Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Антиоксидантная терапия сахарного диабета и его осложнений (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

БИЛИЧЕНКО Светлана Васильевна

004600914

АНТИОКСИДАНТНАЯ ТЕРАПИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА И ЕГО ОСЛОЖНЕНИЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2010

1 5 АПР 2010

004600914

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» Федерального медико-биологического

агентства России

Научный руководитель: доктор медицинских наук Саватеева-Любимова Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Андреев Борис Владимирович доктор медицинских наук профессор Дьячук Георгий Иванович

Ведущая организация: Государственное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» РАМН

Защита состоится «_» мая 2010 г. в 13 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.07 при ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан «_» апреля 2010 г.

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор

Богомолов Борис Николаевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Сахарный диабет (СД) - одна из наиболее актуальных проблем современной эндокринологии. В настоящее время наиболее частой причиной инвалидности и преждевременной смерти больных СД является развитие сосудистых осложнений (микро- и макроангиопатии) и нейро-патии (Дедов И.И., 2008, Волчегорский И.А. и соавт., 2008, Балаболкин М.И. и соавт., 2005; Meigs J. et al. 2007). Сложный патогенез данного заболевания включает генетические факторы, иммунологические нарушения и нарушение всех видов обмена веществ, что приводит к метаболическим сдвигам и запускает каскад реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). В настоящее время разработка средств и методов лечения СД, оказывающих влияние на различные звенья патогенеза, является актуальной задачей современной эндокринологии.

На сегодняшний день терапия СД, в первую очередь, направлена на снижение уровня глюкозы крови путем восполнения дефицита инсулина его аналогом или стимуляцию секреции островковых клеток и повышение утилизации глюкозы периферическими тканями' введением сахароснижающих препаратов (Балаболкин М.И. и соавт, 2005, Один В.И., 2003, Кудрякова C.B., 2001; Marry M. et al., 2002). Подобная тактика лечения не учитывает необходимость воздействия и на другие звенья патогенеза СД, лежащие в основе развития диабетических осложнений (Недосугова Л.В., 2007; Дедов И.И., 2008; Shen W. et al., 2008, Ziegler D. et al., 2004).

Значительная роль в патогенезе сахарного диабета и его осложнений принадлежит окислительному стрессу (Один В.И., 2003; Шанин Ю.Н. и соавт., 2003; Шляхто Е.В., 2003; Meigs J. et al., 2007). Установлена четкая корреляционная зависимость между гипергликемией и степенью выраженности окислительного стресса, наличие которого сопровождается активированием процессов перекисного окисления липидов (Один В.И., 2003; Шанин Ю.Н. и соавт., 2003; Балаболкин М.И. и соавт., 2005). В тоже время, нарушения в системе перекисного окисления липидов (ПОЛ), наряду с метаболическими и генетическими факторами, обуславливают развитие сосудистых и неврологических осложне-

ний диабета (Балаболкин М.И. и соавт., 2005; Ghibu S. et al., 2008, Shaw J.E. et al., 2003).

Таким образом, актуальными являются исследования, направленные на поиск новых лекарственных средств, обеспечивающих профилактику и терапию поздних осложнений СД с учетом патогенетических механизмов их развития. К подобным средствам фармакологической коррекции можно отнести препараты, восстанавливающие нарушения клеточного метаболизма, в первую очередь, препараты антиоксидантного/метаболического типа лействия.

Цель исследования

Экспериментальное изучение специфической фармакологической активности комплексного препарата «Цитофлавин», обладающего антиоксидантной и метаболотропной активностью в условиях модели декомпенсированного сахарного диабета как средства профилактики и терапии поздних осложнений СД.

Задачи исследования

1. Изучить дозозависимые эффекты диабетогенов аллоксана и стрептозо-тоцина в отношении летальности животных (крысы), показателей, характеризующих клиническую картину заболевания, уровня содержания глюкозы и длительности гипергликемического периода, инсулинпродуцирующей функции ß-клеток поджелудочной железы, углеводного и липидного обменов, функциональной активности печени и почек, процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты. Выбрать дозы диабетогенов, вызывающие экспериментальный диабет тяжелой степени (декомпенсированный диабет).

2. Изучить влияние препарата «Цитофлавин» и эталонного средства для лечения поздних осложнений сахарного диабета - «а-липоевая кислота» - на течение клинической картины, состояние углеводного и липидного обменов, процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной защиты в условиях экспериментального декомпенсированного диабета различного генеза.

3. Изучить влияние препарата «Цитофлавин» в сравнении с препаратом «а-липоевая кислота» на процессы нервно-мышечной передачи и когнитивные

функции, состояние митохондриальной активности сгтленоцитов и уровень апоптоза в них в условиях декомпенсированного аллоксанового диабета. Изучить влияние препарата «Цитофлавин» в сравнении с препаратом «а-липоевая кислота» на показатели конканавалин А-обусловленного воспаления.

Научная новизна

1. Впервые проведена экспериментальная оценка эффективности препарата «Цитофлавин» в условиях декомпенсированного экспериментального диабета различного генеза. В отличие от стандартных антидиабетических препаратов продемонстрировано выраженное позитивное влияние на состояние липид-ного обмена, системы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидант-ной защиты организма (АОЗ), лежащих в основе патогенеза осложнений сахарного диабета. Эффективность изученного препарата превосходила эффективность эталонного средства для лечения поздних осложнений диабета - «а-липоевая кислота».

2. Впервые установлено, что введение препарата «Цитофлавин» способствует экспериментальной коррекции неврологических и когнитивных нарушений в модели декомпенсированного СД, что обусловлено входящими в спектр фармакологической активности препарата антиоксидантной и метаболотропной активностью и иммунопротективными свойствами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Препарат «Цитофлавин», обладая невыраженным, по сравнению со стандартными антидиабетическими препаратами, антигипергликемическим действием, значительно превосходит их по степени корригирующего воздействия на состояние липидного обмена, процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной системы защиты организма в условиях декомпенсированного экспериментального диабета различного генеза.

2. Препарат «Цитофлавин» вызывает выраженный регресс патологических изменений афферентной чувствительности и функционального состояния нервно-мышечной передачи, а также когнитивных нарушений, обусловленных действием диабетогена - аллоксана.

3. В основе терапевтической эффективности препарата «Цитофлавин» в отношении поздних осложнений сахарного диабета лежит позитивное влияние на состояние процессов липопероксидации и активности антиоксидантной системы, нарушения липидного обмена, изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, а также наличие в спектре его фармакологической активности противовоспалительного действия.

