Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Эффективность использования "Купренила" и его комбинации с "Мезогелем" для профилактики спаечного процесса в брюшной полости

На правах рукописи

005048447

Ефременков Артём Михайлович

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ «КУПРЕНИЛА» И ЕГО КОМБИНАЦИИ С «МЕЗОГЕЛЕМ» ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ СПАЕЧНОГО ПРОЦЕССА В БРЮШНОЙ ПОЛОСТИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

I / лг;Ь

Курск-2012

005048447

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук Николаев Сергей Борисович

кандидат медицинских наук, доцент Липатов Вячеслав Александрович

Официальные оппоненты:

Лазарева Галина Анатольевна, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой акушерства и гинекологии факультета последипломного образования Покровская Татьяна Григорьевна, доктор медицинских наук, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», профессор кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин Института последипломного медицинского образования

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «^/^тГ^^Г^к^О 13 г. в ,..^*^часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан « ^^^^^ 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Пашин Евгений Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Послеоперационный спаечный процесс в брюшной полости является самым частым осложнением абдоминальных хирургических вмешательств. Кроме того, даже, несмотря на тщательно выполненную операцию по поводу спаечной болезни, продолжаются неоднократные поступления данной категории пациентов в различные лечебные учреждения с дальнейшим развитием у них стойкой инвалидизации. При этом риск повторной операции увеличивается с каждым оперативным вмешательством, достигая после пятой операции 47%. Об актуальности проблемы в целом свидетельствует и тот факт, что в США по поводу спаечной болезни (СБПБ) ежегодно госпитализируется до 300 тыс. больных, при этом затраты только на лечение составляет более 1 млрд дол. (Чекмазов И.А., 2008; Багненко С.Ф. и др., 2009; Nappi С. et al., 2007).

В последние годы большинство авторов, изучая патогенез СБПБ, приходят к выводу, что одним из основных звеньев спайкообразования является измененная иммунобиологическая реактивность организма в сочетании с нарушением синтеза коллагена (Рубцов О. Ю., 2005; Стрелков Н.С. и др., 2008). Известно о дисбалансе между системной и локальной продукцией цитокинов, изменением функциональной активности нейтрофилов и перитонеальных макрофагов (Томашев П.Н., 2007; Гомон М.С., 2009; Кахкцян A.A., 2009; Holsti М.А. et al., 2004; Berkkanoglu M. et al., 2005). В единичных исследованиях приводятся данные о развитии имунносупрессии, сопровождающей послеоперационный спаечный процесс в эксперименте (Гомон М.С. и др., 2008) и клинике (Баранов Г.А., Карбовский М.Ю., 2004; Томашев Н.П., 2007). Имеются литературные данные, что использование иммуномодуляторов может улучшить результаты лечения СБПБ (Томашев Н.П., 2007; Гомон М.С., 2009). Одним из средств с доказанной высокой противоспаечной активностью широко применяющимся в клинике является «Мезогель» (Липатов В.А., 2004; Дубонос A.A., 2009). Его антиадгезивные свойства обусловлены барьерным механизмом действия. Однако, экспериментально установлено, что одним из побочных эффектов данного изделия медицинского назначения является формирование стойкой супрессии показателей как адаптивного, так и врожденного иммунитета в послеоперационном периоде (Гомон М.С. и др., 2008).

Перспективным компонентом в составе комплексного лечения, которое могло бы улучшить его результаты и профилактику СБПБ, являются препараты, способные подавлять синтез коллагена и усиливать его деградацию. К числу таких фармакологических средств относится «Купренил» (D-пеницилламин), обладающий к тому же собственной иммуномодулирующей активностью. Однако, имеются лишь единичные сообщения о возможностях его использования для профилактики образования послеоперационных спаек в брюшной полости (Стрелков Н.С. и др., 2008; Zhang Q. et al., 2011).

Цель - разработать способы профилактики развития послеоперационного спаечного процесса в брюшной полости с использованием различных способов введения «Купренила» без, и в комбинации с «Мезогелем».

Задачи исследования:

1. Оценить эффекты внутрижелудочного и внутрибрюшного введения «Купренила» на развитие клеточной и гуморальной форм иммунного ответа, функциональную активность нейтрофилов периферической крови и перито-неальных макрофагов при экспериментальном спаечном процессе в брюшной полости.

2. Исследовать характер влияния комбинации «Купренила» с «Мезогелем» на врождённый и адаптивный иммунитет в условиях экспериментального внутрибрюшного адгезиогенеза.

3. Изучить морфологические изменения в брюшной полости при использовании «Купренила» без и в комбинации с «Мезогелем» в условиях экспериментального спаечного процесса.

4. Провести сравнительную оценку выраженности спаечного процесса в брюшной полости и иммуномодулирующей эффективности «Купренила» без и в сочетании с «Мезогелем».

5. Установить корреляционные взаимосвязи между параметрами иммунной реактивности и морфологическими критериями выраженности экспериментального спаечного процесса в брюшной полости при использовании «Купренила» без и в сочетании с «Мезогелем».

Научная новизна. Впервые установлено, что «Купренил» супрессирует функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови, перитоне-альных макрофагов и стимулирует формирование гуморального иммунного ответа при экспериментальной спаечной болезни брюшины. Впервые выявлена инверсия иммуносупрессирующих свойств «Купренила» и «Мезогеля» на стимулирующие при сочетанном местном применении в условиях моделированного спаечного процесса брюшной полости. Впервые выявлены нарушения кислородзависимых бактерицидных механизмов перитонеальных макрофагов при экспериментальном спаечном процессе в брюшной полости. Доказана возможность эффективной фармакологической коррекции иммунных нарушений при экспериментальном спаечном процессе в брюшной полости локальной интраоперационной аппликацией «Купренила» и «Мезогеля». Установлено макро- и микроморфологическими методами, что применение «Купренила» уменьшает выраженность спаечного процесса в брюшной полости. Показано, что противоспаечная и иммуномодулирующая активность исследуемых способов профилактики увеличивается в ряду: «Купренил» внутрижелудочно —> «Купренил» интраабдоминально —► «Купренил» внутрижелудочно + «Мезо-гель» —► «Купренил» интраабдоминально + «Мезогель».

Научная новизна исследования подтверждена патентом РФ на изобретение «Способ профилактики полостных спаек» (1Ш2447848).

Практическая значимость. Экспериментально обоснована возможность использования различных способов введения «Купренила» с целью

профилактики послеоперационного спайкообразования в брюшной полости. Доказано, что значительное повышение эффективности коррекции нарушений врождённого и адаптивного на системном и местном уровне, также как и усиление антиадгезивной активности «Купренила» достигается при комбинации последнего с «Мезогелем».

Выявленные корреляционные взаимосвязи между показателями иммунитета и морфометрическими маркерами выраженности спаечного процесса в брюшной полости в условиях применения исследуемых фармакологических схем позволяют судить об эффективности проводимой терапии.

Материалы диссертации вошли в учебный процесс и научно-исследовательскую работу кафедры оперативной и топографической анатомии им. проф. А.Д. Мясникова, кафедры фармакологии Курского государственного медицинского университета; кафедры общей хирургии Воронежской государственной медицинской академии; кафедры клинической фармакологии и фармацевтических дисциплин института последипломного медицинского образования Белгородского государственного национального исследовательского университета,-

Положения, выносимые на защиту

1. Внутрижелудочное и интраабдоминальное введение «Купренила» уменьшает выраженность гистоморфологических проявлений спаечного процесса в брюшной полости без достаточной коррекции иммунных нарушений.

2. Использование «Купренила» совместно с «Мезогелем» позволяет значительно повысить эффективность противоспаечной терапии как на макро-, так и на микроморфологическом уровне, а также нивелировать формирование вторичного иммунодефицита, усиливающегося при изолированном применении «Мезогеля».

3. Интраабдоминальное использованием «Купренила» более эффективно, чем его внутрижелудочное введение.

4. Установлены лабораторные показатели, позволяющие судить об эффективности проводимой противоспаечной терапии с использованием «Купренила» и «Мезогеля».

