Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Биологическая активность производных N-замещённых антраниловых кислот и их амидов

На правах рукописи

РГБ ОД

22ШШ1

Васильева Марианна Юрьевна

Биологическая активность производных ]Ч-замещённых антраниловых кислот и их

амидов

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Уфа - 2002

Работа выполнена на кафедре фармакологии Пермской государственной фармацевтической академии.

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

заслуженный деятель науки России и Мари Эл,

профессор КоллаВ.Э.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Алёхин Е.К.

доктор медицинских наук, главный сотрудник Лукманова К. А.

Ведущая организация:

Екатеринбургский государственный медицинский университет

Зашита диссертации состоится « /т^ » _2002г.

в /у часов на заседании диссертационного совета Д 208.006.03 при Башкирском государственном медицинском университете по адресу: 450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Башкирского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан 2002 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Эткина Э .И.

г ЛЗ г?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Воспаление лежит в основе большинства патологических процессов, поражающих людей разного возраста. Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) представляют собой класс лекарственных средств, фармакологическая активность которых направлена на предотвращение развития или снижение интенсивности воспаления. Они являются одними из наиболее часто используемых в клинической практике лекарственных средств (E.JI. Насонов, 2000). Их назначают приблизительно 20% стационарных больных, страдающих различными заболеваниями внутренних органов (Е.Л. Насонов и др., 1996). Наиболее широко НПВП применяются в комплексном лечении ревматоидного артрита, остеоартроза и других ревматических состояний, а процент этих заболеваний от общего числа не так уж мал. По данным A.Chetley (A.Chetley, 1993), ревматоидным артритом страдает около 1% взрослого населения планеты, а остеоартритом - 15% населения во всём мире. Отсюда понятно, почему арсенал противовоспалительных средств растёт и в практической медицине используют более 1000 одно- и многокомпонентных готовых лекарственных форм (таблетки, капсулы, свечи, мази и другие) (А,И. Бондарев, Ф.С. Зарудий, 1994).

Нестероидные противовоспалительные препараты близки по химическим свойствам и механизмам действия. В ¡971 году J. Vane, J. Smith и А. Willis установили, что противовоспалительные эффекты НПВП связаны в первую очередь с подавлением активности циклооксигеназы - ключевого фермента метаболизма арахидоновой кислоты и, в связи с этим, подавлением в тканях синтеза простагландинов (Г.Я. Шварц, 1980; Б.М. Клебанов, 1992; E.JI. Насонов, 2000). Вынужденное длительное применение НПВП приводит к появлению побочных эффектов: развитию гастропатий, которое может сопровождаться кровотечениями и появлением язв; изменению функции почек, печени, центральной нервной системы, нарушению гемо-поэза, возникновению кожных синдромов, развитию аллергических реакций (Ф.П. Тринус и др., 1975; Ф.П. Тринус и др., 1987; Я.А. Сигидин и др., 1988; Г.Я. Шварц, 1988; Б.М. Клебанов, 1992; А.И. Бондарев, Ф.С. Зарудий, 1994). Всё это свидетельствует о необходимости дальнейшего поиска НПВП среди производных различных химических классов для получения новых высокоэффективных и малотоксичных противовоспалительных средств.

Цель работы. Целью настоящего исследования является поиск противовоспалительных соединений среди новых производных антраниловой кислоты, выявление наиболее перспективных веществ для дальнейшего изучения.

Задачи исследования.

1. Провести скрининг 28 производных Ы-замещённых антраниловых кислот и их амидов на наличие среди них соединений, обладающих противовоспалительным и анальгетическим действием. Определить их острую токсичность.

2. Выбрать соединения с выраженным противовоспалительным действием и низкой токсичностью для дальнейшего углублённого изучения.

3. Изучить эффективность активных соединений при различных моделях воспаления с целью установления их возможного механизма действия.

4. Оценить выраженность противовоспалительного эффекта соединений и провести сравнение их активности со стандартными препаратами.

5. Изучить анальгетическое, жаропонижающее действие и другие виды биологической активности наиболее активных соединений.

Научная новизна работы. Впервые изучена биологическая активность 28 новых синтезированных производных №замещённых антраниловых кислот. Показано наличие противовоспалительной активности в этом ряду соединений. Произведено углублённое исследование двух наиболее активных соединений, которые проявляют высокий противовоспалительный эффект, не уступающий по силе ортофену, а также обладают некоторой анальгетической и жаропонижающей активностью, имеют низкую токсичность и значительную УШФД.

Научно-практическая значимость работы. В ряду исследованных 28 производных антраниловой кислоты обнаружено 19 соединений, обладающих противовоспалительной активностью, в том числе 9 соединений, которые не уступают противовоспалительному эффекту ортофена. Для доклинических исследований выявлено два наиболее активных соединения (229-КЛ - амид К-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты и 225-КЛ -амид К-аллил антраниловой кислоты), которые являются малотоксичными и более безопасными, чем ортофен.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на научных конференциях профессорско-преподавательского состава ПГФА (2000, 2001); на межвузовской конференции, посвященной 40-ому выпуску провизоров ПГФА ( Пермь, 2000); на межвузовской конференции молодых учёных и студентов (Ижевск, 2001); на международной научной конференции «Фармация в XXI веке: инновации и традиции» (С-Петербург, 1999); на Российской научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2000). По материалам диссертации опубликовано 7 тезисов, получен один патент, 1 статья в Информационном бюллетене ПГФА "Экспериментальная фармакология", №3, 1999, 1 статья - в «Химико-фармацевтическом журнале», №4, 2001.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Подтверждена целесообразность дальнейшего поиска соединений, об ладающих противовоспалительным действием в ряду производных ан-траниловой кислоты.

2. Показана высокая противовоспалительная активность значительного числа исследованных соединений (67,8%), обладающих также анальге-тическим действием и низкой токсичностью.