Научно-практическая значимость

Полученные данные представляют собой экспериментальное обоснование роли препарата «Цитофлавин» как средства профилактики поздних осложнений сахарного диабета на гомеостатическом уровне при экспериментальном сахарном диабете.

Показано, что в основе экспериментальной терапевтической эффективности изученного препарата лежит коррекция биоэнергетических нарушений, обусловленных действием диабетогенов.

Результаты настоящего исследования определяют перспективность применения препаратов антиоксидантного/метаболического типа действия, в том числе «Цитофлавина», в комплексной терапии сахарного диабета с целью снижения риска развития осложнений, сопутствующих данному заболеванию и приводящих к инвалидизации и преждевременной смерти.

Реализация результатов работы. Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Сахарный диабет». Результаты работы реализованы в научно-исследовательской деятельности ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА РФ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, и 3 тезиса.

Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертаций изложены на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» в СПбМАПО (Санкт-Петербург, 2006, 2009), на XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в С-

Пб, 2009», заседаниях Ученого совета и межлабораторных заседаниях ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА России.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста, иллюстрированы 23 таблицами и 7 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав собственных исследований, главы с обсуждением результатов исследований, выводов, списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 96 отечественных и 87 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на 710 крысах-самцах линии Wistar массой 180220 г, выращенных в питомнике РАН «Рапполово» и 30 мышах линии СВА.

Моделирование хронической инсулиновой недостаточности у крыс осуществляли однократным введением раствора аллоксан гидрата (подкожно) и введения стрептозотоцина (внутрибрюшинно). Наличие сформировавшегося экспериментального сахарного диабета подтверждали с помощью оценки уровня глюкозы, инсулина и длительности гипергликемического периода.

В исследовании были использованы следующие субстанции или лекарственные препараты: «Цитофлавин» (ООО НТФФ «Полисан») - субстанция комплексного препарата, в состав которого, на одну таблетку, входят: янтарная кислота - 300 мг, никотинамид - 25 мг, рибоксин (инозин) - 50 мг, рибофлавин мононуклеотид - 5 мг. «Цитофлавин» вводили в дозе, равной 100 мг/кг (Коваленко A.JI., 2005). Препарат сравнения липоевая (тиоктовая) кислота (эспарма ГмбХ / esparma GmbH, Osterweddingen, Germany) вводили в дозе 20 мг/кг; мет-формин (Польфа-Кутно А/О, Польша) вводили в дозе 100 мг/кг и манинил (BERLIN-CHEMIE AG, Menarini Group, Germany), в дозе 0,4 мг/кг. Все исследуемые препараты вводили внутрижелудочно с помощью атравматического металлического зонда в виде крахмальной или водной взвеси, начиная со следующего дня после введения диабетогена, в течение 14 дней.

Определение уровня инсулина в плазме проводили стандартным имму-ноферментным методом с использованием набора Rat Insulin ELISA (DRG, Германия). В крови уровень глюкозы определяли глюкозооксидазным фотометрическим методом (Меньшиков В.В., 1987), активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) определяли унифицированным методом Севела-Товарека (Меньшиков В.В., 1987), общий белок - биуретовым методом (Weichselbaum Т., 1946), холестерин - фенольным энзиматическим методом (Trinder Р., 1969), триглицериды - энзиматическим методом по конечной точке (Trinder Р., 1969), креатинин оп-

ределяли по реакции Яффе псевдокинетическим методом (Bartels Н., 1972), концентрацию - мочевины уреазным фенолгипохлоритным методом (Chaney А., Marbach Е., 1962).

Процессы окислительного метаболизма изучали в периферической крови экспериментальных животных. Состояние системы ПОЛ оценивали по концентрации малонового диальдегида (МДА) по методу Uchiyama М. в модификации Глушкова С.И. (Стальная И.Д., 1977; Uchiyama М., Michara М., 1978). О состоянии АОЗ судили по активности каталазы, глутатионредуктазы (ГР), глутатион-пероксидазы (ГП), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГазы), супероксид-дисмутазы (СОД), содержанию восстановленного глутатиона (ВГ) и уровню свог бодных сульфгидрильных групп (SH-групп). Содержание ВГ определяли по методу Ellman G. (1959) в модификации Глушкова С.И. (1998), уровень SH-rpynn определяли по реакции с реактивом Эллмана (Ellman G., 1959; Bellomo G. et al., 1990), каталазы - по методу Королюка М.А. (1988) (Архипова О.Г. и соавт., 1988). Определение активности СОД проводили в крови по методике, описанной Дубининой Е.Е. и соавт. (1983) в основе которой лежит определение степени ин-гибирования восстановления тетразолия нитросинего в присутствии НАДН и феназинметасульфата (Crapo J. et al., 1978, Gwinner W. et al., 1997). Активность ГП определяли по методу Гавриловой А.Р. (1986), ГР - методом Carlberg I. и Mannervik В. (1985), Г-6-ФДГазы - по методу Komberg А. et al. (1955).

Для учета объема выпитой и выделенной жидкости суточную мочу собирали, поместив животных на 1 сутки в индивидуальные обменные клетки фирмы «Texnoplast», Италия. Анализ мочи проводили с помощью тест-полосок Penta Phan Чешской фирмы «Lachema», удельный вес мочи определяли с помощью рефрактометра ИРФ-22.

Оценку рефлекторной деятельности проводили посредством методики суммации пороговых потенциалов и электромиографии. В работе были использованы: полиграф RM-6000, Япония; миоинтегратор MI-2, Венгрия; электростимулятор. Процессы памяти у животных оценивали по методу условной ре-

акции пассивного избегания через 2 и 24 часа после предъявления животным негативной стимуляции (Буреш Я. и соавт., 1991).

Функциональное состояние иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов) изучали методом МТТ-теста по индексу пролиферативной активности при добавлении лимфоцитарных митогенов (Penkowa М., Hidalgo J., 2001). Лимфоциты получали путем гомогенизации и фильтрации селезенок исследуемых крыс. Уровень апоптоза оценивали с использованием метода окрашивания ДНК флюоресцирующим красителем Hoechst 33342. Противовоспалительную активность изучали на модели конканавалин А - индуцированного воспаления на мышах-самцах линии СВА. Мышам субплантарно вводили конканавалин А в дозе 100 мкг/20 г массы тела, в контрлатеральную конечность - физиологический раствор. Объём лап измеряли исходно и через 1 час после введения конканавалин А. Определяли степень экссудации задней конечности.

