічні впливи проміжних відділів ВЛВДМ, опосередковані активацією

5-НТг-серотонінових рецепторів. Вони більш виражені у 4-5-денних щурят у порівнянні з одноденними. Між тим ростральні відділи ВЛВДМ надають тонічний гальмівний опосередкований іі-опіоідними рецепторами вплив на бульбарні механізми генерації дихального ритму. Це гальмування більш істотно виражено у новонароджених щурят у порівнянні з таким у 4-5-денних тварин. Можливо, що більш потужне тонічне опіоі-дергічне гальмування з боку ростральних відділів ВЛВДМ у новонароджених тварин у порівнянні з таким у більш зрілих щурят має визначену функціональну доцільність. Воно, імовірно, приймає участь у гальмуванні дихальної активності плода і тим самим перешкоджає попаданню навколоплідних вод у його повітроносні і дихальні шляхи безпосередньо перед народлен-ням і в його момент (Jansen, Chernick, 1983). •

Результати роботи також свідчать, по-перше, про більш стійкий характер респіраторних реакцій у відповідь як на ко-

роткочасну, так і на тривалу гіпоксію у новонароджених тварин у порівнянні з таким у 4-5-денних, а, по-друге, дають підставу для припущення про більш каудальну локалізацію гас-пінггенеруючих структур довгастого мозку відносно до ейпное-генеруючих.

У роботі також виявлено, що частота розрядів респіраторних нейронів у 4-5-денних ЧІМСП достовірно вище, а її дисперсія значно нилче у порівнянні з аналогічними показниками у препаратів новонароджених тварин. Пригнічення частоти розрядів ііруінспіраторних і експіраторних нейронів протягом фази інспірації було значно менше вираженим у новонароджених ЧІМСП у порівнянні з такти у 4-5-денних препаратів. Слід також відзначити виявлену тенденцію трансформації патерна розрядів більшості преінспіраторних нейронів з біфазного, що має два частотних максимуми - преінспіраторний і постінспі-раторний у новонароджених тварин, на монофазний, що має один преінспіраторний частотний максимум у 4-5-денних щурят. Можливо, що даний факт може лежати в основі пояснення того, чому у дорослих тварин виявляються тільки монофаані преінс-піраторні нейрони (Cohen, 1979; Long, Duffin, 1984; Bianchi et al. 1995). He виключено, що основною причиною даного феномену може слугувати формування реципрокних синаптичних відносин між елементами респіраторної мережі.

Дослідження пейсмекерних властивостей респіраторних нейронів до дії розчину зі зниженим вмістом іонів Сзг+, який надійно блокує синаптичну передачу, показало, що найбільш стійкими з них є преінспіраторні нейрони щурят першого дня життя. Менше стійкими виявились експіраторні нейрони. Виявлено, що обидва типи цих нейронів мали меншу стійкість до

нестачи Caz+ в середовищі у 4-5-денних тварин у порівнянні з аналогічними одиницями ЧШСП новонароджених щурят. Що стосується інспіраторних нейронів тварин обох груп, то стійкість даних одиниць до дії тестуючого розчину виявлена не була. Між тим виявилося, що більшість преінспіраторних нейронів під час дії розчину зі зниженим вмістом іонів Са2+ проходить фазу нерегулярної, а більшість експіраторних - фазу відносно високочастотної регулярної тонічної активності. Це може вказувати на розгальмовування даних нейронів внаслідок усунення реципрокних синаптичних впливів в умовах дефіциту Са2+ в середовищі. Ці результати знаходяться у певній відповідності з даними Онімару (Onimaru, Homrna, 1987; Onimaru et al. 1989) та Ді Паскуале (Di Fasquale et al. 1994), що виявили високу стійкість преінспіраторних неронів до дефіциту Са2+ у повністю ізольованих медулоспинальних препаратів щурят перших 4-х днів життя. Результати цього дослідження, що виявили більш стійкий характер розрядів преінспіраторних нейронів ЧШСП новонароджених щурят у середовищі зі зниженим вмістом іонів Са2+, дають основу на користь припущення щодо "підтримуючої" ролі преінспіраторних нейронів відносно до ще недостатньо сформованої респіраторної мережі у тварин першого дня життя. На користь цього припущення свідчить також виявлене нами неповне відновлення респіраторної активності у ЧШСП новонароджених шурят після попередньої двосторонньої електрокоагуляції зони розташування преінспіраторних нейронів. Між тим необхідно відзначити, що частина експіраторних нейронів, яка мав пейсмекерно-подібні властивості, також може вносити свій певний внесок у підвищення надійності функціонування респіраторної мережі у тварин першого дня життя. На

-гіде, зокрема, вказув робота, згідно якої у щурят гальмівні синапси між респіраторними нейронами починають функціонувати до 4-6 дня життя (ЗсІтееИгег еі аі. 1992).