3. Среди исследованных соединений выявлены два - 229-КЛ (амид N-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты) и 225-КЛ (амид И-аллил ан-траниловой килоты). Данные соединения обладают выраженной противовоспалительной, анальгетической и жаропонижающей активностью, сравнимой с ортофеном и значительно менее токсичны. Данные вещества рекомендованы для детального изучения с целью дальнейшего представления в Фармкомитет.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исседования, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, иллюстрирована 22 таблицами, 10 рисунками. Библиографический указатель содержит 203 источника, из них 76 - иностранных.

Материалы и методы исследований

Экспериментальному изучению были подвергнуты 28 новых соединений, являющихся производными М-замещёшшх аятраниловых кислот и их амидов, впервые синтезированных на кафедре фармацевтической химии под руководством доктора фармацевтических наук, профессора Л.М. Кор-кодиновой. Исследуемые соединения имеют следующую химическую

ОН; Ш2; ШС6Н5; ШСбН4СН30-2; >ШС6Н4СН30-3; ШС6Н4СНзО-4; ШС6Н4ОСН3-4; КНС6Н4СН3-2; ШС6Н4СН3-3; ШС6Н4СН3-4; ШЗДВМ; ШСбН4С1.

Н; СО; СОСН3; СОСбН5; СОСН2С1; СН2СН=СН2; СН2СН=СС1Н3; СОС2Н5. Н; СН2; СН2СН; СН2СН=СС1СН3; СН2С6Н5.

В качестве препаратов сравнения были использованы ортофен и ме-фенамовая кислота.

структуру:

а

где:

СОР1

N р _

^ Яз

Яз=

Эксперименты проведены на 544 беспородных белых крысах и 811 беспородных белых мышах. Распределение животных по сериям эксперимента отражено в таблице 1.

Проведено две группы экспериментов. Первая группа - скрининговое изучение противовоспалительной, анальгетической активности и острой токсичности производных антраниловой кислоты, а вторая группа экспериментов посвящена изучению фармакологического действия отобранных соединений с высокой биологической активностью.

Таблица 1

Распределение животных по видам эксперимента

№ п/п Модель исследования Путь введения Вид животных Число животных в группе Общее число ЖИВОТНЫХ Вид активности

1 2 3 4 5 6 7

Скрининговые исследования

1 Каррагениновая модель воспаления В/б* Крысы 5 150 ПВА*

2 Серотониновая модель воспаления В/б Крысы 5 50 ПВА

3 Гистаминовая модель воспаления В/б Крысы 5 50 ПВА

4 Методика термического раздражения В/б Мыши 10 290 АА*

5 Острая токсичность (по В.Б. Прозоровскому) В/б Мыши 2 224 ОТ*

Изучение отобранных соединений

6 Определение ЭД50 по каррагениновой модели воспаления П/о Крысы 5 45 ПВА

7 Определение ЭД50 по серотониновой модели воспаления П/о Крысы 5 50 ПВА

8 Определение ЭД50 по гистаминовой модели воспаления П/о Крысы 5 50 ПВА

9 Формалиновая модель воспаления П/о Крысы 6 24 ПВА

10 Методика «ватной» грану лймы П/о Крысы 8 32 ПВА

б

Подолжение таблицы 1

1 2 3 4 5 б 7

11 Методика «уксусных корчей» П/о Мыши 10 100 АА

12 Определение ЭД50 по методике «уксусных корчей» П/о Мыши 5 40 АА

13 Острая токсичность ( по Литчфильду и Уилкоксону) В/б Мыши 5 45 ОТ

14 Определение жаропонижающего действия П/о Крысы 6 24 Жаро-понижаю-щая

15 Модель гиперкапниче-ской гипоксии В/б Мыши 8 32 Анти-гипок- си-ческая

16 Определение ульцеро-генного действия П/о Крысы б 24 Ульце-роген- ное действие

17 Модель недифференцированного фагоцитоза В/б Мыши 5 25 Фагоцитарная активность

В/б - внутрибрюшинно; П/о - перорально: ПВА - противовоспалительная активность; АА - анальгетическая активность; ОТ — острая токсичность.

Всего: крысы - 544; мыши - 811.

Острую токсичность соединений определяли на мышах при внутри-брюшинном введении по экспресс-методу В.Б. Прозоровского (1992) и для соединений 229-, 225-KJI - по Г.П.Першину (1950) с расчётом по Литч-фильду и Уилкоксону на мышах и крысах при внутрибрюшинном и перо-ральном введении (M.JI. Беленький, 1963).

Оценка противовоспалительной активности. В качестве скрининговой модели воспаления использовали артрит, вызванный субплантарным введением в заднюю лапу крыс 0,1мл 1% водного раствора каррагенина (C.A.Winter et al., 1962). Соединения вводили в виде взвеси в 2%-кой

крахмальной слизи внутрибрюшинно в дозе 50мг/кг за 1 час до воспроизведения воспаления (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000). Интенсивность экссудации оценивали онкометрически (A.C. Салямон, 1958) по изменению объёма воспалённой конечности до начала опыта, через 1 и 4 часа. Активность соединений выражали в процентах торможения отёка стопы по отношению к контролю. Наиболее активные соединения были испытаны перорально в пяти дозах с вычислением ЭД50.