Материал для гистологических исследований брали из хвостовой части поджелудочной железы у декапитированных животных. Фиксация материала осуществлялась в 10 % нейтральном формалине и в жидкости Боуэна, дегидратировали, заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилин-эозином и па-ральдегидфуксином с докраской трехцветной смесью Гомори. Проводили цифровую фотосъёмку препаратов с помощью микроскопа Amplival (Carl Zeiss).

Статистическая обработка результатов исследования. Полученные данные подвергали стандартной статистической обработке с расчетом среднего значения, доверительного интервала и стандартного отклонения. Отличия между выборками оценивали с помощью критерия t Стьюдента. Вероятность р<0,05 считали достаточной для вывода о статистической значимости различий данных, полученных в эксперименте (Джонсон Н., Лион Ф., 1980). Обработку результатов проводили на персональном компьютере ПЭВМ PC Pentium П с использованием пакета прикладных программ Excel, Graph Pad Prism, Medistat, Statgrafics.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В ходе исследования продемонстрировано наличие дозовой зависимости в действии аллоксана и стрептозотоцина как в отношении летальности, так и показателей (снижение массы тела, увеличение потребления воды и диуреза, гиподинамия, неопрятность, пилоэрекция, кровоточивость десен, шатание и выпадение зубов), характеризующих тяжесть клинической картины заболевания. На основании полученных данных были определены дозы диабетогенов, вызывающие развитие экспериментального сахарного диабета тяжелой степени. Для аллоксана эта доза составляла 150 мг/кг п/к, а для стрептозотоцина - 45 мг/кг в/б.

Изучено влияние диабетогенов в вышеуказанных дозах на выраженность гипергликемической реакции, динамику изменения уровней глюкозы и инсулина; показатели, демонстрирующие развитие изменений на полиорганном уровне, и сопутствующие декомпенсированному СД (содержание общего холестерина, липопротеинов холестерина высокой и низкой плотности (ЛПНП, ЛПВП), триг-лицеридов, амилазы и уровень активности показателя цитолиза — АлАТ). Полученные данные (на примере аллоксана) представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Динамика изменения уровня глюкозы и инсулина в сыворотке крови крыс при введении аллоксана в дозе 150 мг/кг (М±т)

Изучаемые показатели День регистрации

контроль 3 день 7 день 15 день

Глюкоза крови, м моль/л 3,6±0,1 . 17,8±0,8*** 14,6±1,2 10,2±0,7*

Инсулин сыворотки, мкг/л 0,300±0,021 0,140±0,016*** 0,160±0,014 0,180±0,022

Примечание: наличие статистически значимых различий по отношению к контролю (* - р<0,05; *** - р<0,001)

Биохимические показатели периферической крови крыс в условиях декомпен-сированного экспериментального сахарного диабета (М±ш)

Изучаемые показатели Экспериментальные группы

контроль аллоксан, 150 мг/кг

Общий белок, г/л 75±3 69±4

Общий холестерин, ммоль/л 3,88±0,22 5,27±0,24**

Триглицериды, ммоль/л 0,63±0,12 1,91±0,23***

ЛПНП, ммоль/л 1,51±0,35 3,85±0,30***

ЛПВП, ммоль/л 1,47±0,35 0,98±0,20

АлАТ, МЕ/л 21±2 120±11***

Амилаза, Ед/л 115±4 828±19***

Мочевина, ммоль/л 5,5±0,3 9,8±0,5***

Креатинин, мкмоль/л 63±5 66±4

Примечания: ЛПНП - липопротеины низкой плотности; ЛПВП - липопротеи-ны высокой плотности; АлАТ - аланинаминотрансфераза; * - наличие статистически значимых различий по отношению к контролю (** - р<0,01; *** - р<0,001)

Как следует из представленных выше данных, у животных, наряду с гипергликемией и снижением уровня инсулина, развивалась гиперлипидемия (увеличение содержания общего холестерина, липопротеинов холестерина низкой плотности (ЛПНП) и триглицеридов), отмечалось снижение содержания липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), а также наблюдались признаки цитолиза (резкое увеличение активности АлАТ) и увеличение в крови уровня мочевины и амилазы. Таким образом, изучение ряда специфических для СД параклинических показателей продемонстрировало развитие типичных для деком-пенсированного диабета нарушений углеводного, липидного обменов и процессов цитолиза.

Как следует из представленных в табл. 3 данных, у животных наблюдалось усиление процессов ПОЛ и снижение активности АОЗ (увеличение уровня малонового диальдегида и снижение содержания сульфгидрильных групп и

восстановленного глутатиона, а также падение активности супероксиддисмута-зы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназы).

Таблица 3

Показатели ПОЛ-АОЗ в периферической крови крыс в условиях декомпенсированного аллоксанового диабета (М±ш)

Изучаемые Экспериментальные группы

показатели контроль аллоксан, 150мг/кг

МДА, нмоль/г Hb 8,62±0,43 16,01±0,51***

СОД, ед. 28,24±1,42 16,46±1,03***

Г-6-ФДГ, мкмоль/(минт Hb) 8,53±0,37 4,40±0,25***

SH-группы, мкмоль/г Hb 23,08±2,23 13,28±2,34*

Каталаза, мкмоль/(мин-г Hb) 33,04±4,25 14,11±2,84**

ВГ, мкмоль/г Hb 14,09±0,71 6,72±0,82***

ГР, мкмоль/(минт Hb) 297,5±22,3 185,5±22,4*

ГП, мкмоль/(мин-г Hb) 3,61±0,18 2,11±0,12***

Примечания: МДА - малоновый диальдегид, СОД - супероксиддисмутаза, Г-6-ФДГаза - глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназа, ЭН-группы - сульфгидрильные группы белков, ВГ - восстановленный глутатион, ГР - глутатионредуктаза, ГП - глутатион-пероксидаза; * - наличие статистически значимых различий по отношению к контролю (* - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001)

По результатам морфологического исследования ткани поджелудочной железы животных с декомпенсированным СД установлена массивная гибель р-клеток с деструкцией островков Лангерганса, площадь которых уменьшалась в размере по отношению к площади ацинарной ткани. Степень грануляции соответствовала объемному количеству имеющегося инсулина (рис.1).

