Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Синтез, строение, биологическая активность и технология производства 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты

На правах рукописи

003450792 САТТАРОВА ЛЕЙСАН ФАТИХОВНА

Синтез, строение, биологическая активность и технология производства 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этнл-хинолинкарбоновон-3 кислоты (препарата ПОЛИТРИЛ)

15.00.02. - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

О

Казань-2008

003450792

Работа выполнена в ООО «Поливит» (г. Уфа) и на кафедре органической химии ГОУ ВПО «Казанский государственный технологический университет»

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Гуревич Пётр Аронович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтическич наук, профессор Егорова Светлана Николаевна

доктор химических наук, профессор Хусаинова Наргис Габбасовна

Ведущая организация:

Институт органической и физической химии имени А.Е. Арбузова Казанского научного центра РАН

Защита состоится «И» ноября 2008 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420015 г. Казань, ул. Карла Маркса, д. 68, зал заседаний учёного совета А-330.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Электронный вариант автореферата размещён на сайте Казанского государственного технологического университета http://www.kstu.ru

Автореферат разослан « » октября 2008 года

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Захаров В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ* Актуальность проблемы.

В настоящее время в медицине широко используются высоко актишгыс антибактериальные препараты - ингибиторы ДНК-гиразы бактерий, относящиеся к классу 6-фторопроизводных 4-оксохинолинкарбоновых-З кислот.

Фгорохинолоны широко применяют в клиниках России, в первую очередь при инфекциях мочевыводяших путей, при заболеваниях, передаваемых половым путем, инфекциях нижних дыхательных путей, кожи, мягких тканей, раневой инфекции, в том числе у онкологических больных, при различных бактериальных кишечных инфекциях. Промышленное производство субстанций для изготовления лекарственных препаратов класса фторохинолоноп, в том числе для использования п ветеринарии, в Российском Федерации огс>тствус!. Имеющиеся в настоящее время на рынке РФ фторохинолоны приобретаются исключительно за рубежом. Широкие производственные испытания Политрша в Краснодарском крае, Башкортостане, Татарстане, Белгородской, Волгоградской, Курской, Омской областях показали, что препарат не уступает по эффективности и безопасности, превосходит по экономическим показателям применяемые в настоящее время импортные препараты Байтрил и Абактан.

Поэтому астуальным является создание отечественной технологии для удовлетворения потребностей ветеринарной медицины.

Актуально и внедрение в ветеринарную практику новых соединений, поскольку при длительном применении какого-либо препарата у микроорганизмов появляется резистеттюсть и вырабатываются штаммы, устойчивые к воздействию лечебного средства.

Настоящая работа является продолжением исследований, проводимых ООО «Поливит» (г. Уфа) и кафедрой органической химии Казанского государственного технологического университета по сштгезу соединений, обладающих потенциальной биологической активностью, поиску их практического применения в качестве антимикробных и лекарственных средств.

Целыо диссертационной работы являлись'

- разработка методологии синтеза представителя фторохинолонов, пригодного для организации промышленного проюводства (с учётом доступности сырья, растворителей, утилизации отходов);

- создание технологии и промышленный выпуск субстанции - 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты; многоплановое исследование её биологической активности, изучение возможных отдалённых последствий влияния лекарственного препарата (нолытрш) при лечении сельскохозяйственных животных и 1ТГИЦ.

Для достижения поставленной цели было необходимо:

- синтезировать из доступного сырья 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1 -эгил-хинолинкарбоновую-3 кислоту (с учетом доступности реагентоп и растворителей); установить её строение с использованием современных фюико-химических методов (ИК-, ЯМР 'Н, ПС, |9Р - спектроскопия; масс-спектрометрия. РСА);

* Научный консультант диссертационной работы дтн, и о профессора кафедры оборудования пищевых производств КГТУ Струннн Борис Павлович

разработать технологию промышленного производства 1,4-дигидро-7-(морфолиннл-4)-4-оксо-6~фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты - субстанции для производства лекарственного средства политрш',

- изучить биологическую активность синтезированного соединения и установить возможные отдалённые последствия (в частности, эмбриотоксическое, мутагенное и тератогенное действие) влияния политрала па животных и птиц при использовании в качестве лекарственного средства.