Механизм действия девяти перспективных веществ изучали по нескольким моделям острого асептического воспаления. Отёк вызывали инъекцией под плантарный апоневроз 0,1мл 0,1% раствора гистамина или 0,1мл 0,01% раствора серотонина. Интенсивность отёка оценивали по изменению объёма воспалённой конечности онкометрически до начало опыта и через 30, 60, 90минут, 2 и Зчаса после введения гистамина и серотонина. Наиболее активные соединения были изучены при пероральном введении с расчётом ЭД50. С целью изучения лечебного эффекта два наиболее активных соединения (229-KJI и 225-КЛ) были проверены на модели формалинового воспаления лапы крыс. Вещества вводили перорально в дозе ЭД50 по каррагениновой модели воспаления через 4 часа после введения флогогенного вещества (0,1мл 2%-го водного раствора формалина). Ежедневно на протяжении четырёх дней соединения вводили перорально в той же дозе. Степень развития отёка у леченых животных ежедневно сравнивали с отёком у контрольных крыс. Уменьшение отёка выражали в процентах по отношению к контролю.

Антипролиферативный эффект соединений 229-, 225-КЛ изучали в экспериментах на модели «ватной» гранулёмы, которая воспроизводит по-дострое воспаление. С первого дня и на протяжении всего наблюдения опытным крысам ежедневно вводили исследуемые вещества внутрижелу-дочно с помощью зонда в среднеэффективной дозе по каррагениновому тесту. На 8 сутки опыта определяли вес образовавшейся грануляционно-фиброзной ткани по разнице между весом высушенной гранулёмы и имплантированного ватного шарика.

Оценка анальгетической активности. Скрининговые исследования проводили по тесту "горячая пластинка" на мышах (N.B. Eddy and D.J. Leimbach, 1953). Все исследуемые соединения вводили внутрибрюшинно в дозе 50мг/кг (ортофен в дозе 10мг/кг) за 0,5 часа до тестирования в виде взвеси в 2%-ной крахмальной слизи. Время наступления рефлекса определялось через 30 минут, 1 час, 2 и 3 часа после введения соединений. Анальгетическая активность девяти перспективных соединений исследована по методике «уксусных корчей» на мышах (С.Н. Cashin, 1977). Уксусную кислоту вводили в виде 0,75% водного раствора внутрибрюшинно в объёме 0,25мл. Соединения вводили через желудочный зонд за 1 час до уксусной кислоты в дозе 50мг/кг, а ортофен - в дозе 10мг/кг. Для веществ

229-КЛ и 225-КЛ были определены ЭД50 по тесту «горячая пластинка» и «уксусные корчи» при пероральном введении.

Определение жаропонижающего действия. Активность соединений 229-, 225-КЛ оценивали по способности их оказывать жаропонижающий эффект у крыс с лихорадкой, вызванной введением пирогенала внутривенно в дозе 500 минимальных пирогенных доз на кг массы тела животного. Исследуемые вещества и ортофен вводили перорально однократно в дозе 1/ЮЛД50 на фоне максимального повышения температуры (через 1час).

Изучение антигипоксической активности. Антигипоксическая активность изучалась по методу «баночной» гипоксии с гиперкапнией на мышах (П.И. Лукиенко, 1968). Соединения и ортофен вводили внутрибрюшинно в дозе 1/1ОЛД50за 1 час до помещения животного в сосуд.

Определение ульцерогенного действия. Оценивали влияние соединений 229-,225-КЛ на слизистую желудочно-кишечного тракта при введении их крысам через рот в 0,1% суспензии карбоксиметилцеллюлозы в объёме 1мл/100грамм массы тела. Вещества и препарат сравнения - ккдометацип вводили один раз в сутки в течение 4-х дней в дозе 1/5ЛД50 (Метод. Рекомендации МЗ СССР, 1989).

Изучение влияния соединений на фагоцитоз и количество лейкоцитов. Влияние соединений 229-,225-КЛ на фагоцитоз оценивали по поглощению формалинизированяых эритроцитов барана (ФЭБ) (В.Н.Каплин, 1992). Вещества и ортофен вводили мышам внутркбрюшинно в дозе ШОЛДзоза 1час до введения 0,01мл 1% ¡зодного раствора каррагенина. Через 4 часа получали кровь декапитацией. Данные опыта сравнивали с данными у контрольных животных, которым вводили 2%-ную крахмальную слизь на фоне воспаления и с данными интактных животных (без воспаления). Определялись следующие показатели: 1) процент фагоцитоза - количество «истинных» фагоцитов из 100 подсчитанных фагоцитов; 2) фагоцитарное число - количество объектов фагоцитоза, которое в среднем приходится на 1 из 100 подсчитанных фагоцитов; 3) фагоцитарный индекс - количество объектов фагоцитоза, которое приходится на один «истинный» фагоцит. Количество лейкоцитов определялось в камере Горяева.

Результаты всех экспериментов обрабатывали статистически, с помощью ПЭВМ, с вычислением критериев достоверности Стьюдента при р < 0,05 (М.Л. Беленький, 1963).

Результаты исследований

Скрининговые исследования показали, что противовоспалительной активностью обладают 19 из 28 соединений (67,8%). В дозе 50мг/кг девять соединений тормозят развитие воспалительного отёка более чем на 51%, не уступая по силе противовоспалительного действия ортофену (10мг/кг) и мефенамовой кислоте (100мг/кг) (см. таблицу 2).