Виявлені ефекти стимуляції зон розташування преінспіра-торних нейронів можуть також свідчити на користь існування медулярного механізму перемикання фази видиху на фазу вдиху.

Таким чином, можна дійти висновку, що бульбарні механізми генерації дихального ритму у щурят протягом перших п’яти днів життя підвладні досить складним змінам, спрямованим на стабілізацію їх роботи і, імовірно, пов’язаним з переходом у нові умови існування організму і адаптації до них.

ВИСНОВКИ.

1. У дослідах на штучно суперфузованих частково ізольованих медулоспинадьних препаратах щурят перших п’яти днів життя показано, шр в ідентичних умовах експерименту у одноденних щурят частота інспіраторних розрядів у п.рЬгепісиз та їх інтегральна інтенсивність значно нижче аналогічних показників чотирьох-п’ятиденних.

2. Виявлено, що у частково ізольованих медулоспинадьних препаратів новонароджених щурят активність системи опіоідергіч-ного контролю механізмів респіраторного ритмогенезу перевищує таку у чотирьох-п’ятиденних, у той час як серотонінергі-чні впливи, які, імовірно, підтримують стабільність рівню збудженості респіраторної мережі, більш виражені у останніх.

3. Доведено, що респіраторна активність, яка генерується частково ізольованими медулоспинальними препаратами щурят перших днів життя, б ейлноеподібною, у той час як розвиток гас-пінгподібної активності спостерігається тільки в умовах три-

валої гіпоксі.

4. Дослідження впливу гіпоксії на респіраторну активність частково ізольованих медулоспинадьних препаратів виявили більш стійкий характер респіраторних реакцій на гіпоксію у новонароджених тварин у порівнянні з такими у 4-5-денних, а також дали підставу для припущення того, що гаспінггенеруючі структури вентролатеральних відділів довгастого мозку мають більш каудальну протяжність у порівнянні з ейпноегенеруючеи системою нейронів.

5. Частота розрядів медулярних респіраторних нейронів у препаратів чотирьох-п’ятиденних щурят достовірно перевищує таку у новонароджених, а пригнічення частоти розрядів експіраторних і преінспіраторних нейронів під час інспіраторної фази менше виражено у останніх, що може свідчити про визначену морфофункціональну незрілість респіраторної мережі у тварин першого дня життя.

6. Більшість преінспіраторних нейронів частково ізольованих медулоспинадьних препаратів новонароджених щурят мають два частотних максимумів - преінспіраторний і постінспіраторний, у той час як у більшості аналогічних нейронів 4-5-денних щурят був тільки один преінспіраторний максимум. Основою даного феномену може бути поступове формування реципрокних си-налтичних відносин між елементами респіраторної мережі, спрямованих на гальмування активності преінспіраторних нейронів у фазі інспірації.

7. Стимуляція зони розташування преінспіраторних нейронів викликала інспіраторну відповідь у п.рЬгепісиБ при нанесенні стимулу тільки протягом другої половини міжінспіраторної паузи, що може свідчити на користь існування медулярного меха-

- 23 -

ніэму перемикання фази видиху на фазу вдиху.

8. Дослідження пейсмекерних властивостей респіраторних нейронів на основі їх стійкості до дії розчину, який блокує си-наптичну передачу, показало, що найбільш стійкими з них е преінопіраторні і експіраторні нейрони щурят першого дня життя. Менш стійкими виявились аналогічні нейрони 4-5-д'Нних щуренят, у тсй чао як інспіраторні нейрони такою стійкістю не володіли. Це може вказувати на важливу роль пейсмекерних механізмів у генерації респіраторного ритму у новонароджених тварин.