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях общероссийского и международного уровня: 70-й и 73-й итоговой конференции студентов и молодых учёных КГМУ (Курск, 2005 и 2008), I Всероссийской конференции молодых учёных (Воронеж, 2007), Международной научно-практической конференции студентов и молодых учёных «Актуальные проблемы современной медицины» (Киев, Украина, 2007), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010), Научно-практической конференции хирургов Центрального федерального округа Российской Федерации (Белгород, 2010), II Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2011), IV всероссийской конференции молодых учёных «Комплексный подход к диагностике, лечению и профилактике в медицине» (Воронеж, 2011),, VI Всероссийской науч-

но-практической конференции молодых учёных-медиков (Казань, 2012), III международной конференции «Современные технологии и возможности ре-конструктивно-восстановительной и эстетической хирургии (Москва, 2012), совместном заседании кафедр: фармакологии, клинической фармакологии, оперативной хирургии и топографической анатомии, биологической химии, хирургических болезней №2 Курского государственного медицинского университета (Курск, 2012).

Личный вклад автора. Автором лично проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, проведены серии экспериментов, получены и обобщены результаты исследования, проведена статистическая обработка и анализ полученных данных, сделаны выводы и практические рекомендации. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия автора 8595%.

Публикации. По материалам диссертации в центральной и местной печати опубликовано 14 работ, в том числе 4 - в рецензируемых ВАК РФ изданиях, согласно п. 10 «Положения о порядке присуждения ученых степеней», в которых содержится необходимый объем информации, касающейся темы диссертации. Получен патент РФ на изобретение «Способ профилактики полостных спаек» (RU2447848).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 21 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания методов исследования, изложения собственных результатов (4 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 158 отечественных и 60 иностранных источника.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и методы исследования. Эксперименты проводены на здоровых половозрелых крысах линии Вистар, массой 150-200 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 10-12 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал ±10%. Все исследования проводили в одно и то же время суток, с 8 до 14 ч, с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986) и согласно правилам лабораторной практики РФ (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.).

Моделирование спаечного процесса в брюшной полости. Спаечный процесс брюшной полости воспроизводили асептическим травматическим

способом (Липатов В.А. и др., 2004). После срединного лапаротомного разреза выполнялось гидравлическое препарирование брюшины вентральной стенки с последующим ее иссечением на площади 1x1 см, отступя 1 см от края срединной раны, слепая кишка подвергалась скарификации на всей поверхности до появления «кровавой росы» с помощью специального устройства. После оперативного вмешательства брюшную полость зашивали «наглухо» нитью лавсан 4/0. Животных выводили из опыта путем передозировки наркоза на 7 и 14 сутки.

Дизайн исследования. В работе использовали препарат «Купренил» (TEVA KUTNO, S.A., Польша) и изделие медицинского назначения с барьерным механизмом действия «Мезогель» (ООО «Линтекс», г. Санкт-Петербург).

Таблетки «Купренила» предварительно механическим путем очищали от покрывающей их пленочной оболочки. В дальнейшем использовали очищенные от оболочки таблетки с общей массой одной таблетки (действующая субстанция и вспомогательные компоненты) 500 мг ± 1%.

Для внутрижелудочного способа введения очищенные от оболочки таблетки перетирали в керамической ступке до порошкообразной консистенции и вводили в соответствующей дозировке экспериментальным животным на крахмальном киселе через зонд.

Для внутрибрюшного введения из расчета на одну экспериментальную серию в асептических условиях 4 очищенных от оболочки таблетки (1000 мг пенцилламина) растворяли в 50 мл стерильного физиологического раствора. Полученный раствор в течение 1 часа перемешивали на магнитной мешалке. Действующая субстанции препарата «Купренил» - пеницилламин хорошо растворим в воде, поэтому его расчетная концентрация в растворе составляла 20 мг/мл. Далее для очистки полученного раствора от нерастворимых компонентов его пропускали через стерильный фильтр и подвергали ультрафиолетовой стерилизации. Микробиологическую чистоту полученного фильтрата подтверждали проведением контрольных посевов на стерильность.

Для исключения влияния вспомогательных компонентов, входящих в лекарственную форму «Купренил», на процесс адгезиогенеза в эксперимент была введена группа животных, которым внутрибрюшинно вводили только данные составляющие исследуемого препарата в эквивалентных дозах.

«Мезогель» вводили внутрибрюшинно интраоперационно в дозе 10,7 мл/кг веса. Способы, дозировки и кратность введения «Купренил» и «Мезогеля» экспериментальным животным представлены в табл. 1.

Оценка развития гуморального и клеточного иммунного ответа, функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов. Крыс иммунизировали однократным внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 2x109 клеток на 1 кг массы тела. Выраженность гуморального иммунного ответа (ГИО) оценивали на пятые сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа антителообразующих клеток (АОК) (Мальберг К., Зигль Э., 1987). Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) у крыс индуцировали

внутрибрюшинным введением 1x108 ЭБ в 0,5 мл 0,15 М раствора натрия хлорида. О выраженности ГЗТ судили по разнице масс (РМ) регионарного и контрлатерального лимфатических узлов и по разнице количества в них ка-риоцитов (РК) через 24 часа после введения разрешающей дозы антигена (Федосеева В.Н. и др., 1993).

Таблица 1

Препараты, дозировки, способы и кратность введения крысам со СПБП_

№ п/п Группа животных Использованные препараты и изделия медицинского назначения Доза Способ введения Кратность введения

1. Здоровые животные - - - -

2. СПБП - - - -

3. СПБП Физиологический раствор №С1 10,7 мл/кг Внутрибрюшинно интраоперационно Однократно

4. СПБП «Мезогель» 10,7 мл/кг Внутрибрюшинно интраоперационно Однократно

5. СПБП «Купренил» 160 мг/кг* Внугрижелудочно Ежедневно до забоя каждые 24 часа

6. СПБП Физиологический раствор №С1 10,7 мл/кг Внутрибрюшинно интраоперационно Однократно

Вспомогательные компоненты «Купренила» 160 мг/кг** Внутрибрюшинно интраоперационно Ежедневно до забоя каждые 24 часа

7. СПБП Физиологический раствор №С1 10,7 мл/кг Внутрибрюшинно интраоперационно Однократно

«Купренил» 160 мг/кг* Внутрибрюшинно интраоперационно Однократно

8. СПБП «Мезогель» 10,7 мл/кг Внутрибрюшинно интраоперационно Однократно

«Купренил» 160 мг/кг* Внугрижелудочно Ежедневно до забоя каждые 24 часа

9. СПБП «Мезогель» 10,7 мл/кг Внутрибрюшинно интраоперационно Однократно

«Купренил» 160 мг/кг* Внутрибрюшинно интраоперационно Однократно

* В перерасчете на действующую субстанцию - пеницилламин

** Из них 28 мг/кг картофельного крахмала; 106,4 мг/кг лактозы моногидрата; 16 мг/кг повидона; 6,4 мг/кг талька; 3,2 мг/кг магния стеарата.

Выделение нейтрофилов периферической крови проводили при центрифугировании в градиенте плотности фиколл-урографина (р=1,078) на 7-е и 14-е сутки после моделирования СПБП.

Выделение перитонеальных макрофагов осуществлялось на 7-е и 14-е сутки после моделирования СПБП. Через прокол передней брюшной стенки в брюшную полость умерщвленных животных вводили 10 мл стерильного охлажденного раствора Хенкса, производили энергичный массаж брюшной стенки и откачивали перитонеальный экссудат (клетки хранили на льду не более 10 мин). Макрофаги отделяли от других клеток путем их адгезии к поверхности пластиковых чашек Петри в присутствии инактивированной че-

ловеческой сыворотки. Неприкрепившиеся клетки удаляли, а адгезирован-ные клетки отделяли инкубацией с ЭДТА. Полученный осадок ресуспенди-ровали в 4 мл раствора Хенкса. Идентификация и жизнеспособность макрофагов оценивались методами витальной окраски (0,1% нейтральный красный) и по Романовскому-Гимза. Подсчет клеток, окрашенных витальным красителем, проводили в камере Горяева, цитодифференцировка проводилась по критериям: форма, относительные размеры клеток, наличие и форма ядра, цвет цитоплазмы.

Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови и пери-тонеальных макрофагов крыс исследовали после их инкубации с латексом. Для оценки фагоцитарной активности клеток использовали фагоцитарный индекс (ФИ) и фагоцитарное число (ФЧ) (Медведев А.Н., Чаленко В.В., 1991). Рассчитывали индекс активности фагоцитов (ИАФ) - произведение числа фагоцитированных бактерий и процента фагоцитирующих клеток деленное на число подсчитанных клеток (Фримель Г., 1987).

