Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Исследование маркеров программированной клеточной гибели (Bcl-2, Bax, p53 и CD95) в период индукционной терапии острых лейкозов

005049589

На правах рукописи

Ходунова Елена Евгеньевна

«Исследование маркеров программированной клеточной гибели (Вс1-2, Вах, р53 и С095 ) в период индукционной терапии острых лейкозов»

14.01.21 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 4 ФЕВ 2013

Москва - 2013

005049589

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Паровичникова Елена Николаевна Официальные оппоненты:

Луговская Светлана Алексеевна - доктор медицинских наук, кафедра клинической лабораторной диагностики Государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор

Звонков Евгений Евгеньевич - доктор медицинских наук, отделение высокодозной терапии лимфом Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «13» марта 2013 года в 13:00 час.

на заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разос лан «/£» 2013

года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Зыбунова Е.Е

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы: За последнее десятилетия были достигнуты значительные успехи в терапии острых лейкозов (OJI), однако количество резистентных форм заболевания и частота развития рецидивов остаются по-прежнему высокими [Савченко, 2004]. В настоящее время большое внимание уделяется поиску новых подходов к лечению этих заболеваний: изучению биологических особенностей OJI, поиску факторов прогноза с разработкой дифференцированных программ терапии в соответствии с вариантами заболевания. Одним из основных направлений современных исследований при OJI является изучение молекулярно-биологических механизмов патогенеза заболевания. В развитии злокачественных опухолей важную роль играет нарушение баланса между пролиферацией и способностью клеток подвергнуться естественной гибели (апоптозу) [Hengartner, 2000]. Апоптоз - это длительный, растянутый во времени, энергозависимый процесс, который генетически запрограммирован. Рассматривают два основных взаимосвязанных пути реализации апоптоза: «митохондриальный» и «рецепторный». И в том, и другом механизме заложен принцип сбалансированного взаимодействия про- и антиапоптотических факторов, например, таких как белки семейства Вс1-2, белки р53 и CD95 [Green, 1998; Lodich, 2003]. В недавних исследованиях было показано, что высокий уровень экспрессии белка Вс1-2 при острых лейкозах коррелирует с плохим прогнозом заболевания [Testa, 2007]. Выявлено, что соотношение интенсивности экспрессии Вах/Вс1-2 менее 0,3 ассоциируется с незрелостью опухолевых клеток OMJI (М0-М1 вариант по FAB-классификации), наличием хромосомных аберраций и плохим прогнозом заболевания. [Poeta, 2003]. Исследований по динамическому мониторингу маркеров апоптоза в ходе лечения на разных кроветворных клетках и при разных формах острых лейкозов (острых лимфобластных лейкозах, острых промиелоцитарных лейкозах, острых миелоидных лейкозах) не обнаружено.

В настоящее время известно, что основные регуляторные белки ренин-ангиотензиновой системы участвуют в регуляции пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток [Jokubaitis, 2008]. В недавних исследованиях была выявлена экспрессия ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) как на поверхности мультипотентных гемопоэтических клеток (эмбриональных и взрослых), так и на бластных клетках при ОЛ [Goker, 2005; Beyazit, 2007]. Активно исследуется значение экспрессии и функции толл-подобных рецепторов (ТПР) как на нормальных, так и на опухолевых клетках. В некоторых исследованиях выявлено, что опухолевые клетки при хроническом лимфоцитарном лейкозе и множественной миеломе экспрессируют ТПР. А лиганды к ТПР способствуют активации пролиферации этих клеток [Bohnhorst, 2006].

Таким образом, определение нарушений в сложных механизмах программированной клеточной гибели обеспечивает понимание чувствительности

или резистентности опухолевых клеток к проводимой терапии, что в свою очередь может способствовать созданию новых терапевтических программ. Нами не найдено исследований по динамической оценке экспрессии маркеров апоптоза, АПФ и ТПР в ходе лечения на разных кроветворных клетках и при ОЛ.

Цель исследования - охарактеризовать дисбаланс в системе программированной клеточной гибели в различных клеточных популяциях до и после цитостатического воздействия при острых лейкозах.

Задачи исследования:

1. Определить экспрессию Вс1-2, Вах, р53 и С095 в С034+ клетках, Т- и В-лимфоцитах, гранулоцитах костного мозга (КМ) и периферической крови (ПК) у больных ОЛ до начала лечения и сравнить с экспрессией этих маркеров у здоровых доноров.

2. Определить экспрессию ТПР-2 и АПФ в С034+ клетках КМ и ПК у больных ОЛ и сравнить с экспрессией этих маркеров у здоровых доноров.

3. Определить изменения экспрессии исследуемых маркеров в клетках КМ и ПК у больных ОЛ на разных этапах индукционной химиотерапии (ХТ).

4. Выявить различия в экспрессии исследуемых маркеров апоптоза между клетками КМ и ПК у больных ОЛ и здоровых доноров.

5. Оценить взаимосвязь между экспрессией маркеров программируемой клеточной гибели в С034+ клетках при ОЛ и эффективностью лечения (отсутствие ремиссии, рецидив).

Научная новизна

Впервые проведено динамическое исследование экспрессии ключевых маркеров программированной клеточной гибели (Вс1-2, Вах, р53 и С095) в гранулоцитах, лимфоцитах и С034+ клетках КМ и ПК в период индукционного лечения при ОЛ. Выполнено исследование по определению экспрессии АПФ и ТПР-2 на С034+ клетках КМ и ПК у больных ОЛ и у здоровых доноров.

Научно - практическая ценность работы

В результате проведенных исследований выявлены грубые нарушения в экспрессии Вс1-2, Вах, С095 и р53 в различных клеточных популяциях у больных ОЛ в период первого курса индукционной ХТ. Полученные данные имеют важное теоретическое значение и могут служить заделом для последующих исследований.

В результате данного исследования у больных острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) после индукционного курса ХТ был выявлен глубокий В-клеточный иммунодефицит. Эти данные будут учтены в разработке протоколов антибиотической терапии и заместительной терапии иммуноглобулинами.

Основные положения, выносимые на защиту 1. У больных ОЛ на момент диагностики заболевания существуют грубые нарушения экспрессии Вс1-2, Вах, С095 и р53 в различных клеточных

популяциях, которые полностью не восстанавливаются после первого курса индукционной ХТ.

2. На момент диагностики ОЛ С034+ бастные клетки, выходящие в циркуляцию, не отличаются по уровню экспрессии белков апоптоза от клеток костного мозга. У здоровых доноров в популяции С034+ клеток, выходящих в периферическую кровь, существенно увеличивается готовность к апоптозу.

3. Циркулирующие в ПК Т-лимфоциты у больных ОЛ обладают повышенной чувствительностью к индукции апоптоза как до лечения, так и после индукционного курса ХТ.

4. У больных ОМЛ после индукционной ХТ развивается глубокая В-деплеция, при этом существенно увеличивается доля В-лимфоцитов, экспрессирующих проапоптотические белки.

5. На момент диагностики ОЛ определяется высокий процент гранулоцитов, экспрессирующих антиапоптотический белок Вс1-2, что может свидетельствовать об увеличении продолжительности оставшейся минимальной популяции этих клеток.

Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии "Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)" ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗ РФ 24 декабря 2012 года. Основные положения работы доложены на Международной Гематологической школе «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2011) и на Международном симпозиуме «Острые лейкозы XIII. Биология и терапия» (Мюнхен, 2011). По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезисных сообщения.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 166 источников, в том числе 8 отечественных авторов. В работе содержится 15 таблиц, 29 рисунков и одно приложение.

Содержание работы

Общая характеристика больных

В исследование включено 23 больных с диагнозом впервые выявленного ОЛ, находившихся на лечении в отделе химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга за период с февраля 2010 года по июль 2011 года. У 14 больных был диагностирован ОМЛ и у 9 больных - острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ). Среди них было 10 женщин и 13 мужчин в возрасте от

17 до 87 лет, медиана возраста составила 30 лет. В контрольную группу включено 8 здоровых доноров костного мозга.