Методы исследования. Для синтеза целевого соединения использовали общие методы синтетической органической химии. Состав и строение соединений устанавливали с помощью элементного анализа; ИК-. ЯМР-спектроскопии 1Н, |3С, "Г: масс-спектрометрии: рентгеноструктурпого анализа. Микроскопические исследования проводили на световом микроскопе J LNAVAL фирмы «CARL ZEISS». Для количественного определения целевого продукта при промышленном производстве применяли высокоэффективную жидкостную хроматографию (для этой аналитической операции разработаны ТУ 9336-004-39988364-2006).

Научная новизна. Разработана методология лабораторного синтеза одного ю представителей класса фторохинолонов - 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-З кислоты;

- впервые в стране создана технология получения в заводских условиях субстанции этой кислоты (/полифлоксацин) и на её основе в промышленных масштабах изготовлен антибактериальный препарат политрш;

- впервые для политрша систематически изучены различные виды биологической активности и возможные отдалённые последствия влия[гия на сельскохозяйственных животных и птиц

Практическая значимость диссертационной работы определяется:

1) выбором рационального способа синтеза 1.4-дигидро-7-(морфолинил-4)^4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-З кислоты (полифлоксацин), пригодного для организации промышленного прошводства; разработкой технологической схемы получения; реализацией впервые в Росс™ выпуска субстанции в заводских условиях, её наработке в количестве более 1 тонны (завод «Авангард» г. Стерлигамак) и производстве препа--рата политрш (ООО «Поливиг», г. Уфа) (защищено патентом № 2206564 - способ получения потфлоксацта, заявка № 2002105968 от 7.03 2002 г, БИ № 17,2003г.)

2) получением в установленном порядке разрешительной документации на производство и применение субстанции и препарата политрш (защищено патентом № 2161966 -антимикробное средство, заявка № 2000103294 от 14 02.2001 г, БИ № 2, 2001 г.). Имеются:

-Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных - 10% раствор для орального применения политрш - ПВР-2-4.5/01548 от 6.02.2006 г.;

- Инструкция по применению политрша для лечения заболеваний сельскохозяйственных животных, в том числе пгиц бактериальной этиологии, утвержденная Заместителем Руководителя Россельхознадзора 6.02.2006 г.;

- Технические условия ТУ 9336-004-39988364-2006:

- Сертификат соответствия № ЮСС RU. П096. В10344 от 06.03.2006 г., выданный Всероссийским НИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ), -Свидетельство на товарный знак политрш № 170210 от 4.12.1998 г.

3) На основе материалов диссертации подготовлено, издано и используется в обучении студентов (специальности 24090165 «Биотехнология», 26020465 «Технология бродильных производств и виноделие», 24050265 «Технология переработки пластических масс и эластомеров», 24080365 «Рациональное использование материальных и энергетических ресурсов») учебно-методическое пособие «Введение в химию биологически активных веществ» (авторы П.Д. Гуревич, Л.Ф. Сапарова, Б.П. Струним).

Основные положения диссертации, выносимые назаииггу: -разработка лабораторной методики получения 1,4 -д иг и д ро-7-(м о рф о л и ни л -4) -4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолннкарбоиовой-3 кислоты и результаты по изучению ее строения современными фшическими методами (ЯМР 'Н, |3С, "Е, ИК-спектроскопия; РСЛ, масс-спектрометрия);

- создание технологической схемы получения 1.4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1 -У! ид-хинолиикарбоновои-З кислоты, осуществление выпуска субстанции в заводских условиях и препарата политрип в промышленном масштабе;

- результаты исследования биологической активности и фармакотоксикологических свойств субстанции и препарата политрил для установления отдалённых последствий влияния препарата 1И животных и тип; и, как следствие, - обоснование возможности применения политрила в качестве антибактериального средства в ветеринарии.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на: 2-ом Международном форуме молодых ученых (7-й Международной конференции) «Актуальные проблемы современной науки. Естественные науки. Органическая химия» (Самара-2006), научных сессиях КГТУ (Казань, 2006, 2007, 2003), 7 и 8 Республиканских школах студе1ггов и аспирантов «Жить в XXI веке» (Казань, 2007, 2008).

Публикации. Материалы работы опубликованы в 5 статьях (в Вестнике Казанского технологического университета - журнале, рекомендованном ВАК) и 6 тезисах докладов на конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа построена в классическом стиле и состоит ю введения, литературного обзора (по химии фторохино-лонов, методам получения и сведениях о биологической активности соединений этого класса), обсуждения результатов, эксперимеш'альной части (химической, биологической, технологической), выводов, списка цитируемой литературы из 145 наименований, приложения. Диссертация изложена на 162 страницах, включая 19 таблиц и 15 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы актуальность темы исследования, её научная и практическая значимость, сформулирована цель работы.