Кислородзависимую бактерицидную активность нейтрофилов периферической крови оценивали фотометрически в реакции восстановления нитро-синего тетразолия по показателям оптической плотности (тСЮ) в ИСТ сп. (спонтанный НСТ-тест), ИСТ инд. нз (стимулированный неопсонизиро-ванным зимозаном НСТ-тест), НСТ инд. оз (стимулированный опсонизиро-ванным зимозаном НСТ-тест) и вычисляли коэффициенты функционального резерва - КАо (отношение опсонизированного НСТ-теста к спонтанной реакции), КАн (отношение неопсонизированного НСТ-теста к спонтанной реакции) и КО (соотношение опсонизированного и неопсонизированного НСТ-теста) (Зинкин В.Ю. и др., 2004).

Для оценки метаболической бактерицидной активности перитонеаль-ных макрофагов использовали традиционную методику теста восстановления нит-росинего тетразолия (НСТ-тест). Параллельно со спонтанным (НСТ-сп.), ставили стимулированный НСТ-тест (НСТ-инд.), при этом в качестве стимулятора использовали зимозан. Рассчитывали функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) - разницу между диформазан-позитивными клетками в стимулированной реакции и диформазан-позитивными клетками в спонтанной реакции НСТ-теста (Виксман М.Е., Маянский А.Н., 1979; Щербаков В.И., 1989).

Морфологические методы. Морфологические изменения в брюшной полости исследовались с использованием визуально-описательного метода и оценкой выраженности СПБП методом семантического дифференциала, которая представляет собой систему перевода качественных характеристик спаечного процесса в цифровые значения. Показатели (распространенность процесса, деформация органов брюшной полости и выраженность конкретных видов спаек в соответствии с собственной классификацией) оценивались тремя экспертами, не информированными о сущности эксперимента, но владеющими методикой оценки выраженности спайкообразования (слепое исследование). Полученные средние значения умножались на коэффициенты значимости одноименных показателей, произведения суммировались (Липатов В.А., 2001).

Определяли площадь плоскостных сращений, длину окружности измеряли нитью, а затем вычисляли площадь гипотетического круга (Лазаренко В.А. 2011).

Слепую кишку с подпаянными тканями изымали для гистологического исследования. Морфологический материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Затем производили его гистологическое исследование с окраской срезов гематоксилин-эозином, пикро-сириус красным, и по Мал-лори в модификации Гапьденгейна с последующей световой микроскопией. Проводили микрофотографирование гистологических препаратов. С целью изучения морфометрических показателей определяли степень зрелости соединительной ткани, разработанным нами способом: осуществляли подсчёт клеточных элементов полуколичественным методом с присвоением баллов согласно количеству данного типа клеток и волокон. Кроме этого, на микрофотографиях измеряли толщину коллагеновых волокон в образованных спайках полуколичественным методом, а там где плоскостных сращений не формировалось исследовали толщину брюшины.

Статистическая обработка материала. Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средней арифметической (М) и ошибки средней (ш). Гипотеза о нормальности распределения признаков внутри группы проверялась с использованием критерия Шапиро-Уилка. Однородность групповых дисперсий проверялась с помощью критерия Ливиня. Достоверность статистических различий средних арифметических величин оценивалась при множественных сравнениях с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA): параметрических критериев Ньюмена-Кейлса, Стьюдента с поправкой Бонферрони и непараметрического критерия Крускала-Уоллиса, а также коэффициент ранговой корреляции Спирмена, факторный анализ. Статистически значимыми считали различия с р<0,05. Статистическую обработку материала выполняли в программных комплексах «STATISTICA 6.0» и «БИОСТАТИСТИКА для Windows».

По всем показателям рассчитывали коэффициент диагностической ценности, с его помощью определяли формулу расстройств путем выбора из всех изученных параметров трех ведущих, наиболее отличающихся от уровня нормы. Рейтинговый алгоритм устанавливали по величине степени расстройств, для чего исследованные параметры иммунного статуса выстраиваются в порядке снижающейся значимости отличий от заданных значений (Земсков A.M., Земсков В.М., Караулов A.B. и др., 2003). Степень изменения показателей под влиянием фармакологических средств определялась по формуле (Земсков A.M., Земсков В.М., Полякова С.Д., 1997).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Состояние врождённого иммунитета в условиях экспериментального СПБП при использовании «Купренила» и его комбинации с «Мезоге-лем». Известно - операционная травма провоцирует развитие иммунодефи-цитного состояния (Томашев П.Н., 2007; Чекмазов И.А., 2008; Лазаренко В.А.

и др., 2010). Кроме этого, результаты отдельных экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что вещества, сходные по своей химической структуре с «Мезогелем», могут усугублять иммуносупрессию, после моделирования СПБП (Гомон М.С., 2008). Развитие адгезивного процесса сопровождается местной воспалительной реакцией, выраженность и продолжительность которой зависит от состояния фагоцитарной системы на местном и системном уровнях. В связи с этим первым этапом работы стала оценка влияния «Купре-нила» и «Мезогеля» на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов крови и перитонеальных макрофагов.

В группе животных, без применения профилактических средств, развитие СПБП сопровождалось угнетением фагоцитарной активности полиморф-ноядерных лейкоцитов. Интраоперационное внутрибрюшное введение физиологического раствора и вспомогательных компонентов «Купренила» не предотвращало развитие супрессии. Введение «Мезогеля» снижало показатели ФП, ФЧ и ИАФ на всех сроках наблюдения (рис. 1).

Применение «Купренила» внутрижелудочно не влияло на сниженные показатели нейтрофилов крови, однако при внутрибрюшинном его введении на 7-е сутки отмечалось достоверное увеличение ФЧ и ИАФ. Наибольшего иммунокорригирующего эффекта удалось добиться при сочетанном использовании «Мезогеля» и «Купренила». Причем внутрибрюшинное использование последнего в составе выше обозначенной комбинации позволило нормализовать ФП, ИАФ уже на 7-е сутки. К 14-м суткам у животных, которым интраабдоминально вводился «Купренил» и «Мезогель» все исследуемые показатели фагоцитарной активности не отличались от уровня интактных крыс.

ФП ФЧ ИАФ ФП ФЧ ИАФ

Примечание:

1. * К — р<0,05 по отношению к интактным животным (К).

2. Треугольники - р<0,05 по отношению к аналогичным показателям крыс на 7-е сутки

эксперимента.

Рисунок 1. Фармакологическая коррекция фагоцитарной функции нейтрофилов крови «Купренилом» и «Мезогелем» при экспериментальном СПБП.

При исследовании кислородзависимой бактерицидной активности нейтро-филов крови выявлено максимальное угнетение показателей, как спонтанного, так и стимулированного НСТ-теста на 7-е сутки эксперимента. Использование «Мезогеля» к 7-м суткам еще больше уменьшало исследуемые показатели. Применение различных способов введения «Купренила» в виде монотерапии также характеризовалось усилением нарушения кислородзависимых бактерицидных механизмов, но эти изменения были достоверно менее выраженными, чем при использовании «Мезогеля». Использование комбинация «Купренила» с «Мезогелем» для профилактики СБПБ позволяло уже к 7-м суткам уменьшить выраженность иммуносупрессирующих эффектов «Мезогеля» (рис. 2).

Примечание:

1. * К - р<0,05 по отношению к интактным животным (К).

2. Треугольники - р<0,05 по отношению к аналогичным показателям крыс на 7-е сутки

эксперимента.

Рисунок 2. Фармакологическая коррекция нарушений кислородзависимой бактерицидное™ нейтрофилов крови «Купренилом» и «Мезогелем» при экспериментальном СПБП.

Перитонеальные макрофаги являются основными регуляторами воспалительного и адгезивного процессов брюшной полости. В отличие от нейтрофилов крови, их функциональная активность у животных с СПБП оказалась повышенной на всех сроках наблюдения. Введение в брюшную полость физиологического раствора и компонентов «Купренила» существенно не влияло на данные показатели. «Мезогель» к 7-м суткам достоверно снижал ФЧ и увеличивал ФП. Введение «Купренила» приводило на 7-е сутки к достоверному уменьшению этих показателей. Сочетанное использование «Мезогеля» и «Купренила» эффективно корригировало выявленные нарушения на всех сроках наблюдения, причем наибольшей эффективностью обладала схема, с внутрибрюшным введением «Купренила» (табл. 2).

