Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Фармакологический анализ производных флуоренкарбоновой и α-оксифлуоренкарбоновой кислот

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВА Екатерина Евгеньевна

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОИЗВОДНЫХ ФЛУОРЕНКАРБОНОВОЙ

И

а-ОКСИФЛУОРЕНКАРБОНОВОЙ КИСЛОТ 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 5 Ш 2015

Санкт-Петербург 2015

005570492

005570492

Работа выполнена в отделе нейрофармакологии имени C.B. Аничкова Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Институт экспериментальной медицины»

Научный руководитель:

доктор биологических наук Хныченко Людмила Константиновна

Официальные оппоненты:

Петров Александр Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства», заведующий лабораторией психофармакологии.

Воробьева Виктория Владимировна, доктор медицинских наук. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой фармакологии.

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 29 сентября 2015 г. в_часов на заседании диссертационного совета

Д 215.002.07 на базе ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С М. Кирова» (194044, Санкт-Петербург, улица Академика Лебедева, д. 6, Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ, WWW.vmeda.spb.ru и ВАК РФ Министерства образования и науки РФ www.vak.ed.gov.ru

Автореферат диссертации разослан «_»_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор

Богомолов Борис Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Известно, что эмоциональные или аффективные расстройства, и прежде всего депрессия, дезорганизуют приспособительное поведение и являются тяжелым заболеванием, распространяющимся более чем на 12 % населения экономически развитых стран (Смулевич А.Б., 2000; Стрекалова Т.В., Сеспульо Р., Ковальзон В.М., 2008). Представляя собой серьезную медико-социальную проблему, депрессивные расстройства относятся к основным источникам неблагополучия и нетрудоспособности человека (Немерофф Ч.Б., Келси Дж.Э., 2007). По прогнозам эта мультифакторнальная патология к 2020 г может занять 2 место после ишемической болезни сердца (Корнетов Н А., 2002).

Современная тактика лечения тревожно-депрессивных состояний не полностью удовлетворяет потребности практической медицины, поскольку многие применяемые в клинике антидепрессанты и анксиолитики оказывают значительные побочные эффекты, возникновение которых является причиной отмены лечения и, как следствие, несостоятельности терапии (Коррабл Э., Пюх А., 1993; Crawford А.А., Lewis S., Nutt D., Peters T.J, 2014). Так, трициклические антидепрессанты (амитриптилнн) и анксиолитики бензодиазепиновой группы наряду с сильным психотропным эффектом оказывают выраженное периферическое холинолитическое действие, проявляющееся множеством нежелательных побочных эффектов: слабостью, дневной сонливостью, головокружением, тошнотой, головной болью, сухостью во рту, синдромом «сухого глаза», нарушением аккомодации, сердцебиениями, кардиалгией, парестезиями и болями в конечностях, задержкой мочеиспускания и дефекации (Машковский М.Д., 1998; Крылов С.С. и соавт., 1999; Вейн A.M. и соавт., 2002; Crawford А.А. et al., 2013).

Поскольку патогенез современных тревожно-депрессивных нарушений имеет тенденцию к изменению, усложнению, полиморфизму и сочетаемости вследствие интенсификации современного ритма жизни, приводящей к физическому и психическому перенапряжению организма, необходимость в разработке новых антидепрессивных и противотревожных лекарственных препаратов, характеризующихся более высокой эффективностью и переносимостью, для фармакологической коррекции возникающих расстройств не теряет своей актуальности.

В процессе изыскания новых атидепрессивных и противотревожных лекарственных средств, с учетом современных представлений о патогенезе аффективных расстройств, наше внимание привлекли соединения совершенно нового класса -производные флуоренкарбоновой и а-оксифлуоренкарбоновой кислот, оказывающие М-холиноблокирующее действие. Их разработка, синтез и доклинические исследования ведутся в отделе нейрофармакологии имени C.B. Аничкова ФГБНУ «ИЭМ». Экспериментально установлено, что М-холшюблокаторы оказывают стойкое антидепрессивное действие, изменяя синаптическую пластичность (Лосев Н А., 1987; DrevetsW.C., Zarate С.А., Furey M.L., 2012). Важным обстоятельством является и то, что проявляя выраженное психотропное действие, соединения этого класса лишены побочных периферических холинолнтических эффектов. Поэтому поиск препаратов с антидепресивной и противотревожной активностью перспективен среди производных флуоренкарбоновой и а-оксифлуоренкарбоновой кислот.

Степень разработанности темы

Соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391, проявляющие антидепрессивный, анксиолитический, снотворный эффекты и характеризующиеся отсутствием выраженного периферического антихолинергического действия, ранее не были описаны ни в одном литературном источнике. Выявленные фармакологические свойства позволяют предполагать, что новые соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 могут найти применение в комплексной терапии депрессивных расстройств.

Цель работы - исследовать антидепрессивную и анксиолитическую активность аналогов амизила, производных флуоренкарбоновой и а-оксифлуоренкарбоновой кислот -соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 при моделировании депрессивно - тревожного состояния у грызунов.

Задачи исследования:

1. Определить «острую» токсичность производных флуоренкарбоновой и а-оксифлуоренкарбоновой кислот - соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391.

2. Провести сравнительный анализ зависимости фармакологической активности (М-холинолитического, антидепрессивного, противотревожного, снотворного эффектов) соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 от их химического строения.

3. Исследовать влияние соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на эмоциональную реактивность, двигательную активность, исследовательскую способность и память животных в тестах «открытое поле» и «условная реакция пассивного избегания» с использованием препаратов сравнения (амитриптилина и диазепама).

4. Оценить антидепрессивную активность соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на резерпиновой модели депрессии в тесте Порсолта с использованием препаратов сравнения.

5. Исследовать противотревожное (анксиолитическое) действие соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» с использованием препаратов сравнения.

6. Оценить участие моноаминов в механизме противотревожного и антидепрессивного эффектов соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 с учетом патофизиологических особенностей развития депрессивных состояний.

Научная новизна исследования

В работе впервые на модели депрессивного состояния исследованы фармакологические свойства аналогов амизила - производных флуоренкарбоновой и а-оксифлуоренкарбоновой кислот (ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391) в сопоставлении с известными и широко используемыми в клинической практике антидепрессантом амитриптилином и транквилизатором диазепамом.

Установлено, что аналоги амизила являются низко токсичными соединениями (ЛД50 ИЭМ-1524 и амизила находятся в одном диапазоне доз, тогда как ЛД50 ИЭМ-1391 в 3,75 раза выше, чем у амизила). Отсутствие скрытых признаков токсического действия подтверждено и результатами гистологического исследования ткани печени при хроническом внутрибрюшинном введении тестируемых производных в дозах, оказывающих максимальный анксиолитический эффект.

Показано, что тестируемые соединения в высоких дозах (80-100 мг/кг для ИЭМ-1524 и 200-400 мг/кг для ИЭМ-1391) проявляют выраженную снотворную активность, сопоставимую с таковой у эталонного препарата сравнения (барбамил).

При исследовании локомоторной и вегетотропной активности в тесте «открытое поле» выявлено, что соединение ИЭМ-1524 оказывает преимущественно седативное действие с вегетостабилизирующим и миорелаксирующим эффектами, тогда как соединение ИЭМ-1391 - стимулирующее, усиливая двигательную активность экспериментальных животных.

Показано, что курсовое (30 дней) введение соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 не нарушает выработку «условной реакции пассивного избегания», а напротив, улучшает процессы формирования памятного следа.

У животных с моделированной депрессией в тесте Порсолта и в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» установлено, что соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 наряду с центральным мускариновым холиноблокирующим (М-

холиноблокирующим) действием, проявляют выраженную антидепрессивную и анксиолитическую активность.

На основании нейрохимических изменений в структурах головного мозга при моделировании депрессивного состояния показано, что антидепрессивная и противотревожная активность соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 коррелирует с изменением баланса моноаминов (дофамина, норадреналина и серотонина) в сгриатуме и гипоталамусе грызунов.

Научно-практическая ценность работы

Результаты сравнительного исследования новых аналогов амизила - производных флуоренкарбоновой и а-оксифлуоренкарбоновой кислот - позволили впервые обнаружить, что соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 могут рассматриваться как перспективные средства патогенетической терапии при развитии депрессивноподобных состояний.

