Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Эффективность защитного действия L-теанина и гипоксической гипоксии при ишемии головного мозга крыс

На правах рукописи

Зухурова Мавджуда Ашуровна

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ Ь-ТЕАНИНА И ГИПОКСИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ ПРИ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

14.03.03. - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 1 2 МАЙ 2011

2011

4845200

Работа выполнена на кафедре патофизиологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор медицинских наук, профессор

Власов Тимур Дмитриевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор

Васильев Андрей Глебович

доктор медицинских наук, профессор Дергунов Анатолий Владимирович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Научно-иследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

Защита диссертации состоится 20 мая 2011 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д.208.090.03 Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (197089, г. Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, 6/8).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан «_» апреля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессоВ.Ф. Митрейкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Сердечно-сосудистые заболевания занимают ведущее место в структуре общей заболеваемости и смертности в России и во всем мире (Levi et al, 2002). При этом цереброваскулярная патология является ведущей причиной инвали-дизации населения (Гусев Е.И., 2003). В 2005 г. в мире инсульт был причиной 5,7 млн смертельных исходов, прогнозируется рост смертности от инсульта до 6,7 млн в 2015 г, если не будут предприняты активные глобальные меры по борьбе с этой «эпидемией» (Culebras F., 2007). Главным средством борьбы с развивающимся поражением головного мозга при ишемическом инсульте служит реперфузия - восстановление кровотока в ишемизированном участке. Однако, повреждение ткани головного мозга не ограничивается временем ишемии. Ишемия мозга запускает целый каскад реакций, связанных с активацией глутаматной и аспартатной эксайтотоксичности, свободнорадикальным повреждением и другими механизмами (Choi D.W., Rothan S.M., 1990; Won S.J. et al., 2002; Liu Z. et al., 2010). Показано, что при окклюзии средней мозговой артерии у крыс уже через 15 минут в области гипоталамуса и гиппокампа резко повышается уровень глутамата, достигая пика через 1 час после начала ишемии (Не M. et al., 2003). Поэтому поиск механизмов защиты головного мозга от ишемического и реперфузионного повреждения является важнейшей задачей. Существует ряд методик, позволяющих снизить ишемическое-реперфузионное повреждение. Одной из наиболее эффективных является ишемическое прекон-диционирование головного мозга (Kitagawa К. et al., 1990), которое существенно снижает размер повреждения и выраженность функциональных нарушений. Важным стимулом, имеющим сходные с ишемией механизмы повреждения клеток, является гипоксия, в связи с чем, кратковременные гипоксические воздействия на ткани, в том числе и на головной мозг могут быть отдельным направлением прекондиционирования (Семенов Д. Г. и соавт., 2004; Sharp F. et al., 2004).

Еще одним способом защиты мозга от ишемического и реперфузионного повреждения является применение субстанций, в том числе фармакологических веществ. Перспективным в этой области нейропротектором может быть L-теанин - аминокислота, содержащаяся в зеленом чае (Ekborg-Ott К.Н. et al., 1997). L-теанин по структуре похож на возбуждающий нейротрансмиттер -глутаминовую кислоту, и может выступать антагонистом глутаматных рецепторов, что по мнению ряда авторов и связано с его нейропротективным дейсти-вием (Maruyama M. Takeda К. , 1994; Kakuda T., 2002). Однако работ, посвященных исследованию действия L-теанина при ишемии головного мозга крайне мало, кроме того, механизмы его действия не до конца изучены, в частности, взаимодействие теанина с разными подтипами глутаматных рецепторов. Кроме того, неизученным вопросом является эффективность сочеганного воз-

действия Ь-теанина и гипоксического прекондиционирования, с учетом их различных механизмов действия.

Таким образом, исследование нейропротективного действия гипоксии и введения Ь-теанина является весьма актуальным, и может быть основанием для дальнейшей разработки способов защиты головного мозга от ишемического и реперфузионного повреждения.

Цель исследования

Изучить механизмы защиты головного мозга от ишемического-реперфузионного повреждения с помощью применения Ь-теанина и гипокси-ческой гипоксии как самостоятельных факторов и при их сочетании.

Задачи исследования

1. Усовершенствовать методику воспроизведения ишемии головного мозга крысы и отработать оптимальные критерии оценки повреждения с помощью морфологических и функциональных методов на разных сроках после восстановления кровотока.

2. Определить влияние гипоксической гипоксии на степень защиты головного мозга крысы при экспериментальной ишемии головного мозга.

3. Изучить зависимость эффективности Ь-теанина от дозы и времени введения.

4. Исследовать механизмы нейропротективного действия Ь-теанина при ишемическом и реперфузионном повреждении головного мозга крысы.

5. Оценить возможность взаимного потенцирования гипоксического и фармакологического (Ь-теанин) прекондиционирования головного мозга крысы.

Научная новизна

Впервые показано, что Ь-теанин и гипоксическая гипоксия проявляют нейропротективные эффекты, которые не суммируются при их сочетанном действии, что предполагает лимит эффективности защитного действия нейро-протекции. Впервые получены данные об эффективности применения Ь-теанина на разных сроках после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (СМА) и показано, что Ь-теанин оказывает нейропротективное действие при введении препарата до 12 часов после восстановления мозгового кровотока, однако снижает эффективность при введении через 24 часа после окклюзии средней мозговой артерии. Это подтверждает механизм действия Ь-теанина, направленный против ишемической эксайтотоксичности.

Впервые получены данные, что Ь-теанин снижает ИМБА- и каинат-зависимое повреждение головного мозга при ишемии/реперфузии, что дополнительно раскрывает механизмы его нейропротективного действия. Впервые проведено сравнение различных методов оценки неврологического состояния крыс после ишемического/реперфузионного повреждения, показано, что различные тесты для оценки неврологического дефицита обладают разной чувст-

вительностью, и в зависимости от задач исследования могут применяться на разных сроках после ишемического повреждения. Впервые сопоставлены неврологические тесты и поведенческий тест «открытое поле» на сроках до 4-х недель после воспроизведения ишемии головного мозга. Получены данные, что на фоне постепенной нормализации неврологического состояния крыс, у них происходит изменение поведенческих реакций. Отмечено, что однократное введение Ь-теанина достоверно уменьшает неврологический дефицит и изменения поведенческих реакций на всех исследуемых сроках (до 4 недель) после ишемического повреждения.