Всем больным проводили индукционную XT по стандартным программам, принятым в ГНЦ. Больным ОМЛ первый индукционный курс выполняли по схеме «7+3», а больным OJIJI - по протоколу СШЛ-2009. Во время наблюдения одна больная OMJ1 умерла на 7-й день терапии и один больной OMJI отказался от лечения на 5-й день XT. На 36-38 дни после начала индукционной XT у больных OJI на основании процентной концентрации бластных клеток в КМ оценивали достижение ремиссии заболевания. После первого курса XT ремиссия заболевания была достигнута у всех больных OJIJI и у 7 из 12 больных OMJI.

Методы исследования

Для определения экспрессии маркеров апоптоза (CD95, Вс1-2, Вах и р53) на разных популяциях мононуклеарных клеток (CD34+ клетки, гранулоциты, Т- и В-лимфоциты) КМ и ПК и экспрессии АПФ и ТПР-2 на CD34+ клетках КМ и ПК у больных OJI и в контрольной группе применяли метод иммунофенотипирования и проточной цитометрии. Образцы КМ и ПК больных ОЛ исследовали до начала химиотерапии и в течение индукционного лечения: на 8, 21 (только кровь), 36-38 дни от начала лечения. Таким образом, у одного больного исследовано в среднем 140 показателей экспрессии белков апоптоза на четырех клеточных линиях. Всего выполнено около 2800 исследований.

Для определения экспрессии исследуемых белков применяли панель моноклональных антител (мкАТ), меченных одним из 4 флюорохромов: FITC, фикоэритрин (РЕ), РегСР и РЕ-Су7 (производитель BD).

Для определения экспрессии поверхностных антигенов (CD34, CD 13, CD 19, CD3, CD95, ТЛР и АПФ) 100 мкл цельной крови и/или костного мозга распределяли одноканальной пипеткой в пробирки (соответственно количеству комбинаций антител) и добавляли в требуемом объеме мкАТ. В пробирки с изотипическим контролем добавляли неспецифические мышиные иммуноглобулины, меченные соответствующими флюорохромоми. Пробы инкубировали 30 минут при комнатной температуре. После этого проводили лизис эритроцитов и фиксацию клеток раствором Immunoprep reagent system (Beckman coulter). Затем выполняли анализ проб на проточном цитометре.

Для окрашивания внутриклеточных антигенов (Вс1-2, Вах, р53) 100 мкл цельной крови и/или костного мозга распределяли одноканальной пипеткой в пробирки и добавляли в требуемом объеме мкАТ к поверхностным антигенам (CD34, CD13, CD19 и CD3). В пробирки с изотипическим контролем добавляли неспецифические мышиные иммуноглобулины, меченные соответствующими флюорохромами. Пробы инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Для лизиса эритроцитов использовали раствор Lysis Buffer (BD). Нелизированные ядерные клетки осаждали

центрифугированием (1000 об./мин., 10 минут, при температуре +4°С). После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 1 мл солевого фосфатного буфера (PBS) и повторяли осаждение. После удаления супернатанта, для пермеабилизации клеток, осадок ресуспендировали в 100 мкл раствора Cytofix/Cytoperm Plus (BD) и инкубировали в течение 20 минут при температуре +4°С. Затем ядерные клетки осаждали центрифугированием (1000 об./мин., 10 минут, при температуре +4°С) и удаляли супернатант. После этого пробы отмывали раствором Perm/wash (BD) и инкубировали 20 минут с требуемым объемом мкАТ к внутриклеточным белкам Bcl-2, Вах и р53. После инкубации клетки отмывали в фосфатном буфере и анализировали на проточном цитометре.

При анализе данных на точечном графике с помощью электронного окна (гейт) изолировали группу клеток, экспрессирующих специфический антиген (CD34, CD13, CD3, CD 19). Процентное соотношение позитивных и негативных по экспрессии исследуемых маркеров апоптоза клеток определяли только на популяции находящейся внутри гейта. Установка курсора на точечном графике, отделяющего позитивные и негативные значения, выполнялась по изотипическому контролю (клетки, окрашенные неспецифическим мышиным иммуноглобулином того же изотипа, что и используемые мкАТ) с допустимым значением в позитивной области менее 5%. Учитывая применение двух и более флюорохромов, полученные результаты анализировали после коррекции спектральных пересечений (электронная компенсация). В каждом образце исследовали не менее 10000 клеток.

Статистический анализ данных

До начала исследования на этапе предварительного планирования был разработан дизайн и протоколы исследования. Всю информацию из рукописных информационных протоколов переносили в базу данных, созданную в среде MS ACCESS. В дальнейшем все данные исследования были преобразованы с помощью программ на метаязыке в рабочие файлы статистического пакета SAS. Для поиска закономерностей в динамических рядах лабораторных параметров использовались эвристические методы. Также при анализе данных использовались традиционные методы описательной статистики. Для получения достоверных результатов при статистическом анализе, использовался более строгий уровень статистической значимости - менее 0.005. Разработка программного обеспечения исследования и информационное сопровождение выполнены сотрудниками лаборатории биостатистики и медицинских информационных систем ГНЦ (руководитель - к.т.н. С.М. Куликов).

Результаты исследований

Экспрессия CD95. р53, Вс1-2. Вах. АПФ и ТЛР-2 в CD34 + клетках ПК и КМ у больных ОЛ в течение индукционного курса химиотерапии и в контрольной группе здоровых доноров костного мозга

Процентное содержание С034+ клеток в бластной популяции у больных ОЛ в КМ и в ПК представлено в таблице 1. На момент диагностики ОЛ нами не выявлено значительных различий в количестве С034+ клеток в зависимости от варианта заболевания, и оно было значимо выше, чем у здоровых доноров (р <0.005). На 36-38 день после начала индукционной химиотерапии отмечалось существенное снижение количества С034+ клеток в обеих группах больных (р <0.005). Более высокий процент этих клеток после индукционной ХТ у больных ОМЛ, по сравнению с больными ОЛЛ, обусловлен, по-видимому, отсутствием ремиссии у 5 человек в этой группе.

Таблица 1.

Количество С034+ клеток в КМ и ПК у больных ОЛ и здоровых доноров

Группы СЭ 34+ клетки в КМ, % М±т (разброс значений) С034+ клетки в ПК, % М±ш (разброс значений)

до лечения + 36-38 дни до лечения + 36-38 дни

ОМЛ (п = 14) 41,5 ±6,9* (0,2-85,5) 7,7 ± 5,5 (0,6 - 63,3) 24,8 ±5,5* (0,5 - 80,0) 6,2 ± 4,5 (0,2-51,0)

ОЛЛ (п = 9) 39,0 ± 10,6* (1,0-93,2) 2,6 ± 1,4 (0,4 - 14,0) 24,8 ± 8,6* (0,3-73,1) 0,7 ± 0,2 (0,1-2,4)

Доноры (п = 8) 1,9 ±0,4 (0,4 - 3,8) 0,5 ±0,1 (0,1-1,1)

*- р < 0.005 при сравнении с аналогичными клетками здоровых доноров

При анализе экспрессии антиапоптотического белка Вс1-2 было определено, что количество С034+/Вс1-2+ клеток в КМ у больных ОЛ на момент диагностики составило 34,8% ± 6, и было статистически значимо выше, чем в контрольной группе здоровых доноров - 11,5% ± 1,8. В ПК не было существенных различий в содержании этих клеток между больными ОЛ и контрольной группой, которое составило 37,2% ± 7,4 и 26,3% ± 6,2, соответственно. Также не было определено существенных отличий в количестве С034+/Вс1-2+ клеток в КМ и в ПК между группами больных ОМЛ и ОЛЛ (рис. 1, рис. 2).

Как представлено на рис.1, на 8 день терапии у больных ОМЛ отмечалось увеличение количества С034+/Вс1-2+ клеток в КМ до 53,1% ± 11,7, а затем их снижение к 36-38 дню до 15,4% ± 2,7. В то время как у больных ОЛЛ выявлено постепенное уменьшение процента этих клеток в течение индукционного курса ХТ с 32,0 ± 11,2 до 18,2 ± 6,2. Как и в КМ, в ПК на 8 день от начала ХТ у больных ОМЛ отмечалось значительное увеличение количества С034+/Вс1-2+ клеток в ПК до 62,5% ± 4,5, а затем их постепенное снижение к 36-38 дню до 23,6% ± 4,0 (рис.2). В отличие от больных ОМЛ у больных ОЛЛ не было выявлено существенных изменений в

количестве этих клеток в течение индукционного курса химиотерапии, которое варьировало от 23,4% ± 7,0 до 32,3% ± 7,9. На 36-38 дни от начала ХТ не выявлено существенных отличий в количестве С034+/Вс1-2+ клеток КМ и ПК как между больными ОЛ и контрольной группой, так и между группами больных (рис. 1, рис. 2).