Противовоспалительная активность производных ^замещённых антраннловых кислот при внутрибрюшинном введении белым крысам в дозе 50мг/кг

Шифр соединений Рациональное название % торможения каррагенинового отёка к контролю

через 1 час через 4 часа

1 2 3 4

229-кл Амид N-(3 '-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 66,7 68,3

215-кл Фениламид Т<[-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 49,0 62,0

230-кл М-ацетил-1чт-аллил антраниловой кислоты 59,0 60,2

236-кл Фениламид №фуроил-№(-3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 47,8 60,0

214-кл 2-Метилфениламид М-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 27,0 59,0

217-кл З-Метилфениламид №хлорацетил-М-аллил антра-ккловоя кислоты 36,4 58,4

220-кл Анилид К-ацетил-Кт-(3'-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты 33,1 57,3

219-кл З-Метилфениламид 1чт-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 69,9 53,6

225-кл Амид К-ал лил антраниловой кислоты 38,0 51,6

221-кл 2-Метиланилид К-ацстил 1Ч-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 52,8 50,1

231-кл И-ацетил М-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 60,9 42,7

234-кл М-хлорацетил М-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 51,0 41,9

213-кл 4-Метилфениламид >ЦЗ'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 30,3 40,5

238-кл Фениламид М-этинил N-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 30,3 46,3

212-кл ..... 4-Метоксифениламид Ы-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 47,4 38,8

Продолжение таблицы 2

1 2 3 4

233-кл Ы-Бензоил 1\т-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 55,3 27,7

235-кл М-Фуроил М-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 46,9 29,5

222-кл З-Метиланилид И-ацетил- М-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 21,4 49,7

223-кл 4-Метиланилид Ы-ацетил- Н-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 30,9 45,4

224-кл 4-Метоксианилид М-ацетил-М-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 34,6 42.4

237-кл Фениламид М-хлорацетил- >}-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 38,0 32,9

239-кл 4-Хлорфениламид К-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 43,6 27,6

232-кл 4-Броманилид 1\т-ацетил ]\т-(3'-лЛорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 15,6 25,4

227-кл Амид антраниловой кислоты 34,6 5,3

218-кл 4-Метилфениламид И-бензил антраниловой кислоты 19,0 16,5

216-кл 4-Броманилид 1^-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты 14,0 18,0

228-кл Амид М-ацетил антраниловой кислоты нт нт

240-кл Фениламид М-бензоил М-(3'-хлорбутеп-2'-ил) антраниловой кислоты 19,4 нт

Ортофен 10мг/кг 37,8 61,3

Мефенамовая кислота 50 мг/кг 21,8 37,6

Мефенамовая кислота 100 мг/кг 32,0 56,2

нт - нет торможения

Как видно из таблицы, соединения по-разному влияют на динамику воспалительного процесса. Так, соединения 214-КЛ и 222-КЛ через 1 час после введения флогогенного агента не оказали противовоспалительного действия, зато через 4 часа эти же вещества проявили выраженный противовоспалительный эффект. Наоборот, соединения 233-КЛ и 239-КЛ через 1

час оказали выраженное противовоспалительное действие, а через 4 часа не проявили эффекта. Девять соединений с выраженным противовоспалительным эффектом по каррагениновой модели воспаления были обследованы на моделях серотонинового и гистаминового воспаления при внутри-брюшинном введении крысам. Все девять соединений показали чёткую противовоспалительную активность на серотониновой модели воспаления (см. таблицу 3). Из таблицы видно, что все вещества и ортофен достаточно сильно тормозят развитие серотонинового отёка уже через 30 минут после введения флогогена, а через три часа почти полностью снимают отёк лапы.

Таблица 3

Противовоспалительная активность производных антраниловой кислоты на серотониновой модели воспаления при внутрибрю-шинном введении крысам

№

п/п Шифр соеди- % торможения серотонинового отёка к контролю

нений,

название пре- 0,5 часа 1 час 1,5 часа 2 часа 3 часа

парата

1 229-кл 75,7* 63,5 67,2* 65,2* 72,5*

2 225-кл 63,9 /" ч Л 66,3* ГП t J. /СО С*

3 215-кл 67,4* 64,5 64,0* 62,7* 74,6*

4 214-кл 47,7 41,5* 50,9* 26,1* 64,5

5 219-кл 68,9* 63,1 69,6* 60,5* 70,8*

6 220-кл 40,3* 35,5* 42,8 47,2 49,0

7 217-кл 59,3 48,6 60,5* 53,6 52,3

8 230-кл 74,9* 75,9* 66,5* 67,9* 76,9*

9 236-кл 65,6* 58,7 64,2* 51,Ъ 63,4

10 Ортофен 59,3 54,3 33,8 41,2 55,2

*- данные достоверно отличаются от ортофена при р < 0,05

Развитие гистаминового отёка исследуемых веществ и ортофена показано в таблице 4, из которой видно, что соединения, такие как 229-, 215-, 214-, 236-KJI проявляют противовоспалительное действие уже через 0,5 часа, которое постепенно усиливается при наблюдении за развитием отёка в течении 3-х часов, действуя на уровне ортофена. Соединение 225-КЛ действует аналогично ортофену. Однако, соединения 217-, 230-КЛ тормозят развитие гистаминового отёка только через 0,5часа, а затем не оказывают противовоспалительного действия.

Противовоспалительная активность производных аитраниловой кислоты на гистаминовой модели воспаления при внутрибрюшин-ном введении крысам