Теоретическая и практическая значимость

Данные, полученные в исследовании, расширяют современные представления о механизмах повреждения головного мозга при ишемии и служат теоретической основой для применения методов, активирующих механизмы нейро-протекции. Полученные данные о механизмах действия Ь-теанина создают предпосылки для дальнейших углубленных исследований его потенциального использования как нейропротектора и для создания фармакологических препаратов, имеющих сходные механизмы действия. Результаты работы о значимости различных тестов (поведенческих и неврологических) на разных сроках после ишемии могут быть полезными в методическом плане для исследований ишемического повреждения головного мозга в эксперименте.

Личный вклад автора

Личное участие автора в проведенном исследовании заключается в самостоятельной разработке программы исследования, личном участии в ее осуществлении, получении, обработке и анализе экспериментальных данных

Положения, выносимые на защиту

1. Режим дозированной гипоксии и введение Ь-теанина являются преконди-ционирующими воздействиями, защищающими головной мозг от повреждения при ишемии/реперфузии, однако при сочетании этих воздействий их прекондиционирующий эффект не суммируется.

2. Введение Ь-теанина вызывает уменьшение ишемического/реперфузионного повреждения головного мозга крысы при введении до начала ишемии головного мозга, а также через 3 и 12 часов после восстановления кровотока; основным механизмом нейропротективного эффекта Ь-теанина является снижение эксайтотоксичности.

3. Нейропротекция, вызванная введением Ь-теанина уменьшает неврологические и поведенческие расстройства, вызванные ишемией головного мозга, как на ранних, так и на поздних (до 4-х недель) сроках наблюдения.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 9 печатных работ, из них 3 - в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ.

Внедрение результатов работы

Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре патофизиологии Санкт-Петербургского государственного медицинского' университета им. акад. И.П. Павлова.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на ряде Российских и международных конференций и симпозиумов:

1. Апрель 2009, 2010, 2011 гг — Ежегодная конференция «Актуальные проблемы патофизиологии». Санкт-Петербург.

2. Май 2010 г - конференция с международным участием, посвященная 50-летию кафедры патологической физиологии г. Гродно, Беларусь.

3. Октябрь 2010 - 58-ая ежегодная научно-практическая конференция Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибн-Сино. Душанбе, 2010.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 50 отечественных и 156 иностранных источников. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 27 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были проведены на крысах-самцах линии Вистар, возраста 14-16 недель, массой 220-260 г. которые были получены из питомника «Раппо-лово» РАМН, Россия. Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 (четырнадцать) дней. Животные содержались на свободном потреблении корма (стандартный рацион для лабораторных крыс К-120 фирмы «Информ-корм», Россия) и имели свободный доступ к воде. Все эксперименты были одобрены этическим комитетом ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И. П. Павлова».

Моделирование ишемии головного мозга

Фокальная транзиторная ишемия головного мозга воспроизводилась с помощью модели транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) по методике Koizumi J., et al. (1986). Методика заключается во введении окклюдера - полипропиленовой нити (4-00) длиной 20-22 мм, и диаметром дистальных концов филаментов от 0,23 до 0,35 мм во внутреннюю сонную артерию на глубину 20-22 мм до места отхождения средней мозговой артерии, устье которой перекрывалось вводимым окклюдером. В результате введения нити происходит ишемизация мозга в бассейне средней мозговой артерии. Ишемия воспроизводилась в течение 30 минут, после чего нить извлекалась,.рана ушивалась.

Определение размера экспериментального инфаркта головного мозга

Оценка ишемического повреждения головного мозга производилась через 48 часов после восстановления кровотока. Для определения размера инфаркта головного мозга в экспериментах in vivo использовали общепринятый метод, позволяющий на макроскопическом уровне отграничить необратимо поврежденную (некротизированную) от ткани мозга, сохранившей жизнеспособность, и основанный на окрашивании срезов головного мозга 1,2,3-трифенилтетразолия хлоридом (ТТХ). Срезы мозга помещали в 2% раствор ТТХ (MP Biomedicals, США), окрашивающий жизнеспособную ткань с сохраненной активностью НАД-зависимых ферментов в ярко-красный (кирпичный) цвет. Инкубацию срезов осуществляли в течение 15 минут при температуре 37°С и рН 7,4. После инкубации срезов с ТТХ на срезах мозга определялись участки кирпичного цвета и участки нативного цвета, после чего обе поверхности всех срезов фотографировали цифровой камерой Olympus С-4000, сопряженной с помощью микрофотографического устройства с микроскопом МБС-10 (JIOMO, Санкт-Петербург). Цифровые изображения таких срезов затем обрабатывали компьютерным методом с помощью программы ImageJ, которая позволяет рассчитать площадь зоны некроза. Затем, суммируя результат по всем срезам, вычисляли площадь зоны некроза по отношению к общей площади срезов головного мозга (в %). Кроме того, в отдельных опытах было проведены гистологическое исследование ткани мозга.

Оценка неврологического состояния животных

Шкала Гарсия. Неврологическое состояние животных оценивалось по шкале Гарсия (Garcia J.H. et al., 1995). По данной методике используется 6 тестов, каждый из которых имеет оценку в баллах, которые затем суммируются. Ниже перечислены тесты, включаемые в шкалу Гарсия. Количество баллов, данное каждой крысе по завершении испытания, представляет собой суммацию результатов всех шести отдельных тестов. Минимальный неврологический результат — 3, а максимальный — 18.