в6 ^ ? jS

О £

ДНИ

диагноз ---лавр — ОМЛ -- ОЛЛ Рис. 1. Динамика экспрессии Вс1-2 в СЭ34+ клетках КМ у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

S5-^ Ж-

ДИаГНОЗ ■•■ донор омл ога

Рис. 2. Динамика экспрессии Вс1-2 в СЭ34+ клетках ПК у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

При исследовании экспрессии проапоптотического белка Вах в CD34+ клетках КМ на момент диагностики заболевания выявлены отличия в процентном содержании CD34+/Bax+ клеток у больных разных групп (рис. 3). Так, количество этих клеток у больных ОЛЛ составило 48,2% ± 9,3 и было статистически значимо выше по сравнению с больными ОМЛ - 24,7% ± 7,5 (р < 0.005). На 8 день от начала ХТ наблюдалось значимое увеличение процента CD34+/Bax+ клеток КМ у больных ОМЛ до 62,2 ± 11,8, и его снижение у больных ОЛЛ до 28 ± 7,0. На 36-38 дни от начала ХТ отмечено примерно одинаковое количество CD34+/Bax+ клеток КМ у больных ОМЛ и ОЛЛ, которое составило 46,3% ± 12,3 и 38,0% ± 12,8, соответственно. Таким образом, на 36-38 дни от начала ХТ не выявлено статистически значимой разницы между больными ОЛ и контрольной группой.

Как показано на рис. 4, в ПК на момент диагностики заболевания не было выявлено существенных отличий в количестве CD34+/Bax+ клеток между больными ОМЛ и ОЛЛ, которое составило 35,9% ± 9,8 и 39,8% ± 4,5, соответственно, но оно было статистически значимо меньше по сравнению с контрольной группой (р < 0.005). Также у больных ОМЛ на 8, 21 и 36-38 дни процент CD34+/Bax+ клеток был незначительно больше, чем у больных ОЛЛ (рис. 4), однако статистически значимых отличий получено не было. К 36-38 дню от начала ХТ отмечено увеличение процента CD34+/Bax+ клеток ПК у больных ОЛ, но значения контрольной группы достигнуто не было.

дни

АНИ

Рис. 3. Динамика экспрессии Вах в СЭ34+ клетках КМ у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

ДИаГНОЗ • ■•инор — омл сил

диагноз -••¡¡¡ад — омл оля

Рис. 4. Динамика экспрессии Вах в СБ34+ клетках ПК у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

При анализе экспрессии р53 на CD34+ клетках КМ не было выявлено существенных отличий между больными ОЛ и контрольной группой, как на момент диагностики заболевания, так и в течение всего курса ХТ. Как показано на рис.5, в ПК процент CD34+/p53+ клеток у больных ОЛ на момент диагностики заболевания был статистически значимо ниже чем у здоровых доноров (р < 0.005). На 8 и 21 дни у больных ОМЛ отмечено увеличение процента CD34+/p53+ клеток в два раза (55,6% ± 7,8 и 52,7% ± 9,4), а затем снижение их количества на 36-38 дни до 29,9% ± 8,6. В то время как, у больных ОЛЛ отмечено постепенное увеличение процента CD34+/p53+ клеток с 25,4 ± 7,7 на 8-й день до 46,0 ± 9,2 на 36-38 дни. Таким образом, не было статистически значимых отличий в количестве CD34+/p53+ клеток между группами больных на 36-38 дни, но у больных ОМЛ оно было меньше. Также как и в начале заболевания, на 36-38 дни процентное содержание CD34+/p53+ клеток у больных ОЛ было статистически значимо ниже по сравнению со здоровыми донорами (р < 0.005).

При анализе экспрессии АПФ на CD34+ клетках КМ нами не выявлено существенных отличий в количестве С034+/АПФ+ клеток как между группами больных ОЛЛ и ОМЛ в течение индукционного курса ХТ, так и между больными ОЛ и контрольной группой на момент диагностики заболевания и после индукционной ХТ. В отличие от КМ, в ПК выявлены различия в экспрессии АПФ на CD34+ клетках между больными ОЛ и контрольной группой в течение индукционного курса ХТ (рис. 6). Так, количество С034+/АПФ+ клеток ПК у больных ОЛ в начале заболевания было статистически значимо меньше по сравнению с контрольной группой (р < 0.005), и составило 22,7% ± 5,9 и 67,0% ± 11,4, соответственно. На момент диагностики заболевания не было статистически значимых отличий в экспрессии АПФ CD34+ клетками ПК между группами больных, однако у больных ОЛЛ она была в среднем выше (ОМЛ - 15,9% ± 6,7, ОЛЛ - 33,2% ± 10,3). На 8-й день терапии отмечалось статистически значимое повышение количества С034+/АПФ+ клеток у

больных OMJI до 51,5% ± 7,0 (р < 0.005), а у больных OJTJ1 количество этих клеток не изменилось и составило 26,7% ± 8,7. На 21 день от начала ХТ выявлена практически одинаковая экспрессия АПФ на CD34+ клетках между группами больных (ОМЛ -46,2% ± 12,6, ОЛЛ - 53,7% ± 9,3). На 36-38 дни от начала ХТ определена статистически значимая высокая экспрессия АПФ у больных ОЛЛ, в связи с увеличением количества С034+/АПФ+ клеток у больных ОЛЛ до 65,9% ± 13,3, и уменьшением процента этих клеток у больных ОМЛ до 35,2 ± 9,8. Таким образом, на 36-38 дни от начала ХТ у больных ОЛ отмечено увеличение процента С034+/АПФ+ клеток ПК до 39,0 ± 7,1, но значений контрольной группы достигнуто не было.

диагноз •■•im — с« олл

диагноз

Рис. 5. Динамика экспрессии р53 в СЭ34+ клетках ПК у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

Рис. 6. Динамика экспрессии АПФ в СЭ34+ клетках ПК у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

При исследовании экспрессии С095 и ТПР-2 на СЭ34+ клетках КМ и ПК у больных ОЛ в течение индукционного курса и в контрольной группе нами не выявлено существенных отличий как между больными ОМЛ и ОЛЛ, так и между больными ОЛ и контрольной группой.

Таким образом, в нашем исследовании определено, что на момент диагностики ОЛ в КМ преобладают С034+ клетки, экспрессирующие антиапоптотический белок Вс1-2, а процент СЭ34+ клеток ПК, экспрессирующих проапоптотические белки Вах, р53 и АПФ, значимо ниже, чем в контрольной группе. Следовательно, в С034+ бластных клетках больных ОЛ снижена способность отвечать на индукцию апоптоза. У здоровых доноров содержание С034+ клеток, экспрессирующих Вс1-2, Вах, р53 и АПФ значительно выше в ПК, что указывает на увеличение готовности к апоптозу в циркулирующих клетках-предшественницах. При ОЛ эти показатели в КМ и в ПК идентичны. У больных ОМЛ и ОЛЛ в течение индукционного курса ХТ определяется разная динамика в проценте С034+ клеток, экспрессирующих Вс1-2, Вах, р53 и АПФ, это указывает на отличающиеся при ОЛЛ и при ОМЛ механизмы индукции апоптоза.

Однако нами не выявлено взаимосвязи между профилем экспрессии исследуемых маркеров и эффективностью лечения ОЛ.

Экспрессия СР95. р53. Вс1-2 и Вах в СРЗ + клетках ПК и КМ у больных ОЛ в течение индукционного курса химиотерапии и в контрольной группе здоровых доноров костного мозга

Клетки, несущие на поверхности СРЗ-антиген, принято относить к пан-Т-клеточной популяции. В нашем исследовании была определена экспрессия исследуемых белков в Т-клеточной популяции у больных ОЛ на фоне цитостатического воздействия и в контрольной группе здоровых доноров. Как видно из таблицы 2, на всех этапах индукционной терапии ОЛ процентное содержание Т-клеток (СРЗ+) в КМ и в ПК существенно не отличалось от значений в контрольной группе. Также не выявлено существенных отличий между группами больных ОЛЛ и ОМЛ.