№ Шифр, наз- % торможения гистаминового отёка к контролю

п/п вание 0,5 часа 1 час 1.5 часа 2 часа 3 часа

1 229-кл 40,2 27,1 36,5* 47,4 48,3*

2 225-кл 36,4 47,2* 52,9* 60,2* 68,4

3 215-кл 31,2 26,7 29,3 33,5* 39,0*

4 214-кл 30,9 26,2 21,7 25,5* 37,8*

5 219-кл 31,7 35,8 44,2* 33,4* 13,6*

6 220-кл 33,3 35,4 46,6* 43,7 28,2*

7 217-кл 34,1 0 8,8* 17,2* 29,6*

8 230-кл 40,6 1,4* 18,7* 20,5* 0

9 236-кл 28,6 32,1 35,2* 37,7 43,0*

10 Ортофен 36,3 29,7 20,9 43,3 61,0

♦-данные достоверно отличаются от ортофена при р < 0,05

Скрининговое изучение анальгетической активности 28 производных антраниловой кислоты проводили по методике термического раздражения. Среди обследованных веществ выявлено пять соединений, проявляющих некоторую анальгетическую активность, т.е. вызывают увеличение времени оборонительного рефлекса на пике действия более чем на 50% по сравнению с исходными данными. Соединение 225-КЛ по данной методике показало наибольшую анальгетическую активность (38,0 секунд). У девяти соединений, которые показали высокую противовоспалительную активность, обезболивающее действие было изучено по методике «уксусных корчей», так как эта модель является более специфичной и, по данным В.В.Либиной (1988), имеет простагландиновый генез. Из таблицы 5 видно, что соединения 229-, 225- и 219-КЛ существенно повышали порог болевой чувствительности опытных животных, вызывали торможение болевой чувствительности более чем на 50% по сравнению с животными контрольной группы. Два соединения (220- и 236-КЛ) показали анальгетическую активность по данной методике на уровне ортофена и мефенамовой кислоты. Три соединения (215-,214-,217-КЛ) снижали количество «корчей» более чем на 30%.

Анальгетическая активность производных антраниловой кислоты по методике « горячей пластинки» и «уксусных корчей»

№ п/п Шифр, Название Время рефлекса на пике действия, с Количество « уксусных корчей» % торможения «уксусных корчей» к контролю

1 229-кл 13,3 9,0 71,8*

2 225-кл 38,0* 11,2 62,4*

3 215-кя 20,2 17,0 42,9*

4 - 214-кл 15,2 19,2 35,5*

219-кл 13,6 ill и,о сс -з*

б 220-кл 15,2 22,0 26,1

7 217-кл 13,6 20,6 30,8*

8 230-кл 16,4 30,4 0

9 236-кл 11.3 22,0 26,1

10 Ортофен 10мг/кг 17,4 23,6 20,8

Н Мефенамовая кислота 50мг/кг 23,8 21,4 28,1

12 Контроль 11,2 29,8 -

■"-данные достоверно отличаются от ортофена в дозе 10мг/кг при р < 0,05

Изучение острой токсичности производных М-замещённых антрани-ловых кислот и их амидов показало, что 28 соединений относятся по классификации К.К.Сидорова (1973) к малотоксичным, практически нетоксичным и относительно безвредным веществам. А по ГОСТу к умеренно опасным либо малоопасным веществам. Шесть соединений относятся к группе относительно безвредных и малоопасных веществ. Двадцать веществ - к практически нетоксичным и умеренно опасным, а два соединения - к малотоксичным и умеренно опасным веществам.

В целом скрининг веществ показал, что большинство изученных нами соединений обладает низкой токсичностью; девять соединений имеют выраженный противовоспалительный эффект на моделях каррагенинового и серотонинового воспаления, не уступающий ортофену; семь веществ показали активность при гистаминовом воспалении; шесть соединений обладают анальгетической активностью по методике «уксусных корчей». По

результатам скрининга нами были отобраны два наиболее активных соединения 229-КЛ и 225-КЛ.

Углублённое изучение соединений 229-КЛ и 225-КЛ.Острая токсичность для соединений 229-КЛ и 225-КЛ была определена по Литчфильду и Уилкоксону на мышах и крысах при внутрибрюшинном и пероральном введении. Результаты этих опытов представлены в таблице 6.

Таблица б

Острая токсичность соединений 229-,225-КЛ, ортофена и мефсна-мовой кислоты для крыс и мышей при пероральном и внутрибрюшинном введении

№ п/п Шифр, назва- ЛД50, мг/кг

ние Мыши Крысы

Г"о В/5 П/о В/5

1 229-КЛ >8000,0 32™>0 (3033,0+3376,0) >8000,0 2560,0

2 225-КЛ 3906,0 (3723,5+4097,3) 1250,0 (1126,0+1387,0) 4341,3 (3192,1+5904,1) 1389,2 (1021,4+1889, 3)

3 Ортофен 370,0' (247,0+555,0) 74,0 (48,8+112,2) 370,0" (247,0+533,0) 135,0'

4 Мефенамовая кислота 590,0' (527,0+661,0) 150,0-(113,0+198,0) 520,0" (419,0+644,0) 180,0" (123,0+262,0)

Примечание: по данным 1 - Я.С.Сигидина, Г.Я.Шварца, 1988; 2 -А.Ф.Голеневой, Е.Л.Пидэмского, 1991; 3 - Г.И.Степанюк и соавт., 1990; 4-Ф.П.Тринус и соавт., 1975; 5 - Н.А.Мартыновой и соавт., 1983; 6 - Ф.П. Тринус, НЛ.Мохорт, 1971

Из таблицы 6 видно, что исследованные соединения менее токсичны, как при внутрибрюшинном, так и при пероральном пути введения, чем ор-тофен и мефенамовая кислота.

Как указано выше, соединения 229-КЛ и 225-КЛ показали высокую противовоспалительную активность при внутрибрюшинном введении на моделях каррагенинового, серотонинового и гистаминового воспаления. Учитывая, что нестероидные противовоспалительные средства применяются перорально, мы изучили противовоспалительную активность при пероральном пути введения крысам на указанных ранее видах воспаления. Была определена ЭД50 при пероральном введении на всех видах воспаления. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Острая токсичность, противовоспалительная активность и УШФД соединений 229-КЛ, 225-КЛ и ортофена при различных моделях воспаления

Шифр соединений, на- ЛД5о, мг/кг Каррагениновое воспаление Серотониновое воспаление Гистаминовое воспаление

звание препарата ЭД50, мг/кг УШФД ЭДзо, мг/кг УШФД ЭДзо, Мг/кг УШФД

229-КЛ >8000,0 60,0 (50,4+ 71,4) 133,3* 74,0 (55,2+ 99,2) 108,1* 77,3 (63,294,5) 103,4*

225-КЛ 4341,3 (3192,1+ 5904,1) 135,0 (110,6+ 164,7) 32,1 112,0 (73,6+ 170,4) 38,7 94,0 (66,0+ 133.8) 46,1

Ортофен 370,0** (247,0+ 533,0) 8,0*** (4,0+ 14,0) 46 о 4.** (5,1+ 7,8) 39,3 6,2** (2,8+ 13,6) 59,6

Примечание: *- данные достоверно отличаются от ортофена при р < 0,01; **- по данным А.Ф.Голеневой, Е.Н.Пидэмского и соавт. (1991); ***-по данным Я.А.Сигидина, Г.Я.Шварца и соавт. (1988)

Из которой видно, что исследованные соединения обладают выраженной противовоспалительной активностью и имеют значительно большую широту фармакологического действия (УШФД), и, следовательно, являются более безопасными.