Методология и методы исследования

Методология исследования заключалась в фармакологическом анализе поведения грызунов (крыс и мышей), включая оценку антидепрессивных и анксиолитических эффектов аналогов амизила - производных флуоренкарбоновой и а-оксифлуоренкарбоновой кислот. Исследование поведения включало ряд тестов («открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт», тест Порсолта, «условная реакция пассивного избегания»), В качестве препаратов сравнения использованы антидепрессант амитриптилин и транквилизатор диазепам. В исследование также входила токсикологическая оценка соединений с использованием пробит-анализа, расчета ЛД50 и ЕД50, морфологического изучения ткани печени и слизистой оболочки желудка, исследования уровня моноаминов в головном мозге грызунов с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектором. Работа выполнена с соблюдением всех правил доказательной медицины.

Положения, выносимые на защиту:

1. ИЭМ-1524 - низко токсичное соединение. При однократном введении в диапазоне доз от 3 до 80 мг/кг проявляет анксиолитическое (противотревожное), седативное, миорелаксирующее действие, а в более высоких дозах (80-100 мг/кг) - снотворный эффект. Центральная М-холинолитическая активность вещества ИЭМ-1524 преобладает над периферическими М-холинолитическими реакциями

2. Соединение ИЭМ-1391 является транквилизатором с широким терапевтическим диапазоном доз и низкой токсичностью. В дозах от 5 до 200 мг/кг при однократном введении активирует ЦНС и проявляет анксиолитические свойства, а в более высоких (200-400 мг/кг) - обладает снотворным эффектом.

3. Курсовое введение соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 оказывает анксиолитическое и антидепрессивное действия, сопоставимые по выраженности эффектов с таковыми у препаратов сравнения (амитриптилин, диазепам); стимулирует исследовательскую активность у грызунов; а также вызывает изменение локомоторной активности (седативный эффект для ИЭМ-1524 и стимуляция общей двигательной активности для ИЭМ-1391).

4. Антидепрессивный и противотревожный эффекты соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 не только обусловлены блокадой мускарнновых холинорецепторов, но и связаны с коррекцией таких патофизиологических механизмов депрессии и тревоги, как нарушение баланса моноаминов (дофамина норадреналина и серотонина) в структурах головного мозга (стриатум, гипоталамус). При этом соединение ИЭМ-1524 в большей степени вовлечено в процессы серотошшергической и норадренергической передачи, а ИЭМ-1391 - дофаминергнческой.

Степень достоверности результатов исследования и сделанных на их основе выводов определяется большим количеством наблюдений на 850 крысах и 1256 мышах; формированием групп сравнения; использованием современных методов оценки поведения животных; морфологических изменений в ткани печени; биохимических изменений в головном мозге; корректностью статистической обработки полученных данных в сочетании с их анализом.

Реализация результатов исследования

Работа выполнена в соответствии с плановыми научно-исследовательскими разработками ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедры фармакологии Российской военно-медицинской академии им. С.М. Кирова Министерства обороны РФ, кафедры фармакологии Новгородского государственного университета им. Ярослава Мудрого. По результатам исследования получен патент на изобретете № 2535027 (Антидепрессивное средство. Дата публикации: 10.12.2014. Официальный бюлл. Изобретения. Полезные модели № 34, ФИПС, Москва-2014).

Личный вклад автора

Автором проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, самостоятельно выполнены экспериментальные фармакологические исследования. Вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены и обсуждены на 3-ем Всероссийском научно-практическом семинаре молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011 ); Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011); 4-ом съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); 2-ой Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2013); Всероссийской научной конференции с международным участием «Фармакологическая нейропротекция», посвященной 90-летию Отдела нейрофармакологии НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2013); Всероссийской конференции с международным участием «Инновации в фармакологии: от теории к практике», посвященной 90-летию со дня рождения академика АМН СССР A.B. Вальдмана (Санкт-Петербург, 2014).

Апробация диссертации прошла на заседании отдела нейрофармакологии им. акад. C.B. Аничкова ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН 09 декабря 2014 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых журналах, рекомендованных перечнем ВАК, и патент № 2535027.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 7 рисунков и состоит из следующих разделов. «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов», «Выводы». Список цитируемой литературы включает 149 источников, из них 70 отечественных и 79 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные животные и условия их содержания. Опыты выполнены на 1256 самцах белых беспородных мышей массой 18-27 г и 850 крысах - самцах породы Вистар массой 180-200 г, полученных из питомника «Рапполово». До начала эксперимента животные содержались в условиях вивария на стандартном сбалансированном рационе со свободным доступом к воде при 12 часовом световом дне с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997).

В таблицах 1 и 2 представлены: химическое название, структурные формулы, лабораторный шифр аналогов амизила и препаратов сравнения; дозы, путь введения в зависимости от объекта исследования.

Таблица 1

Основные сведения (химическое название, структурные формулы, лабораторный шифр) аналогов амизила и препаратов сравнения

Химическое название Структурная формула Вещество

Гидрохлорид 2 — (диэтиламино)-этилового эфира бензиловой кислоты 9, но—с—« сг-с амизил

Гидрохлорид 2- (диэтиламино)-этилового эфира 9-гидрокси-9-Н флуоренкарбоновой кислоты 1-\ рн V /—СН, Г~\ Т -СН, ИЭМ-1524

Гидрохлорид 4- (этилпиперазин-1-ил) - амида 9-гидрокси-9-Н флуоренкарбоновой кислоты I /н—^ ff \ о ^— на ИЭМ-1391

5-(3-Диметиламинопропилиден)-10,11- дигидродибензоциклогептен 0,1 амитриптилин

7-хлоро-1-метил-5-фенил-1,3- дигидро-2Н-1,4-бензодиазепин- 2-он НЛ XXJ диазепам

Таблица 2

Дозы, путь введения соединений ИЭМ-1524, ИЭМ-1391 и препаратов сравнения в зависимости от объекта исследования__

№ Вещество Путь введения Объект Доза, мг/кг

п/п исследования

1 ИЭМ-1524 внутрибрюшинно мыши 19

крысы 9

2 ИЭМ-1391 внутрибрюшинно мыши 22

крысы 10

3 амитриптилин внутрибрюшинно мыши 2

крысы 1

4 диазепам внутрибрюшинно мыши 1

крысы 0,5

Острую токсичность ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 определяли на мышах. С помощью метода пробит-анализа Блисса-Прозоровского были произведены расчеты ЛД50. ЕД5о и средней ошибки, на основании чего построены графики «кривая доза-эффект» и определены максимально эффективные дозы тестируемых соединений в отношении анксиолитического эффекта (Прозоровский В.Б., 2007). Для выявления возможных отсроченных эффектов новых аналогов амизила проводили курсовое (30 дней) введение ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на двух видах животных (белые мыши, крысы породы Вистар).

Модель ареколинового тремора (Раевский К.С., Наркевич В.Б., 2000). Исследуемые вещества (ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391) вводили мышам внутрибрюшинно однократно в дозах: 1мг/кг, 5мг/кг, 10мг/кг, 25мг/кг или 50 мг/кг за 20 минут до введения М-холиномиметика ареколина. Доза ареколина, при которой у 100% животных возникает ареколиновый тремор, составляла 15 мг/кг. Растворы тестируемых веществ вводили в одном и том же объеме из расчета 0,2 мл на 20 г массы животного. Контрольная группа мышей получала физиологический раствор и ареколин внутрибрюшинно. Время наблюдения составляло 30 мин после инъекции. Гиперкинезы оценивали визуально по интенсивности и длительности. Кроме тремора (центральное М-холиномиметическое действие ареколина) оценивали интенсивность саливации (периферический эффект). Во всех опытах учитывали количество летальных исходов. Были определены дозы препаратов, полностью предупреждающие возникновение ареколинового тремора, максимально неэффективные дозы и несколько промежуточных доз. В качестве препаратов сравнения использовали диазепам, амитриптилин, амизил, метамизил.

Модель никотиновых судорог. Соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391, вводили мышам внутрибрюшинно однократно за 20 мин до введения центрального Н-холиномиметика никотина. Никотин использовали в дозе 14 мг/кг, при которой никотиновые судороги возникают у 100% мышей. Время наблюдения составляло 15 мин после инъекции. Гиперкинезы оценивали визуально по интенсивности, длительности судорог и количеству летальных исходов. О выраженности и характере центрального холинергического действия судили по степени ингибиции или потенциации судорог, вызванных введением никотина. В качестве препаратов сравнения использовали диазепам, амитриптилин, амизил, метамизил.