Таблица 2

Изменения фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов _при СПБП на 7-е и 14-е сутки (М±ш)_

№ Группа животных Сутки после моделирования СПБП

7 14

ФП ФЧ ИАФ ФП ФЧ ИАФ

1 Здоровые животные 49,8±2,2 3,7±0,2 1,8±0,1 49,8±2,2 3,7±0,2 1,8±0,1

2 СПБП 75,8±3,8 •1 6,7±0,5 ♦1 5,1±0,4 ♦1 65Д±3,3 »1 5.6Ю,4 •!■:■- 3,7±0,3 »5

3 СПБП + 0,9% ЫаС1 в брюшную полость 73,7±3,7 *1 6,4±0,4 ♦1 4,7±0,35 ♦1 64,5±3,2 ♦1 5,3±0,4 ♦1 3,4±0,2

4 СПБП + М 86,4±4,0 «1-3 5,3±0,3 ♦1-3 4,6±0,3 ♦1 69.613,5 •1 4,1 ±0,3 ,-•2,5- 2,9±0,2 ' »1-2

5 СПБП + Кж 69,1±3,6 •1,4 5,6±0,3 ♦1,2 3,9±0,25 ♦1-3 60,2±3,0 ♦1,4 4,7±0,3 ♦1,2 2,8±0,3 .. «1-3 , ';

6 СПБП + ВККб 71,2±3,5 ♦1,4 6,3±0,4 ♦1,4,5 4,5±0,3 ♦1,5 66,4±3,1 ♦1 5,4±0,3 »1,4.5 ; 3,610,25 ,. »1,4.5

7 СПБП + Кб 60,8±2,9 ♦1-6 5,1±0,25 ♦1-3,6 3,1±0,2 ♦1-6 57,5±2,4 ♦1,4,6 4,010,25 ♦2,3,6 2,3±0,2 ♦1-3,6

8 СПБП + М + Кж 63,2±3,2 ♦1-4,6 4,5±0,2 ♦1-6 2,8±0,25 ♦1-6 53,7±2Л ♦г-4 3,9±0,2 ♦2,3,5 2,1±0,15 »1-6

9 СПБП + М+ Кб 52,4±2,1 ♦2-8 3,8±0,2 ♦2-8 2,0±0,15 ♦2-8 49,3±2,0 ♦2-7 3,5±0,2 ♦2,3,5,6 1,7±0,1 »2-8

Примечание: здесь и в последующих таблицах: 1. * — р<0,05; цифра рядом со звездочкой указывает на группу, по отношению к которой различия достоверны.

2- Ш - р<0,05 по сравнению с 7-ми сутками.

При оценке фунциональной активности активности перитонеальных макрофагов в НСТ-тесте был выявлен аналогичный вектор изменений (табл. 3).

Таблица 3

Изменения кислородзависимой бактерицидной активности перитонеальных _макрофагов при СПБП на 7-е и 14-е сутки (М±ш)_

№ Группа животных 7-е сутки 14-е сутки

НСТ-сп. НСТ-инд. ФРН НСТ-сп. НСТ-инд. ФРН

1 Здоровые животные 10,5±0,7 29,8±1,9 19,4±1,3 10,5±0,7 29,8±1,9 19,4±1,3

2 СПБП 26,2±2,2 »1 38,3±2,7 •1 12,1±0,8 ♦1 20,1±1,3 ♦1 35,9±2,4 »1 15,8±1,1 »!

3 СПБП + 0,9% №С1 в брюшную полость 25,4±2,0 ♦1 37,2±2,5 »1 11,8±0,9 ♦1 19,4±1,4 «1 34,8±2,3 15,4+1,0 • • «1.

4 СПБП + М 20,3±1,4 ♦1-3 36,4±2,4 ♦1 16,1±1,0 ♦1-3 14,3±1,1 »1-3... 29,3±1,8 16,0±1,2 »1

5 СПБП + Кж 23,1±1,8 ♦1 38,4±2,9 ♦1 15,3±1,2 ♦1-3 16,4±1,3 ♦1.2 ' 30,7±1,9 14,3±1,1 »1

6 СПБП + ВККб 24,8±1,9 ♦1,4 37,812,8 13,0±0,9 ♦1,4 19.2±1,2 *1Д5 . 33,6±2,1 14,4±1,0 ♦1

7 СПБП + Кб 21,3±1,6 ♦1 37,4±2,6 ♦1 16,1±1,1 ♦1,6 14,6±1,1 »1-3 30,2±1,8 15,6±1,0 ♦1

8 СПБП + М + Кж 16,2±1,2 ♦1-7 31,0±2,2 ♦2,3,5 14,8±1,0 ♦1,3 12,3±0,8 »2-7 32,4±2,3 20,1±1,4 - »2-7

9 СПБП + М+ Кб 11,410,9 ♦2-8 30,6±2,0 ♦2-7 19,6±1,4 ♦2-8 10,2±0,7 ♦2-8 29,1±1,8 »2,3 18,9±1,2 ♦2-7

Таким образом, нами подтверждены данные об угнетении функционально-метаболической активности нейтрофилов крови крыс в процессе развития спаечной болезни как на 7-е, так и на 14-е сутки эксперимента. Параллельно отмечалось увеличение активности перитонеальных макрофагов в эти же сроки наблюдения. Использование «Мезогеля» еще больше углубляло супрессию полиморфноядерных лейкоцитов крови, но уменьшало избыточно активированную функционально-метаболическую активность перитонеальных макрофагов. Монотерапия «Купренилом» сохраняла фагоцитарную активность нейтрофилов крови практически на уровне животных со СПБП и угнетала кислородзависимые бактерицидные механизмы. Наибольшей эффективностью в отношении фагоцитов крови и перитонеальной жидкости обладала схема с внутрибрюшным введением «Купренила» и «Мезогеля», позволявшая нормализовать практически все исследуемые показатели.

Состояние адаптивного иммунитета в условиях экспериментального СПБП полости при использовании «Купренила» и его комбинации с «Мезогелем». Важнейшую роль в обеспечении противоинфекционного иммунитета играет ГИО. В связи с этим далее исследовано влияние «Купренила» и «Мезогеля» в условиях СПБП на формирование ГИО на ЭБ.

У животных со СПБП угнетается развитие ГИО на ЭБ. Внутрибрюшин-ное введение «Мезогеля» животным со СПБП не влияло на число АОК в селезенке к 7-м и несколько увеличивало этом показатель к 14-м суткам эксперимента. «Купренил» в виде монотерапии стимулмровал развитие ГИО на ЭБ у животных со СПБП, причём его внутрибрюшное введение оказалось более эффективным. Полной нормализации формирования ГИО на ЭБ, удалось достичь на всех сроках исследования у животных со СПБП только при соче-танном внутрибрюшинном применении «Мезогеля» и «Купренила» (рис. 3).

Примечание:

1. Радиус окружности - показатели интактных крыс, принятые за 100%.

2. • - р<0,05 по отношению к интактным животным.

3. р<0,05 показателей полученных на 14-е сутки эксперимента по отношению к показателям крыс на 7-е сутки эксперимента.

Рисунок 3. Фармакологическая коррекция показателей адаптивного иммунитета «Купренилом» и «Мезогелем» при экспериментальном СПБП.

Реакция ГЗТ являясь защитной формой реагирования организма, представляет собой эффекторную фазу клеточного иммунитета, опосредованного, в основном, Т-лимфоцитами, цитокинами и привлеченными в качестве эф-фекторных клеток макрофагами. У животных со СПБП установлено угнетение формирования ГЗТ на 7-й, с нормализацией показателей на 14-й день эксперимента. Введение «Мезогеля» еще больше снижало показатели ГЗТ на всех сроках наблюдения. Внутрижелудочное применение «Купренила» не влияло на сниженные показатели РМ и РК к 7-м суткам и нормализовало их к 14-му дню наблюдения, при внутрибрюшном введении нормализация исследуемых параметров клеточного иммунитета происходила уже к 7-м суткам. Внутрижелудочное введение «Купренила» в сочетании с аппликацией «Мезогеля» на брюшину при моделировании СПБП уменьшало супрессирующие эффекты последнего в отношении показателей ГЗТ. Нормализация формирования ГЗТ наблюдалась только при внутрибрюшном введении «Купренила» и «Мезогеля» (рис. 3). Вспомогательные компоненты «Купренила» не влияли на показатели адаптивного иммунитета.