9. 7 результаті відділення шляхом поперечних перерізок і ефектів електрокоагуляції дільниць вентролатеральної області доовгастого мозку, які містять преінопіраторні нейрони, виявлено неповне відновлення респіраторної активності у частково ізольованих медулоспинадьних новонароджених щурят, у той час як у препаратів чотирьох-п’ятиденних тварин респіраторна активность відновлялась у всіх без винятку випадках. Це може свідчити про важливу роль зони розташування преінспіраторних нейронів у механізмах генерації респіраторного ритму у тварин першого дня життя.

ПЕРЕЛІК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Voitenko L.P., Osadchenko I.A., Marchenko Y.A.,

Preobrazhensky N.N., Sushko S.S. Comparative anatomy of rats medullar respiratory nuclei in postnatal development // Тез. межд. конфер. Rythmogenesis, Plasticity: Advantages and

limits of new experimental approaches in Neurobiology (Marseille, 1994). - P. 61.

2. Марченко Б.A., Феник В.Б., Преображенский H.H., Середенко

М.М. Респираторная активность в диафрагмальном нерве частично изолированного медулло-спинального препарата мозга новорожденных крысят // Нейрофизиология. - 1995. - Т. 27, N 5/6.

- С. 387-395.

3. Марченко В.А., Феник В.Б., Преображенский Н.Н., Середенко М.М. Роль опиоидергической и серотонинергической системы ве-нтролатеральных отделов продолговатого мозга в регуляции респираторной активности у крысят раннего возраста // Нейрофизиология. - 1996. - Т. 28, N 1. - С. 62-73.

4. Марченко В.А. Влияние гипоксии на респираторную активно-

сть, генерируемую частично изолированными медуллоспинальными препаратами крысят раннего возраста // Нейрофизиология. -1996. - Т. 28, N 2/3. - С.121-131.

5. Марченко В.А., Феник В.Б., Войтенко Л.П., Осадченко И.А. Характеристики разрядов респираторных нейронов вентролате-ральных отделов продолговатого мозга у крысят раннего возраста // Нейрофизиология,- 1996.- Т. 28, N 4/5.- С.107-117.

6. Марченко В.А. Респіраторна активність у діафрагмадьному нерві частково ізольованого штучно суперфузованого медуло-спинального препарату новонароджених щурів (in situ) // Тези доп.II конгресу патофізіологів України (Київ, 1996). - Фізі-ол. журн. - 1996. - Т. 42, N 3/4. - G. 73.

Marchenko V.A. Investigation of the medullary formation of respiratory rhythm. The dissertation (manuscript) is

presented in accordance with requirements for the degree of candidat of medical sciences in the speciality 14.03.03. -

Normal Physiology. A.A.Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1997.

We have studied respiratory activity generated by artificially superfused in situ semi-isolated medullo-spinal preparation of newborn (1-day-old) and 4- to 5-day-old rats. It was discovered that medullary respiratory rhythm generating mechanism is under tonic opioidergio inhibitory and serotoninergic excitatory control in the first days of life. It was shown that preinspiratory neurons of the newborn rats are more resistant to the synaptic blocking Caz+-low-containing solution than others units and consequently have pacemaker pecularities. Moreover, results show that in newborn animals the retrofacial region containing preinspiratory neurons play a more important role in the support of respiratory rhythm. The results allow us to conclude that the level of maturity of morphofunctional organization of medullary respiratory networks considerably differs in newborn and older animals.

Марченко В.А. Исследование медуллярних механизмов формирования дыхательного ритма. Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности

14.03.03 - нормальная физиология. Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 1997.

Исследовали респираторную активность искусственно су-перфузируемого in situ частично изолированных медуллоспи-нальных препаратов новорожденных (1-й день жизни) и 4-5-дневных крысят. Показано, что центральные механизмы генерации дыхательного ритма у животных первых дней лизня жизни находятся как под тормозным опиоидергическим так и под возбуждающим серотонинергичексим контролем. При исследовании лейсмекерных свойств респираторных нейронов, выявлено, что наибольшей устойчивосью к раствору с низким содержанием Са2+, блокирующим синаптическую передачу, обладают преинспи-раторные нейроны у новорожденных крысят. Показано, что рет-рофациальная зона продолговатого мозга, содержащая лреинспи-раторные нейроны, имеет важное значение для поддержания генерации респираторного ритма у животных 1-го дня жизни. Сделан вывод о существенном отличии степни зрелости и морфофункциональной организации медуллярной респираторной сети у животных разного возраста.

Ключові слова: респіраторна мережа, пейсмекерні механізми, гіпоксія, опіоіди, серотонін, нейрон, синапс.