Учитывая важность лечебного использования исследованных соединений, мы изучили их действие при развившемся формалиновом воспалении. Динамика развития формалинового отёка при пероральном введении исследуемых веществ и ортофена в сравнении с контрольной группой животных представлена в таблице 8. Из которой видно, что соединение 229-КЛ тормозит развитие формалинового отёка на 58,5%, а ортофен и соединение 225-КЛ на 32,6 и 38,8% уже через 4 часа и эффект соединений длится на протяжении четырёх суток.

Противовоспалительная активность соединений 229-, 225-КЛ и орто-фена при формалиновой модели воспаления

№ п/п Шифр, название % торможения формалинового отёка

4часа 24часа 48часов 72часа 96часов

1 229-КЛ 58,5± 7,09 51,05± 5,97 46,4± 9,8 43,5± 9,7 49,6± 8,9

2 225-КЛ 32,6± 1,57 38,7± 6,0 33,3± 3,37 40,6± 5,64 48,8± 7,23

3 Ортофен 38,8± 2,2 45,0± 5,6 38,9± 3,2 40,7± 6,4 47,8± 5,6

Примечание: данные достоверно отличаются от контроля при р<0,05

Кроме противоэкссудативного эффекта НПВС оказывают выраженное действие на пролиферативную фазу воспаления, замедляя развитие гранулёмы. Поэтому, нами изучено влияние соединений 229-КЛ, 225-КЛ и ор-тофена на пролиферативную стадию воспаления ка модели «ватной» гранулёмы у крыс (см. табл.9).

Таблица 9

Влияние соединений 229-, 225-КЛ и ортофеиа на развитие «ватной» гранулёмы и массу тела животного

№ п/п Шифр, название % прироста к контролю Масса тела крысы, г

влажной гранулёмы сухой гранулёмы Исходная к концу опыта

1 229-КЛ 10,8* 20,2* 237,1 249,0

2 225-КЛ 13,0* 24,5* 243,3 258,5

3 Ортофен 14,7* 25,8* 248,6 260,6

4 Контроль 0 0 236,2 247,5

* - данные достоверно отличаются от контроля при р<0,05

Из которой видно, что под влиянием соединения 229-КЛ, вводимого перо-рально в дозе бОмг/кг в сутки в течение 7 дней, наблюдается уменьшение массы экссудата на 10,8%, а грануляционно-фиброзной ткани на 20,2% по сравнению с контролем. Под влиянием соединения 225-КЛ, вводимого пе-рорально в дозе 135мг/кг в сутки в течение 7 дней, наблюдается уменьшение массы экссудата на 13,07%, а грануляционно-фиброзной ткани на 24,5% по сравнению с контролем. Этот эффект не сопровождался снижением массы тела животных. Антипролиферативное действие соединений соответствует антипролиферативному действию ортофена.

Таким образом, исследуемые соединения оказали влияние как на экс-судативную, так и на пролиферативную фазу воспаления при пероральном введении и по выраженности эффекта не уступают ортофену при испытании в эквиэффективных дозах.

При исследовании анальгетической активности соединений 229-, 225-КЛ на моделях «горячей пластинки» и «уксусных корчей» при пероральном введении мышам была определена ЭД50. Результаты опытов представлены в таблице 10.

Таблица 10

Острая токсичность, анальгетическая активность и условная широта фармакологического действия соединений 229-, 225-КЛ и ортофена

ТТТя/Ьп •---ТГ' ЛДи, ЭД5Г,, метол «го- УШФД ЭДщметодика УШФД

назва- мг/кг рячей пластин- «уксусных кор-

ние ки»,мг/кг чей», мг/кг

229-КЛ >8000 580,0 13,8 37,5 213,3

(513,2+655,4) (28,4+49,5)

225-КЛ 3906,0 145,0 26,9 64,2 60,8

(3723,5+4097,3) (120,8+174,0) (57,3+71,9)

Орто- 370,0* 98,0* 3,7 5,0* 74,0

фен (247,04-555,0) (56,0+172,0) (3,0+8,0)

* - по данным Я.А. Сигидина, Г.Я. Шварца и соавт. (1988) Из таблицы видно, что УШФД соединения 229-КЛ по методике "горячей пластинки" в 3,7раза превышает УШФД ортофена, а по методике "уксусных корчей" - в 2,8раза.

Жаропонижающее действие соединений 229-, 225-КЛ изучалось на модели пирогеналовой гипертермии. Соединения, аналогично ортофену, предотвращают максимальное повышение температуры уже через 1 час после их введения. Соединения 229-КЛ, 225-КЛ и ортофен снижают температуру на пике действия пирогенала, соответственно, на 0,7, 0,2 и 0,6°С по сравнению с контролем. Кроме того, в течение трёх часов соединения

229-КЛ и 225-КЛ, как и ортофен, полностью снижают гипертермическое действие пирогенала.