Адгезивный тест. Для определения координационных односторонних неврологических повреждений ипользовался адгезивный тест (Sughrue М.Е. et

al., 2006). В данном тесте использовалась липкая лента, изготовленная из липкой бумаги (Klebe bander, Германия). Лента длиной 3,0 х 1,0 см оборачивалась вокруг передней лапы в области запястье, после чего животное помещалось в клетку, и за ними проводили наблюдение в течение 30 с. Лента должны хорошо фиксироваться, чтобы животное не могло самостоятельно снять ее до конца проведения опыта. Оценивалось время, которое крыса тратила на попытки удаления ленты, что отражает не только сохранность моторной функции, но и чувствительности.

Тест на координацию движений языка. С целью уточнения данных по степени неврологических нарушений при ОСМА в отдельных сериях экспериментов также использовали тест на координацию высовывания языка по методике Gulyaeva N. et al. (2003).

Оценка поведенческих реакций

Поведенческие реакции оценивали по методу «открытого поля». Установка «Открытое поле» была изготовлена из белого пластика и представляла собой круглую камеру диаметром 1,25 м с высотой стенок 0,4 м. Дно камеры было расчерчено на 21 квадрат, площадью 625см2; в точках пересечения линий разметки были сделаны отверстия (норки) диаметром 3,5 см (16 норок). Тестирование животных в «открытом поле» проводили в темную фазу суточного светового цикла (с 20.00 до 24.00) при освещении тусклым рассеянным светом. Оценивали двигательную активность по следующим паттернам: локомоция, движение на месте, неподвижность (сидение);

Исследовательскую активность оценивали по реакцию на «норку», стойку с упором, и вертикальную стойку (вертикальная стойка па задних лапах); Показатели тревожности оценивали по грумингу (все разновидности данной реакции, заключающиеся, главным образом, в вылизывании и почесывании), фризингу (замиранию).

Применение прекондиционирующих факторов

В качестве химического прекондиционирующих факторов применялся L-теанин (у-гаммаглутамилэтиламид) производство Taiyo Kagaku (Япония), который растворялся в физиологическом растворе для внутрибрюшинного введения в концентрации 1 и 4 мг/кг и для церебровентрикулярного введения в дозе 800 мкг/кг в объеме 20 мкл на одно животное.

Прекондиционирование умеренной гипобарической гипоксией проводилось в барокамере проточного типа путем трехкратного «подъема» животных на высоту 5 км (360 мм рт. ст.) длительностью 90 мин, с интервалом 24 часа. Подъем производился медленно продолжительностью 20-25 мин и такое же время занимало повышение давления. Все процедуры проводились в одно и то же время. На третьи сутки после воздействия гипоксии была произведена операция окклюзии средней мозговой артерии (СМА).

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка данных проводилась с помощью программного пакета SPSS Statistics 13.0. Значимость различий измеряемых параметров оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для независимых выборок и критерии двух связанных выборок Уилкоксона. Значения Р менее чем 0,05 рассматривались как значимые.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Влияние различных концентраций и разных сроков введения L-теанина на степень ишемического и реперфузионного повреждения головного мозга

В данной серии исследований всем животным воспроизводилась 30-минутная ишемия головного мозга с последующей реперфузией в течение 48 часов.

Исследовались следующие группы животных:

1. Контрольная (ишемия) (п = 8).

2. L-теанин за 30 мин до ишемии в дозе ] мг/кг (п = 8).

3. L-теанин через 3 часа после ишемии в дозе в дозе 1 мг/кг (п = 7).

4. L-теанин через 3 часа после ишемии в дозе 4 мг/кг (п = 6).

5. L-теанин через 12 ч после ишемии в дозе 4 мг/кг (n=l 1);

6. L-теанин через 24 ч после ишемии в дозе 4 мг/кг (п=5).

В контрольной группе наблюдалось выраженное повреждение левого полушария крысы. Повреждение ткани мозга, выявленное с помощью окраски ТТС, занимало 23,64±4,04% от площади поврежденного полушария и 13,03±1,96% ог общей площади среза мозга. Эти данные подтверждались и результатами гистологического исследования.

Введение L-теанина за 30 минут до ишемии, а также через 3 часа и 12 часов после ишемии вызывало достоверное (р<0,05) уменьшение размера повреждения, по сравнению с контрольной группой (рис. 1).

Необходимо отметить, что L-теанин оказал достоверное дозо-зависимое действие. Так, при введении L-теанина в дозе 4 мг/кг наблюдалось увеличение нейропротективного действия по сравнению с дозой 1 мг/кг (р<0,05). Применение L-теанина через 24 часа после ишемии головного мозга не приводило к уменьшению размера повреждения головного мозга.

При исследовании неврологического состояния крыс были получены результаты, которые в целом хорошо коррелировали с полученными с помощью окраски TTC.

I 25

20

15

10

Контроль

Теанин за 30 мин, 1 мг/кг

Теанин Зч, 1 мг/кг

Теанин Зч, 4 мг/кг

Теанин 12 Теанин 24 ч, 4 мг/кг ч, 4 мг/кг

Рис. 1. Показатели повреждения головного мозга крыс (по окраске ТТХ) при экспериментальной ишемии/постишемической реперфузии на фоне введения Ь-теанина.

У крыс контрольной группы отмечалось выраженное нарушение неврологического состояния, выражающееся в уменьшении общего количества баллов до 9,1+1,86 (против 18,0±0,0 в норме), которые животные получали при выполнении нескольких стандартных тестов на двигательную активность и чувствительность, по шкале Гарсии. У всех крыс опытных групп отмечалось достоверное (р<0,05) уменьшение неврологических нарушений (рис. 2).

Полученные результаты свидетельствуют о достоверном нейропротек-тивном действии Ь-теанина при его применении как за 30 минут до окклюзии средней мозговой артерии, так и через 3 и 1?. часов после окончания 30-минутной ишемии. Эффективность Ь-теанина через 3 и 12 часов после окончания ишемии предполагает, что его эффект связан преимущественно с торможением эксайтотоксичности, поскольку защита от ишемическо-го/реперфузионного повреждения к окончанию 3-го, и тем более, 12-го часа уменьшаются, и через 24 часа размер повреждения не оличается от такового в контрольной группе.