В главе 1 «Синтез, строение п биологическая активность фторохинолонов» представлен анализ литературного материала по «Синтезу и химии хинолинов и хинолонов». «Получению лекарственных соединений хинолинового и шохинолинового ряда», «Биологической активности фторохинолонов».

Во введении отмечено, что применяемые в ветеринарной практике субстанции фторохинолонов не производятся в Российской Федерации и закупаются за рубежом.

Нами была поставлена задача выбора производного фторохинолона, доступного по исходному сырью и технологическим параметрам, с целью организации

его промышленного производства для обеспечения потребностей в противомик-робных препаратах сельского хозяйства РФ.

Из тысяч описанных в литературе производных фторохинолона мы остановились на аналоге норфлоксацина-1 (X = N11) - 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоте (X = О - полыфлоксацин -субстанция препарата политрил - 2).

1. Спите!, строение и технология прошводства 1,4-дигидро-7-(могиЬолннил-4)-4-оксо-6-фторо-1 ->тил-\инолинкаг>боновом -3 кислоты (препарата политрил)

п с гроснис

В 1993 г. японские авторы описали лабораторный синтез такого же соединения. В табл. I приведены сравнительные характеристики литературного соединения и полифлоксаци-иа, синтезированного нами.

Таблица 1.

J. Med. Chem. 1993, v. 36, N 10, pp. 1356-1363 Полифлоксацин - субстанция, препарат - политрил

Эфир, ДМ ФА, ДМСО, метанол, уксусный ангидрид Растворители Диметисульфон, толуол, ацетон, вода, этанол, уксусная кислота

Концентрированная серная кислота Растворитель при термоконденсацин Дизельное топливо летнее ГОСТ305-82

1-нитро-3,4-дифторобегаол; 1-амино-3,4-дифторобе1сзол Реагенты 1-нитро-4-фторо-3- хлоробеюол; 1 -ам ино-4ч|]Торо-3- хлоробензол

in vitro: S. Pneumoniae 12,5 м г/мл Е Faecalts LS-10I- 3,13 мг/мл Ecoli- 0,78 мг/мл P. aeruginosa U-3I- 3,13 мг/мл in vivo - не описано Антимикробная активность и лечебное действие in vitro: индикаторные штаммы ТА1950, ТА98, TAÍ00; золотистый стафилококк (штамм 209Р), кишечная палочка (штамм 1749). in vivo - 578 белых беспородных мышей, мыши линии СВА; 184 белых крысы; аквариумные рыбки гуппи, более 500 поросят-сосунов; крупный рогатый скот (телята), свиньи крупной белой породы (460 больных свиноматок, 126 хряков); 202700 цыплят-

1.]. Синтез

бройлеров и кур, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям.

Выбор порфлоксацина, как базового аналога, обоснован тем, что это - один из первых представителей фторохинолонов. широко используемых в медицинской практике. Мы учли, что фрагмент нергидрооксазина (морфолина) входит в состав ряда лекарственных и дезинфицирующих средств и предположили, чго он будет образовывать меньше метаболитов по сравнению с пергидродиазином (пиперази-ном) (что впоследствии подтвердилось) и является более доступным по сырьевой базе, чем пиперазин.

После многоплановых систематических испытаний биологической активности. изучения основных фармаксггоксикологических свойств политрш разрешен в установленном порядке для лечения бактериальных инфекции у сельскохозяйственных животных, втом числе, птиц.

Во 2 главе «Экспериментальная часть» представлены результаты лабораторного синтеза полифлоксацина ~ субстрата препарата политрил; рассматривается технологическая схема производства.

Стггез целевого соединения в лаборатории проводили в несколько этапов по модифицированным литературным методикам, которые затем были реализованы при создании технологической схемы и выпуске субстанции в промышленном масштабе. Следует отметить, что на каждой стадии подбирали оптимальные условия (прежде всего соответствующий реагент и растворитель), устанавливали строение основных и побочных продуктов реакций.