Миорелаксирующую активность оценивали с помощью теста удерживания на перевернутой сетчатой платформе и теста бокового положения (Воронина Т А., Неробкова Л.Н., 2000).

Снотворный эффект соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 изучали на 150 белых мышах-самцах с помощью методики оценки гипнотического эффекта по боковому положению животных. При введении высоких доз веществ, вызывающих гипнотическое состояние, животные некоторое время после введения вещества остаются в неудобной позе на спине или на боку, которая и обозначается как наличие бокового положения (Воронина Т А., Неробкова Л.Н., 2000). Определяли длительность бокового положения животных и ЕД50 препаратов. Снотворное действие тестируемых соединений сравнивали с эффектом барбамила.

Методы исследования поведенческих реакций животных

Опыты проводили в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Миронов А.Н., Бунатян Н.Д. и соавт., 2012) на крысах-самцах породы Вистар массой 180-200 г. Для экспериментов отбирали животных, проявляющих средний уровень спонтанной двигательной активности в тесте «открытое поле». В каждом тесте специфическую активность или совокупность поведенческих показателей изучали на 60 животных, которых делили на 6 групп. Первую группу составляли интактные животные. Крысам второй (контрольной) группы ежедневно в течение 30 дней внутрибрюшинно вводили физиологический раствор, третьей и четвертой - соединение ИЭМ-1524 или ИЭМ-1391 в дозах 9 мг/кг и 10 мг/кг соответственно. Животным пятой и шестой групп внутрибрюшинно вводили один из препаратов сравнения - амитриптилин или диазепам. На 30-й, 31-й дни хронического введения соединений проводили тестирование («открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт», «условная реакция пассивного избегания» или тест Порсолта). В Тесте «открытое поле» в модификации «Real Timer» арена, используемая нами, представляла собой круглую площадку, диаметром 92 см и боковыми стенками высотой 41 см. Пол площадки был расчерчен на 18 одинаковых секторов, расположенных в три ряда. За единицу перемещения принимали один пересеченный сектор. На пересечении секторов имелись небольшие округлые отверстия. Площадка равномерно освещалась источником света. Горизонтальную двигательную активность грызунов регистрировали на периферии, в наружных 2/з арены и в ее центре. Помимо горизонтальной локомоторной активности регистрировали вертикальную двигательную активность (представленную двумя видами стоек: с опорой передними лапами на стенку и без нее); груминг; обследование (обнюхивание) отверстий (норок) как показатель исследовательской способности и уровень дефекации, который считается индексом эмоциональности животного (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П., 1991; Holl C.S., 1936). Параллельно отмечали наличие замираний животного как показатель крайней степени тревожности и эмоционального напряжения.

Резерпиновая модель депрессии. На 30-й день курсового введения соедннешш ИЭМ-1524, ИЭМ-1391 или препаратов сравнения создавали модель экспериментальной депрессии. Крысам экспериментальных групп через 1 час после введения тестируемых соединений внутрибрюшинно вводили резерпин в дозе 4 мг/кг (Андреева, Н И., 2000). При появлении признаков депрессивного поведения (гипокинезия, блефароптоз, гипотермия), максимально развивающихся через 4 часа после инъекции раствора резерпина, оценивали степень депрессивности с помощью теста Порсолта. Тест Порсолта. При плавании в ограниченном пространстве, из которого невозможно выбраться, после начального периода активных попыток крысы резко снижают двигательную активность и зависают в воде в характерной позе. Стадия неподвижности (иммобнлыюсти) в тесте интерпретируется как депрессивноподобное состояние (Молодавкин и др., 2005; Миронов А.Н. и соавт., 2012; Porsolt et al„ 1978). Через 4 часа после введения резерпина, крысу помещали в сосуд (диаметром 30-40 см и глубиной 60 см, который заполнялся водой с температурой 25°С), где она плавала в течение 15 мин. Затем животное вынимали, высушивали и помещали в домашние клетки. Для оценки

выраженности депрессивноподобного состояния регистрировали время иммобильности и количество замираний.

Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ). В работе был использован лабиринт, состоящий из двух открытых и двух закрытых рукавов, расположенных крестообразно и приподнятых над полом на 50 см. Ширина рукавов составляла 10 см, высота стенок в закрытых рукавах- 45 см. Сверху все рукава были открыты. В месте перпендикулярного пересечения рукавов находилась площадка размером 10x10 см, на которую сажали тестируемую крысу. Поведение животных регистрировали в течение 5 мин и оценивали следующие параметры: количество заходов в открытые и закрытые рукава, время нахождения в открытых и закрытых рукавах. Анксиолитический эффект препарата оценивался по числу заходов в светлые рукава и времени нахождения в них, без увеличения общего числа заходов (Воронина Т.А., Середенин С Б., 2000). Тест «условная реакция пассивного избегания» (УРШ1) вырабатывали на основе однократного электрокожного подкрепления в установке, состоящей из двух камер -большой (освещенной) и малой (темной) с электрифицированным полом, сообщающихся между собой круглым отверстием. При обучении каждое экспериментальное животное помещалось на 3 мин в середину освещенной камеры так, чтобы хвост был направлен к отверстию в темную камеру. Крысы исследовали камеру, находили отверстие в темную и проникали в нее. Регистрировали латентный период захождения животного в темную камеру. В конце третьей минуты на электродный пол темной камеры подавали электрический ток (50 Гц, 6 мА), заставляющий крысу перебегать в освещенную камеру, откуда ее удаляли. Воспроизведение УРПИ определяли через 24 часа. Для этого крысу помещали в установку на 3 мин. Регистрировали тот же параметр, что и при обучении. В случае если крыса не заходила в темную камеру, то это расценивали как воспроизведение навыка пассивного избегания, а если уменьшался промежуток времени нахождения в освещенной камере - как амнезию навыка.

Биохимические методы исследования. Содержание моноаминов и их метаболитов в структурах головного мозга крыс определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектором (ВЭЖХ). После декапитации животных, на льду извлекали мозг и выделяли из него структуры (стриатум, гипоталамус). Ткань мозга хранили в холодильнике при -70°С до последующего анализа. Перед анализом пробы гомогенизировали с помощью прибора УЗДН-2Т, центрифугировали в течение 10 минут с добавлением 50 мкл хлорной кислоты (0,1 М). В надосадочной жидкости определяли концентрацию норадреналина (НА), дофамина (ДА), серотонина (5-ОТ) и метаболитов 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) на хроматографе Beckman System Gold с аналитической колонкой Phenomenex (Ci8, 250 х4,6 мм, 5мкм) и амперометрическим детектором LC-4B BAS. Определите концентрации исследуемых веществ проводили при потенциале +0,75 В. Подвижная фаза состояла из 0,02 M цитратно-фосфагного буфера (рН=3,5); 0,002 M №2ЭДТА; 0,006 % октилсульфата натрия; 6,5% ацегонитрила при скорости потока 1,0 мл/мин. Аналитическое время пробега пробы в' хроматотрафической колонке составляло 18 мин. Идентификацию и чистоту хроматографических пиков, а также их количественную оценку осуществляли по отношению к пикам, полученным от внешних стандартов.

Морфологический анализ ткани печени. Для гистологического исследования кусочки печени фиксировали в растворе Буэна (пикриновая кислота 1,2% - 15 мл; формалин 40% -5 мл; уксусная кислота - 1 мл) и проводили через хлороформ с последующей заливкой в парафин. Серийные срезы окрашивали гематоксилином-эозином и просматривали под световым микроскопом.

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ проводили с использованием дисперсионного анализа two-way ANOVA test. Различия между значениями при р<0.05 считали статистически значимыми. В таблицах и графиках

результаты экспериментов представлены в виде М+ т, где: М - среднее арифметическое, m - среднеквадратичная ошибка среднего арифметического.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Определение токсичности соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391

Острую токсичность определяли на 560 белых мышах-самцах массой 18-27 г. Каждая доза препарата испытана на 10 животных. Соединение ИЭМ-1524 при однократном введении исследовали в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг, 150 мг/кг, 200 мг/кг, 250 мг/кг, 300 мг/кг, а соединение ИЭМ-1391 - в дозах 200 мг/кг, 400 мг/кг, 600 мг/кг, 800 мг/кг, 1000 мг/кг, 1200 мг/кг. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор в равном объеме.

Наблюдение за поведением и состоянием подопытных животных проводили в течение 14 суток Ежедневно отмечали изменение внешнего вида, поведенческих реакций и количество погибших животных.