При анализе экспрессии антиапоптотического белка Вс1-2 в СОЗ+ популяции клеток КМ и ПК не выявлено значительных различий в количестве СРЗ+/Вс1-2+ клеток как между больными ОЛ и контрольной группой, так и между группами больных в течение индукционного курса ХТ.

Таблица 2.

Количество СОЗ+ клеток в КМ и ПК у больных ОЛ и здоровых доноров

Группы СО 3+ клетки в КМ, % М±т (разброс значений) СРЗ+ клетки в ПК, % М±т (разброс значений)

до лечения + 36-38 дни до лечения + 36-38 дни

ОМЛ (п = 14) 8,2 ± 2,2 (1,7-33,5) 15,2 ±3,6 (3,0-38,8) 20,1 ±5,5 (0,8-60,2) 32,2 ± 6,5 (8,6 - 85,2)

ОЛЛ (п = 9) 12,3 ±3,8 (0,4-31,7) 23,1 ±4,1 (4,7-41,5) 26,6 ± 5,9 (7,5-68,7) 33,4 ± 6,0 (3,5 - 68,2ы)

Доноры (п = 8) 8,8 ± 1,6 (0,1-13,3) 21 ±3,1 (2,6-30,6)

При исследовании экспрессии проапоптотического белка Вах в СРЗ+ клетках КМ на момент диагностики заболевания процент СРЗ+/ Вах+ клеток у больных ОЛЛ составил 10,3 ± 4,4 и был статистически значимо выше (р <0.001) по сравнению с больными ОМЛ (3,3 ± 0,6) и контрольной группой (2,5 ± 0,9). На 8 день от начала ХТ отмечено увеличение процента СРЗ+/Вах+ клеток у больных ОМЛ до 16,0 ± 7,1 и его снижение у больных ОЛЛ до 7,2 ± 1,9 (рис. 7). На 36-38 дни от начала ХТ отмечено примерно одинаковое количество СРЗ+/Вах+ клеток у больных ОМЛ и ОЛЛ, которое составило 12,0% ± 6,5 и 8,1% ± 3,3, соответственно, в связи, с чем не выявлено

статистически значимых отличий в количестве этих клеток между больными ОЛ и контрольной группой.

Как показано на рис.8, экспрессия Вах в CD3+ клетках ПК у больных ОЛ в начале заболевания была статистически значимо больше по сравнению с контрольной группой (р <0.001). В отличие от КМ, в ПК не было выявлено существенных отличий в количестве CD3+/Bax+ клеток между больными ОМЛ и ОЛЛ, которое составило 7,7% ±4,7 и 4,4% ±2,1, соответственно. На 8 день от начала ХТ группы больных статистически значимо отличались по экспрессии Вах (р < 0.005). Это связано с тем, что у больных ОМЛ количество CD3+/Bax+ клеток увеличилось до 18,0% ± 6,3, а у больных ОЛЛ процент этих клеток практически не изменился - 3,5 ± 0,8. На 21 и 3638 дни процент CD3+/Bax+ клеток был примерно в 2 раза выше у больных ОМЛ, однако статистически значимой разницы получено не было. На 36-38 день от начала ХТ процент CD3+/Bax+ клеток ПК у больных ОЛ увеличился до 15,3 ± 6,0, и был статистически значимо больше по сравнению с контрольной группой (1,1% ± 0,1).

i *

диагноз

C«

от

Рис. 7. Динамика экспрессии Вах в СОЗ+ клетках КМ у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

диагноз

ОЛЛ

Рис. 8. Динамика экспрессии Вах в СЭЗ+ клетках ПК у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

При анализе экспрессии р53 в СЭЗ+ клетках КМ на момент диагностики заболевания не было выявлено существенных отличий между больными ОЛ (3,5% ± 0,9) и контрольной группой (2,1% ± 1,0), а также между группами больных ОМЛ и ОЛЛ (рис. 9). На 8 день у больных ОМЛ отмечено увеличение процента С03+/р53+ клеток до 13,7 ± 5,3, а у больных ОЛЛ процент этих клеток не изменился. Таким образом, экспрессия р53 у больных ОМЛ была статистически значимо выше. На 36-38 дни от начала ХТ количество С03+/р53+ клеток КМ в этих группах было примерно одинаковым (ОМЛ - 5,3% ±2,2, ОЛЛ - 6,5% ±2,1) и существенно не отличалось от контрольной группы.

В ПК количество CD3+/p53+ клеток у больных ОЛ на момент диагностики заболевания было статистически значимо выше чем у здоровых доноров (р < 0.005), и составило 3,0% ± 0,8 и 0,3 ± 0,1, соответственно. На 8 день от начала ХТ у больных ОМЛ отмечено статистически значимое увеличение процента CD3+/p53+ клеток до 21,0 ± 10,0, а затем их снижение на 21 день до 10,6% ± 4,3. А у больных ОЛЛ отмечено небольшое увеличение процента этих клеток в течение всего периода наблюдения (рис. 10). На 36-38 дни статистически значимых отличий в проценте CD3+/p53+ клеток между группами больных выявлено не было. Как и в начале заболевания, на 36-38 дни процент CD3+/p53+ клеток у больных ОЛ был статистически значимо выше (5,7 ± 1,9) по сравнению с контрольной группой (р < 0.005).

диагноз

дай

■ донор ~ ем

диагноз — шл олл

Рис. 9. Динамика экспрессии р53 в СЭЗ+ клетках КМ у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

Рис. 10. Динамика экспрессии р53 в С03+ клетках ПК у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

При анализе экспрессии СР95 на СБЗ+ клетках КМ и ПК нами не выявлено существенных отличий в количестве СЭЗ+/С095+ клеток как между больными ОЛ в течение индукционного курса ХТ и контрольной группой, так и между группами больных ОЛЛ и ОМЛ.

На основании полученных данных можно сделать заключение, что циркулирующие в ПК Т-лимфоциты больных ОЛ обладают повышенной чувствительностью к индукции апоптоза.

Экспрессия СР95. р53. Вс1-2 и Вах в СР19+ клетках ПК и КМ у больных ОЛ в течение индукционного курса химиотерапии и в контрольной группе здоровых доноров костного мозга

Как видно из таблицы 3, до лечения процент СЭ19+ клеток у больных ОМЛ в КМ и в ПК был ниже, чем в контрольной группе, а у больных ОЛЛ процент СБ 19+ клеток был значимо выше. Значительная разница в проценте СР19+ клеток до

14

лечения в зависимости от варианта заболевания обусловлена наличием антигена СО 19 на бластных клетках у больных ОЛЛ. На +36-38 день после начала индукционной химиотерапии у больных ОМЛ выявлено дальнейшее снижение процента СШ9+ клеток в КМ и в ПК. У больных ОЛЛ на 36-38 дни от начала ХТ выявлено статистически значимое уменьшение процента СБ 19+ клеток до 2,9 ± 0,9 в КМ и 3,2 ± 1,6 в ПК (р < 0.005), которое обусловлено достижением ремиссии заболевания с элиминированием бластных клеток, несущих антиген СО 19, в этой группе больных. Необходимо отметить, что на 36-38 дни от начала заболевания процент СО 19+ клеток в обеих группах больных был ниже, чем в контрольной группе (р < 0.005).

Таблица 3.

Количество СЭ19+ клеток КМ и ПК у больных ОЛ и здоровых доноров

СО 19+ клетки в КМ, % СО 19+ клетки в ПК, %

Группы М±ш (разброс значений) М±ш (разброс значений)

до лечения + 36-38 дни до лечения + 36-38 дни

ОМЛ(п= 14) 2,5 ±0,6 (0,5 - 8,3) 1,0 ±0,1* (0,3 - 2,0) 3,5 ± 0,9 (0,6-11,4) 0,6 ± 0,08* (0,1 - 1,2)

ОЛЛ (п = 9) 56,0 ± 10,7 (1,9-94,0) 2,9 ±0,9* (0,1-7,7) 37,1 ± 10 (1,2-91,2) 3,2 ± 1,6* (0,3-15,5)

Доноры (п = 8) 5,6 ± 0,6 (1,6-7,3) 5,1 ±0,4 (2,4-7,0)

*- р < 0.005 при сравнении с аналогичными клетками здоровых доноров

Учитывая наличие антигена С019 на бластных клетках у больных ОЛЛ в начале заболевания и отсутствие возможности разделения СО 19+ бластных клеток и В-лимфоцитов, анализ экспрессии исследуемых маркеров апоптоза на В-клетках в течение всего индукционного курса ХТ был выполнен только у больных ОМЛ.