Таким образом, развитие послеоперационного СПБП сопровождается угнетением формирования адаптивного иммунитета. При этом наиболее выраженная супрессия ГИО на ЭБ наступает к 14-м, а ГЗТ к 7-м суткам эксперимента. Супрессия ГИО и ГЗТ на ЭБ усугубляется интраабдоминальным введением «Мезогеля». «Купренил» способен частично восстанавливать нарушенную иммунную реактивность при внутрижелудочном введении и полностью нормализовать исследуемые показатели ГИО и ГЗТ на ЭБ при локальном внутрибрюшинном введении, в том числе и при использовании в комбинации с «Мезогелем».

Влияние «Купренила» и его комбинации с «Мезогелем» на макро- и микроморфологические изменения брюшной при моделированном спаечном процессе. В группе моделирования СПБП выраженность внутри-брюшной адгезии была наибольшей. Отмечались спайки практически во всех областях брюшной полости, слепая кишка была значительно деформирована, подвздута, у всех животных припаяна к области перитонеальной травмы.

Таблица 4

Выраженность СПБП методом семантического дифференциала (М±т)

№ Группа Выраженность СПБП

п/п ЖИВОТНЫХ 7 14

I. СПБП 2,68±0,23 2,46±0,26

2. СПБП + 0,9% ЫаС1 внутрибрюшинно 2,41 ±0,18 ' 2,20±0,17

3. СПБП + М 0,84±0,13*' 0,83±0,12"'

4. СПБП + Кж 1,58±0,14"1-2 1,90±0,10*и

5. СПБП + ВККб 2,74± О.ЗО'3-4 2,32±0,21

6. СПБП+Кб 1,26±0,14''"" 1,33±0,16''°

7. СПБП + М + Кж О^ОАО.Ю"1'"-6 0,88±0, В*1'2,4"''

8. СПБП + М+ Кб 0,75±0,07*1-2'4"6 0,61±0,05*'"'

Введение в брюшную полость физиологического раствора и компонентов «Купренила» не влияло на выраженность СПБП. «Купренил» уменьшал спайкообразование, однако наименьшая степень адгезиогенеза наблюдалась в группе совместного использования его с «Мезогелем», причём введение «Купренила» на геле оказалось наиболее эффективным (табл. 4).

Одним из наглядных показателей эффективности противоспаечных препаратов является средняя площадь плоскостных сращений в области стандартной травмы брюшины. В группах с использованием «Мезогеля» плоскостных спаек не регистрировалось.

При гистологическом исследовании в условиях СПБП в зоне оперативного вмешательства выявлены выраженные реактивные изменения: интер-стициапьный отек, преобладание клеточного компонента над волокнистым, наблюдались многочисленные фибробласты, лимфоциты, плазмоциты, макрофаги, сегментоядерные нейтрофилы и эозинофилы (рис. 4а). В группах с использованием «Купренила» обнаружены одиночные и сгруппированные адипоциты, клеточный состав спаечного комплекса был достаточно скудным и представлен преимущественно фибробластами, фиброцитами и плазмоци-тами (рис. 46). В группе с введением «Мезогеля» в структуре грануляционной ткани спайки наблюдалось большое количество макрофагов (рис.4в). Применение «Купренила», при любых его путях введения, совместно с «Мезогелем» достоверно уменьшало спайкообразование на фоне активно проходящих репаративно-регенераторных процессов. При этом брюшная стенка, не вовлеченная в спаечный процесс, в местах ее экспериментального десеро-зирования, содержала регенерированную брюшину, не имеющую явно выраженных морфологических отличий с париетальной брюшиной интактных особей (рис. 4 г).

в)

Г)

Рисунок 4.

Гистологическая картина изменений в условиях СПБП при применении «Купренила» и его комбинации с «Мезогелем». Окр. Г+Э. Ув. х40

Проведенное микроморфометрическое исследование толщины колла-геновых волокон на фоне различных схем профилактики СПБП позволило установить, что применение «Купренила» способствует уменьшению толщины коллагеновых волокон в сравнении с группами контроля, причём внутрибрюшное его введение было более эффективно, чем внутрижелудоч-ное. Наибольший же эффект наблюдался при совместной внутрибрюшной 100 ..................^пт.тет1...............................птатг„....................жт^гггшг; аппликации «Купренила» и

пкс 90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

□тсттбп..............

.....В 4 СП БП+Кб

□ ТСПБП+М..................ВЗСПБП+Кж

.....и.5сп.бп±м+Кж ■.6спбп+м+кб «Мезогеля» (рис. 5).

rh

•1-4 А

Ыщ | *1-5

И

5 6

Примечание:

1. * — р<0,05, цифры рядом со звездочкой указывают по отношению к показателям какой группы эти различия достоверны

2. Треугольники - р<0,05 по отношению к аналогичным показателям крыс на 7-е сутки эксперимента

7-е сутки

14-е сутки

Рисунок 5. Толщина коллагеновых волокон в новообразованной соединительной ткани при использовании «Купренила» и «Мезогеля» в условиях СПБП.

Установлено, что максимальная степень зрелости соединительной ткани отмечается в группах с моделированным СПБП. При использовании «Мезогеля» степень зрелости была наименьшей. В группах получавших «Купре-нил» с «Мезогелем» наименьшая степень зрелости соединительной ткани отмечалась при внутрижелудочном введении первого (табл. 5).

Таблица 5

Степень зрелости новообразованной соединительной ткани при использовании «Купренила» и «Мезогеля» в условиях СПБП (М±ш)

№ п/п Группа животных Степень зрелости новообразованной соединительной ткани

7-е сутки 14-е сутки

1. СПБП 4,57±0,55 4,75±0,49

2. СПБП + 0,9% NaCl внутрибрюшинно 4,43±0,52 4,29±0,49

3. СПБП + М 1,34±0,12"''2 1,43±0,13"м

4. СПБП + Кж 3,5±0,35*'-J 3,57±0,34*'"3

5. СПБП + ВККб 4,69±0,4f"!-4 4,82±0,45*3'4

6. СПБП + Кб 2,5±0,25*'"5 2,57±0,23*'"5

7. СПБП + М + Кж 1,83±0,21*'"6 l^öiO.lS"1"6

8. СПБП + М+ Кб 2,17± 0,26"'"" 2,14±0,22*'~6

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о морфологическом подтверждении того, что применение «Купренила» и его комбинации с

«Мезогелем» при лечении спаечной болезни, не только препятствует спайко-образованию, но так же уменьшает экссудацию и интерстициальный отек, ускоряет формирование и созревание грануляционной ткани, стимулирует регенерацию, усиливая в целом пролиферативные процессы.

Сравнительная иммуно-морфологическая эффективность применения «Купренила» и «Мезогеля» в коррекции нарушений, возникающих при экспериментальном СПБП. Доказательная медицина диктует необходимость использования для оценки эффективности того или иного сочетания фармакологических препаратов современных методик статистического анализа. Поэтому на заключительном этапе работы был проведен сравнительный анализ иммуно-морфологической эффективности предложенных схем фармакологической и нефармакологической профилактики экспериментального послеоперационного спайкообразования. В качестве «основы» для сравнения были выбраны показатели животных с экспериментальным спаечным процессом в брюшной полости. Другие схемы, в которых использовались только «Мезогель», внутрижелудочное или интраабдоминальное введение «Купренила» в виде монотерапии или в сочетании с «Мезогелем» были приняты за альтернативные.

Для реализации данной задачи был использован метод оценки эффективности иммунокоррекции, предложенный A.M. Земсковым (1997). Его суть состоит в вычислении степени нарушений каждого из показателей иммунного статуса, а затем подсчете собственных корригирующих эффектов каждой схемы в виде суммы баллов коррекции по специальным формулам (Земсков A.M. и др., 1997).

Моделирование СПБП у крыс к 7-м суткам сопровождалось нарушением 11 из 12 показателей иммунного статуса на системном уровне и всех 6 на местном. ФРИС ИМСЛЗ. ВИД СООТВСТСТВ6ННОI НСТсп. iHCTcr. („/3)"2KAo"i и НСТиндЛФРЩФЧ^. К 14 суткам количество измененных показателей на системном уровне уменьшалось до 7 и ФРИС была KAo'iHCT^. (0/3)'i®4"i. На местном — изменений не происходило, поэтому ФРИС практически полностью сохраняла прежний вид: НСТш1Л +1 ФРН"iФЧ+2.