Результаты токсикологических тестов показали, что в группе животных, получавших соединение ИЭМ-1524 в дозе 50 мг/кг, смертность отсутствовала, а в дозах 100 - 300 мг/кг летальность варьировала в пределах 20-100 %. Максимальное число погибших мышей (100%) зарегистрировано при введении ИЭМ-1524 в дозе 300 мг/кг.

Внутрибрюшинные инъекции соединения ИЭМ-1391 в дозе 200 мг/кг не приводили к летальным исходам, тогда как в дозах 400-1200 мг/кг гибель животных в испытуемых группах достигала 40-100%. Стопроцентная летальность зарегистрирована у мышей, которым вводили ИЭМ-1391 в дозе 1200 мг/кг.

Используя показатели гибели экспериментальных мышей, рассчитали ЛД50 для соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 методом пробит-анализа Блисса-Прозоровского (Прозоровский В.Б., 2007) по формуле: Y=A+BX, где X - аргумент (место дозы), Y -функция (пробит), А - исходная точка на оси процентов против дозы 1, В - коэффициент пропорциональности. Чтобы определить среднее отклонение для ЛД50 - рассчитывали ЛД84 и ЛД|6, а затем по формуле: s = (DL84 - DLi6): 2 VN-K где N - количество животных, участвовавших в опыте, получали величину среднего отклонения.

Установлено, что ЛД50 для ИЭМ-1524 составила 145±9,9 мг/кг; а ЛД50 для ИЭМ-1391 - 476±44мг/кг На основании полученных данных построены графики «кривая доза-эффект» (рисунки 1, 2). Гаусообразная кривая частоты гибели животных, представленная на рисунках, свидетельствует о нормальном распределении показателей летальности.

Рис. 1. Острая токсичность соединения ИЭМ- Рис. 2. Острая токсичность соединения ИЭМ-1524 1391

Поданным литературы ЛД50 амизила - 127,5±8,5 (Лосев НА., 1987). Проведенные токсикологические исследования показали, что ЛД50 соединения ИЭМ-1524 (145±9,9 мг/кг) и амизила находятся в одном диапазоне, тогда как токсичность ИЭМ-1391 в 3,75 раза ниже, чем у амизила.

Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 являются низко токсичными химическими соединениями.

В следующей серии опытов исследовали аналоги амизила (ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391) при однократном внутрибрюшинном введении в нескольких дозировках: 1, 3, 5, 10, 20, 25, 50, 60, 70, 80, 90, 100 мг/кг (ИЭМ-1524) и 1, 3, 5, 10, 20, 25, 50, 60, 80, 100, 200, 400 мг/кг (ИЭМ-1391). Каждую дозу испытывали не менее чем на 10 мышах. Оценивали общее состояние, поведение, интенсивность и характер двигательной активности, тонус скелетных мышц, количество и консистенцию фекальных масс, частоту мочеиспускания, а также уровень тревожности животных в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт».

Установлено, что максимальные проявления седативного и анксиолитического эффектов (снижение двигательной активности, редукция замираний, груминговых реакций и сокращение числа актов дефекации как показателей повышенной тревожности) наблюдались при введении соединения ИЭМ-1524 в диапазоне доз: 10-20 мг/кг; а в дозе 25 мг/кг появлялась выраженная миорелаксация, которая затрудняла оценку противотревожного эффекта. Введение соединения ИЭМ-1524 в дозе 80 мг/кг оказывало на мышей выраженное снотворное действие. С увеличением дозы до 90 мг/кг у мышей появлялись рризнаки токсического действия препарата: беспокойство, значительное увеличение частоты сердечных сокращений и дыхательных движений, тремор. При инъекциях ИЭМ-1524 в дозе 100 мг/кг отмечалась выраженная миорелаксация вплоть до мышечной атонии, у 20% животных развивались спонтанные клонико-тонические судороги, вызывающие гибель. Поэтому дозы 100 мг/кг и выше (для соединения ИЭМ-1524) интерпретированы нами как токсические.

В тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт» на мышах установлено, что инъекции соединения ИЭМ-1391 в дозе 5 мг/кг способствовали повышению общей двигательной активности и улучшению показателей исследования норок, стабилизации вегетативного дисбаланса как критериев снижения тревожности. Максимальный анксиолитический эффект у мышей отмечался нами при введении соединения ИЭМ-1391 в диапазоне доз: 20-25 мг/кг. С увеличением дозы наблюдалось дальнейшее нарастание общей двигательной активности, которая при достижении дозы 100 мг/кг переходила в двигательное возбуждение типа поисковой реакции, сопровождающееся значительным учащением дыхания, что затрудняло оценку транквилизирующего действия исследуемого вещества. При увеличении дозы ИЭМ-1391 до 200 мг/кг фаза двигательной активности у мышей сменялась ослаблением мышечного тонуса и переходом в длительный сон. Внутрибрюшинное введение мышам соединения ИЭМ-1391 в дозе 400 мг/кг и выше приводило к изменениям в организме животных по типу токсических реакций (беспокойство, значительное увеличение частоты сердечных сокращений и частоты дыхательных движений, тремор и выраженная миорелаксация), летальность составляла 40%.

Таким образом, в проведенном исследовании выявлено, что соединения ИЭМ-1524 (в дозах 10-20 мг/кг) и ИЭМ-1391 (20-25 мг/кг) оказывают выраженное анксиолитическое действие. С увеличением дозы до 80 мг/кг (ИЭМ-1524) и 200 мг/кг (ИЭМ-1391) исследуемые соединения проявляют снотворный эффект. Кроме того, результаты, полученные в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт», свидетельствуют о наличии у соединения ИЭМ-1524 седативного, а у ИЭМ-1391 -стимулирующего эффектов.

Следующим этапом скринингового исследования являлся анализ противотревожного эффекта тестируемых соединений в диапазоне доз 10-20 мг/кг (для ИЭМ-1524) и 20-25 мг/кг (для ИЭМ-1391) с разницей между двумя соседними дозами в 1 мг/кг. Через 20 минут после однократного внутрибрюшинного введения изучаемых соединений в каждой дозе, мыши проходили тестирование в «приподнятом крестообразном лабиринте». Результаты тестирования показали, что доза, при которой максимально выражено анксиолитическое, седативное, вегсто стабилизирующее и миорелаксирующее действия для вещества ИЭМ-1524, составляет 19 мг/кг при внутрибрюшинном введении. Максимальный анксиолнтический эффект соединения ИЭМ-1391 отмечался при введении его в дозе - 22 мг/кг.

С целью выявления возможных отсроченных нежелательных реакций оценивали общее состояние, локомоторный и эмоциональный статус, уровень тревожности в тестах «открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт» на двух видах животных (белые мыши, крысы породы Вистар) и гистологическую картину ткани печени мышей после курсового (30 дней) введения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391. Полученные данные не выявили видимых признаков токсического воздействия веществ ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на организм экспериментальных животных. Результаты морфологического анализа ткани печени мышей после курсового внутрибрюшинного введения ИЭМ-1524 или ИЭМ-1391 в дозах 19 мг/кг и 22 мг/кг соответственно, также подтверждают низкую токсичность этих соединений.

Исследование центральных и периферических М-холиноблокирующих свойств ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на модели ареколинового гиперкинеза

Оценивали противоареколиновый эффект аналогов амизила - соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 и препаратов сравнения в дозах: 1мг/кг, 5. мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг и 25 мг/кг. Тестируемые соединения и препараты сравнения вводили внутрибрюшинно за 20 минут до инъекции М-холиномиметика ареколина (15 мг/кг).

В контрольных опытах у мышей после внутрибрюшинного введения М-холиномиметика ареколина наблюдался выраженный тремор, наступающий спустя 1-1,5 мин и продолжающийся в течение 4-5 мин (центральный эффект ареколина). Одновременно отмечалась усиленная саливация, слезотечение, мочеиспускание и дефекация (периферические эффекты).

Инъекция амизила в дозе 5 мг/кг предупреждала развитие тремора и гиперсаливации, вызываемых введением ареколина, а при введении соединения ИЭМ-1524 (5 мг/кг) тремор отсутствовал, но гиперсаливация сохранялась. Этот факт свидетельствует о том, что у вещества ИЭМ-1524 центральные М-холинолитические эффекты превалируют над периферическими, в то время как амизил проявляет равные по силе холинолитического действия центральный и периферический эффекты.