1. Этил-З -это кс и-2 -(этоктнк-арбонил)п ропепоат получали из ортомуравьи-ного эфира и малонового эфира:

С(0)0С2Н5

(с2н5о)3сн + сн2<С(0)0СгН5

2п(0Ас),'2Н20

СН,С(0)0Н

—»(С,Н50)2СН-СН<

Структуру целевого спектров (Табл. 2)

С(0)0С2Н5

С(0)0С2Н5 ~с,н5он

соединения

5 7 9

1 2 3 4Х(0)0-СНГСН3

СНгСН2-0-СН=<Х С(0)0-СН2-СН3

6 8 10

идентифицировали на основании ЯМР 13С-

Я1У1Р С - спектральные характеристики

Таблица 2

5С, м.д.

С1 С2 С с с6 с' с8 С С10

14,7 71,7 162,7 106,6 163,4 164,3 60,1 60,1 13.7 13,7

'•1сн,Г«

127,0 146,0 185,3 - - - 146,0 146,0 127,0 127,0

МС1|, Гц

- - - 6,6 - - - - - -

Побочные продукты реакции:

После выделения целевого соединения перегонкой в реакционной колбе ос тавалась густая масса, в которой методом ЯМР 3С - спектроскопии идентифици-

7

рованы: диэтил-2,4-ди(этоксикарбонил)пентен-2-диоат и этил-3,3-диэтокси-2-(этоксикарбонил)пропаноат:

п 0 0

9 V , , Л II

с-о-с,н. .с-о-сгн5 сн3—сн2—о—"с\, , , ;'с-о-сн2-сн3

СН, -- , 4 . СН-С = С(

сгн,0-сн-г; , - , < ,

Г-о-С,Н, Чг-П_г.н. СН3—СН2—0-С/

(I

о

■ II:

с-о-с2н, о

Я1У1Р С-спектральные характеристик»

„С—О—СН2—С'Н3

о

Таблица 3

5С, м.д.

С1 & Сг С4 С С6 с' С* С С с" с С С14 С

13,4 13,4 62,0 62,0 165.8 165,8 51,7 138,1 131,9 163.0 163, 6 61,3 61.3 13,4 13,4

'<1сн< Гц

127, 0 127, о 146, 0 146, 0 - - 33,5 168,4 - - - 146,0 146, 0 127, 0 127, 0

О

,1 - » сн,-сн2-оЧ5 6/7с-о-сн2-сн3

сн-сн

СНз-СНз-О'' >-о-сн2-сн3 о

ЯМР |3С - спектральные характеристики_Таблица 4

5С, м.д.

С1 С Сг С С С С7 С* С9 С10 С" С12

14,6 62,8 100,9 56,9 165,5 60,7 13,6

'.Ген, Гц

127,0 146,1 168,4 138 - 146,0 127,0

2. 1-Нитро-4-<Ьто по-3-хлоробе тол

(ПДК 1 мг/м3, выход 93%). На этапе фторирования в качестве исходного доступного многотониажного сырья выбран фторид калия, дигидрат. Обнаружено, чго на этой стадии нежелательно присутствие воды, которая способствует гидролизу атома хлора и приводит к образованию 4-нигро-2-хлорофенола, снижающего выход целевого соединения итрудно утилизируемого.

Потому тщательная предварительная сушка фторида калия и его прокаливание при ЗООР С являются основным условием успешного протекания реакции заместительного фторирования.

На основании экспериментов по подбору оптимального растворителя процесса фторирования выбран сухой диметилсульфон, поскольку его легко регенерировать и от него достаточно просто отделить образующийся хлорид калия.

3. 1-Ампно-4-фтопо-3-хлоро-

' беюол (ПДК 0.5 мг/см3, выход 87%)

* зре'0' синтезировали по реакции Зинина

восстановлением I -ьIигро-4ч]>торо -3 -

хлоробензола в водном этаноле

(мелкодисперсное железо, обработанное соляной кислотой, с1 = 1,19).

4. Этнл-2-э то кепка ибо 1Н1л-3-(4-<Ьтопо-3-хло рофе пилам нно)про не поат

(выход 70 %) по-

_с<соос3н, • _ сгн,он > лучали ш амина

с о о с г н 5 (стадия 3) и про-

пеноата (стадия ,хоос2н5 1). Спектр ЯМР р-Л__/^н'сн-с<с00с!н5 'Н (4-ацетон), 6,

м.д.: 1,15 (6 Н. т,

2 СН}); 4,2 (4 Н, к, 2 ОСН2); 6,5 (1 Н, д, 3.1НН =5 Гц, С(6> Н); 6,7 (I Н, с, С(2) Н); 7,4 (1 Н. д, 3.1„и = 5 Гц. С,,, Ы); 7.6 (1 Н. д.3 Jш, = 7.5 Гц. =СН); хим. сдвиг 1М-Н не фиксируется вследствие обмена па О.