Как показано на рис. 11, в начале заболевания у больных ОМЛ процент СО 19+ клеток, экспрессирующих антиапоптотический белок Вс1-2, в КМ был статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой (р < 0.005), и составил 43,2% ± 7,8 и 12,1 ± 6,3, соответственно. В течение индукционного курса химиотерапии не выявлено статистически значимых изменений в количестве С019+/Вс1-2+ клеток на 8 и 36-38 дни от начала ХТ. Как и в начале заболевания, на 36-38 дни сохранялись статистически значимые отличия в количестве С019+/Вс1-2+ клеток между больными ОМЛ и контрольной группой. В ПК не выявлено существенных отличий в экспрессии белка Вс1-2 в С019+ клетках у больных ОМЛ и в контрольной группе в течение всего курса ХТ (рис. 12). Однако у больных ОМЛ количество С019+/Вс1-2+ клеток было выше.

о

о

и

Рис. 11. Динамика экспрессии Вс1-2 в СЭ19+ клетках КМ у больных ОМЛ в теченне курса ХТ

диагноз ---тер — са-

ДИЭГНОЗ •••зад — омл

Рис. 12. Динамика экспрессии Вс1-2 в С019+ клетках ПК у больных ОМЛ в течение курса ХТ

При исследовании экспрессии проапоптотического белка Вах в СО 19+ клетках КМ нами были выявлены существенные изменения в количестве С019+/Вах+ клеток в течение индукционного курса химиотерапии (рис. 13) В начале заболевания статистически значимых различий в проценте СЭ19+ клеток, экспрессирующих Вах, между больными ОМЛ и контрольной группой (15,6% ± 3,2 и 7,0 ± 2,0, соответственно) выявлено не было. На 8 день от начала ХТ определялось увеличение количества С019+/Вах+ клеток до 47,7 ± 12,4, а на 36-38 дни от начала ХТ до 57,5 ± 7,1. Таким образом, после индукционной ХТ, выявлена статистически значимо большая экспрессия Вах у больных ОМЛ по сравнению с контрольной группой.

В ПК выявлены аналогичные изменения, как и в КМ (рис. 14). Так, на момент диагностики заболевания не было выявлено статистически значимых различий в количестве С019+/Вах+ клеток между больными ОМЛ и контрольной группой (15,3% ± 3,4 и 5,7 ± 1,1, соответственно). На 8 день от начала ХТ процент С019+/Вах+ клеток у больных ОМЛ увеличился до 64,1 ± 8,5, а на 21 день - до 90,6 ± 2,5. На 36-38 дни от начала ХТ количество СЭ19+/Вах+ клеток составило 60,2% ± 8,3. Таким образом, в течение индукционного курса ХТ процент С019+/Вах+ клеток был статистически значимо больше у больных ОМЛ по сравнению контрольной группой (р <0.005).

Количество СБ 19+ клеток в КМ, экспрессирующих р53 в группе больных ОМЛ в начале заболевания была статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой (р < 0.005), и составило 15,4% ± 4,2 и 5,3% ± 1,8, соответственно. На 8 и 3638 дни от начала ХТ отмечено увеличение процента С019+/р53+ клеток до 36,7 ± 7,2 и до 47,6% ± 5,7, соответственно (рис. 15). Таким образом, как в начале заболевания, так и после индукционной ХТ, выявлена статистически значимо большая экспрессия р53 у больных ОМЛ по сравнению с контрольной группой (р <0.005).

Как и в КМ, в ПК процент CD19+/p53+ клеток у больных ОМЛ на момент диагностики заболевания составил 25,8 ± 8,1 и был значимо выше по сравнению с контрольной группой - 3,9 ± 1,5. На 8 день от начала ХТ отмечено дальнейшее увеличение процента CD19+/p53+ клеток до 45,9 ± 7. На 21 и 36-38 дни от начала ХТ у больных ОМЛ также сохранялся высокий процент CD 19+ клеток, экспрессирующих р53 (рис. 16). Таким образом, в течение всего послекурсового периода выявлена статистически значимо большая экспрессия р53 у больных ОМЛ по сравнению с контрольной группой (р < 0.005).

диагноз •••доим — Ш

Рис. 13. Динамика экспрессии Вах в С019+ клетках КМ у больных ОМЛ в течение курса ХТ

диагноз

ОМЛ

диагноз •■■»нор — очл

Рис.15. Динамика экспрессии р53 в CD 19+ клетках КМ у больных ОМЛ в течение курса ХТ

Рис. 14. Динамика экспрессии Вах в CD19+ клетках ПК у больных ОМЛ в течение курса ХТ

диагноз

ДНИ

• ДОНОО ™ ОМЛ

Рис. 16. Динамика экспрессии р53 в С019+ клетках ПК у больных ОМЛ в течение курса ХТ

Нами не выявлено существенных отличий в экспрессии С095 на СО 19+ клетках КМ у больных ОМЛ в начале заболевания и в контрольной группе (ОМЛ - 6,0% ± 1,9, доноры - 2,8% ± 0,9). В течение всего послекурсового периода выявлено постепенное увеличение количества СЭ19+/СП95+ клеток и на 36-38 дни от начала ХТ процент

этих клеток составил 33,3 ± 9,1 (рис. 17). Таким образом, на 36-38 дни от начала ХТ количество СР19+/СР95+ клеток в КМ было статистически значимо выше у больных ОМЛ по сравнению с контрольной группой (р < 0.005).

В ПК также были выявлены изменения в экспрессии СР95 у больных ОМЛ в течение индукционного курса ХТ (рис. 18). В начале заболевания количество СР19+/СЭ95+ клеток ПК у больных ОМЛ составило 11,4% ± 3,3 и не отличалось от значений контрольной группы - 8,4% ± 5,4. На 8 день отмечено увеличение процента этих клеток до 22,1 ± 4,7 и на 21 день ХТ до 48,7 ± 9,3. На 36-38 дни от начала ХТ количество СР19+/СР95+ клеток у больных ОМЛ составило 30,5% ± 6,5 и было статистически значимо больше чем в контрольной группе (р < 0.005).

ДИаГНОЗ ■•■«!) — ет

Рис. 17. Динамика экспрессии С095 в СБ19+ клетках КМ у больных ОМЛ течение курса ХТ

диагноз

• вне?

«

Рис. 18. Динамика экспрессии С095 в С019+ клетках ПК у больных ОМЛ в в течение курса ХТ

Таким образом, у больных ОМЛ как до, так и после курса ХТ процент В-лимфоцитов, экспрессирующих антиапоптотический белок Вс1-2, существенно превышал значения у здоровых доноров, что в условиях глубокой В-лимфопении может свидетельствовать об индукции механизмов сохранения жизнеспособности. На 36-38 дни от начала ХТ отмечалось дальнейшее снижение числа В-лимфоцитов в КМ и в ПК, которое сопровождалось значительным увеличением клеток, экспрессирующих проапоптотические белки Вах, СР95 и р53.

Характеристика экспрессии СР95. р53. Вс1-2 и Вах в гранулоцитах (СР13+) ПК и КМ у больных ОЛ в начале заболевания, сравнение с показателями в контрольной группе

Определение экспрессии исследуемых маркеров апоптоза в течение индукционного курса химиотерапии у больных ОЛ было выполнено только в СР13+ клетках, соответствующих фракции гранулоцитов.

Как видно из таблицы 4, до лечения количество гранулоцитов у больных ОМЛ и ОЛЛ в КМ и ПК было статистически значимо ниже по сравнению с контрольной

18

группой. На 36-38 день после начала индукционной химиотерапии у больных ОЛ отмечено статистически значимое увеличение количества гранулоцитов практически до значений здоровых доноров.

Таблица 4.