М-холинолитические свойства препарата сравнения амитриптилина выражены в значительно меньшей степени, по сравнению с амизилом и его новыми аналогами. При этом важно отметить, что на фоне введения амитриптилина (5 мг/кг) блокада периферических мускариновых рецепторов наступает гораздо раньше, чем блокада центральных. Полученные результаты свидетельствуют о превалировании у амитриптилина периферического над центральным эффектом, что увеличивает вероятность развития побочного действия при его применении. В отличие от амитриптилина, амизил, метамизнл и ИЭМ-1391 проявляют равное М-холинолитическое действие по отношению к центральным и периферическим холинорецепторам, тогда как у соединения ИЭМ-1524 (5 мг/кг) центральный М-холиноблокирующий эффект превосходит его периферическую активность.

На фоне предварительного введения соединения ИЭМ-1391 в дозе 25 мг/кг ареколиновый тремор и гиперсаливация полностью блокировались.

Полученные результаты позволяют заключить, что М-холинолитические свойства амизила и ИЭМ-1524 по силе холинолитического эффекта сопоставимы между собой, тогда как соединение ИЭМ-1391, по сравнению с ними, проявляет более слабое М-холинолитическое действие. Известно, что определяющим в развитии М-холиноблокирующих свойств амизила является гидроксил в a-положении в кислотной части его молекулы у углерода (Крылов С.С., 1956; Денисенко П.П., 1965; Аничков C.B., 1974; Лосев H.A., 1987). Помимо этого, существуют данные, свидетельствующие о том, что в формировании М-холиноблокирующей активности важная роль отводится наличию метальных радикалов в a-положении относительно азота в молекуле амизила (Денисенко П.П., 1961). Соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 имеют в своей структуре, как гидроксил в a-положении у углерода в кислотной части молекулы, так и метальные радикалы в а-положении относительно азота, в связи с чем, вероятно, их М-холиноблокирующие свойства изменяются незначительно, по сравнению с амизилом. Выраженная центральная М-холинолитическая активность наряду с более низким периферическим М-холинолитическим действием у соединения ИЭМ-1524, по сравнению с амитриптилином, выгодно отличает его от широко применяемого трициклического антидепрессанта.

Влияние соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на никотиновый гиперкинез

В настоящей серии экспериментов оценивали влияние ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на выраженность и характер центрального Н-холинергического эффекта по степени ингибиции или потенциации судорог у мышей, вызываемых внутрибрюшинным введением никотина (14 мг/кг). Результаты исследования показали, что предварительное введение соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 в дозах 1; 5 или 10 мг/кг приводило к усилению интенсивности никотиновых судорог. Статистически значимого увеличения длительности судорог у животных, получавших ИЭМ-1524, не выявлено. Инъекции соединения ИЭМ-1391 в дозе 10 мг/кг, напротив, способствовали достоверному уменьшению длительности судорог. Данный факт, возможно, связан с увеличением числа летальных исходов у животных, выявленным в эксперименте, что, в свою очередь, обуславливает уменьшите суммарной длительности судорог в исследуемых группах. Однозначно трактовать причину летальных исходов у мышей данной группы не представляется возможным, однако, можно предположить наличие у соединения ИЭМ-1391 потенцирующего эффекта к Н-холиномиметику никотину.

Длительность и интенсивность никотиновых судорог у животных, которым вводили амизил в дозе 10 мг/кг, достоверно увеличивалась по сравнению с животными, получавшими амизил в дозе 5 мг/кг. Это подтверждает наличие у центрального М-холиноблокатора амизила потенцирующего действия к Н-холиномиметикам. Предварительные инъекции препарата сравнения диазепама приводили к снижению интенсивности никотиновых судорог по сравнению с контрольной группой животных. Однако, на фоне выраженного миорелаксирующего эффекта, вызванного введением диазепама, длительность судорог возрастала. Полученные результаты не противоречат данным литературы, которые свидетельствуют, что диазепам не проявляет выраженной противосудорожной активности к никотину при наличии у него антагонизма по отношению к коразолу (Вихляев Ю.И., Клыгуль Т.А., 1968).

Инъекции амитриптилина увеличивали у животных длительность судорог, не изменяя при этом их структуры (тонико-клонические) и интенсивности, что также указывает на усиление Н-холиномиметических процессов. Известно, что трицикпические антидепрессанты могут быть включены в политерапию пациентов с депрессией или иными психическими и вегетативными феноменами на фоне длительно существующей повышенной судорожной активности (эпилептического и неэпилептического генеза) (Вышковский Г Л., 2007; Silver J.M., Hales R.E., Yudofsky S C., 1990). Выявленная нами способность амитриптилина к потенциации судорог должна быть принята во внимание в

случае назначения этого антидепрессанта пациентам с судорожной готовностью и эпилепсией.

Анализ снотворного эффекта соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391

В результате проведенных исследований установлено, что у животных, которым вводили ИЭМ-1524 (10-100 мг/кг), ■ наблюдалось снижение мышечного тонуса, сменяющееся боковым положением животного (в дозе 80 мг/кг и выше), указывающее на снотворный эффект соединения (таблица 3). Длительность бокового положения зависела от дозы вещества и составляла от 20 до 30 минут. Иной характер наступления снотворного эффекта наблюдался на фоне применения соединения ИЭМ-1391. После введения снотворных доз вещества (200-400 мг/кг) у животных быстро нарастала двигательная активность, постепенно приобретающая характер стереотипных движений, после чего мыши принимали боковое положение.

Таблица 3

Снотворный эффект соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 у мышей

ИЭМ-1524 ИЭМ-1391

доза вещества (мг/кг) латентный период бокового положения (мин) поведение животных доза вещества (мг/кг) латентный период бокового положения (мин) поведение животных

10 легкая миорелаксация, снижение активности 10 активны

15 — умеренная миорелаксация 50 — избыточная активность

25 — умеренная миорелаксация 100 — двигательное возбуждение

50 выраженная миорелаксация 200 15±1.72 боковое положение с закрытыми глазами в течение 20-30 мин

80 10±2,36 выраженная миорелаксация, боковое положение до 20 мин, глаза открыты 300 15±2,79 боковое положение с закрытыми глазами в течение 1-2 час

100 10±1,П выраженная миорелаксация. боковое положение до 30 мин, глаза открыты 400 10±2,56 боковое положение с закрытыми глазами в течение 1,5-2,5 час

Примечания: п -10

Сравнительная оценка снотворного эффекта соединения ИЭМ-1391 и барбамила в снотворных дозах не выявила принципиальных различий в их эффектах. Так, при переходе в боковое положение глаза у животных были закрыты, дыхание ровное, также как и на фоне применения барбамила. Кроме того, как и при введении барбамила, наблюдался периодический тремор конечностей, постепенно исчезающий по мере углубления сна. Сон длился в зависимости от дозы ИЭМ-1391 от 20 мин до нескольких часов.

Снотворный эффект соединения ИЭМ-1524 или ИЭМ-1391 сопоставим с таковым у эталонного препарата сравнения - барбамила. Вместе с тем, величина дозы, при которой

соединение ИЭМ-1391 проявляет равный (по продолжительности) снотворный эффект, в 2,4 раза больше, чем у барбамила, но его токсичность в 2,5 раза меньше.

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что соединения ИЭМ-1524 (80-100 мг/кг) и ИЭМ-1391 (200-400 мг/кг) оказывают выраженный снотворный эффект, в отличие от амизила, который в высоких дозах значительно повышает двигательную активность экспериментальных животных и проявляет галлюциногенное действие при его применении у пациентов в клинике (Денисенко П.П., 1965; Машковский М.Д., 1998; Шабанов П.Д., 2013).

Из нескольких десятков синтетических аналогов амизила, синтезированных в отделе нейрофармакологии Института экспериментальной медицины, только ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 проявили снотворный эффект, который, по-видимому, обусловлен жесткой фиксацией фенильных радикалов в молекулах данных соединений.

Исследование поведенческих эффектов соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391

В настоящем разделе оценивали поведенческие реакции экспериментальных животных (крыс) в тестах «открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт», «условная реакция пассивного избегания» и в тесте Порсолта после курсового (30 дней) внутрибрюшинного введения соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391.