5. 'Этиловый_чфнр_1,4-д игщ ро-4-о ксо-6-фторо-7-

хлорохинолинкарбоиовой-З кислоты (выход 82 %) образуется при термоциклизации аминопропеноата (стадия 4) в летнем дизельном топливе (ДТЛ) - ГОСТ 305-82. ДТЛ имеет ряд преимуществ: возможность достичь необходимой температуры, дешевизна (по сравнению со многими высоко кипящими органическими растворителями) и доступность. Циклический фторохинолон, образующийся в процессе реакции, не растворяется в ДТЛ, выпадает в осадок и легко отделяется.

Попытки использовать для проведения термоциклизации в качестве растворителей кислотных агентов (серной или хлорсульфоновой кислот) не увенчались успехом, поскольку образовывался конкурирующий продукт - этиловый эфир 1,4-днгидро-4-оксо-6-фторо-5-хлорохинолинкарбоновой-3 кислоты (соотношение 1:1). Он затруднял выделение целевого соединения и утилизацию отходов; способствовал перерасходу сырья.

ИК спектр, v, см'1: 1660 (СО); 1740 (СООЕ0, 3200 (ЫН).

В спектре ПМР (ДМСО-Ц,), 5, м.д.: Н-С(2) - 8,2 (д.,3111Н = 7,5 Гц). Слабополь-ный сдвиг Н-С(2) относительно его положения в целевом соединении стадии 4 (с 7,6 до 8,2 м.д.) можно объяснить тем, чго он стал внутренним протоном гетероциклической системы. Хим. сдвиг Ы-Н не фиксируется вследствие обмена на О.

При разработке технологической схемы и промышленном выпуске субстрата стадии 4 и 5 обч^едипяли и осуществляли в одном реакторе.

6. 1,4-Диг1ипо-4-оксо-6-<Ьторо-7-хлоро-1-эт1М-хинолинкарбоновая-3 кислота (выход 74,2 %).

При алкилировании гетероцикла (стадии 5) бромэтаном в присутствии основания (с одновременным гидролизом сложноэфирнон группировки) образуется целевая кислота.

Алкилирование

соос,н< р ? в водно-щелочной

I С;Н.вг,июи(н,о).I '/у^"10" среде протекает при

2 нвг(н2о) аАч^А )> +^вг+с2н,он нагревании реакцион-с2н5 ной смеси в течение

12 часов. В кипящем

же ДМФА продолжительность реакции уменьшается до 2 часов, но происходит осмоление реакционной массы. По-видимому, в среде ДМФА имеет место декарбоксилирование, причем активирующее влияние на этот процесс оказывают две соседние С=Ю-группы.

Из литературы известно, что /3-оксокислоты, к которым можно отнести образующуюся кислоту, легко декарбоксилируются. При этом суммарная скорость декарбоксилирования зависит от концентрации самой оксокислоты и конце трации её аниона. Быстрое декарбоксилирование таких соединений обусловлено переносом протона карбоксильной группы к соседней карбонильной группе за счет образования водородной связи.

Спектр ЯМР'Н (4-ДМСО), о, м.д.: 1,15 (3 Н, 1, Лкн = 7 Гц, СН3); 3,75 (2 Н, к, Зт = 7 Гц, М:Н2); 6,70 (1 Н, с, С(8)Н); 7,45 (1 Н, с, С(5)Н); 8,15 (1 Н, с, =С(2)Н); хим. сдвиг О-Н не фиксируется вследствие обмена на О.

7. и4-Диг>щро-7-(мог>фоп1тил-4)-4-оксо-6-фтопо-1-этил-Х1И1олинка1)бочовая-3 кислота (выход 82,8 %)

о

ЛЛ '

NN О

Г-\

г О I

N_/ -НС1 V-/

соон

Получается при нагревании хинолинкарбонов ой кислоты

(стадия 61 с ш бытком

оСО -

С2Н5 морфолина.

ИК спектр, v, см"1: 1690 (СО); 1730 (СООЕО, 3400 (ОН).