Результаты экспериментов по изучению эффективности препаратов «Ци-тофлавин» и «а-липоевая кислота» в сравнении со стандартными антидиабетическими препаратами в условиях декомпенсированного аллоксанового и стреп-тозотоцинового диабета продемонстрировали наличие выраженного гиполипи-демического эффекта в действии данных препаратов, максимально в случае «Цитофлавина», в отличие от манинила и метформина (табл. 4). В тоже время,

стандартные антидиабетические препараты гораздо более выражено влияли на уровень глюкозы в крови. Аналогичные данные были получены и в условиях стрептозотоцинового диабета (табл. 5).

'Ш

и

татт

1 2

Рис. 1. Островок Лангерганса поджелудочной железы интактной крысы (1) и крысы с аллоксановым диабетом (2) (окраска паральдегидфуксином)

Таблица 4

Влияние изучаемых препаратов на показатели углеводного и липидного обменов у крыс в условиях аллоксанового диабета (М±ш)

Показатели

Экспериментальные группы глюкоза крови, ммоль/л общий холестерин, ммоль/л ЛПВП, ммоль/л ЛПНП, ммоль/л триглице-риды, ммоль/л

1 Контроль-1 3,6±0,4оо° 3,64±0,16°°° 1,41±0,30 1,35±0,37°°° 0,84±0,09°

2 Контроль-2 10,5±1,1*** 6,35±0,26*** 0,84±0,10 3,67±0,15*** 1,58±0,20*

3 Метформин 4,3±0,6°°° 4,43±0,25оо° 0,93±0,21 3,05±0,22** 1,35±0,12*

4 Манинил 4,6±0,7°° 4,37±0,28°°° 0,92±0,17 3,11±0,17** 1,29±0,08**

5 Цитофлавин 7,0±0,4***° 3,82±0,23оо° 1,21±0,14 1,86±0,14ОС° 0,91 ±0,10°

6 Липоевая кислота 7,8±0,5*** 3,96±0,24°°° 1,10±0,15 2,27±0,15оо° 1,08±0,14

Примечания: контроль-! - интактные животные; контроль-2 - животные, не получавшие лечения. ЛПВП - липопротеины холестерина высокой плотности, ЛПНП - липопротеины холестерина низкой плотности; * - наличие статистически значимых различий по отношению к контролю-1 (* - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001); ° -наличие статистически значимых различий по отношению к контролю-2 (° - р<0,05; °°-р<0,01; 000 — р<0,001)

Влияние изучаемых препаратов на показатели углеводного и липидного обменов в условиях декомпенсированного стрепгозотоцинового диабета (М±т)

Экспериментальные группы Изучаемые показатели

глюкоза крови, м моль/л общий холестерин, ммоль/л ЛПВП, ммоль/л ЛПНП, ммоль/л триглице-риды, ммоль/л

1 Контроль-1 3,4±0,3°°° 3,59±0,17°°° 1,38±0,32 1,32±0,16°°° 0,63±0,15°

2 Контроль-2 15,9±1,5*** 6,93±0,24*** 0,79±0,15 3,84±0,12*** 1,66±0,26*

3 Метформин 5,5±0,6*оо° 4,51±0Д1*оо° 0,91±0,22 3,12±0,18***° 0,98±0,14

4 Манинил 6,9±0,8**оо° 4,68±0,26*°°° 0,88±0,31 3,24±0,14***° 1,09±0,15

5 Цитофлавин 7,6±0,4***оо° 3,77±0,22оо° 1,15±0,16 2,16±0,17*°СО 0,75±0,12°

6 Липоевая кислота 9,2±0,4***ООС 4,01±0,25оо° 1,0±0,14 2,43±0,18**с°° 0,84±0,16

Примечание: контроль-1 - интактные животные; контроль-2 - животные, не получавшие лечения. ЛПВП - липопротеины холестерина высокой плотности, ЛПНП - липопротеины холестерина низкой плотности; * - наличие статистически значимых различий по отношению к контролю-1 (* - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001) ; ° -наличие статистически значимых различий по отношению к контролю-2 (° - р<0,05; оо°-р<0,001)

: Анализ данных, полученных при исследовании влияния изучаемых препаратов на показатели ПОЛ-АОЗ, показал, что стандартные антидиабетические препараты практически не влияли на выраженность «оксидативного стресса» в условиях декомпенсированного диабета. «Цитофлавин» и «а-липоевая кислота» вызвали достоверное снижение содержания вторичного продукта ПОЛ - МДА в эритроцитах животных. Снижение уровня МДА сопровождалось достоверным увеличением активности глутатионзависимых ферментов (глутатионпе-роксидазы и глутатионредуктазы) и содержанием сульфгидрильных групп белков и восстановленного глутатиона (табл. 6 и 7).

Таким образом, было показано, что в условиях декомпенсированного диабета различного генеза стандартные антидиабетические препараты (метформин и манинил) преимущественно восстанавливали углеводный обмен и частично влияли на показатели липидного обмена, в то время как у животных сохранялся высокий уровень ПОЛ и низкая активность ферментов АОЗ. В связи с чем было

правомерно предположить, что при длительном сохранении неполной компенсации углеводного обмена при наличии оксидативного стресса развитие диабетических микро-, макроангиопатий и неврологических нарушений неизбежно. В этих же экспериментальных условиях была продемонстрирована высокая эффективность препарата «Цитофлавин» в отношении снижения активности процессов ПОЛ и восстановления пула ферментов антиперекисной системы.

Таблица 6

Влияние изучаемых препаратов на показатели ПОЛ-АОЗ в условиях декомпен-сированного аллоксанового диабета (М±ш)

Изучаемые показатели Экспериментальные группы

контроль аллоксан метфор-мин манинил цитофлавин липоевая к-та

МДА, нмоль/г Hb 8,62±-0,43°°° 16,01±-0,51*** 12,50±-0,60***°° 11,72=Ь— 1,20° 9,08±-0,58°°° 9,35±-0,46°°°

СОД, ед 28,24±-1,42°°° 16,46±-1,03*** 20,30±-2,14* 19,53±-2,31* 23,4 2,43° 21,46±-2,32

Г-6-ФДГаза, мкмоль/(минт Hb) 0,37°°° 4,40±-0,25*** 6,02±-0,70* 5,80±-0,62** 6,86±-0,20**°°° 6,42±-0,37**°°

SH-группы, мкмоль/г Hb 23,08±-2,23° 13,28±-2,34* 15,10±-2,16 16,20±-1,62 21,65±-2,06 19,00±-1,18