На 14-е сутки при использовании «Мезогеля» подтвердились иммуно-супрессирующие свойства последнего, так как количество измененных показатель на системном уровне увеличилось с 7 до 11, на местном же измененными оставались лишь 4 показателя из 6. ФРИС имела вид: HCTcn "iHCTCT (н/3)" iKAo'i и ФРН"1НСТ+2ФП+2. Внутрижелудочное введение «Купренила» также увеличивало количество нарушенных показателей на системном уровне до 8, а его интраабдоминальная аппликация наоборот снижала до 5 и 4 на системном и местном уровне соответственно. Использование «Купренила» в комбинации с «Мезогелем» позволило при внутрижелудочном введении первого уменьшить иммуносупрессорные эффекты на системном уровне и усилить иммунокорригирующие на местном, что отразилось в снижении количества нарушенных показателей и изменении ФРИС, которая на местном уровне приняла одночленный вид: ИАФ^. Внутрибрюшинное введение «Купренила» с «Мезогелем» полностью нормализовало все исследуемые показателей общего и локального иммунного статуса, препятствуя реализации иммуносу-прессорных свойств «Мезогеля» при экспериментальном СПБП (табл. 14).

Вычисление суммы собственных корригирующих эффектов на 14-е сутки показало, что при использовании схемы лечения с «Мезогелем» показатель был равен - -145, с внутрижелудочным введением «Купренила» - 168, с внутриабдоминальной аппликацией «Купренила» - 349, комбинации внут-рижелудочного введения «Купренила» и «Мезогеля» - 418 и сочетания ин-трабдоминальной аппликации «Купренила» и «Мезогеля» - 613.

Для выяснения механизмов влияния фармакологических препаратов на изучаемые показатели иммунной реактивности нами также использовались методы факторного анализа, позволяющие редуцировать показатели иммунитета, на которые исследуемые схемы оказывают минимальное воздействие и выделить те, которые максимально отвечают на проводимую фармакотерапию.

Установлено, что наиболее чувствительными факторами к воздействию использованных фармакологических схем оказались на системном уровне оказались АОК, ФЧ и ИАФ, на местном - ИАФ, НСТ-сп. Именно эти показатели, по-видимому, являются основными точками приложения действия «Купренила».

Далее с использованием корреляционного анализа были выяснены взаимосвязи между лабораторными показателями характеризующими иммунный статус на системном и местном уровне и степенью выраженности СПБП, рассчитанного методом семантического дифференциала, в зависимости от схемы профилактики на 14-е сутки эксперимента.

Установлено, что при использовании в качестве профилактики СПБП только «Мезогеля» отсутствуют достоверные корреляционные связи, между степенью выраженности спаечного процесса и исследованными показателями иммунного статуса на системном уровне. Данное обстоятельство не позволяет оценивать эффективность его противоспаечной терапии на основании исследованных параметров иммунитета. При использовании внутриже-лудочного введения «Купренила» выявлена одна отрицательная корреляционная связь средней силы с показателем НСТ-ст. (н/з) (г=-0,67; р<0,05), при его интраабдоминальной аппликации установлено две отрицательные корреляционные связи средней силы с количеством АОК (г=-0,68; р<0,05) в селезенке и НСТ-тестом (г=-0,68; р<0,001) в спонтанной реакции. При использовании комбинированных с «Мезогелем» схем выявлено большее количество корреляционных взаимосвязей между параметрами системного иммунного ответа и эффективностью противоспаечной терапии. Корреляционные взаимосвязи сохраняли свою отрицательную направленность, но их сила возрастала, особенно, при совместном внутрибрюшинном введении «Купренила» и «Мезогеля».

Следовательно, в условиях эксперимента по возрастанию степени эффективности, схемы профилактики СПБП можно расположить следующим образом: «Купренил» внутрижелудочно —> «Купренил» внутрибрюшинно —> «Купренил» внутрижелудочно + «Мезогель» —> «Купренил» внутрибрюшинно + «Мезогель».

Таким образом, в работе экспериментально обоснована возможность использования как отдельно «Купренила», так и его комбинации с «Мезогелем» для профилактики СПБП. Интраабдоминальная аппликация во время операции является наиболее оптимальным способом введения «Купренила» в ор-

ганизм для достижения максимальной фармакологической эффективности. Установленные иммуномодулирующие эффекты «Купренила» позволяют более эффективно препятствовать формированию спаек в брюшной полости, что еще раз подтверждает перспективность применения препаратов данной фармакологической группы в качестве новой категории антиадгезивных средств.

ВЫВОДЫ

1. Включение в схему профилактики послеоперационного спаечного процесса в брюшной полости «Купренила» уменьшает выраженность имму-нодефицитного состояния, вызываемого развитием адгезиогенеза и введением «Мезогеля».

2. В условиях экспериментального спаечного процесса на фоне внут-рижелудочного введения «Купренила» макроморфологическая степень выраженности адгезиогенеза уменьшается в 1,3 раза, при его внутрибрюшной аппликации - в 1,9 раз; при совместном введении «Мезогеля» с внутрижелу-дочным «Купренила» - в 2,8 раза, а при сочетанном внутрибрюшном введении «Мезогеля» и «Купренила» - в 4 раза по сравнению с группой животных, не получавших профилактическую терапию.

3. Использование для профилактики спаечного процесса в брюшной полости «Купренила», особенно интраабдоминальное введение, без и в комбинации с «Мезогелем» уменьшает толщину и площадь висцеро-париетальных спаек, клеточное разнообразие и средние значения диаметра коллагеновых волокон, замедляет созревание соединительной ткани спаек.

4. По степени возрастания иммунокорригирующая и противоспаечная эффективности использованные фармакологические средства располагается в следующей последовательности: «Купренил» внутрижелудочно —» «Купре-нил» внутрибрюшинно —» «Купренил» внутрижелудочно + «Мезогель» —> «Купренил» внутрибрюшинно + «Мезогель».

5. Наиболее информативными лабораторными иммунологическими показателями, позволяющими оценить эффективность профилактики экспериментального спаечного процесса при внутрибрюшинно аппликации комбинации «Мезогеля» и «Купренила» являются фагоцитарная функция нейтро-филов и перитонеальных макрофагов, показатель спонтанной реакции НСТ-теста перитонеальных макрофагов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные сведения о фармакологических эффектах различных схем профилактики экспериментального спаечного процесса в брюшной полости с использованием «Купренила» и его комбинации с «Мезогелем» рекомендовать для проведения доклинических и клинических испытаний.

2. Исследовать возможность получения новой лекарственной формы препарата с высокой противоспаечной активностью, путём иммобилизации действующей субстанции «Купренила» - пеницилламина и «Мезогеля».

3. Исследовать в клинике диагностическую ценность показателей функциональной активности нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов для оценки выраженности спаечного процесса и прогноза его течения в брюшной полости.

4. Использовать в учебном процессе медицинских вузов знания о возможностях фармакологической коррекции «Купренил» иммунодефицитного состояния, индуцированного спаечным процессом в брюшной полости и профилактическим применением «Мезогеля».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Современные способы профилактики спаечного процесса брюшной полости и спаечной болезни брюшины после оперативных вмешательств / A.M. Еф-ременков, В.А. Липатов, C.B. Костин, Е.В. Чернявский // Украинский научно-медицинский молодёжный журнал. - 2007. - № 3. - С. 269.

2. Ефременков A.M., Интраоперационные способы профилактики спаечного процесса брюшной полости / A.M. Ефременков, В.А. Липатов, К.С. Трофимов // Детская хирургическая служба Белгородской области, достижения, перспективы развития. - Белгород. - «ПОЛЛИТЕРА». - С. 74-78.

3. Ефременков A.M., Перспективы применения иммуномодулирующей терапии для профилактики спаечной болезни / A.M. Ефременков, A.B. Липатов // Детская хирургическая служба Белгородской области, достижения, перспективы развития. - Белгород. - «ПОЛЛИТЕРА». - С. 69-71.

4. Лазаренко В.А., К вопросу о рациональности использования препаратов с гиалуронидазной активностью с целью профилактики послеоперационной спаечной болезни брюшины и ее осложнений / В.А. Лазаренко, В.А. Липатов, A.M. Ефременков // Медицинский вестник Северного Кавказа. - 2009. - № 1 (13). -С. 39-40.

5. Липатов В.А., Перспективы применения вязких биоинертных гелей для профилактики послеоперационных спаечных сращений у детей / В.А. Липатов,

A.M. Ефременков, В.А. Лазаренко // Медицинский вестник Северного Кавказа. -2009. -№ 1 (13).-С. 40.