С целью установления идентичности вновь синтезированного антимикробного средства предлагаемой структуре проведено сравнение спектров ЯМР 'Н, 13С, |9Р политрила (2) и норфлоксацина (1), выделенного из импортного препарата полигон (синоним 1) и специально сшггез про пат юг о нами. Спектральные данные свидетельствуют, что политрил по своей структуре близок к норфлоксацину.

Спектр ЯМР'Н политрила (Х=0) (2)/норфлоксацина (Х=М1) (1)

Таблица 5

х=о 1,02 т 2,6 т 2,7 т 3,81 К 6,43 с 7,36 д 7,98 с

зн, С"Н, 8Н, гыоснл 4Н, 0(СН3), 2Н, ЫСН2 1Н, с"н= !Н, с*н=, '.11 1Г 3,75 Гц 1Н, ЫН, ОН не фиксируются -обмене 0£>

ХНЧ н 1,00 т 2,6 с 3,81 к 6,45 с 7,38 д 8,00 с

Спекпгр ЯМР,3С политрила (2)/норфлоксацнна(1) (Х^О, Вгикег,300 МГц)

Таблица 6

6, М.Д.

Сг С1 С4 С С" С1 С С С с" с С С14 С

х=о 147,2 117,1 175,0 112,0 152,7 144,1 104,5 136,5 122,4 172,0 49,1 14,0 50,1 66,6

Х=1ЧН 147,7 117,1 175,2 111,9 153,1 144,8 105,6 136,7 122,7 172,6 49.1 13,9 50,9 44,9

Атом фтора проявляется в ЯМР "рспектре (2)/(1) 5 = -48,1/-48,2 м.д. (Н20 + КР + 020).

'и

Рис. ! СпектрЯМР |9Р норфлоксацина из Рис. 2 Спектр ЯМР |9Р политрила коммерческого препарата нолицин

II МП V1VV

11,1 „„.ц^.,,!........1,

СО 150 140 130 120 110 100 10 во ис сои ллимш пмижио« 1Н огв»«.он 7«.в1 «« 1*5

30 го рр-

Рис. 3 ЯМР-спектр

|3С

1-этил-6-фтор-7-пипераз инил-4-оксо-хинолинкарбоновой-3 кислоты (выделенной из пре парата)

Рис. 4 ЯМР-спектр 13С субстанции лолитрила

I V/ v

.с:

,0 'он

Рис. 5. ЯМР-спектр 1Н субстанции по-литрила

CHi-CH,

н

н н

il L-J и

J

Строение субстанции (продукт 2) подтверждают данные масс-спектрометрии электронного удара (ЭУ) (TRACE MS «Finnigan МАТ», энергии ионизирующих электронов 70 эВ, температура источника ионов 20(f С при прямом вводе вещества). В масс-спектре соед. 2 пик m/z 320 отвечает молекулярному иону (М+ ) молекулы со структурой 2. Первая стадия распада молекул 2 при ЭУ связана с разрывом С-С и С-0 связей в азотсодержащгм насыщеннном гетероцикле. Данный процесс приводит к пику иона [M-C2H»Of m/z 276. Потеря самого гетероцикла М+ - ионом обусловливает появление в масс-спектре пика иона m/z 234, Наряду с этим процессом, происходит миграция одного атома водорода к заряженному осколку с образованием иона с m/z 235. В дальнейшем последний ион теряет ОН - группу с образованием иона m/z 218. Присутствие в масс-спектре иона m/z 203, можно связать с последующим отщеплением СН3-группы из иона m/z 218. Присутствие других осколочных ионов с малыми значениями m/z в масс-спектре ЭУ 2 вызвано, по-видимому, последовательным распадом при ЭУ отмеченных выше ионов.

Строение субстанции политрила подтверждено также методом ренггеност-руктурного анализа (РСА) монокристаллов: 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновая-3 кислота (2) образует триклинные кристаллы (пространственная группа Р -1) (рис.6). Хинолиновый фрагмешг молекулы плоский в пределах экспериментальной погрешности 0.029(2)А :

Карбоксильная группа расположена в плоскости гетероцикла, а метильная группа этильногозаместителя молекулы находится практически в перпендикулярном к плоскости гетероцикла положении. Длины связей при атоме азота N1 существенно различаются между собой: И1-С2 1.344(2)А, Ш-С8А 1.396(2)А, 1М1-С9

он

Рис.6. Геометрия молекулы 2 в кристалле и схема нумерации. Отличные от водородных атомы представлены вероятностными эллипсоидами тепловых колебаний (р = 50%), атомы водорода -сферами произвольного радиуса.