Каталаза, мкмоль/(мин-г Hb) 33,04±-4,25°° 14,11±-2,84**; 18,14±-4,23 17,80±-5,16 26,68±-3,21° 22,70±-3,91

ВГ, мкмоль/г Hb 14,09±-0,91°°° 6,72±-0,82*** 9,04±-0,94** 8,46±-1,12** 11,77±-0,96°° 10,58±-0,78*°

ГР, кмоль/(мин-г Hb) 297,5±-22,3° 185,5±-22,4* 193,7±-16,0** 205,2±-14,2* 234,5±-21,6 212,6^ 26,3

ГП, мкмоль/(мин-г Hb) 3,61±-0,18°°° 2,П±-0,12*** 2,14±-0,25*** 0,16*** 2,78±-0,18*° 2,47±-0,21**

Примечания: контроль (1) - интактные животные; контроль (2) - животные, не получавшие лечения, МДА - малоновый диальдегид, СОД - супероксиддисмутаза, Г-6-ФДГаза - глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназа, БН-группы - сульфгидрильные группы белков, ВГ - восстановленный глутатион, ГР - глутатионредуктаза, ГП - глутатион-пероксидаза; * - наличие статистически значимых различий по отношению к контролю (*-р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,001) ; ° - наличие статистически значимых различий по отношению к группе животных с аллоксановым диабетом, не получавших лечение (° -р<0,05; °° - р<0,01; 000 - р<0,001)

Влияние изучаемых препаратов на показатели ПОЛ-АОЗ в условиях декомпен-сированного стрептозотоцинового диабета (М±ш)

Изучаемые показатели Экспериментальные группы

контроль стреп-тозото-цин метфор-мин мани-нил цитофла-вин липоевая к-та

МДА, нмоль/г Hb 8,62± 0,43000 17,07± 0,44 14,16± 0,56°° 12,31± 0,71°°° 9,75± 0,54°°° 10,44± 0,32*°°°

СОД, ед 28,24± 1,42°°° 13,44± 2,02 15,26± 2,18 14,48± 2,66 20,32± 2,42 18,82± 2,33*

Г-6-ФДГаза, мкмоль/(мин-г Hb) 8,53± 0,37°°° 5,09± 0,35 6,56± 0,51 6,18 ± 0,44 7,13± 0,42°° 6,88± 0,32*°°

SH-группы, мкмоль/г Hb 23,08± 2,23° 12,45± 2,12 14,14± 2,04 15,26± 1,22 19,87± 1,2° 19,36± 1,44

Каталаза, мкмоль/(мин-г Hb) 33,04± 4,25° 15,82± 3,15 18,06± 4,09 16,88± 3,74 23,62± 3,72 21,54± 2,92

ВГ, мкмоль/г Hb 14,09± 0,91°°° 7,18± 0,52 8,54± . 0,52 7,75± 1,06 10,04± 1,02 9,15± 0,92**

ГР, кмоль/(мин-г Hb) 297,5± 22,3°°° 164,7± 12,5 200,6± i 13,2 188,3± 12,1 240,1± 19,0° 221,4± 17,8

ГП, мкмоль/(минт Hb) 3,61± 0,18°°° 1,68± 0,11 1,73± 0,14 1,84± 0,20 2,55± 0,16°° 2,19± 0,18***

Примечания: контроль - интактные животные; МДА - малоновый диальдегид, СОД - супероксиддисмутаза, Г-6-ФДГаза -глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназа, ЭН-группы - сульфгидрильные группы белков, ВГ - восстановленный глутатион, ГР -глутатионрсдуктаза, ГП - глутатионпероксидаза; * - наличие статистически значимых различий по отношению к контролю (* - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001); ° -наличие статистически значимых различий по отношению к группе животных со стрептозотоциновым диабетом, не получавших лечение (° - р<0,05;00 - р<0,01; °°° -р<0,001)

На основании полученных данных, мы предположили, что применение «Цитофлавина» в терапии СД может привести к компенсации патологических нарушений, лежащих в основе патогенеза поздних осложнений.

Характерным осложнением сахарного диабета являются различные варианты невропатии. Около 70% поражений нервной системы при сахарном диабете приходится на полиневропатию, характеризующуюся диффузным или локальным повреждением периферических нервных волокон. Кроме этого, при декомпенсированном диабете у больных и у экспериментальных животных формируется состояние диабетической энцефалопатии, близкой к деменции, развивающейся при различных нейродегенеративных заболеваниях.

Полученные результаты послужили основанием для изучения возможной лечебной эффективности препарата «Цитофлавин» в отношении диабетической энцефалопатии и периферической нейропатии как типичных осложнений де-компенсированного СД.

Было проведено сравнительное изучение влияния препаратов «Цитофлавин» и «а-липоевая кислота» на показатели нейропатии и функционального состояния иммунитета в условиях декомпенсированного аллоксанового диабета (табл. 8).

Таблица 8

Влияние исследуемых препаратов на состояние процессов памяти (УРПИ)

Изучаемые показатели Экспериментальные группы

интактные плацебо цитофлавин липоевая к-та

Норковый рефлекс

Животные, не зашедшие в темную камеру, % 0 0 0 0

Через 2 часа после обучения

животные, не зашедшие в темную камеру, % 100 40 50 60

Через 24 часа после обучения

животные, не зашедшие в темную камеру, % 100 10 80 50

Примечание: УРПИ - условный рефлекс пассивного избегания

При изучении влияния препаратов на функциональное состояние периферических нервов и когнитивные функции было показано, что у животных с де-компенсированным СД развился синдром, характеризующийся нарушением хранения и воспроизведения памятного следа (достоверное увеличение количества особей, забывших ситуацию темной камеры). Особенно выраженные нарушения были выявлены при тестировании через 24 часа.

«Цитофлавин» и «а-липоевая кислота», не влияя существенно на процессы краткосрочной памяти (2 часа после обучения), оказали позитивное действие в отношении нарушений, связанных с извлечением памятного следа (механизмы долговременной памяти). Эффективность «Цитофлавина», при этом, была достоверно выше, чем у «а-липоевой кислоты».

Данные по влиянию изучаемых препаратов на показатели функциональной активности нервной системы представлены в табл. 9. Как следует из представленных данных, у экспериментальных животных наблюдалось достоверное увеличение показателя СПП (суммация пороговых показателей), что свидетельствует о нарушении способности нервной системы к суммации раздражителей и замедлении скорости обработки информации и достоверное уменьшение величины спонтанной ЭМГ (снижение мышечного тонуса и реакции на механическое раздражение).