Количество гранулоцитов (С013+) в КМ и ПК у больных ОЛ и здоровых

доноров

Группы CD 13+ клетки в КМ, % М±ш (разброс значений) CD 13+ клетки в ПК, % М±т (разброс значений)

до лечения + 36-38 дни до лечения + 36-38 дни

ОМЛ (п= 14) 10,1 ± 1,9* (1,6-26,0) 31,8 ±6,1 (5,6 - 68,0) 9,5 ± 1,8* (1,4-23,4) 39,6 ± 6,9 (1,9-72,6)

ОЛЛ (п = 9) 10,5 ±3,4* (2,5-33,3) 35,9 ±5,8 (16,0-66,4) 15,8 ±4,3* (2,2-48,5) 37,7 ±4,4 (12,9-55,6)

Доноры (п = 8) 40,4 ±3,5 (26,0 - 54,2) 59,2 ± 4,8 (33,0 - 74,7)

*- р < 0.005 при сравнении с аналогичными клетками здоровых доноров

На момент диагностики ОЛ процент гранулоцитов в КМ и в ПК, экспрессирующих антиапоптотический белок Вс1-2, был статистически значимо выше, чем в контрольной группе (р <0.0001). Не выявлено отличий в количестве СВ13+/Вс1-2+ клеток в КМ и в ПК между группами больных ОМЛ и ОЛЛ. Так, в КМ количество СОЗ+/Вс1-2+ клеток у больных ОМЛ составило 44,2% ± 9,6, а у больных ОЛЛ - 40,3% ± 10,5, в ПК - 38,4% ± 11,2 и 35,6% ± 10.6, соответственно.

На 8 день терапии у больных ОМЛ в КМ отмечалось увеличение количества С013+/Вс1-2+ клеток до 52.2% ± 11,0, а затем их снижение к 36-38 дню до 10,4% ± 6,0 (рис.19). В то время как у больных ОЛЛ выявлено постепенное уменьшение количества этих клеток в течение индукционного курса ХТ сначала до 28,0% ± 6,0, а затем до 8,5% ± 2,7. Таким образом, к 36-38 дням от начала ХТ отмечено существенное снижение процента С013+/Вс1-2+ клеток КМ у больных ОЛ, однако значений контрольной группы достигнуто не было. Как и в КМ, в ПК у больных ОМЛ отмечалось существенное увеличение количества С013+/Вс1-2+ клеток на 8 день от начала ХТ до 50,7% ± 9,4, а затем их снижение к 21 дню до 29,6% ± 14,7 (рис.20). У больных ОЛЛ на 8 день отмечено уменьшение количества С013+/Вс1-2+ клеток в ПК до 14,2% ± 6,5, а затем их увеличение до 29,8% ± 7,3. Таких образом, на 21 день количество С013+/Вс1-2+ клеток было примерно одинаковым в двух группах больных. К 36-38 дню от начала ХТ отмечено дальнейшее уменьшение процента этих клеток в обеих группах практически до значений, характерных для клеток здоровых доноров.

Количество С013+/Ва\+ клеток в КМ на момент диагностики заболевания у больных ОМЛ составило 80,8% ± 5,8, а у больных ОЛЛ - 52,9% ± 9.7 и существенно

19

не отличалось от значений контрольной группы (49,6% ± 11). На 8 день отмечено незначительное увеличение процента СО 13+/Вах+ клеток в обеих группах больных со снижением его к 36-38 дню (рис. 21). Как в начале заболевания, так и в течение индукционного курса ХТ количество С013+/Вах+ клеток было выше в группе больных ОМЛ. На 36-38 дни от начала ХТ у больных ОЛ процент С013+/Вах+ клеток был примерно как в контрольной группе и составил 49,7 ± 9,3.

Экспрессия Вах в гранулоцитах ПК у больных ОЛ в начале заболевания была незначительно выше по сравнению с контрольной группой (рис. 22). Также не было выявлено существенных отличий в количестве С034+/Вах+ клеток в ПК между больными ОМЛ и ОЛЛ, которое составило 81,8% ± 6.8 и 71,6% ± 9,7, соответственно. Так же, как и в начале заболевания, на 8 и 21 день от начала ХТ в СО 13+ клетках ПК у больных ОЛ сохранялась высокая экспрессия Вах. Однако у больных ОМЛ она была статистически значимо выше, чем у больных ОЛЛ. На 36-38 день от начала ХТ процент СЭ13+/Вах+ клеток ПК у больных ОМЛ снизился до 58,4 ± 13,8, а у больных ОЛЛ до 34,9 ± 12,7. Таким образом, на 36-38 дни не выявлено статистически значимых отличий в экспрессии Вах на гранулоцитах ПК между больными ОЛ и контрольной группой.

При анализе экспрессии р53 и СБ95 в гранулоцитах КМ и ПК нами не выявлено статистически значимых отличий между больными ОЛ и контрольной группой, и между группами больных, как в начале заболевания, так и после индукционного курса ХТ.

Таким образом, на момент диагностики ОЛ выявлено большое количество нейтрофилов КМ и ПК, экспрессирующих антиапоптотический белок Вс1-2, что может свидетельствовать об увеличении продолжительности жизни оставшейся минимальной популяции этих клеток.

ДЮГНОЗ •••т (М оля

диагноз —№ ~~ смл ом

Рис. 19. Динамика экспрессии Вс1-2 в СЭ13+ клетках КМ у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

Рис. 20. Динамика экспрессии Вс1-2 в С013+ клетках ПК у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

дик

диагноз — с« -■ си

Рис. 21. Динамика экспрессии Вах в С013+ клетках КМ у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

диагноз •■•ин-зр — омл сил

Рис. 22. Динамика экспрессии Вах в С013+ клетках ПК у больных ОМЛ и ОЛЛ в течение курса ХТ

Выводы:

1. Показано, что на момент диагностики острых лейкозов выявляются грубые нарушения баланса экспрессии белков-регуляторов апоптоза и пролиферации в различных клеточных популяциях, которые полностью не восстанавливаются после индукционной химиотерапии

2. Доказано, что на момент диагностики острого лейкоза в костном мозге преобладают CD34+ клетки, экспрессирующие антиапоптотический белок Bcl-2, а в периферической крови выявлено значимое снижение количества CD34+ клеток, экспрессирующих проапоптотические белки Вах, р53 и АПФ, по сравнению со здоровыми донорами

3. Определено, что у здоровых доноров содержание CD34+ клеток, экспрессирующих Вс1-2, Вах, р53 и АПФ значительно выше в периферической крови. При острых лейкозах эти показатели в костном мозге и периферической крови идентичны

4. Установлено, что количество Т-клеток в костном мозге и периферической крови у больных острыми лейкозами на всех этапах индукционной химиотерапии существенно не отличается от значений в контрольной группе, но содержание Т-клеток, экспрессирующих проапоптотические белки Вах и р53, в периферической крови значимо превышает показатели у доноров

5. Показано, что после цитостатического воздействия у больных острыми миелоидными лейкозами существенно уменьшается количество В-лимфоцитов в костном мозге и периферической крови, сопровождаемое значительным увеличением доли В-клеток, экспрессирующих проапоптотические белки Вах, CD95 и р53

6. Установлено, что на момент диагностики острых лейкозов число гранулоцитов костного мозга и периферической крови, экспрессирующих антиапоптотический белок Вс1-2, существенно превышает значения контрольной группы. На 36-38 дни от начала химиотерапии количество этих клеток достигает значений показателей у здоровых доноров

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Ходунова Е.Е., Паровичникова Е.Н., Гапьцева И.В., Куликов С.М., Исаев В.Г., Савченко В.Г.//Динамическое исследование экспрессии Вс1-2, Вах, р53 и АПФ в CD34 + клетках периферической крови и костного мозга у больных острым лейкозом в течение индукционного курса химиотерапии// Терапевтический архив,- 2011.-№7.- С. 32-37.

2. Ходунова Е.Е., Паровичникова Е.Н.//Нарушения регуляции программируемой клеточной гибели при остром лейкозе//Гематология и трансфузиология. -2011.-Т.56 №4. С. 22-30.

3. Khodunova Е., Parovichnikova Е., Galtzeva I., Kulikov S., Isaev V., Savchenko V.//Dynamics of BcI-2, Bax and ACE Expression In CD34+ Cells of Peripheral Blood and Bone Marrow In Patients with Acute Leukemia During Induction Therapy//Bood ASH Annual Meeting Abstracts.- 2010,- 116,- abstr. 4840.