и

18 16 14

12 10 8 6 4 2 0

9,1

11,7!!

14,2

■4,4:1

15

13,2

Контроль Теанинза Теанин Теанин Теанин 12 Теанин 24 30 мин, 1 Зч, 1 мг/кг Зч, 4 мг/кг ч,4мг/кг ч, 4 мг/кг мг/кг

Рис. 2. Показатели неврологических расстройств у крыс при экспериментальной ишемии/постишемической реперфузии на фоне введения Ь-теанина.

Ъ Исследование механизмов нейропротективного действия Ь-теанина Для выявления механизмов действия Ь-теанина и его возможного торможения эксайтотоксичности была проведена следующая серия экспериментов. В этой серии экспериментов эффективность введения теанина оценивались при введении непосредственно в боковой желудочек мозга с целью максимального избегания его системного эффекта. Ь-теанин вводился трехкратно, в боковой желудочек головного мозга, микроинъектором, в дозе 250 мкг/кг в объеме 20 мкл за одно введение. Всем животным за 2 дня до операции окклюзии СМА в правый желудочек мозга вставлялся микроинъектор, который у крыс контрольной группы был заполнен физиологическим раствором, а у крыс опытных групп либо физиологическим раствором, либо раствором, содержащим теанин. Внутрибрюшино вводились агонисты глутаматных рецепторов (ЫМБА в дозе 35 мг/кг через три 3 и 24 часа после начала реперфузии; каиновая кислота в дозе 1,2 мг/кг через 3 часа после начала реперфузии. Наблюдались шесть групп животных:

1. Контроль (введение через микроинъектор физраствора в указанные выше сроки);

2. Ь-теанин (введение через микроинъектор Ь-теанина);

3. КМВА+физраствор (введение через микроинъектор физраствора и внут-рибрюшинное введение М1УГОА);

4. МШЭА+теанин (введение через микроинъектор Ь-теанина и внутрибрю-шинное введение NN10А);

5. Каиновая кислота+физраствор (введение через микроинъектор физраствора и внутрибрюшинное введение каиновой кислоты);

6. Каиновая кислота+теагога (введение через микроинъектор Ь-теанина и внутрибрюшинное введение каиновой кислоты);

Таблица 1. Показатели смертности крыс и морфологические показатели повреждения головного мозга крыс после транзиторной окклюзии СМА.

Показатель Кол-во Об- Итог Размер повреждения

про- щая овое (в%)

опери- смерт- кол- К общей К площади

рован- ность во площади моз- полушария

Группа х^ ных крыс га

крыс

Контроль 7 1 (14%) 6 17,31±2,65 32,61±4,87

(физраствор)

Теанин 6 0 6 5,91±2,34 * 11,88±4,92 *

>1МОА+физраствор 14 8 (57%) 6 28,33±4,95 52,76±8,18

*# Ч

ЫМОА+теанин 9 3 (33%) б 1б,61±2,14 31,45±3,59

#Л #Л

Каиновая к-та+ 12 6 (50%) 6 37,48±2,33 68,33±5,30

физраствор *# *#

Каиновая к-та+ 8 2 (25%) б 21,13±7,00 39,69±11,85

теанин #> #>

*- р<0,05 по сравнению с группой «контроль»; #- р<0,05 по сравнению с группой «Теанин»; л - р<0,05 по сравнению с группой «ММВА»; > - р<0,05 по сравнению с группой «Каиновая к-та».

Из таблицы 1 следует, что в контрольной группе животных окклюзия средней мозговой артерии на 30 минут вызывала развитие ишемического повреждения головного мозга, которое составляло 32,61±4,87% от площади среза поврежденного полушария (табл. 1) и 17,31±2,65 % по отношению к общей площади среза мозга. Показатели повреждения мозга в контрольной группе были несколько выше, чем те, которые были получены нами в предыдущих сериях (23,64±4,04%), что связано с тем, что всем животным была поставлена канюля (микроинъектор) в боковой желудочек контрлатерального полушария головного мозга за 2 дня до моделирования ишемии. При введении в желудочек мозга Ь-теанина у животных достоверно на 63% уменьшался размер ишемического/реперфузионного повреждения (табл. 1).

Внугрибрюшинное введение NMDA привело к резкому повышению смертности животных (57% против 14% в контроле) В данной группе опытов после первой инъекции NMDA у 57% животных наблюдались непрекращающиеся судороги, заканчивавшиеся гибелью животных, что послужило необходимостью увеличения количества прооперированных крыс. Кроме того, у крыс данной серии отмечалось увеличение размера ишемическо-го/реперфузионного повреждения, в среднем на 64% по сравнению с контрольной группой. При введении L-теанина на фоне применения NMDA (группа NMDA+теанин) наблюдалось уменьшение смертности животных, а также отмечалось достоверное снижение выраженности повреждения мозга крысы на 40%, по сравнению с группой «NMDA+физраствор». С нашей точки зрения эти данные являются подтверждением предположения о взаимодействии теанина с глутаматной системой и его механизму действия через уменьшение NMDA-зависимой эксайтотоксичности.

При введении животным с ишемией мозга каиновой кислоты (группа «каиновая кислота+физраствор») также, как и в группе NMDA+физраствор, отмечалось резкое увеличение смертности животных на (50% против 14% в контроле) и и увеличение размера повреждения более, чем в 2 раза по сравнению с контрольной группой (табл. 1).

При добавлении теанина (группа Каиновая кислота+теашш) отмечалось уменьшение выраженности повреждения (на 42%), которое приближалось к значениям контрольной группы. Результаты неврологического исследования крыс полностью соответствовали данным, полученным при оценке размера повреждения головного мозга.

Таким образом, введение в желудочек мозга теанина препятствовало NMDA-индуцированному и каинат-индуцированному повреждению на фоне ишемии/реперфузии головного мозга крысы.