Подобные изменения являются характерными для экспериментальной полиневропатии и патогномоничны для заболеваний, сопровождающихся нарушениями миелиновых структур. Оба препарата оказали равноэффективное достоверное лечебное действие в отношении величины суммации пороговых показателей, т.е. процессов передачи нервных импульсов в ЦНС (афферентная стимуляция).

Что касается тонической активности мышц и ЭМГ-реакции на механическое раздражение, то препарат «Цитофлавин» значительно превосходил по эффективности препарат сравнения и способствовал нормализации уровня данных показателей.

Влияние исследуемых препаратов на состояние нервно-мышечной передачи (М±ш)

Изучаемые показатели Экспериментальные группы

интактные аллоксан+ плацебо аллоксан+ цитофлавин аллоксан+ липоевая к-та

СПП, В 9,3±0,5°°° 15,2±0,6*** 8,0±1,Г°° 9,4±1,3°°

ЭМГ, усл.ед. 39,1±3,9° 24,7±3,0* 36,8±2,8" 25,6±4,4

ЭМГ-вызв., усл.ед. 3,1 ±0,7 1,5±0,4 3,0±0,6 1,7±0,2

Примечание: СПП - суммационно-пороговые показатели, ЭМГ - электромиография (спонтанная и индуцированная); * - наличие статистически значимых различий по отношению к интактным животным (* - р<0,05; *** - р<0,001); 0 - наличие статистически значимых различий по отношению к группе Аллоксан+плацебо (° -р<0,05; 00 - р<0,01; 000 - р<0,001)

Накопление свободных радикалов, наблюдающееся при декомпенсиро-ванном СД, способно изменять структуру ДНК и вызывать цитотоксическое действие, а также активацию аутоиммунного процесса.

Оценку метаболической активности лимфоцитарного звена иммунитета проводили на спленоцитах крыс. Уровень апоптоза изучали для определения активности иммунорегуляторных механизмов, отвечающих на изменение функционального состояния иммунитета. В качестве позитивного контроля использовали уровень апоптической реакции в клетках, обработанных фактором некроза опухоли альфа (ФНО-а) и актиномицином Д.

Как следует из данных, представленных в табл. 10, у нелеченных экспериментальных животных наблюдалось достоверное снижение как спонтанной метаболической активности спленоцитов, так и метаболической реакции в ответ на стимуляцию лимфоцитарными митогенами. Характер выявленных изменений свидетельствовал об угнетении функциональной активности лимфоцитов как Т-, так и В-клеточного звена, происходящей в условиях декомпенсирован-ного экспериментального СД.

Терапия обоими изучаемыми препаратами оказала позитивное действие в отношении выявленных изменений параметров функциональной активности лимфоцитарного звена иммунитета. Эффективность препарата «Цитофлавин» несколько превосходила таковую препарата «а-липоевая кислота».

Таблица 10

Влияние изучаемых препаратов на уровень индуцированной и спонтанной пролиферативной активности спленоцитов в условиях декомпенсированного аплоксанового диабета (М±ш)

Экспериментальные группы Уровень индуцированной активности, индекс реакции, митоген Уровень спонтанной активности

ФГА КонА PWM

Интактные животные 2,40+0,08°°° 1,83+0,05°°° 2,04+0,11°° 0,223*0,009°°°

Алло ксан+плацебо 1,12+0,06*** 0,88±0,11*** 1,42+0,10** 0,112+0,006***

Аллоксан+цитофлавин 2,16±0,10оо° 1,69±0,13о°° 1,90+0,08°° 0,189±0,015°°°

Аллоксан+а-липоевая к-та 2,06+0,10°°° 1,48+0,08**°° 1,72*0,12 1,180+0,012***°°°

Примечания: ФГА - фитогемагглютинин, КонА - конканавагшн A, PWM -митоген лаконоса (pokeweed mitogen); * - наличие статистически значимых различий по отношению к интактным животным (** - р<0,01; *** - р<0,001) ; 0 - наличие статистически значимых различий по отношению к группе Аллоксан+плацебо -р<0,01;°°°-р<0,001)

Таблица 11

Влияние изучаемых препаратов на уровень апоптоза в спленоцитах в условиях декомпенсированного аплоксанового диабета (М±ш)

Экспериментальные группы Уровень апоптоза, процентное соотношение

Интактные животные 2,00+1,23***°°°

Аллоксан+плацебо 31,00+6,40

Аллоксан+цитофлавин 6,20+0,58***°°°

Аллоксан+а-липоевая к-та 14,75+3,43

Примечания: * - наличие статистически значимых различий по отношению к интактным животным (*** - р<0,001); ° - наличие статистически значимых различий по отношению к группе Алоксан+плацебо (°°° - р<0,001)

Из данных, представленных в табл. 11, следует, что в условиях декомпен-сированного СД происходит резкое повышение уровня апоптоза в культуре спленоцитов.

Терапия препаратом «Цитофлавин» способствовала достоверному снижению уровня индуцированного аллоксаном апоптоза, значительно превосходя по своей эффективности препарат сравнения, что свидетельствует о нормализации параметров активности и уровня клеточной гибели иммунокомпетентных клеток в условиях экспериментального декомпенсированного СД на фоне его применения.

Течение декомпенсированного диабета вызывает массивную некротическую гибель (с повреждением миелиновой оболочки и аксона) нервных клеток и сопровождается развитием воспаления. Так, уже через 72 часа после введения аллоксана у экспериментальных животных наблюдаются такие сдвиги в картине крови, как нейтрофильный лейкоцитоз и моноцитоз на фоне лимфопении (Волчегорский И.А., 2008), характерные для системного ответа на воспаление.

Это согласуется и с данными о воспалительном поражении поджелудочной железы и печени в те же временные интервалы (Волчегорский И.А., Цей-ликман В.Э. и др., 2008). Одновременно с этим, воспаление является общебиологической реакцией организма на происходящие события и направлено на удаление нежизнеспособных клеток и их фрагментов, а также ограничение распространения клеточной гибели и восстановление ткани.

Принимая во внимание вышеизложенное, было изучено влияние препаратов «Цитофлавин» и «а-липоевая к-та» на выраженность воспалительной реакции у мышей СВА на модели конканавалин А - индуцированного воспаления (табл. 12).

Как видно из данных таблицы, оба препарата обладали противовоспалительной активностью в данной модели воспаления, достоверно снижая индекс воспалительной реакции.