6. Острая спаечная кишечная непроходимость в хирургическом стационаре /

B.А. Липатов, A.M. Ефременков, A.C. Сотников, A.A. Булаткин // Материалы TV международной научной конференции молодых учёных-медиков (25-26 февр. 2010 г., г. Курск). - Курск. - 2010. - Т. 2. - С. 211-213.

7. Острая спаечная кишечная непроходимость в хирургическом стационаре / Сотников A.C., Лазаренко В.А., Липатов В.А., Ефременков A.M., Булаткин A.A. // Материалы научно-практической конференции хирургов Центрального федерального округа Российской Федерации «Актуальные вопросы хирургии» (27-28 мая 2010 г., г. Белгород). - Белгород, 2010. - С. 291-293.

8. Состояние адаптивного иммунитета при использовании «Мезогеля» и «Купренила» в условиях экспериментального спаечного процесса в брюшной полости / A.M. Ефременков, С.Б. Николаев, В.А. Липатов, А.И. Конопля // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 11 (Ч. 3). - С. 606-610.

9. Экспериментальное исследование противоспаечной эффективности D-пеницилламипа в сочетании с мезогелем при различных способах введения / В.А. Лазаренко, В.А. Липатов, A.M. Ефременков и др., // Научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2011. - № 4. - С. 56-65.

10. Современая семиотика острой спаечной кишечной непроходимости / В.А. Лазаренко, В.А. Липатов, A.C. Сотни ко j и др. // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2012. - Т. 5,№ 2. - С. 292-296.

11. Современные аспекты профилактики послеоперационного спаечного процесса брюшной полости / A.A. Булаткин, A.M. Ефременков, В.А. Липатов, В.А. Лазаренко // Материалы III международной конференции «Современные технологии и возможности реконструктивно-восстановительной и эстетической хирургии» (17-18 апр. 2012 г., г. Москва). - М„ 2012. С. - 103-106.

12. Сорбционные подходы к локальной профилактике послеоперационного спаечного процесса брюшной полости / В.А. Лазаренко, В.А. Липатов, В.А. Жуковский, A.M. Ефременков, A.A. Булаткин // Материалы III международной конференции «Современные технологии и возможности реконструктивно-восстановительной и эстетической хирургии» (17-18 апр. 2012 г., г. Москва). - М., 2012.-С. 106-108.

13. Влияние «Мезогеля» и «Купренила» на врожденный иммунитет на системном и местном уровне при экспериментальном спаечном процессе в брюшной полости / Ефременков A.M., Николаев С.Б., Конопля А.И. // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. - 2012. - Т.11, №2. -С.423-432.

14. Современные аспекты профилактики послеоперационного спаечного процесса брюшной полости / A.A. Булаткин, A.M. Ефременков, В.А. Липатов, В.А. Лазаренко // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных-медиков (27-28 февр. 2012 г., г. Казань). - Казань. - 2012. - С. 211-213.

Патент на изобретение:

1. Патент 2447848 Российская Федерация, МКП7 А61В17/00, А61К31/717, А61К31/145, А61Р41/00. Способ профилактики полостных спаек / Ефременков A.M., Лазаренко В.А., Бежин А.И., Липатов В.А., Булаткин A.A., заявитель и патентообладатель Курский гос. мед. у-т. - № 2010131096/14. заявл. 26.07.10, опубл. 20.04.12, Бюл. №11.-8 е.: ил.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АОК - антителообразующие клетки, тыс./селезенка; ВКК - вспомогательные компоненты «Купренила» ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа ГИО - гуморальный иммунный ответ ИАФ - индекс активности фагоцитоза; ед. Кб - «Купренил» внутрибрюшинно Кж - «Купренил» внутрижелудочно

КАн - коэффициент активации на неопсонизированный зимозан КАо - коэффициент активации на опсонизированный зимозан КО - коэффициент опсонизации М - «Мезогель»

HCT инд. (н/з) - стимулированный неопсонизированным зимозаном НСТ-тест, mOD

HCT инд. (о/з) - стимулированный опсонизированным зимозаном НСТ-тест, mOD

НСТ-сп. - спонтанный тест восстановления нитросинего тетразолия, % или mOD

НСТ-ст. - стимулированный тест восстановления нитросинего тетразолия, %

ФРН — функциональный резерв нейтрофилов, %

РМ - разница массы контралатеральных лимфатических узлов

PK - разница кариоцитов в контралатеральных лимфатических узлах

СПБП - спаечный процесс брюшной полости

ФП - фагоцитарный показатель, %

ФРИС - формула расстройств иммунной системы

ФЧ - фагоцитарное число, абс.

ЭБ - эритроциты барана

Подписано в печать 17.12.2012. Формат 60x84/16. Гарнитура Times. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 360. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИД «Белгород» 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Актуальность работы.

Актуальность исследований по поиску методов и средств профилактики спаечной болезни брюшины не вызывает сомнений. По данным международного общества изучения спаек (International Adhesion Society), послеоперационный спаечный процесс в брюшной полости является самым частым осложнением абдоминальных хирургических вмешательств. Кроме того, даже, несмотря на тщательно выполненную операцию по поводу спаечной болезни, продолжаются неоднократные поступления данной категории пациентов в различные лечебные учреждения с дальнейшим развитием у них стойкой ин-валидизации. Причем риск повторной операции нарастает с каждым оперативным вмешательством, достигая после пятой операции 47%. Об актуальности проблемы в целом свидетельствует и тот факт, что в США по поводу спаечной болезни ежегодно госпитализируется до 300 тыс. больных, при этом затраты только на лечение составляет более 1 млрд дол. [7, 147, 148].

В последние годы большинство авторов, изучая патогенез спаечной болезни, приходят к выводу, что одним из основных звеньев спайкообразова-ния является измененная иммунобиологическая реактивность организма в сочетании с нарушением синтеза коллагена [18, 116, 128]. Литературе данные касающиеся состояния и роли иммунитета у больных со спаечным процессом в брюшной полости неоднозначны. Так, уже известно о дисбалансе между системной и локальной продукцией цитокинов, изменением функциональной активности нейтрофилов и перитонеальных макрофагов [31, 53, 137, 189, 209]. В единичных исследованиях приводятся данные о развитии имунносу-прессии, сопровождающей послеоперационный спаечный процесс в эксперименте [31] и клинике [10, 137], обосновываются способы иммунокоррек-ции с использованием «Лонгидазы» и «Дерината» [31, 96].

В связи с этим, перспектива улучшения результатов лечения и профилактики спаечной болезни лежит, по мнению большинства ученых, в разработке, внедрении и усовершенствовании методов малотравматичных вмешательств и лекарственных препаратов, предупреждающих образование спаек в послеоперационном периоде [4, 14, 194]. К числу средств с доказанной высокой противоспаечной активностью относится препарат с барьерным механизмом действия - «Мезогель» [39, 66]. Однако, экспериментально установлено, что одним из побочных действий данного фармакологического средства является формирование стойкой супрессии показателей как адаптивного, так и врожденного иммунитета. При этом использование в комбинации с «Мезогелем» иммуномодуляторов «Лонгидазы» и «Дерината» позволяет повысить эффективность противоспаечной терапии и частично нивелировать иммуносупрессирующие эффекты первого [31, 56]. Третьим перспективным компонентом в составе комплексной терапии, который мог бы улучшить результаты лечения и профилактики спаечной болезни, является препарат, способный подавлять синтез коллагена и усиливать его деградацию. К числу таких фармакологических средств относится «Купренил» (О-пеницилламин), обладающий также собственной иммуномодулирующей активностью. В литературе имеются единичные сообщения о возможностях использования «Купренила» для профилактики образования послеоперационных спаек в брюшной полости без объективной оценки его фармакологической эффективности [128, 161].

Таким образом, для повышения эффективности профилактики послеоперационного спайкообразования целесообразно использовать комбинацию фармакологические препаратов, которые способны механически разобщать листки брюшины, подавлять синтез коллагена и обладать иммуномодулирующей активностью. В этой связи перспективными объектом изучения для достижения поставленной цели является использование комбинации «Мезо-геля» и Б-пеницилламина с учетом различных способов введения последнего в организм экспериментальных животных.

Цель - разработать способы профилактики развития послеоперационного спаечного процесса в брюшной полости с использованием различных способов введения «Купренила» без, и в комбинации с «Мезогелем».