3. Влияние сочетанной нейропротекнии гипоксией и L-теанином на степень ишемического и реперфузионного повреждения головного мозга.

В нашем исследовании были изучены не только механизмы фармакологической (L-теанин) нейропротекции, но и предпринята попытка изучения влияния физического фактора (гипоксия) и эффективности сочетания этих факторов при фокальной ишемии головного мозга крысы. В данной серии опытов исследовались 4 группы животных:

1. Контрольная (п= 8). На животных воспроизводилась ишемия головного мозга с последующей реперфузией 48 часов.

2. Гипоксическое прекондиционирование (п= 6)

3. Внутрибрюшино теанин за 30 мин до ишемии в дозе 1 мг/кг. (п= 7)

4. Гипоксическое прекондиционирование + внутрибрюшиное введение Теанина за 30 мин. до ишемии в дозе 1 мг/кг. (п= 6).

Как и в предыдущих сериях экспериментов, 30-минутная ишемия вызывала повреждение головного мозга крысы с площадью 23,32±4,96% от площади среза поврежденного полушария. В группе крыс, которые подвергались гипоксическому прекондиционированию, отмечалось достоверное уменьшение повреждения головного мозга на 34 % (р<0,001). В группе крыс, которым вводили Ь-теанин площадь повреждения также достоверно уменьшалась и составила 40Уо от площади повреждения контрольной группы (рис. 3).

30

1 25 -

О.

ев Э

I 20 ■■

с

с с

1 15

К 5

X 0)

I 10

с

88 5

0 -

Контроль Гипоксия Теанин Гипоксия+теанин

Рис. 3. Показатели повреждения головного мозга крыс при экспериментальной ишемии на фоне гипоксического прекондиционирования и введения Ь-теанина.

Различия между контролем (ишемия) и остальными группами достоверны (Р<0,05)

Мы ожидали, что при сочетании гипоксического прекондиционирования и введения Ь-теанина произойдет усиление их защитного эффекта и размер повреждения будет меньше, чем при их раздельном действии. Однако мы не получили достоверного усиления их защитного эффекта и площадь повреждения мозга у крыс этой группы составила около 50% от площади повреждения контрольной группы. Данные неврологической оценки крыс также совпадали с данными морфометрического исследования.

В целом можно сделать заключение, что полученные данные доказывают эффективность нейропротективного эффекта гипоксического прекондиционирования и фармакологического прекондиционирования Ь-теанином, а также при сочетании этих воздействий, хотя ожидаемого суммирования гипоксического и фармакологического воздействий не отмечалось.

4. Исследование длительности нейропротективного действия однократного введения Ь-теанина.

Для определения длительности действия Ь-теанина проводилось наблюдение за животными в течение 4 недель после 30-минутной окклюзии СМА. Сравнивались 2 группы крыс: контрольная (без лечения) и опытная (введение Ь-теанина в дозе 4 мг/кг через 30 минут после окончания ишемии. Проводилась оценка неврологических нарушений и поведенческих реакций с помощью теста «открытое поле».

Животных протестировали по шкале Гарсия, модифицированным адгезивным тестом и тестом на координацию движений языка. Необходимо отметить, что при оценке неврологического состояния животных по шкале Гарсия были получены данные, что этот тест максимально информативен на вторые сутки после окклюзии СМА. На третьи сутки у всех животных наблюдалось выраженное улучшение состояния, и по шкале Гарсия их показатели увеличивались до 16-17 баллов и достоверно не различались между группами. При оценке адгезивного теста у животных всех групп при первом исследовании исходные показатели были сходными (табл. 2). Ишемия вызывала достоверное сокращение времени попыток удаления липкой ленты с правой лапы крысы по сравнению с ложнооперированными животными в конце первой и второй недель наблюдения, что предполагает снижение чувствительности конечности крысы, связанное с ишемическим очагом повреждения. Показатели, полученные у крыс, которым вводился Ь-теанин, достоверно не отличались от таковых в контрольной группе.

Табл. 2. Время, затраченное животными по удалению липкой ленты с лапы за 30-секундное время наблюдения (в секундах).

Срок наблюдения Лапа Ложпооперир. ишемия Ь-теанин

До ишемии Левая 23,5±1,9 22,4±1,7 24,2±1,4

Правая 24,5±0,5 _ 23,8±0,9 24,3±0,4

1 нед Левая 18,2±1,6 16,8±1,5 22,8±2,1

Правая 22,0±0,8 16,2±2,0* 21,0±3,2

2 нед Левая 22,7±0,8 20,6±1,4 17,7±2,1

Правая 24,3±1,6 14,0±2,1* 18,7±1,4

3 нед Левая 15,3±1,1 19,4±2,4 18,0±2,3

правая 16,3±2,1 18,8±2,2 18,3±1,2

4 нед левая 18,8±3,0 16,8±3,5 22,3±2,4

правая 17,3±2,3 12,8±2,9 16,5±1,3

* - р<0,05 по сравнению с ложнооперированной группой

При проведении теста на координацию работы языка крысы также получены данные о том, что окклюзия СМА достоверно вызывает дискоординацию языка, что проявляется на 1 и 3-й неделях наблюдения. Применение Л-теанина у крыс с окклюзией СМА предотвращает эти неврологические нарушении (табл. 3)

Табл. 3. Глубина съеденного столбика масла на разных сроках после окклюзии СМА (в миллиметрах).

^^Срсэк наблюден, группы до опер 1 нед 2 нед 3 нед 4 нед

Ложнооперир. 9,2±0,3 9,2±0,4 9,0±0,4 9,0±0,5 9,3±0,2

ишемия 9,4±0,6 6,0±1,3 * 7,8±0,7 7,2±0,4* 9,6±0,6

теанин 9,3±0,2 9,0±0,3 9,2±0,9 9,2±0,3 10,2±0,4

* - р<0,05 по сравнению с ложнооперированной группой

80 70 60 50 40 30 20 10 0

частота лок

длитлок

частота движ на

месте

□ЛОЖНООПЕР 0 ИШЕМИЯ □ТЕАНИН

йш

длит движ на месте

частота сидения

длит сидения

4 нед после операции

Рис. 4. Пример изменений отдельных показателей поведенческих реакций крыс через 4 недели после окклюзии СМА.