В связи с тем, что большинство нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) обладают ульцерогенным действием, это послужило поводом для определения этого побочного эффекта у соединений 229-КЛ и 225-КЛ. Каждая группа состояла из шести животных. В группе животных, которым вводили соединение 229-КЛ выявлены незначительные изменения на слизистой желудка, что соответствует 0,16 баллам по шкале (Ф.П.Тринус и соавт., 1983). При введении соединения 225-КЛ наблюдаются повреждения, которые соответствуют 1,16 баллам по шкале. Введение индометацина (препарат сравнения) вызывало появление множественных эрозий, геморрагий и язв на слизистой оболочке желудка, что соответствовало 3,5 баллам.

Так как воспалительный процесс невозможен без участия нейтрофи-лов, важно было оценить нейтрофильный фагоцитоз и изменение количества лейкоцитов при введении соединений на фоне воспаления. Установлено, что на фоне соединений 229-, 225-КЛ статистически значимо снижается количество.лейкоцитов по сравнению с контролем и, одновременно, повышается фагоцитарная активность нейтрофилов.

Таким образом, соединения 229-КЛ и 225-КЛ обладают всем спектром действия НПВП. Преимущество веществ заключается в том, что, имея меньшую токсичность, по силе противовоспалительного, анальгети-ческога и жаропонижающего действия они не уступают эталонному препарату (ортофену) и не оказывают выраженного ульцерогенного действия как индометацин.

Заключение и обсуждение результатов

Из литературы известно, что производные антраниловой кислоты обладают широким спектром биологической активности. Однако, установлено, что больший интерес представляют производные антраниловой кислоты как соединения с противовоспалительным (Ф.П. Тринус, 1977; А.Н. Гайдукевич и соавт., 1992; Aries Robert, 1970), анальгетическим (А.Н. Гай-дукевич и соавт., 1986; Kojima Eisuke, 1994) и жаропонижающим действием (Ф.П. Тринус и соавт., 1971; Miyashita Mitsutomo, 1993).

Это подтверждается и данными наших исследований. Изучение противовоспалительной активности 28 соединений показало, что 19 из них обладают данным видом активности, что составляет 67,8%. Девять соединений (32,2%) по силе выраженности данного эффекта не уступают ортофену. Известно, что при создании каррагениновой модели воспаления в течение 1-го часа отёк формируется за счёт активации калликреин-кининовой системы, а через 3-4 часа основными медиаторами воспаления являются простагландины (H.A. Мохорт, 1974; Б.М. Клебанов, 1979). НПВП, угнетая

активность циклооксигеназы (A.C. Саратиков, 1982) - ключевого фермента метаболизма арахидоновой кислоты - препятствует превращению последней в эндоперекись и, следовательно, образованию простагландинов, В настоящее время торможению биосинтеза простагландинов придаётся ведущее значение в механизме действия НПВП (E.JI. Насонов, 1996, 1999; I.R. Vane, 1995; С. Campos et al., 1999). Но, в то же время, предполагают возможное участие и других механизмов действия (Б.М. Клебанов, 1992). Соединения 229-KJI и 225-KJI показали выраженный противовоспалительный эффект как через 1 час, так и через 4 часа после введения каррагенина. Полученные данные дают возможность предполагать, что изученные вещества оказывают влияние как на калликреин-кининовую систему, так и на систему простагландинов. Среди механизмов, участвующих в противовоспалительном действии необходимо отметить влияние веществ на активность медиаторов воспаления серотонина и гистамина (Г.В. Дзяк, 1997). При серотониновой модели воспаления противовоспалительная активность соединений 229-КЛ и 225-КЛ выражена сильнее и проявляется достаточно сильно уже через 30 минут после введения серотонина. При гистаминовой модели воспаления действие соединений 229-КЛ и 225-КЛ развивается постепенно и усиливается к 3-м часам наблюдения за развитием отёка. Полученные данные говорят о возможном блокирующем действии соединений на серотониновые, гистаминовыс рецепторы. Для того, чтобы дополнительно подтвердить специфичность противовоспалительного действия соединений, в опытах вкутрибрюшпиный путь был заменён на пероральный, а также на моделях серотонинового и гистаминового воспаления установлена прямолинейная зависимость «доза - эффект». Соединения 229-КЛ и 225-КЛ оказывают не только профилактическое действие, но и лечебное, которое было изучено на модели формалинового воспаления. Наряду с ан-тиэкссудативным действием, данные вещества проявили антипролифера-тивный эффект. Соединения 229-КЛ и 225-КЛ показали чёткое анальгети-ческое действие на модели «уксусных корчей» (по данным В.В. Либиной (1992) эта методика является более специфичной и имеет простагландино-вый генез). У этих же соединений была установлена прямолинейная зависимость анальгетического действия от дозы. В результате экспериментов установлено, что соединения 229-КЛ и 225-КЛ обладают жаропонижающим действием на уровне ортофена. При длительном применении НПВП вызывают ряд нежелательных эффектов и гастротоксическое действие НПВП стоит на первом месте (Е.Л.Насонов, 1996, 1998, 2000). Преимущество исследованных веществ заключается в том, что у соединения 229-КЛ ульцерогенное действие отсутствует, а соединение 225-КЛ показало слабо выраженный ульцерогенный эффект по сравнению с индометацином.

Выводы

1. Из 28 производных антраниловой кислоты противовоспалительная активность по каррагениновой модели установлена у 19 соединений (67,8%). У девяти соединений противовоспалительная активность близка к таковой ортофена.

2. Установлено, что все девять соединений, показавших высокую активность при каррагениновом отёке обладают противовоспалительной активностью при серотониновой и пять соединений при гистаминовой моделях воспаления, а восемь соединений также проявляют анальгети-ческую активность по методике «уксусных корчей».

3. Все исследованные соединения являются практически нетоксичными или относительно безвредными, а также умеренно или малоопасными поГОСТу.