Влияние препарата цитофлавин на развитие индуцированной воспалительной реакции (М±ш)

Экспериментальные группы Средние значения индексов реакций Разница средних индексов реакции по сравнению с контролем (%)

Контроль (0,9% раствор НаС1) 44,0±0,6 -

Цитофлавин 23,0±0,3*** 21

а-Липоевая к-та 24, Ш), 8*** 20

Примечание: * - наличие статистически значимых различий по отношению к контролю (*** - р<0,001)

Изучение эффективности препарата «Цитофлавин» в двух моделях экспериментального декомпенсированного диабета установило его выраженное позитивное действие в отношении снижения активности ПОЛ и восстановления пула ферментов антиперекисной системы, что способствует нормализации энергетического обмена митохондрий. «Цитофлавин» оказал более выраженное позитивное действие на показатели, провоцирующие развитие осложнений СД, чем «а-липоевая кислота».

Препарат способствовал нормализации ряда показателей, характеризующих функциональную активность центральной и периферической нервных систем. Выявленная на организменном уровне лечебная эффективность «Цитофла-вина» коррелировала с его влиянием на параметры активности и уровень клеточной гибели иммунокомпетентных клеток, уровень спонтанной и митоген-индуцированной метаболической активности митохондрий спленоцитов, индекс воспалительной реакции.

Механизм лечебной эффективности препарата обусловлен его антиокси-дантными и метаболопротективными свойствами и направлен, помимо влияния на процессы биологического окисления, на коррекцию энергодефицита, нарушений транспорта макроэргов и накопления недоокисленных соединений, восстановление изменений липидного обмена.

Таким образом, результаты проведенного исследования позволяют констатировать, что перспективным подходом к профилактике и лечению перекис-ных и энергодефицитных повреждений тканей при СД, может служить метаболическая коррекция клеточного дыхания с использованием препарата «Цитоф-лавин». Восстанавливая баланс системы ПОЛ-АОЗ, возможно предотвратить или отсрочить инвалидизирующие и фатальные последствия диабетических ан-гио- и нейропатий.

Полученные данные позволят считать целесообразным применение «Ци-тофлавина» в комплексной терапии диабета.

23

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальный декомпенсированный диабет у крыс характеризуется выраженным и длительным гипергликемическим периодом, массивной гибелью р-клеток с деструкцией островков Лангерганса, нарушениями липидного обмена и процессов ПОЛ-АОЗ, функционального состояния иммунокомпетент-ных клеток и механизмов апоптоза, развитием нейродегенеративных изменений и угнетением когнитивных функций.

2. Препарат «Цитофлавин» способствует восстановлению нарушенного липидного обмена, процессов перекисного окисления липидов и активности ан-тиоксидантной системы защиты организма, в отличие от стандартных антидиабетических препаратов.

3. Препарат «Цитофлавин» эффективно корригирует нейродегенератив-ные процессы и дефицит когнитивных функций, развивающиеся у животных в условиях декомпенсированного диабета, нормализует состояние митохондри-альной активности спленоцитов и снижает уровень апоптоза.

4. Препарат позитивно влияет на показатели воспалительной реакции, обусловленной действием лимфоцитарного митогена конканавалин А.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты проведенного исследования позволяют констатировать, что перспективным подходом к профилактике и лечению перекисных и энергодефицитных повреждений тканей при сахарном диабете, может служить метаболическая коррекция клеточного дыхания с использованием препарата «Цитофлавин». Восстанавление баланса системы ПОЛ-АОЗ, позволяет предотвратить или отсрочить инвалидизирующие и фатальные последствия диабетических ан-гио- и нейропатий, и повысить качество жизни больных, страдающих сахарным диабетом.

Результаты работы определяют возможность применения нового отечественного препарата «Цитофлавин» в клинических схемах лекарственной терапии сахарного диабета и его осложнений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Биличенко C.B. Антигипергликемическое действие цитофлавина и ли-поевой кислоты при экспериментальном диабете у крыс. Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. Сб. тез. - С-Пб, 2006 - С. 223.

2. Биличенко C.B. Эффективность цитофлавина при экспериментальном диабете различного генеза / Т.Н. Саватеева-Любимова, А.Л. Коваленко,

A.B. Саватеев // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. - 2006. № 1. - С. 137139.

3. Биличенко C.B. Влияние цитофлавина на функциональную активность иммунокомпетентных клеток при экспериментальном диабете / Т.Н. Саватеева-Любимова, A.B. Саватеев II Медицинская иммунология: материалы ХШ Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика

B.И. Иоффе. - С-Пб., 2009. - Т. И, № 4-5. - С. 303.

4. Биличенко C.B. Антиоксидантная активность и антинейропатическое действие цитофлавина при экспериментальном диабете / Т.Н. Саватеева-Любимова // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. Сб. тез. - С-Пб, 2009 - С. 16-17.

5. Биличенко C.B. Влияние цитофлавина на процессы памяти и нервно-мышечной передачи у крыс в условиях аллоксанового диабета / Т.Н. Саватеева-Любимова, A.B. Саватеев // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.В. Мечникова. - 2009. - № 1. - С. 129-132.

Формат 60x84/16 Заказ № 295

Подписано в печать 30.03.10

Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Типография BMA им. С.М. Кирова 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

Сахарный диабет (СД) является актуальной проблемой современной эндокринологии. Наиболее частой причиной инвалидности и преждевременной смерти больных СД является развитие сосудистых осложнений (микро- и макроангиопатии) и нейропатии [8, 9, 11, 33, 35, 36, 72, 97, 109, 121]. Сложный патогенез данного заболевания включает генетические факторы, иммунологические; нарушения и нарушение всех видов обмена веществ, что приводит к метаболическим сдвигам и запускает каскад реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Разработка средств и методов лечения СД, оказывающих влияние на различные звенья патогенеза, является актуальной задачей эндокринологии.

На сегодняшний день терапия СД направлена на снижение уровня глюкозы крови путем восполнения дефицита инсулина его аналогом или же стимуляцию секреции островковых клеток и повышение утилизации глюкозы периферическими тканями введением сахароснижающих препаратов [2, 8, 9, 36, 42, 77, 79, 133, 138]. Подобная тактика лечения не учитывает необходимость воздействия и на другие звенья патогенеза СД, лежащие в основе развития диабетических осложнений [1, 34, 58, 62, 89, 93, 95,102,129].