* - р<0,05 по сравнению с ложнооперированной группой

# - р<0,05 по сравнению с группой «ишемия»

Таким образом, неврологические нарушения, вызванные 30-минутной ишемией головного мозга крыс прослеживаются с помощью разных тестов на сроке до 3-й недели включительно. На 4-й неделе отмечается полное выравнивание неврологических показателей у ложнооперированных крыс и крыс с окклюзией СМА.

Нами проведены также исследования поведенческих реакций у животных разных групп через 48 часов, 1,2, 3 и 4 недели на сроке до 4-х недель наблюдения. Оценивались основные показатели: двигательная активность, исследовательская активность и тревожность. Через 48 часов не выявлено достоверных отличий между ложнооперированными и опытными животными. У крыс с окклюзией СМА начиная с 1-й недели после операции наблюдалось нарастание показателей тревожности, и снижение показателей исследовательской и двигательной активности. Максимальными данные расстройства были к 3-4-й неделе. В частности при оценке двигательной активности крысы с окклюзией СМА показали уменьшение длительности локомоций, частота сидения на месте и увеличение длительности движений на месте (рис. 4). Аналогичные изменения наблюдались в отношении тревожности и исследовательской активности крыс.

Однократное введение Ь-теанина уменьшает поведенческие расстройства, которые наблюдаются у крыс через 2-4 недели после окклюзии СМА (рис. 4) Таким образом, на сроках до 2-3 недель после окклюзии СМА отдельные неврологические тесты отражают степень ишемического повреждения головного мозга крысы, в то время как для оценки отсроченных изменений, индуцированных ишемией головного мозга целесообразна оценка поведенческих реакций.

ВЫВОДЫ

1. Введение теанина в дозах 1 и 4 мг/кг за 30 минут до ишемии, а также через 3 и 12 часа после начала реперфузии головного мозга крысы оказывает дозо-зависимый нейропротективный эффект.

2. Применение Ь-теанина через 24 часа после восстановления кровотока по СМА не сопровождается достоверным снижением ишемического и реперфузи-онного повреждения головного мозга, однако уменьшает неврологические нарушения, вызванные ишемией.

3. Однакратное применение Ь-теанина в дозе 1 мг/кг через 30 мин после начала реперфузии у опытных животных оказывает пролонгированный нейропротективный эффект до 3-х недель после окклюзии СМА.

4. Механизмы нейропротективного действия Ь-теанина связаны с уменьшением ишемической эксайтотоксичности посредством влияния на №\ША-зависимое и каинат-зависимое повреждение.

5. Гипоксия в режиме (10% О2 по 90 мин, 3 дня) оказывает достоверное защитное действие при экспериментальной ишемии/реперфузии головного мозга крыс.

6. Сочетанное применение гипоксии и Ь-теанина в дозе 1 мг/кг за 30 минут до ишемии не сопровождается усилением их эффектов, полученных при раздельном использовании как прекондиционирующих факторов.

7. 30-минутная окклюзия СМА является адекватной моделью фокального ишемического повреждения головного мозга крысы; из функциональных методов оценки последствий ишемического повреждения мозга на ранних сроках (от 0 до 3-х недель) после ишемии головного мозга наиболее воспроизводимы отдельные неврологические тесты, в то время как на сроках (от 2 до 4-х недель) предпочтительно исследование поведенческих реакций,

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Ь-теанин и его структурные аналоги могут явиться основой для разработки фармакологических препаратов с целью профилактики и лечения ишемического повреждения головного мозга в клинике.

2. Нейропротекция, вызванная различными воздействиями, имеет ограничение по своей эффективности, поэтому сочетание разных методов нейропротекции может не приводить к усилению их действия, что следует учитывать при проведении соответствующих исследований.

3. Для оценки последствий ишемического повреждения головного мозга в экспериментальной работе целесообразно использование неврологических тестов, однако их выбор должен основываться на их чувствительности. Исследование поведенческих реакций нецелесообразно на ранних сроках после ишемическо-го/реперфузионного повреждения головного мозга, но становится информативным на более поздних (через несколько недель) сроках.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зухурова М.А. Влияние Ь-теанина (гамма-глутамилэтиламида) на фокальное ишемическое/реперфузионное повреждение головного мозга крысы. / М.А. Зухурова // Материалы XV Межгородской конференции молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии»,- Санкт-Петербург, 22-23 апреля 2009 г,-СПб.; Изд-во СПбГМУ, 2010 С.44-45.

2. Зухурова М.А. Эффекты гипоксического и фармакологического преконди-ционирования при ишемии головного мозга у крыс/ М.А. Зухурова. // Материалы XVI Межгородской конференции молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии».- Санкт-Петербург, 21-22 апреля 2010 г.- СПб.; Изд-во СПбГМУ, 2010 С.67-69.

3. Просвирина М.С. Оценка нейропротективных свойств тиашша при разных сроках введения после фокальной ишемии головного мозга у крыс./ М.С. Просвирина, А.В.Симаненкова, М.А.Зухурова // Материалы XVI Межгородской

конференции молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии».-Санкт-Петербург, 21-22 апреля 2010 г.- СПб.; Изд-во СПбГМУ, 2010 С.146-148.

4. Зухурова М.А. Нейропротективный эффект L-теанина при экспериментальной ишемии головного мозга у крыс / М.А.Зухурова, Е.А. Байса, А.В.Симаненкова, Т.Д. Власов // Вестник Авиценны. - 2010. - №1. - С. 119125.

5. Власов Т.Д. Исследование нейропротективных эффектов теанина в различных дозах и на различных сроках введения про фокальной ишемии головного мозга у крыс. / Т.Д. Власов, А.В.Симаненкова, М.С.Просвирнина, М.А. Зухурова // Материалы республиканской конференции с международным участием «Актуальные теоретические и прикладные аспекты патофизиологии». Гродно, ГрГМУ, 2010. С. 133-138.