1.478(2)к.

Лтом водорода Н12 гидроксильной группы участвует в образовании классической внутримолекулярной водородной связи с кислородом 04 карбонильной группы. Взаимное расположение молекул в кристалле оказывается таковым, что вблизи атома водорода гидроксильной группы не оказывается ни одного другого акцептора.

Из меж молекулярных взаимодействий можно отметить парные взаимодействия С9-Н92...011 между молекулами, приводящие к образованию цстросиммет-ричных Н-димеров в кристалле (рис.7).

Наличие объемного заместителя в бициклической части молекулы соединения 2 препятствует возникновению в кристалле тг-тг взаимодействий, характерных для упаковки в кристалле подобных систем. Коэффициент упаковки молекул в кристалле достигает величины 71.5% (рис.8).

<

Рис. 7. Образование Н-димера в кристалле соединения 2, показаны только атомы водорода, участвующие в водородных связях (пунктирные линии).

Рис.8. Упаковка молекул соединения 2 в кристалле, вид вдоль кристаллографического направления (-110), показаны только атомы водорода, участвующие в водородных связях (пунктирные линии).

1.2. Технологическая схема протводства политрипа

Достоверное установление строения субстрата и результаты предварительных испытаний биологической активности субстрата и препарата политрил, свидетельствовали о необходимости проведения широких и разносторонних биологических испытаний, в том числе - изучения отдаленных последствий возможного действия препарата на животных и, в конечном итоге, выпуска лекарственной формы, лечения животных и птиц.

Это явилось основанием для разработки, создания технологической схемы и выпуска (более I тонны) субстрата на предприятии «Авангард» г. Стерлигамак и организации производства препарата политргп в ООО «Поливит» г. Уфа.

Технологические операции получения препарата соответствуют стадиям, применяемым в лабораторном синтезе. Объём автореферата не позволяет привести описание всех этапов производства и соответствующих технологических схем (они подробно освещены в диссертации). Здесь приведены: блок-схема всего производственного процесса и принципиальная технологическая схема установки получения субстрата-1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоно -вой-3 кислоты.

БЛОК-СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА ПОЛИТРИЛА

Установка циклшаикн Установка этидироваиия Установка морфотпиромння

схем! установки инклизаиин

■ • мерник, 2 - загрузочный бункер. 3. 7 - реактор, 4 - иасадочиал колонка. 1} § - нутч-филктр, 9 - вакуумный сборник, 10 - накопительная емкость. 11 - куб. 12

|.б- рияелктелкиыД сосуд, олсниа, Н - сборник этанола

В главе 3 «Экспериментальные результаты биологических испытаний»

представлены сведения о методах исследования и результатах испытаний биологической активности.

2. Фапмакотоксикологические свойства и биологическая активность

похитрила

Фармакотоксикологические свойства субстанции политрила щучены совместно с государственным учреждением «Краснодарский научно-исследовательский ветеринарный институт».

Экспериментальные лабораторные исследования биологической активности проведены на кафедре внутренних незаразных болезней, клинической диагностики и фармакологии Башкирского государственного аграрного университета (на 578 белых беспородных мышах и мышах линии СВА и С57В1 с живой массой 18-20 г; на 184 белых крысах с массой 175-220 г). Лабораторные животные содержались в одинаковых зоогигиенических условиях вивария. Белые мыши содержались по 3040 голов, белые крысы по 10 голов в специальных клетках. Кормление животных проводили согласно суточной потребности лабораторных животных.

Лекарственное действие в условиях производства исследовано: Краснодарский край: ГУ «Краснодарская научно-исследовательская ветеринарная станция»; учхоз «Кубань» Краснодарского государственного университета; ЗАО «Индустриальный»; ООО «Кубаньптицепром»; управление ветеринарии Тбилисского р-на; СПК «Кавказ» Староминского р-на; Свинотоварная ферма МУП «Прогресс»; ОПХ «Колос»; ЗАО птицефабрика «Новомышастовская». Республика Башкортостан: птицефабрики «Благовещенская», «Турбаслинская», «Благоварская»; учхоз Башкирского государственного аграрного университета; свинотоварная ферма АКХ «Рассвет»; АКХ «им. Асаева». Республика Татарстан: свиноводческая ферма Агрофирмы «Бирюлинский». Волгоградская область: ООО «Красный Путиловец». Омская область- Сибирская опытная станции ВНИИМК, г.Исилькуль.