Тест «открытое поле»

Результаты проведенного исследования (таблица 4) показали, что у животных, которые получали соединение ИЭМ-1524, снижается горизонтальная двигательная активность. Об этом свидетельствует достоверное уменьшение числа пересеченных квадратов в наружном секторе поля (в 2 раза по сравнению с интактными и на 37 % по сравнению с контрольными крысами, получавшими физиологический раствор). Наблюдаемое снижение двигательной активности в наружной трети поля наряду с ее увеличением в центре арены, по сравнению с контрольными и интактными животными (на 30% и 15% соответственно), и неизменными показателями активности в средней трети поля указывает на наличие анксиолитического эффекта у соединения ИЭМ-1524. Кроме того, отмечено снижение вертикальной локомоторной активности (уменьшение числа стоек с опорой на 25% по сравнению с интактными животными). Совокупное снижение горизонтальной и вертикальной двигательной активности свидетельствует о седативном эффекте соединения ИЭМ-1524.

Горизонтальная и вертикальная локомоторная активность после курсового введения соединения ИЭМ-1391 усиливалась. Об этом свидетельствует увеличение количества пересеченных квадратов в наружном секторе открытого поля (на 37% по сравнению с контрольной группой и на 20% - с интактной). На фоне введения этого соединения у крыс также наблюдалось увеличение числа стоек обоего вида: без опоры на стенку (на 34%, по сравнению с интактными и контрольными показателями) и с опорой на нее (на 45%, по сравнению с показателями контрольной группы). Отмеченные изменения в поведении животных свидетельствуют о стимулирующем эффекте ИЭМ-1391 на двигательную активность. В случае применения амитриптилина и диазепама двигательная реакция близка к таковой у животных контрольной группы.

Следует отметить, что в тесте «открытое поле» курсовые инъекции соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 предупреждали возникновение таких проявлений повышенной тревожности, как замирания, имеющие место у животных контрольной и интактной групп. Полученные данные позволяют предположить, что тестируемые аналоги амизила оказывают антидепрессивное и анксиолитическое действие.

Влияние ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на общую эмоциональность и вегетативный статус животных проявляется редукцией актов дЪфекации (в 2 и 8 раз у ИЭМ-1391 и ИЭМ-1524 соответственно) и груминговых реакций (на 39% и 92% у ИЭМ-1391 и ИЭМ-1524 соответственно), по сравнению с контрольными крысами, проявляющими повышенную тревожность.

На исследовательскую активность крыс новые аналоги амизила оказывают стимулирующее действие, повышая число обследованных норок на 30% и 35% для ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 соответственно, относительно интактных животных, и на 42% и 48% для ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 соответственно, относительно контрольных. В связи с этим, можно заключить, что ИЭМ-1391 проявляет общее стимулирующее, а ИЭМ-1524 общее депримирующее действие, не оказывая при этом отрицательного воздействия на исследовательскую способность животных. Наличие депримируюшего эффекта является основополагающим для препаратов, применяемых для лечения разного рода психозов и перспективным для снятия тревожных и депрессивных эпизодов (Вышковский Г Л., 2007).

Таблица 4

Влияние соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391, на поведение крыс в тесте «открытое поле»

Группы животных

Показатели интактные контрольные (физиологический раствор) ИЭМ-1524 9 мг/кг амитриптилин 1 мг/кг ИЭМ-1391 10 мг/кг диазепам 0.5 мг/кг

Количество 1.5 ± 1.18 0,8±0,79 0.1 ±0.32 0.4 ± 0.67а 0,4 ± 0.44а 0.3±1.06а

актов дефекации а,Ь

число замираний 0,5 ±0,85 0,4±0,52 0 0 0 0

Число 31.3 ±11,2 24,4±11,25 15,3 ±10,4а 29,5 ±9,86 38,2 ± 10,12 36,1±11,3

пересеченных Ь

секторов в

наружной трети

поля

Число 2.8 ± 1,55 3,9±2.47 3,4 ± 2.4 3,5 ± 2,46 5,7 ± 1,85а 5,2±2,04а

пересеченных

секторов в

средней трети

поля

Число 1,7 ± 1,16 1,4±0.84 2 ± 1,41 1,1 ±0,32 2,2 ± 1,1 2,6±1,56

пересеченных

секторов в

центре поля

Число стоек без 2,5 ± 1.51 2,6±1,78 2,4 ± 3,03 2,2 ± 3,05 3,9 ± 2,06 2,97±3,25

опоры на стенку

Число стоек с 8 ± 3.37 5,5±3,81 6,4 ±4,55 7,8 ± 5,09 7,9 ±4,15 9,56±4,28

опорой

Обнюхивание 5,4 ±4,62 4,4±3,69 7,6±2.95Ь 4,8 ±4,31 8,4 ± 2,73Ь 6.76±3,54

норок

Груминг 1,3 ± 1.42 0,7±1,06 0,1 ± 0.32а 0,8 ± 1,03 0,9 ±0.17 0

Примечание: а- различия достоверны по сравнению с ишактшлми животными при р<0,05; Ь- различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05, п-10.

Оценка антидепрессивной активности соединении ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391

В настоящей серии экспериментов исследовали влияние соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391, в сопоставлении с препаратами сравнения (амитриптилин, диазепам), на депрессивноподобное поведение, обусловленное внутрибрюшинным введением резерпина. Из данных, представленных в таблице 5, видно, что инъекции крысам соединения ИЭМ-1524 (9 мг/кг) оказывают выраженный антидепрессивный эффект. Дисперсионный анализ показал, что число замираний в тесте Порсолта у крыс, получавших резерпин на фоне предварительного введения соединения ИЭМ-1524, в 3,5 раза ниже числа замираний у крыс с резерпиновой депрессией (контрольные). Кроме того,

в проведенном исследовании установлено, что число замираний у животных на фоне введения ИЭМ-1524 в 2,4 раза ниже, чем у крыс, получавших амитриптилин (1 мг/кг), и в 2 раза ниже по сравнению с животными, получавшими диазепам (0,5 мг/кг).

В меньшей степени, но аналогичные тенденции наблюдались и в группе животных, которые получали соединение ИЭМ-1391. Внутрибрюшинное введение ИЭМ-1391 (10 мг/кг) вызывало снижение депрессивности до уровня, наблюдаемого у интактных животных.

Таблица 5

Антидепрессивная активность соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 в тесте Порсолта у крыс

Группы животных

I 2 3 4 5 6

Показатели Интакт- Контроль- ИЭМ-1524 Амитрипти- ИЭМ-1391 Диазепам

ные ные 9 мг/кг лин 10 мг/кг 0,5 мг/кг

(физиологи- + 1 мг/кг + +

ческим раствор) резерпин 4 мг/кг + резерпин резерпин 4 мг/кг резерпин 4 мг/кг

+ 4 мг/кг

резерпин 4 мг/кг

Количество 6.8±ЗД6 9,2±4,42 2,6±1,35 6,2±5,2Ь 7,7±3,94 4,4±3,95 а,Ь

замирании. а, Ь, с, е

ед.

Длительность 22.12±4Л6 26,75± 17.04 2,85±1,49 6±5,43а, Ь, е 15,9± 12,95 10,5±9,66

им мобиль- а, Ь, с, (!, е а,Ь а,Ь

ности, сек

Примечание; а- различия достоверны по сравнению с интактиыми животными при р<0,05; Ь- различия достоверны по сравнению с контрольной группой при р<0,05; с- различия достоверны по сравнению с животными, получавшими амитриптилин при р<0,05; А- различия достоверны по сравнению с животными, получавшими диазепам при р<0,05; е - различия достоверны по сравнению с животными, получавшими ИЭМ-1391 при р<0,05, п=10.

Таким образом, результаты изучения антидепрессивной активности с помощью резерпиновой модели депрессии и теста Порсолта показали, что для соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 характерно наличие антидепрессивных свойств, причем ИЭМ-1524 оказывает выраженное антидепрессивное действие, превышающее таковое у амитриптилина и диазепама.

Оценка аиксиолитической (противотревожной) активности соединений ИЭМ-1524 и

ИЭМ-1391

Результаты экспериментов в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» показали, что у животных при курсовом введении соединения ИЭМ-1524 увеличивалось количество заходов в «открытые» рукава на 78% и возрастала продолжительность пребывания в них в 2,4 раза по сравнению с крысами, получавшими физиологический раствор (рисунки 3, 4). Наблюдаемые изменения указывают на снижение уровня тревожности. Инъекции соединения ИЭМ-1391 (группа 5) оказывали на грызунов анксиолитическое действие, проявляющееся увеличением числа заходов в «открытые» рукава и длительностью пребывания в них (в 2 раза), по сравнению с аналогичными показателями у контрольных животных (группа 2). Следует отметить, что в исследованных дозах выраженность противотревожного эффекта соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 сопоставима с таковым у диазепама и амитриптилина. На основании полученных результатов можно заключить, что соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 проявляют выраженную анксиолитическую активность.