6. Зухурова М.А. Гипоксичсское и фармакологическое прекондициони-рорвание как механизмы зашиты при фокальной ишемии головного мозга крысы. / М.А.Зухурова, A.B. Старков, A.B. Старовойт, A.A. Барковская., Т.Д. Власов // Регионарное Кровообращение и Микроциркуляция - 2010. -Т.9, №3 (35). - С.84-89.

7. Зухурова М.А., Барковская A.A., Власов Т. Д., Механизмы нейропротектор-ного эффекта L-теанина./ М.А. Зухурова, A.A. Барковская, Т.Д. Власов // Внедрение достижений современной науки в медицину (58-я годичная научно-практическая конфиренция Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сина, посвященная 100-летию со дня рождения академика К.Т. Таджиева). Д. «Хикмат», 2010-Душанбе, 384 стр. ТГМУ им. Абуали ибни Сино, 2010 С. 195-196.

8. Зухурова М.А. Механизмы пейропротекторного эффекта компонента зелёного чая - L-теанина. / М.А. Зухурова, A.A. Барковская., В.М. Цвери-на, Т.Д. Власов // Регионарное Кровообращение и Микроциркуляция -2010. - Т.9, №4 (36). - С.67-71.

9. Зухурова М.А. Эффективность неврологических и поведенческих тестов в оценке постишемических расстройств у крыс на разных сроках постоперационного периода / М.А.Зухурова, Д.С.Лупан, А.С.Дайнеко, A.A. Барковская, П.А.Николаева. // Материалы XVII Межвузовской конференции молодых учёных «Актуальные проблемы патофизиологии».- Санкт-Петербург, 20-21 апреля 2011 г.- СПб.; Изд-во СПбГМУ, 2011 С.62-63.

Список основных обозначений и сокращений

СМА - средняя мозговая артерия ОСМА — окклюзия средней мозговой артерии ТТХ - 1,2,3-трифенилтетразолия хлорид NMDA - М-метил-Б-аспартат

Формат 60x84 1/16. Объём усл. печ. л.1,0 Тираж 120 экз. Заказ 02-04 Бесплатно.

Подписано в печать 15.04 11 Отпечатано с готового оригинал-макета. Издательство «Система».

Актуальность исследования

Сердечно-сосудистые заболевания занимают ведущее место в структуре общей заболеваемости и смертности в России и во всем мире (Levi et al, 2002). При этом цереброваскулярная патология является ведущей причиной инвалидизации населения (Гусев Е.И., 2003). В 2005 г. в мире инсульт был причиной 5,7 млн смертельных исходов, прогнозируется рост смертности от инсульта до 6,7 млн к 2015 г, если не будут предприняты активные глобальные меры по борьбе с этой «эпидемией» (Culebras F., 2007). Главным средством борьбы с развивающимся поражением головного мозга при ишемическом инсульте служит реперфузия - восстановление кровотока в ишемизированном участке. Однако повреждение ткани головного мозга не ограничивается продолжительностью ишемии. Ишемия мозга запускает целый каскад реакций, связанных с активацией глутаматной и аспартатной эксайтотоксичности, свободнорадикальным повреждением и другими механизмами (Choi D.W., Rothan S.M., 1990; Won S.J. et al., 2002; Liu Z. et al., 2010). Показано, что при окклюзии средней мозговой артерии у крыс уже через 15 минут в области гипоталамуса и гиппокампа резко повышается уровень глутамата, достигая пика через 1 час после начала ишемии (Не М. et al., 2003). Поэтому поиск механизмов защиты головного мозга от ишемического и реперфузионного повреждения является важнейшей задачей. Существует ряд методик, позволяющих снизить ишемическое-реперфузионное повреждение. Одной из наиболее эффективных является ишемическое прекондиционирование головного мозга (Kitagawa К. et al,, 1990), которое существенно снижает размер повреждения и выраженность функциональных нарушений. Важным стимулом, имеющим сходные с ишемией механизмы повреждения клеток, является гипоксия, в связи с чем. кратковременные гипоксические воздействия на ткани, в том числе и на головной мозг могут быть отдельным направлением прекондиционирования (Семенов Д. Г. и соавт., 2004; Sharp F. et al., 2004).

Еще одним способом защиты мозга от ишемического и реперфузионного повреждения является применение субстанций, в'том числе фармакологических веществ. Перспективным в этой области нейропротектором может быть Ь-теанин - аминокислота, содержащаяся в зеленом чае (ЕкЬо1^-СЖ К.Н. а1., 1997). Ь-теанин по структуре похож на возбуждающий нейротрансмиттер - глутаминовую кислоту, и может выступать антагонистом глутаматных рецепторов, что, по мнению ряда авторов, и связано с его нейропротективным дейстивием (Магиуата М., Такеёа К., 1994; Какиёа Т., 2002). Однако работ, посвященных исследованию действия Ь-теанина при ишемии головного мозга крайне мало, кроме того, механизмы его действия не до конца изучены, в частности, взаимодействие теанина с разными подтипами глутаматных рецепторов. Кроме того, неизученным вопросом является эффективность сочетанного воздействия Ъ-теанина и гипоксического прекондиционирования, с учетом их различных механизмов действия.

Таким образом, исследование нейропротективного действия гипоксии и введения Ь-теанина является весьма актуальным, и может быть основанием для дальнейшей разработки способов защиты головного мозга от ишемического и реперфузионного повреждения.

Цель исследования

Изучить механизмы защиты головного мозга от ишемического-реперфузионного повреждения с помощью применения Ь-теашша и гипоксической гипоксии как самостоятельных факторов и при их сочетании.

Задачи исследования 1. Усовершенствовать методику воспроизведения ишемии головного мозга крысы и отработать оптимальные критерии оценки повреждения с помощью морфологических и функциональных методов на разных сроках после восстановления кровотока.