4. Khodunova E., Parovichnikova E., Galtzeva I., Kulikov S., Isaev V., Savchenko V. Changes of Bcl-2, Bax, p53 and ACE expression in CD34+ cells of peripheral blood and bone marrow in acute leukemia patients during induction chemotherapy//Annals of Hematology.- 2011.- Vol. 90,suppl.l, P. 12-13.

5. Khodunova E., Parovichnikova E., Galtzeva I., Kulikov S., Isaev V., Savchenko V. Pro- and Antiapoptotic Proteins Expression on Bone Marrow and Peripheral Blood CD34+Cells in Acute Leukemia (AL) Patients//Blood ASH Annual Meeting Abstracts.- 201L- 118.- abstr. 4996.

Список сокращений:

АПФ - ангиотензин превращающий фермент

КМ - костный мозг

Мк AT - моноклональные антитела

ОЛ - острый лейкоз

ОЛЛ - острый лимфобластный лейкоз

ОМЛ - острый миелобластный лейкоз

ПК - периферическая кровь

XT - химиотерапия

ТПР - толл-подобные рецепторы

CD - кластер дифференцировки

Подписано в печать: 27.01.2013 Тираж 100 экз. Заказ №918 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский пр-т д.74 (495)790-74-77 www.reglet.ru

Актуальность темы

За последние десятилетия были достигнуты значительные успехи в терапии острых лейкозов (OJ1), однако количество резистентных форм заболевания и частота развития рецидивов остаются по-прежнему высокими. Пятилетняя безрецидивная выживаемость больных с различными вариантами OJI в среднем составляет 30-40% и отличается в зависимости от варианта заболевания. При остром монобластном лейкозе - 10-15%, при остром промиелоцитарном - 7075% [7]. Несмотря на достигнутые успехи, в настоящее время большое внимание уделяется поиску новых подходов к лечению этих заболеваний: изучению биологических особенностей OJI, поиску факторов прогноза с разработкой дифференцированных программ терапии в соответствии с вариантами заболевания. Одним из основных направлений современных исследований при OJI является изучение молекулярно-биологических механизмов патогенеза заболевания. В развитии злокачественных опухолей важную роль играет нарушение баланса между пролиферацией и способностью клеток подвергнуться естественной гибели (апоптозу) [65]. Апоптоз - это длительный, растянутый во времени, энергозависимый процесс, который генетически запрограммирован. Рассматривают два основных взаимосвязанных пути реализации апоптоза: «митохондриальный» и «рецепторный». И в том и другом механизме заложен принцип сбалансированного взаимодействия про- и антиапоптотических факторов, например таких, как белки семейства Вс1-2, белки р53 и CD95 [27, 54, 65, 86]. В недавних исследованиях было показано, что высокий уровень экспрессии белка Вс1-2 при острых лейкозах коррелирует с плохим прогнозом заболевания [147]. Выявлено, что соотношение интенсивности экспрессии Вах/Вс1-2 менее 0,3 ассоциируется с незрелостью опухолевых клеток OMJI (М0-М1 вариант по FAB-классификации), наличием хромосомных аберраций и плохим прогнозом заболевания [38]. Исследований по динамическому мониторингу маркеров апоптоза в ходе лечения на разных кроветворных клетках и при разных формах острых лейкозов (острых лимфобластных лейкозах, острых промиелоцитарных лейкозах, острых миелоидных лейкозах) не обнаружено.

В настоящее время известно, что основные регуляторные белки ренин-ангиотензиновой системы РАС (ренин, ангиотензин I и II, АПФ) участвуют в регуляции пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток [75]. В недавних исследованиях была выявлена экспрессия АПФ как на поверхности мультипотентных гемопоэтических клеток (эмбриональных и взрослых), так и на бластных клетках при OJI [21, 52, 164].

Активно исследуется значение экспрессии и функции толл-подобных рецепторов (ТПР) как на нормальных, так и на опухолевых клетках. ТПР представляют собой семейство белков, поверхностных рецепторов, которые присутствуют на всех гемопоэтических клетках, и их число увеличивается при инфекционных воспалительных процессах [109, 122]. В некоторых исследованиях выявлено, что опухолевые клетки при хроническом лимфолейкозе (XJIJI) и множественной миеломе (ММ) экспрессируют ТПР. А лиганды к ТПР способствуют активации пролиферации этих клеток [24, 141]. Исследования по динамической оценке экспрессии ТПР при разных формах острых лейкозов отсутствуют.

Таким образом, определение сложных механизмов программированной клеточной гибели обеспечивает понимание чувствительности или резистентности опухолевых клеток к проводимой терапии, что в свою очередь может способствовать созданию новых терапевтических программ.

Цель исследования

Охарактеризовать дисбаланс в системе программированной клеточной гибели в различных клеточных популяциях до и после цитостатического воздействия при острых лейкозах.

Задачи исследования

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить экспрессию Вс1-2, Вах, р53 и СБ95 в СБ34+ клетках, Т- и В-лимфоцитах, гранулоцитах костного мозга и периферической крови у больных ОЛ до начала лечения и сравнить с экспрессией этих маркеров у здоровых доноров.

2. Определить экспрессию ТПР-2 и АПФ в С034+ клетках КМ и ПК у больных ОЛ и сравнить с экспрессией этих маркеров у здоровых доноров.

3. Определить изменения экспрессии исследуемых маркеров в клетках КМ и ПК у больных ОЛ на разных этапах индукционной химиотерапии.

4. Выявить различия в экспрессии исследуемых маркеров апоптоза между клетками КМ и ПК у больных О Л и здоровых доноров.

5. Оценить взаимосвязь между экспрессией маркеров программируемой клеточной гибели в СЭ34+ клетках при О Л и эффективностью лечения (отсутствие ремиссии, рецидив).

Научная новизна

Впервые проведено динамическое исследование экспрессии ключевых маркеров программированной клеточной гибели (Вс1-2, Вах, р53 и СБ95) в гранулоцитах, лимфоцитах и СЭ34+ клетках КМ и ПК в период индукционного лечения при ОЛ. Выполнено исследование по определению экспрессии АПФ и ТПР-2 на С034+ клетках КМ и ПК у больных ОЛ и у здоровых доноров.

Практическая значимость работы

В результате данного исследования у больных ОМЛ после индукционного курса ХТ был выявлен глубокий В-клеточный иммунодефицит. Эти данные будут учтены в разработке протоколов антибиотической терапии и заместительной терапии иммуноглобулинами.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных ОЛ на момент диагностики заболевания существуют грубые нарушения экспрессии Вс1-2, Вах, СБ95 и р53 в различных клеточных популяциях, которые полностью не восстанавливаются после первого курса индукционной ХТ.

2. На момент диагностики ОЛ СОЭ4+ бластные клетки, выходящие в циркуляцию, не отличаются по уровню экспрессии белков апоптоза от клеток костного мозга. У здоровых доноров в популяции СБ34+ клеток, выходящих в периферическую кровь, существенно увеличивается готовность к апоптозу.

3. Циркулирующие в периферической крови Т-лимфоциты у больных ОЛ обладают повышенной чувствительностью к индукции апоптоза как до лечения, так и после индукционного курса ХТ.

4. У больных ОМ Л после индукционной ХТ развивается глубокая В-деплеция, при этом существенно увеличивается доля В-лимфоцитов, экспрессирующих проапоптотические белки.

5. На момент диагностики ОЛ определяется высокий процент гранулоцитов, экспрессирующих антиапоптотический белок Вс1-2, что может свидетельствовать об увеличении продолжительности жизни оставшейся минимальной популяции этих клеток.

Апробация результатов исследования

Диссертационная работа апробирована 24 декабря 2012 года на заседании проблемной комиссии «Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения; ТКМ; миело- и лимфопролиферативные заболевания; опухоли лимфатической системы; патология красной крови; ИТП; порфирии)» ФГБУ «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Основные положения работы доложены на Международной гематологической школе «Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования» (Москва, 2011) и на Международном симпозиуме «Острые лейкозы XIII. Биология и терапия» (Мюнхен, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Выводы

1. Показано, что на момент диагностики острых лейкозов выявляются грубые нарушения баланса экспрессии белков-регуляторов апоптоза и пролиферации в различных клеточных популяциях, которые полностью не восстанавливаются после индукционной химиотерапии.