Проведенные исследования показали, что соединения - ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 проявляют противотревожные и антидепрессивные свойства, различающиеся по степени

проявления. Следует отметить, что вектор свойств зависит преимущественно от структуры введенного радикала. Так, установлено, что соединение ИЭМ-1524, представляющее собой трициклическую структуру с добавочным линейным радикалом и близкое по строению к трициклическим антидепрессантам (два бензольных кольца, соединенных семичленным бензольным кольцом), при хроническом введении оказывает седативное (тест «открытое поле») и выраженное антидепрессивное действие (резерпиновая модель депрессии, тест Порсолта), превышающее антидепрессивный эффект амитршггилина. Соединение ИЭМ-1391, имеющее радикал с замкнутым пиперазиновым циклом, который приближается по химическому строению к циклической структуре бензодиазепиновых транквилизаторов (бензольное кольцо, соединенное с семичленным гетероциклическим кольцом, содержащим, как и пиперазиновый цикл, два атома азота), в большей степени проявляет противотревожные свойства.

| | время в открытых рукавах

время в закрытых рукавах

Рис. 3. Влияние соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391,

амитриптилина и

диазепама на время, проведенное крысами в открытых и закрытых рукавах в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контрольной группой

животных при р<0,05, п=10.

интактные контрольные ИЭМ-1524 ИЭМ-1391 амитилтилни диазепам

ЛЩ количество заходов в открытые рукава количество заходов в закрытые рукава

Рис. 4. Влияние соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391,

амитриптилина и

диазепама на количество заходов крыс в открытые и закрытые рукава в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с контрольной группой

животных при р<0,05, п=10.

интактные контрольные ИЭМ-1524 ИЭМ-1391

Таким образом, можно заключить, что сходство химической структуры соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 с М-холиноблокатором амизилом обуславливает их центральную мускариновую холинолитическую активность, а сходство с препаратами из групп трициклических антидепрессантов и бензодиазепиновых транквилизаторов обуславливает проявление выраженных антидепрессивных и анксиолитических свойств.

Исследование влияния соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на память у крыс

Модель УРПИ позволяет оценить влияние новых веществ на формирование кратковременной памяти и процесса консолидации, а также на сохранение и воспроизведение из долговременной памяти выработанного навыка пассивного избегания (McLaren I P., Mackintosh N.J., 2002).

Дисперсионный анализ показал, что во всех тестируемых группах промежуток времени, проведенного крысами в светлой камере при воспроизведении навыка, продолжительнее, чем при обучении (рисунок 5). При этом на фоне введения соединений ИЭМ-1524, ИЭМ-1391 или диазепама у 100% животных, участвовавших в тесте, было достигнуто абсолютное воспроизведение навыка пассивного избегания (т.е. незахождение в темную камеру на второй день эксперимента). В то же время, у крыс после курсового введения амириптилина воспроизведение навыка не изменяется, по сравнению с показателями у контрольных животных (9 из 10 крыс воспроизводят навык пассивного избегания).

время, проведенное в светлой камере при обучении

время, проведенное в светлой камере при воспроизведении

IJJII

Рис. 5. Влияние соединений ИЭМ-1524, ИЭМ-1391,

амитриптилина и

диазепама на

воспроизведение условной реакции

пассивного избегания у крыс

Примечание: различия

достоверны по сравнению с показателями при обучении при

р<0,05, п=10.

интактные

амитриптилин дказепам

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что инъекции (в течение 30 дней) соединений ИЭМ-1524 или ИЭМ-1391 не нарушают выработку УРПИ (т.е. не оказывают отрицательного воздействия на память животных) Это является еще одним преимуществом новых аналогов амизила при их возможном применении в терапии аффективных расстройств.

Влияние соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на изменение уровня моноаминов в структурах головного мозга крыс

Известно, что развитие депрессии является результатом нарушения совокупной деятельности различных отделов головного мозга и сопровождается нарушением метаболизма моноаминов (Пайн Д.С., Гран Д., Горман Д.М., 2007: Fibiger Н.С., 1995; Randrap А., Braestrxip С., 1997; Mathew S.J.. Manji Н.К., Chamey D.S., 2008). Поскольку соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 проявляют выраженное влияние на эмоциональную, локомоторную и вегетативную сферы поведения, правомерно предположить их участие в нейрорегуляторных механизмах физиологических и патологических процессов, протекающих в ЦНС. В связи с этим было исследовано влияние соединений ИЭМ-1524. ИЭМ-1391 на изменение содержания моноаминов в стриатуме и гипоталамусе депрессивных крыс, подвергнутых принудительному плаванию в тесте Порсолта (рисунки 6,7).

10

нг/мг ткани

Рис. 6. Изменение содержания моноаминов в стриатуме мозга крыс (нг/мг ткани), получавших соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на фоне резерпиновой модели депрессии

Группы животных: 1 - интактные; 2 - контрольные (ф.р.+ резерпин); 3 - ИЭМ-1524+ резерпин; 4 - ИЭМ-1391+ резерпин; 5 — амитриптилин+ резерпин; 6 - диазепам+ резерпин

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с интактной группой животных при р<0,05; ** -различия достоверны по сравнению с контрольной группой животных при р<0.05; *А* - различия достоверны по сравнению с группой животных, получавших диазепам при р<0,05; **** - различия достоверны по сравнению с группой животных, получавших амитрилтилин при р<0,05, п-10

2 ; нг/мг ткани

****

Рис. 7. Изменение содержания моноаминов в гипоталамусе мозга крыс (нг/мг ткани), получавших соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 на фоне резерпиновой модели депрессии

Группы животных: 1 - интактные; 2 - контрольные (ф.р.+ резерпин); 3 - ИЭМ-1524+ резерпин; 4 - ИЭМ-1391+ резерпин; 5 - амитриптилин+ резерпин; 6 - диазепам+ резерпин

Примечание: * - различия достоверны по сравнению с интактной группой животных при р<0,05; ** -различия достоверны по сравнению с контрольной группой животных при р<0.05: *** - различия достоверны по сравнению с группой животных, получавших диазепам при р<0.05 ; **** - различия достоверны по сравнению с группой животных, получавших амитригттилин при р<0,05, п=10.

Из результатов, представленных на рисунках (6, 7), видно, что в контрольной группе крыс, прошедших тест Порсолта, отмечалось существенное снижение содержания НА, ДОФУК, ДА, 5ГИУК и 5-ОТ в стриатуме (рис. 6) и НА, ДА, 5ГИУК и 5-ОТ в гипоталамусе (рис. 7), по сравнению с животными интакгной группы. Снижение уровня моноаминов в совокупности с повышением соотношений ДОФУК/ДА и 5ГИУК/5-ОТ, наблюдаемое нами при введении резерпина, свидетельствует о выраженном депрессивном действии резерпина и об эффективности избранной нами фармакологической модели депрессии. В этих условиях предварительные инъекции холинолитиков ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 предупреждали снижение уровня моноаминов и их метаболитов, по сравнению с группой животных, которым вводили только резерпин. Так, при терапии соединением ИЭМ-1524 уровень НА, ДА, 5ГИУК и 5-ОТ (стриатум) и ДА, 5ГИУК и 5-ОТ (гипоталамус) оказался достоверно выше, по сравнению с контрольной группой крыс, не получавших лечение. Предварительные инъекции ИЭМ-1391 предупреждали снижение уровня НА, ДА, 5-ОТ в стриатуме и ДА, 5-ОТ в гипоталамусе.

В группе животных, которым вводили препарат сравнения амитриптилин (классический неселективный блокатор обратного захвата моноаминов), содержание НА, ДОФУК, ДА, 5-ОТ в стриатуме и ДА, 5-ОТ в гипоталамусе не отличалось от значений, наблюдаемых у интактных крыс. В гипоталамусе крыс, получавших диазепам, только содержание норадреналина не отличалось от интактных значений; в стриатуме уровень НА, ДА, 5ГИУК оставался таким же низким как у депрессивных животных.