По данным многочисленных исследований значительная роль в патогенезе сахарного диабета и его осложнений принадлежит окислительному стрессу [31, 34, 58, 61,125,132, 150, 153, 165]. Установлена четкая корреляционная зависимость между гипергликемией и степенью выраженности окислительного стресса, наличие которого сопровождается активированием процессов перекисного окисления липидов [10, 34, 102, 160, 175, 180]. Нарушения в системе ПОЛ, наряду с метаболическими и генетическими факторами, обусловливают развитие сосудистых и неврологических осложнений диабета [9, 36, 40, 54, 55, 70,129,165].

Таким образом, актуальными являются исследования, направленные на поиск новых лекарственных средств, обеспечивающих профилактику и терапию поздних осложнений СД с учетом патогенетических механизмов их развития.

К подобным средствам фармакологической коррекции можно отнести препараты, восстанавливающие нарушения клеточного метаболизма, в первую очередь, антиоксиданты-антигипоксанты.

Цель исследования

Экспериментальное изучение специфической фармакологической активности комплексного препарата «Цитофлавин», обладающего антиокси-дантной и метаболотропной активностью в условиях модели декомпенсиро-ванного сахарного диабета как средства профилактики и терапии поздних осложнений СД.

Задачи исследования

1. Изучить дозозависимые эффекты диабетогенов аллоксана и стреп-тозотоцина в отношении летальности животных (крысы), показателей, характеризующих клиническую картину заболевания, уровня содержания глюкозы и длительности гипергликемического периода, инсулинпродуци-рующей функции (3-клеток поджелудочной железы, углеводного и липидно-го обменов, функциональной активности печени и почек, процессов пере-кисного окисления липидов и антиоксидантной защиты. Выбрать дозы диабетогенов, вызывающие экспериментальный диабет тяжелой степени (де-компенсированный диабет).

2. Изучить влияние препарата «Цитофлавин» и эталонного средства для лечения поздних осложнений сахарного диабета — «а-липоевая кислота» - на течение клинической картины, состояние углеводного и липидного обменов, процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной защиты в условиях экспериментального декомпенсированного диабета различного генеза.

3. Изучить влияние препарата «Цитофлавин» в сравнении с препаратом «а-липоевая кислота» на процессы нервно-мышечной передачи и когнитивные функции, состояние митохондриальной активности спленоцитов и уровень апоптоза в них в условиях декомпенсированного аллоксанового диабета. Изучить влияние препарата «Цитофлавин» в сравнении с препаратом «а-липоевая кислота» на показатели конканавалин А-обусловленного воспаления.

Научная новизна

1. Впервые проведена экспериментальная оценка эффективности препарата «Цитофлавин» в условиях декомпенсированного экспериментального диабета различного генеза. В отличие от стандартных антидиабетических препаратов продемонстрировано выраженное позитивное влияние на состояние липидного обмена, системы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты организма (АОЗ), лежащих в основе патогенеза осложнений сахарного диабета. Эффективность изученного препарата превосходила эффективность эталонного средства для лечения поздних осложнений диабета - «а-липоевая кислота».

2. Впервые установлено, что введение препарата «Цитофлавин» способствует экспериментальной коррекции неврологических и когнитивных нарушений в модели декомпенсированного СД, что обусловлено входящими в спектр фармакологической активности препарата антиоксидантной и ме-таболотропной активностью и иммунопротективными свойствами.

Положения, выносимые на защиту

1. Препарат «Цитофлавин», обладая невыраженным по сравнению со стандартными антидиабетическими препаратами антигипергликемическпм действием, значительно превосходит их по степени корригирующего воздействия на состояние липидного обмена, процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной системы защиты организма в уелоt виях декомпенсированного экспериментального диабета различного генеза.

2. Препарат «Цитофлавин» вызывает выраженный регресс патологических изменений афферентной чувствительности и функционального со$ стояния нервно-мышечной передачи, а также когнитивных нарушений, обусловленных действием диабетогена - аллоксана.

3. В основе терапевтической эффективности препарата «Цитофла-вин» в отношении поздних осложнений сахарного диабета лежит позитивное влияние на состояние процессов липопероксидации и активности анти-оксидантной системы, нарушения липидного обмена, изменения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, а также наличие в спектре его фармакологической активности противовоспалительного действия.

Научно-практическая значимость

Полученные данные представляют собой экспериментальное обоснование роли препарата «Цитофлавин» как средства профилактики поздних осложнений сахарного диабета на гомеостатическом уровне при экспериментальном сахарном диабете.

Показано, что в основе экспериментальной терапевтической эффективности изученного препарата лежит коррекция биоэнергетических нарушений, обусловленных действием диабетогенов.

Результаты настоящего исследования определяют перспективность применения препаратов антиоксидантного/метаболического типа действия, в том числе «Цитофлавина», в комплексной терапии сахарного диабета с целью снижения риска развития осложнений, сопутствующих данному заболеванию и приводящих к инвалидизации и преждевременной смерти.

Апробация и публикация материалов исследования

Материалы диссертации изложены на научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» в СПб МАЛО (Санкт-Петербург, 2006, 2009), на XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в С-Пб, 2009», заседаниях Ученого совета и межлабораторных заседаниях ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА России.

Реализация работы

Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Сахарный диабет». Результаты работы реализованы в научно-исследовательской деятельности ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА РФ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста, иллюстрированы 24 таблицами, 6 рисунками и 1 схемой. Диссертация состоит из введения,.обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, главы с обсуждением результатов исследований, выводов, списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 96 отечественных и 91 иностранных источников.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальный декомпенсированный диабет у крыс характеризуется выраженным и длительным гипергликемическим периодом, массивной гибелью Р-клеток с деструкцией островков Лангерганса, нарушениями липидного обмена и процессов ПОЛ-АОЗ, функционального состояния им-мунокомпетентных клеток и механизмов апоптоза, развитием нейродегене-ративных изменений и угнетением когнитивных функций.

2. Препарат «Цитофлавин» способствует восстановлению нарушенного липидного обмена, процессов перекисного окисления липидов и активности антиоксидантной системы защиты организма, в отличие от стандартных антидиабетических препаратов.

3. Препарат «Цитофлавин» эффективно корригирует нейродегенера-тивные процессы и дефицит когнитивных функций, развивающиеся у животных в условиях декомпенсированного диабета, нормализует состояние митохондриальной активности спленоцитов и снижает уровень апоптоза.

4. Препарат позитивно влияет на показатели воспалительной реакции, обусловленной действие^'лимфоцитарного митогена конканавалин А.