2. Доказано, что на момент диагностики острого лейкоза в костном мозге преобладают СЭ34+ клетки, экспрессирующие антиапоптотический белок Вс1-2, а в периферической крови выявлено значимое снижение количества СЭ34+ клеток, экспрессирующих проапоптотические белки Вах, р53 и АПФ, по сравнению со здоровыми донорами.

3. Определено, что у здоровых доноров содержание СЭ34+ клеток, экспрессирующих Вс1-2, Вах, р53 и АПФ, значительно выше в периферической крови. При острых лейкозах эти показатели в костном мозге и в периферической крови идентичны.

4. Установлено, что количество Т-клеток в костном мозге и периферической крови у больных острыми лейкозами на всех этапах индукционной химиотерапии существенно не отличается от значений в контрольной группе, но содержание Т-клеток, экспрессирующих проапоптотические белки Вах и р53, в периферической крови значимо превышает показатели у доноров.

5. Показано, что после цитостатического воздействия у больных острыми миелоидными лейкозами существенно уменьшается количество В-лимфоцитов в костном мозге и периферической крови, сопровождаемое значительным увеличением доли В-клеток, экспрессирующих проапоптотические белки Вах, СБ95 и р53.

6. Установлено, что на момент диагностики острых лейкозов число гранулоцитов костного мозга и периферической крови, экспрессирующих антиапоптотический белок Вс1-2, существенно превышает значения контрольной группы. На 36-38-й день от начала химиотерапии количество этих клеток достигает значений показателей у здоровых доноров.

Заключение

Совершенно очевидно, что апоптоз играет важную роль в процессе нормального гемопоэза. Механизмы регуляции апоптоза представляют собой сложнейший молекулярный каскад, нарушение которого ведет к развитию многих заболеваний системы крови, в том числе и гемобластозов. Для большинства препаратов, применяемых при интенсивном лечении ОЛ, индукция апоптоза является основным направлением их действия. Это показано, в частности, для таких препаратов, как антиметаболиты (цитозар, 6-тиогуанин, метотрексат), ингибиторы топоизомеразы (этопозид, тенипозид), антрациклины (рубомицин, даунорубицин) и родственные им препараты (адриамицин, митоксантрон) [130]. Такими же свойствами обладают и ретиноиды. Эта группа препаратов используется в качестве средств, вызывающих дифференцировку и апоптоз опухолевых клеток, при лечении некоторых гематологических заболеваний, в частности при остром промиелоцитарном лейкозе [86, 135]. Таким образом, именно возможность опухолевой клетки подвергнуться апоптозу во многом определяет ее химиочувствительность. Ключевую роль в регуляции апоптоза играют такие белки, как С095, Вс1-2 и Вах, которые участвуют в каскадах «рецепторного» и «митохондриального» сигнальных путей. Также очень важным звеном в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза является транскрипционный белок р53.

В исследование по изучению экспресии маркеров апоптоза включены 23 больных с ОЛ. Оценка экспрессии исследуемых маркеров апоптоза выполнена на всех клеточных популяциях в ПК и КМ у больных ОЛ в период индукционной ХТ, а также в группе здоровых доноров костного мозга.

В исследовании выявлены значимые отличия в экспрессии маркеров апоптоза на разных популяциях клеток (СБ34+ клетки, гранулоциты, Т- и В-лимфоциты) как у больных ОЛ в течение индукционного курса ХТ по сравнению с контрольной группой, так и между больными ОМЛ и ОЛЛ.

Так, у больных О Л в начале заболевания в СБ34+ бластных клетках была определена статистически значимо высокая экспрессия антиапоптотического белка Вс1-2 в КМ и низкая экспрессия проапоптотических белков р53, Вах и АПФ в ПК. Эти данные позволяют предположить, что при ОЛ в СБ34+ активированы пути защиты от апоптоза. Также необходимо отметить, что у больных О Л СИ 34+ клетки КМ и ПК на момент диагностики практически не отличались по экспрессии Вс1-2 и Вах. А у здоровых доноров СЭ34+ клетки, выходящие в циркуляцию, в отличие от С034+ локализованных в КМ, статистически значимо больше экспрессировали эти белки (р < 0.005). Выявленные нами изменения свидетельствует о том, что при ОЛ рециркулирующие и локализованные в КМ СБ34+ бластные клетки имеют сходные биологические характеристики. Также были выявлены значимые отличия в экспрессии исследуемых белков межу больными ОМЛ и ОЛЛ в течение индукционной ХТ. На 36-38-й день от начала ХТ нами не выявлено существенных отличий в экспрессии СЭ95, Вс1-2, Вах между больными ОЛ и контрольной группой, что вероятно обусловлено достижением ремиссии заболевания.

В нашем исследовании выявлены значимые отличия между больными ОЛ и контрольной группой в экспрессии маркеров апоптоза, участвующих в регуляции «митохондриального» пути, в СБЗ+ клетках. Так, в начале заболевания у больных ОЛ выявлен высокий процент Т-лимфоцитов, экспрессирующих белок Вс1-2. На 36-38-й день от начала ХТ отмечено снижение экспрессии белка Вс1-2 в СБЗ+ клетках у больных ОЛ практически до значений контрольной группы. Высокий уровень экспрессии Вс1-2 в Т-лимфоцитах у больных ОЛ в начале заболевания свидетельствует о том, что эти клетки защищены от апоптоза. В то же время у больных ОЛ экспрессия проапоптотического белка Вах была выше по сравнению с контрольной группой как в начале заболевания, так и после индукционной ХТ. Нами определена низкая экспрессия (менее 5% клеток) белка р53 в Т-лимфоцитах как у больных О Л, так и в контрольной группе. Однако у больных О Л его экспрессия в ПК была статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой как в начале заболевания, так и после индукционного курса ХТ. Таким образом, можно предположить, что у больных ОЛ в Т-клетках активированы сигнальные пути, регулирующие апоптоз.

Аналогично данным литературы, в нашем исследовании процент нейтрофилов у больных ОЛ в начале заболевания был значимо ниже по сравнению с контрольной группой, на 36-38-й день от начала ХТ отмечено его увеличение практически до значений здоровых доноров костного мозга. Как в КМ, так и в ПК была выявлена статистически значимо большая экспрессия Вс1-2 в нейтрофилах у больных ОЛ в начале заболевания по сравнению с контрольной группой. На 36-38-й день от начала ХТ у больных ОЛ отмечено значительное снижение экспрессии Вс1-2, однако значений контрольной группы достигнуто не было. Нами не выявлено существенных отличий в экспрессии Вах, СЭ95 и р53 в СБ 13+ клетках между больными ОЛ и контрольной группой. Вероятно, наблюдаемая защита гранулоцитов от апоптоза связана с тем, что в условиях нейтропении необходимо увеличить продолжительность жизни индивидуальных клеток.

Как указывалось ранее, анализ экспрессии белков апоптоза на В-лимфоцитах был выполнен только у больных ОМЛ. Как в начале заболевания, так и после индукционной ХТ выявлена статистически значимо высокая экспрессия белка Вс1-2 в СБ 19+ клетках КМ у больных ОМЛ по сравнению с контрольной группой. Необходимо отметить, что нами не выявлено существенных изменений количества С019+/Вс1-2+ клеток в течение индукционного курса ХТ. Экспрессия белков Вах и СЭ95 у больных ОМЛ в начале заболевания и в контрольной группе была практически одинаковой. После индукционной ХТ отмечено статистически значимое увеличение экспрессии этих белков, которая была выше по сравнению с контрольной группой. Эти данные свидетельствуют об активации апоптоза в СБ 19+ клетках после цитостатического воздействия, что подтверждается низким процентом этих клеток у больных ОМЛ на 36-38-й день исследования. Экспрессия р53 у больных ОМЛ в начале заболевания была выше по сравнению с контрольной группой, а после индукционной ХТ отмечено дальнейшее ее увеличение.

Полученные нами данные свидетельствуют, что у больных ОЛ существует дисбаланс про- и антиапототических белков-регуляторов во всех популяциях клеток КМ и ПК. Учитывая небольшое число исследуемых больных и достижение ремиссии у 19 пациентов из 23, определить прогностическую значимость экспрессии исследуемых белков на течение заболевания не представляется возможным. Но выявленные нами изменения свидетельствуют о необходимости проведения дальнейших исследований в этой области.