Анализ соотношения биогенных аминов к их метаболитам показал, что при внутрибрюшинном введении резерпина усиливается метаболизм серотонина. Об этом свидетельствует увеличение уровня метаболитов серотонина (превращение 5-ОТ в 5ГИУК, ДА в ДОФУК) и снижение превращения ДА в ГВК. В этих условиях введение соединения ИЭМ-1524 приводит к восстановлению соотношения 5ГИУК/5-ОТ до уровня контрольных животных, тогда как соотношение ДОФУК/ДА в большей степени восстанавливается на фоне введения трициклического антидепрессанта амитриптилина и соединения ИЭМ-1391. Соответственно, отношение ДОФУК/ДА в большей мере снижалось при хроническом введении соединения ИЭМ-1391 и амитриптилина (Рис.6). В то же время уровень метаболита ДОФУК (3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты) увеличивался при введении соединения ИЭМ-1391 или диазепама в большей степени, чем на фоне применения соединения ИЭМ-1524 или амитриптилина.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что инъекции соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 предупреждают снижение содержания моноаминов и их метаболитов в стриатуме и гипоталамусе, вызванное введением резерпина. Интересно отметить, что наблюдаемые нейрохимические изменения (устранение дефицита серотонина и стабилизация содержания дофамина и норадреналина) коррелируют с выявленной нами высокой антидепрессивной активностью соединения ИЭМ-1524 и умеренной антидепрессивной активностью соединения ИЭМ-1391. Основываясь на данных хроматографического исследования (изменение показателей дофаминергического, норадренергического и серотонинергического звеньев депрессивного процесса под влиянием хронического введения новых аналогов амизила), можно предположить, что анксиолитический эффект соединения ИЭМ-1391 связан с оптимизацией уровня моноаминов в стриатуме и гипоталамусе. При этом соединение ИЭМ-1391 в большей мере, чем соединение ИЭМ-1524, вовлечено в процессы дофаминергической передачи и в меньшей мере - серотонинергической. Соединение ИЭМ-1524, как установлено, принимает участие в процессах нормализации уровня серотонина и норадреналина у

подвергнутых депрессии крыс, с чем, возможно, и связан его антидепрессивный эффект.

***

Таким образом, на основании проведенного исследования можно заключить, что производные флуоренкарбоновой и а-оксифлуоренкарбоновой кислоты оказывают

выраженное антндепресеивное и противотревожное действие. Установлено, что соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 являются низко токсичными, не оказывают отрицательного воздействия на память, а в высоких дозах обладают снотворным эффектом и имеют меньшую выраженность периферических побочных реакций по сравнению с широко применяемыми трициклическими антидепрессантами и бензодиазепиновыми транквилизаторами. Полученные результаты свидетельствуют, что соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 являются перспективными для дальнейшей разработки в качестве средств терапии депрессивных и тревожных расстройств.

Практические рекомендации:

1. Производные флуоренкарбоновой и а-оксифлуоренкарбоновой кислот рекомендуются для дальнейшего изучения с целью применения в терапии тревожно-депрессивных состояний (ИЭМ-1524 как антидепрессивное средство с седативным, противотревожным, миорелаксирующим и вегетостабилизирующим действием, а ИЭМ-1391 в качестве анксиолитика, не имеющего угнетающего воздействия на двигательную и эмоциональную сферу).

2. Соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 могут быть заявлены как фармакологические средства с выраженным снотворным действием.

3. Способность амитриптилина к потенциации судорог необходимо учитывать при назначении этого антидепрессанта пациентам с депрессивными расстройствами на фоне длительно существующей повышенной судорожной активности (эпилептического и неэпилептического генеза), поскольку это может отрицательно сказаться на течении основного заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Среди производных флуоренкарбоновой и а-оксифлуоренкарбоновой кислот выявляются высокоактивные и низко токсичные соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391, которые оказывают выраженное антидепрессивное и противотревожное действие в классических поведенческих тестах на грызунах (мыши, крысы).

2. Центральное М-холиноблокирующее действие соединения ИЭМ-1524 преобладает над его периферической активностью, что обуславливает меньшее число побочных холинолитических эффектов по сравнению с трициклическим антидепрессантом амитриптилином.

3. Для соединения ИЭМ-1524 в большей степени характерно седативное, вегетостабилизирующее, умеренное миорелаксирующее действие с одновременным повышением исследовательской активности.

4. ИЭМ-1391, в отличие от соединения ИЭМ-1524, умеренно стимулирует двигательную и исследовательскую активность со снижением эмоциональности животных.

5. Соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391, в отличие от их структурного аналога амизила, в высоких дозах проявляют выраженный снотворный эффект, который, по-видимому, связан со структурными особенностями их молекулы (жесткой фиксацией фенильных радикалов).

6. Соединения ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 при курсовом введении (30 дней) не нарушают процессы сохранения памятного следа, что значительно отличает их от бензодиазепиновых транквилизаторов.

7. Предполагаемым механизмом антидепрессивной и противотревожной активности соединений ИЭМ-1524 и ИЭМ-1391 является устранение дисбаланса моноаминов (дофамина, норадреналина и серотонина) в структурах головного мозга (стриатум, гипоталамус) по типу замедления обмена дофамина и усиления обмена серотонина.

Работы, опубликованные по теме диссертации

Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК:

1. Яковлева, Е.Е. Влияние диазепама и амитриптилина на ареколиновый и никотиновый гиперкинезы у мышей / Е.Е. Яковлева // Вестн. Волгоградского гос. мед. ун-та. -

2011.-Прил.-С. 90-93.

2. Хныченко, Л.К. Новое свойство Н-холинолитика бензогексония / Л.К. Хныченко, И В. Окуневич, H.A. Лосев, Н.С. Сапронов, Е.Е. Яковлева // Бюл. эксперим. биологии и медицины'. - 2012. - Т. 153, № 4. - С. 477-479.

3. Яковлева, Е.Е. Нейробиологические механизмы депрессивных расстройств и их фармакотерапия / Е.Е.Яковлева, Л.К.Хныченко, Н.А.Лосев // Обзоры по клин, фармакологии и лекарств, терапии. - 2013. - T.l 1, № 3. - С. 20-25.

4. Лосев, H.A. Антидепрессивное средство. Патент на изобретение № RU 2 535 027 С2 / H.A. Лосев, Е.Е. Яковлева, Л.К. Хныченко, Н.С. Сапронов, П.Д. Шабанов // Бюл. Изобретения. Полезные модели. - 2014. - № 34. - С. 1-11.

Публикации в других изданиях:

5. Яковлева, Е.Е. Холинотропные эффекты амитриптилина и диазепама / Е.Е. Яковлева // Мед. акад. журн. - 2012. - Т. 11. - С. 64.

6. Яковлева, Е.Е. Изучение новых производных амизила / Е.Е. Яковлева // Матер. IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии». Тез. докл. -

2012. - М. : Фолиум. - С. 206.

7. Яковлева, Е.Е. Влияние нового производного флуоренкарбоновой кислоты на изменение уровня моноаминов и их метаболитов в головном мозге крыс / Е.Е. Яковлева, Е.Р. Бычков, М.Ю. Зенько, Л.К. Хныченко // Обзоры по клин, фармакологии и лекарств, терапии. - 2013. - Т. 11, Спецвыпуск. - С. 158-159.

8. Яковлева, Е.Е. Антидепрессивная активность нового центрального мускаринового холиноблокатора / Е.Е. Яковлева, H.A. Лосев, Л.К. Хныченко // Обозрение психиатрии и мед. психологии. - 2014. - Прил. - С. 205.

Список использованных сокращений

АХ — ацетилхолин, БД - бензодиазепины,

БТ - бензодиазепиновые транквилизаторы,

ВЭЖХ/ЭД - высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимическим

детектированием,

ГВК - гомованилиновая кислота,

ДА - дофамин,

ДОФА - дигидроксифенилаланин, ДОФУК -3,4-диоксифенилуксусная кислота,

ЕД50 -доза вводимого вещества, оказывающего эффект в 50% случаев, ЛД5(Г- доза вещества, вызывающая гибель половины животных, ЛП - латентный период, НА - норадреналин,

СИОЗС - селективные ингибиторы обратного захвата серотонина,

ТЦА - трициклические антидепрессанты,

ЦНС - центральная нервная система,

5- ГИУК - 5-гидрокси-З-индолуксусная кислота,

5- ОТ — 5-окситриптамин (серотонин).

Подписано в печать 22.06.15 Формат 60x84/16

Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 493

Типография ВМедА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.