2. Определить влияние гипоксической гипоксии на степень защиты головного мозга крысы при экспериментальной ишемии головного мозга.

3. Изучить зависимость эффективности L-теанина от дозы и времени введения.

4. Исследовать механизмы нейропротективного действия L-теанина при ишемическом и реперфузионном повреждении головного мозга крысы.

5. Оценить возможность взаимного потенцирования гипоксического и фармакологического (L-теанин) прекондиционирования головного мозга крысы.

Научная новизна

Впервые показано, что L-теанин и гипоксическая гипоксия проявляют нейропротективные эффекты, которые не суммируются при их сочетанном действии, что предполагает лимит эффективности защитного действия нейропротекции. Впервые получены данные об эффективности применения L-теанина на разных сроках после трапзиторной окклюзии средней мозговой артерии (СМА) и показано, что L-теанин оказывает нейропротективное действие при введении препарата в течение 12 часов после восстановления мозгового кровотока, однако снижает свою эффективность при введении через 24 часа после окклюзии средней мозговой артерии. Это подтверждает механизм действия L-теанина, направленный против развития ишем и ческой эксайтотоксичности.

Впервые получены данные, что L-теанин снижает NMDA- и каинат-зависимое повреждение головного мозга при ишемии/реперфузии, что дополнительно раскрывает механизмы его нейропротективного действия. Впервые проведено сравнение различных методов оценки неврологического состояния крыс после ишемического/реперфузионного повреждения, показано, что различные тесты для оценки неврологического дефицита обладают разной чувствительностью, и в зависимости от задач исследования могут применяться на разных сроках после ишемического повреждения.

Впервые сопоставлены неврологические тесты и поведенческий тест «открытое поле» на сроках до 4-х недель после воспроизведения ишемии головного мозга. Получены данные, что на фоне постепенной нормализации неврологического статуса крыс, происходит изменение их поведенческих реакций. Отмечено, что однократное введение Ь-теанина достоверно уменьшает неврологический дефицит и изменения поведенческих реакций на всех исследуемых сроках (до 4 недель) после ишемического повреждения.

Теоретическая и практическая значимость

Данные, полученные в исследовании, расширяют современные представления о механизмах повреждения головного мозга при ишемии и служат теоретической основой для применения методов, активирующих механизмы нейропротекции. Полученные данные о механизмах действия Ь-теанина создают предпосылки для дальнейших углубленных исследований его потенциального использования как нейропротектора и для создания фармакологических препаратов, имеющих сходные механизмы действия. Результаты работы о значимости различных тестов (поведенческих и неврологических) на разных сроках после ишемии могут быть полезными в методическом плане для исследований ишемического повреждения головного мозга в эксперименте.

Личный вклад автора

Личное участие автора в проведенном исследовании заключается в самостоятельной разработке программы исследования, личном участии в ее осуществлении, получении, обработке и анализе экспериментальных данных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Режим дозированной гипоксии и введение Ь-теанина являются прекондиционирующими воздействиями, защищающими головной мозг от повреждения при ишемии/реперфузии, однако при сочетании этих воздействий их прекондиционирующий эффект не суммируется.

2. Введение Ь-теанина вызывает уменьшение ишемического/реперфузионного повреждения головного мозга крысы при введении до начала ишемии головного мозга, а также через 3 и 12 часов после восстановления кровотока; основным механизмом нейропротективного эффекта Ь-теанина является снижение эксайтотоксичности.

3. Нейропротекция, вызванная введением Ь-теанина уменьшает неврологические и поведенческие расстройства, вызванные ишемией головного мозга, как на ранних, так и на поздних (до 4-х недель) сроках наблюдения.

ВЫВОДЫ

1. Введение теанина в дозах 1 и 4 мг/кг за 30 минут до ишемии, а также через 3 и 12 часов после начала реперфузии головного мозга крысы оказывает дозозависимый нейропротективный эффект.

2. Применение Ь-теанина через 24 часа после восстановления кровотока по СМА не сопровождается достоверным снижением ишемического и реперфузионного повреждения головного мозга, однако уменьшает неврологические нарушения, вызванные ишемией.

3. Однакратное применение Ь-теанина в дозе 1 мг/кг через 30 мип после начала реперфузии у опытных животных оказывает пролонгированный нейропротективный эффект до 3-х недель после окклюзии СМА.

4. Механизмы нейропротективного действия Ь-теанина связаны с уменьшением ишемической эксайтотоксичности посредством влияния на ММЕ)А-зависимое и каинат-зависимое повреждение.

5. Гипоксия (10% 02 по 90 мин, 3 дня) оказывает достоверное защитное действие при экспериментальной ишемии/реперфузии головного мозга крыс.

6. Сочетанное применение гипоксии и Ь-теанина в дозе 1 мг/кг за 30 минут до ишемии не сопровождается усилением их эффектов, полученных при раздельном использовании как прекондиционирующих факторов.

7. 30-минутная окклюзия СМА является адекватной моделью фокального ишемического повреждения головного мозга крысы; из функциональных методов оценки последствий ишемического повреждения мозга на ранних сроках (от 0 до 3-х недель) после ишемии головного мозга наиболее воспроизводимы отдельные неврологические тесты, в то время как на сроках от 2 до 4-х недель предпочтительна оценка поведенческих реакций.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Ь-теанин и его структурные аналоги могут явиться основой для разработки фармакологических препаратов с целью профилактики и лечения ишемического повреждения головного мозга в клинике.

2. Нейропротекция, вызванная различными воздействиями, имеет ограничение по своей эффективности, поэтому сочетание разных методов нейропротекции может не приводить к усилению их действия, что следует учитывать при проведении соответствующих исследований.

3. Для оценки последствий ишемического повреждения головного мозга в экспериментальной работе целесообразно использование неврологических тестов, однако их выбор должен основываться на их чувствительности. Исследование поведенческих реакций нецелосообразно на ранних сроках после ишемического/реперфузионного повреждения головного мозга, но становится информативным на более поздних (несколько недель) сроках.