4. Проведённый скрининг позволил выделить два наиболее активных соединения 229-КЛ (амид К-(3"-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты) и 225-КЛ (амид И-аллил антраниловой кислоты). Противовоспалительная активность на разных моделях воспаления (каррагениновой, серотониновой, гистаминовой и формалиновой) при внутрибрюшинном и пероральном введении у соединения 229-КЛ превосходит по активности ортофен, а соединения 225-КЛ не уступает ортофену.

5. Соединения 229-КЛ и 225-КЛ достоверно превосходят ортофен по анальгетической активности и обладают жаропонижающим действием на уровне ортофена.

6. Проведённые эксперименты показали, что вещество 229-КЛ не оказывает ульцерогенного действия, а вещество 225-КЛ проявляет слабый ульцерогенный эффект в испытанных дозах (1/ЮЛД50).

7. Соединение 229-КЛ являются мало опасным веществом по ГОСТу, а соединение 225-КЛ - умеренно опасным. Малая опасность этих соединений подтверждается большой величиной условной широты фармакологического действия (УШФД). При оценке противовоспалительного и анальгетического действия эта величина равна соответственно для 229-КЛ-133 и 213, а для 225-КЛ-32 и 60.

Практические рекомендации

1. Целесообразен дальнейший поиск соединений с противовоспалительной активностью среди производных 'М-замещённых антраниловых кислот.

2. Соединения 229-КЛ и 225-КЛ рекомендуются для доклинических исследований в качестве противовоспалительных средств.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Васильева М.Ю., Шакирова А.Б., Марданова Л.Г., Коркодинова Л.М., Солодников С.Ю., Кожевников В.В. Поиск биологически активных веществ, полученных на основе 1Ч-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты // Фармация в XXI веке: инновации и традиции. Тез. докл. международ. науч. конф. 7-8 апреля 1999г. - С-Пб., 1999.-С.11.

2. Васильева М.Ю., Марданова Л.Г., Колла В.Э. Противовоспалительная и анальгетическая активность амидов >ЦЗ'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты И Экспер. фармакол. - Информ. бюллетень ПГФА, апрель 1999. -№3.- С. 19-21.

3. Васильева М.Ю., Марданова Л.Г., Колла В.Э., Коркодинова Л.М. Противовоспалительная и анальгетическая активность N-замещённых амидов антраниловой кислоты // Рациональное использование лекарств: Тез. докл. Росс. НПК. 1-3 марта 2000г. - Пермь, 2000.-С.40.

4. Васильева М.Ю., Марданова Л.Г., Колла В.Э., Коркодинова Л.М. Влияние производных N-замещённых антраниловой кислоты на экссудатив-нуто фазу экспериментального воспаления //Актуальные проблемы фарм. науки и образования, итоги и перспективы: Материалы межвуз. НПК.3-4 марта 2000г. - Пермь, 2000. - С.92.

5. Васильева М.Ю., Марданова Л.Г. Скрининговые исследования амидов антраниловой кислоты // Актуальные проблемы медицины и фармации: Материалы 65-ой итоговой НПК молодых учёных и студентов. 6-8 апреля 2000г. - Курск, 2000. - С.315-316.

6. Положительное решение о выдаче патента по заявке № 2000119954/04 (020922) от 26.07.2000// Шакирова А.Б., Коркодинова Л.М., Васильева М.Ю., Марданова Л.Г., Колла В.Э. Амид N-аллилантраниловой кислоты, проявляющий противовоспалительную, анальгетическую и антиги-поксическую активности.

7. Положительное решение о выдаче патента по заявке № 2000119951/04 (020919) от 26.07.20000// Подчезерцева A.B., Коркодинова Л.М., Васильева М.Ю., Марданова Л.Г., Колла В.Э. Анилид №(3'хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты, проявляющий противовоспалительную активности.

8. Патент №2170726, Россия, заявл.14.12.1999, опубл.20.07.2001// Коркодинова Л.М., Васильева М.Ю., Шакирова А.Б., Марданова Л.Г., Колла В.Э. N-аллил (3'-хлорбутен-2'-ил) ацетилантраниловые кислоты, проявляющие противовоспалительную и анальгетическую активность.

9. Шакирова А.Б., Подчезерцева A.B., Васильева М.Ю., Марданова Л.Г., Коркодинова Л.М., Колла В.Э., Вахрина М.И., Данилов Ю.Д. Синтез, противовоспалительная и анальгетическая активности некоторых производных ариламидов замещённых антраниловых кислот //Хим.-фарм. журнал. - 2001. - т.35.- №4.-С. 17-19.

Ю.Васильева М.Ю. Оценка противовоспалительной и анальгетической активности N-замещённых амидов антраниловой кислоты // Актуальные медико-биологические проблемы в современных условиях: Материалы межвуз. Конф. Молодых учёных и студентов. 10-13 апреля 2001 г. -Ижевск, 2001. -С.61-62.

11.Васильева М.Ю., Марданова Л.Г., Колла В.Э. Изучение острой токсичности, жаропонижающего и ульцерогенного действия N-замещённых амидов антраниловой кислоты // Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: Материалы межвуз. Юбилейной НПК, по-свящённой 85-летию высшего образования на Урале,- Пермь, 2001. -С.35.

12.Просвирнина A.M., Михалев А.И., Кириллова Р.В., Васильева М.Ю., Колла В.Э. Синтез и противовоспалительная активность производных этилового эфира антраниловой кислоты// Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: Материалы межвуз. Юбилейной НПК, посвящённой 85-летию высшего образования на Урале,- Пермь, 2001.-С.56.

К печати г 2 О X . 2002 г. Формат 60x84x116 Усл. печ. л. 1,4 Тираж 100 экз. 7b.

Типография Пермского государственного университета 614600, г. Пермь, ул. Букирева, 15