Задачи исследования:

1. Оценить эффекты внутрижелудочного и внутрибрюшного введения «Купренила» на развитие клеточной и гуморальной форм иммунного ответа, функциональную активность нейтрофилов периферической крови и пе-ритонеальных макрофагов при экспериментальном спаечном процессе в брюшной полости.

2. Исследовать характер влияния комбинации «Купренила» с «Мезогелем» на врождённый и адаптивный иммунитет в условиях экспериментального внутрибрюшного адгезиогенеза.

3. Изучить морфологические изменения в брюшной полости при использовании «Купренила» без и в комбинации с «Мезогелем» в условиях экспериментального спаечного процесса.

4. Провести сравнительную оценку выраженности спаечного процесса в брюшной полости и иммуномодулирующей эффективности «Купренила» без и в сочетании с «Мезогелем».

5. Установить корреляционные взаимосвязи между параметрами им-мунной реактивности и морфологическими критериями выраженности экс-периментального спаечного процесса в брюшной полости при использовании «Купренила» без и в сочетании с «Мезогелем».

Научная новизна. Впервые установлено, что «Купренил» супрессирует функционально-метаболическую активность нейтрофилов крови, перитоне-альных макрофагов и стимулирует формирование гуморального иммунного ответа при экспериментальной спаечной болезни брюшины. Впервые выявлена инверсия иммуносупрессирующих свойств «Купренила» и «Мезогеля» на стимулирующие при сочетанном местном применении в условиях моделированного спаечного процесса брюшной полости. Впервые выявлены нарушения кислородзависимых бактерицидных механизмов перитонеальных макрофагов при экспериментальном спаечном процессе в брюшной полости. Доказана возможность эффективной фармакологической коррекции иммунных нарушений при экспериментальном спаечном процессе в брюшной полости локальной интраоперационной аппликацией «Купренила» и «Мезоге-ля». Установле-но макро- и микроморфологическими методами, что применение «Купренила» уменьшает выраженность спаечного процесса в брюшной полости. Показано, что противоспаечная и иммуномодулирующая активность исследуемых способов профилактики увеличивается в ряду: «Купре-нил» внутрижелудочно —» «Купренил» интраабдоминально —► «Купренил» внутрижелудочно + «Мезогель» —► «Купренил» интраабдоминально + «Ме-зогель».

Научная новизна исследования подтверждена патентом РФ на изобретение «Способ профилактики полостных спаек» (1Ш2447848).

Практическая значимость. Экспериментально обоснована возможность использования различных способов введения «Купренила» с целью профилактики послеоперационного спайкообразования в брюшной полости. Доказано, что значительное повышение эффективности коррекции нарушений врождённого и адаптивного на системном и местном уровне, также как и усиление антиадгезивной активности «Купренила» достигается при комбинации последнего с «Мезогелем».

Выявленные корреляционные взаимосвязи между показателями иммунитета и морфометрическими маркерами выраженности спаечного процесса в брюшной полости в условиях применения исследуемых фармакологических схем позволяют судить об эффективности проводимой терапии.

Материалы диссертации вошли в учебный процесс и научно-исследовательскую работу кафедры оперативной и топографической анатомии им. проф. А.Д. Мясникова, кафедры фармакологии Курского государственного медицинского университета; кафедры общей хирургии Воронежской государственной медицинской академии; кафедры клинической фармакологии и фармацевтических дисциплин института последипломного медицинского образования Белгородского государственного национального исследовательского университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Внутрижелудочное и интраабдоминальное введение «Купренила» уменьшает выраженность гистоморфологических проявлений спаечного процесса в брюшной полости без достаточной коррекции иммунных нарушений.

2. Использование «Купренила» совместно с «Мезогелем» позволяет значительно повысить эффективность противоспаечной терапии как на макро-, так и на микроморфологическом уровне, а также нивелировать формирование вторичного иммунодефицита, усиливающегося при изолированном применении «Мезогеля».

3. Интраабдоминальное использованием «Купренила» более эффективно, чем его внутрижелудочное введение.

4. Установлены лабораторные показатели, позволяющие судить об эффективности проводимой противоспаечной терапии с использованием «Купренила» и «Мезогеля».

Личный вклад автора. Автором проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертационного исследования, проведены серии экспериментов, получены и обобщены результаты исследования, проведена статистическая обработка и анализ полученных данных, сделаны выводы и практические рекомендации. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия автора 8595%.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях общероссийского и международного уровня: 70-й и 73-й итоговой конференции студентов и молодых учёных КГМУ (Курск, 2005 и 2008), I Всероссийской конференции молодых учёных

Воронеж, 2007), Международной научно-практической конференции студентов и молодых учёных «Актуальные проблемы современной медицины» (Киев, Украина, 2007), IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010), Научно-практической конференции хирургов Центрального федерального округа Российской Федерации (Белгород, 2010), II Международной научно-практической конференции «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» (Владикавказ, 2011), IV всероссийской конференции молодых учёных «Комплексный подход к диагностике, лечению и профилактике в медицине» (Воронеж, 2011), совместном заседании кафедр: фармакологии, клинической фармакологии Курского государствен» ного медицинского университета (Курск, 2012), VI Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных-медиков (Казань, 2012), III международной конференции «Современные технологии и возможности рекон-структивно-восстановительной и эстетической хирургии (Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертации в центральной и местной печати опубликовано 14 работ, в том числе 4 - в рецензируемых изданиях, согласно п. 10 «Положения о порядке присуждения ученых степеней», в которых содержится необходимый объем информации, касающейся темы диссертации.

Получен патент РФ на изобретение «Способ профилактики полостных спаек» (RU 2447848).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 21 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания методов исследования, изложения собственных результатов (4 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 158 отечественных и 60 иностранных источника.

109 ВЫВОДЫ

1. Включение в схему профилактики послеоперационного спаечного процесса в брюшной полости «Купренила» уменьшает. выраженность иммуно-дефицитного состояния, вызываемого развитием адгезиогенеза и введением «Мезогеля».

2. В условиях экспериментального спаечного процесса на фоне внут-рижелудочного введения «Купренила» макроморфологическая степень выраженности адгезиогенеза уменьшается в 1,3 раза, при его внутрибрюшной аппликации - в 1,9 раз; при совместном введении «Мезогеля» с внутрижелу-дочным «Купренила» - в 2,8 раза, а при сочетанном внутрибрюшном введении «Мезогеля» и «Купренила» - в 4 раза по сравнению с группой животных, не получавших профилактическую терапию.

3. Использование для профилактики спаечного процесса в брюшной полости «Купренила», особенно интраабдоминальное введение, без и в комбинации с «Мезогелем» уменьшает толщину и площадь висцеро-париетальных спаек, клеточное разнообразие и средние значения диаметра коллагеновых волокон, замедляет созревание соединительной ткани спаек.

4. По степени возрастания иммунокорригирующая и противоспаечная эффективности использованные фармакологические средства располагается в следующей последовательности: «Купренил» внутрижелудочно —> «Купренил» внутрибрюшинно —> «Купренил» внутрижелудочно + «Мезогель» —» «Купренил» внутрибрюшинно + «Мезогель».

5. Наиболее информативными лабораторными иммунологическими показателями, позволяющими оценить эффективность профилактики экспериментального спаечного процесса при внутрибрюшинно аппликации комбинации «Мезогеля» и «Купренила» являются фагоцитарная функция нейтрофилов и перитонеальных макрофагов, показатель спонтанной реакции НСТ-теста пе-ритонеальных макрофагов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные сведения о фармакологических эффектах различных схем профилактики экспериментального спаечного процесса в брюшной полости с использованием «Купренила» и его комбинации с «Мезогелем» рекомендовать для проведения доклинических и клинических испытаний.

2. Исследовать возможность получения новой лекарственной формы препарата с высокой противоспаечной активностью, путём иммобилизации действующей субстанции «Купренила» — Б-пеницилламина и «Мезогеля».

3. Исследовать в клинике диагностическую ценность показателей функциональной активности нейтрофилов периферической крови и перитонеаль-ных макрофагов для оценки выраженности спаечного процесса и прогноза его течения в брюшной полости.

4. Использовать в учебном процессе медицинских вузов знания о возможностях фармакологической коррекции «Купренил» иммунодефицитного состояния, индуцированного спаечным процессом в брюшной полости и профилактическим применением «Мезогеля».