Курская область: ОАО свинокомплекс «Магнитный», Железпогорский р-н. Белгородская область: СПК «Томаровский», Яковлевский р-н.

2.1 Изучение острой токсичности

Изучение острой.токсичности политрша проводили по общепринятой методике (Саноцкий И.В., 1970; Елизарова О.Н. 1971): в дозах 2000-2300 мг/кг у мышей отмечалось незначительное угнетение, мыши забивались в угол, переставали двигаться, как бы «застывали» на месте. Через 2-3 часа после введения политрша животные приходили в нормальное состояние. При введении белым мышам политрша внутрь в дозах 2800-2900 мг/кг признаки отравления проявлялись через 30-40 минут. Коэффициент вариабельности для белых мышей при пероральном применении составил 1.15. для крыс 1.12. Средняя смертельная доза политрила для белых мышей составила 2575,0±91,1 мг/кг, для крыс 3066,6±46,б мг/кг. Согласно ГОСТ 12.1.00.7-76 политрип относится к 4 классу опасности (малотоксичные вещества).

2.2. Противоязвенная активность

В опытах на крысах установлено, что при индукции язв индометацином по-литрил в значительной мере предохраняет слизистую оболочку желудка. При введении политрила в дозе 5 мг/кг противоязвенная активность составила 6,95, превысив таковую у животных, получавших фуразолидон (применяемый препарат), на 74,9% В контрольной группе животных отмечались язвенные поражения в различных отделах желудка. При моделировании «ацетилсалициловых» язв у крыс установлено, что политрил в дозе 5 мг/кг обладает выраженной аш'иульцерогенной активностью: при его применении индекс изъязвления уменьшился с 16,17±0,32 (контроль) до 2,9±0,3. Таким образом, политрил в лозе 5 мг/кг защищает слизистую оболочку желудка, не тормозя секреции кислоты.

2.3. Противовоспалительная активность

.Механизм противовоспалительного действия многих .препаратов включает торможение циклооксигеназы, биосинтез простагландинов и тромбоксанов. Следствием является повреждение желудочно-кишечного тракта, задержка натрия и воды, повышение давления и бронхоспазм. Исследования на моделях воспалений у крыс показали, что политрип в дозе 5 мг/кг достоверно утнетает раз в иг ие отека при лидокаиновом воспалении на 27% при белковом - на 29.4% при каррагениновом -на 38.7% ( по сравнению с вольтареном - контроль).

2.4. Определение антителообразующпх клеток (АОК)

Изучение возможности модуляции антителогенеза политршом проводилось на белых мышах, которых иммунизировали внутрибрюшинным введением оптимальной дозы 2х 10® эритроцитов барана. Из данных (табл. 7) видно, что введение политрила в дозе 5 мг/кг в селезёнку иммунизированных мышей приводило к достоверному увеличению количества ангигелообразующих клеток. Это в 10,4 раза больше по сравнению с контрольным значением и в 5,3 раза активнее гидроксиметилурацши и байтрша, рекомендованных в качестве ростостимулирующих добавок для телят и цыплят.

№ п/п Соединение Доза, мг/кг Количество животных Число АОК 1С/' плелощггов Р по сравнению с контролем

1 П олигрил 2 8 6000,0± 192.0 <0,001

2 П0Л1ГГрИЛ 3 8 Ь200,0±223,0 0,001

3 Полигрил 4 8 7249,3±337,0 0,001

4 Политрил 5 8 7360,3±315,0 0,001

5 Полетршг 6 8 7250,4±296,0 0,001

6 Гидроксиме-тилурацил 25 8 1390,5±99,0 0,001

7 БаГггрнл 8 8 1285,0±10),0 0,001

8 Контроль - 8 710,5±66,0 -

2.5. Гиперчувствнтелыюетьзамедлеииого типа

Исследована эффективность политрша при гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), моделированной методом «лапки». Изучали его влияние на формирование ГЗТ к эритроцитам барана на мышах линии с^ш, и СВА в сравнении с действием гидроксиметилурацила, используемого в настоящее время. По-литрил вводили внутрь в течение 7 дней до сенсибилизации. Отмечалась тенденция к угнетению реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей линии СВА аналогично гидроксиметилурацилу, как при профилактическом, так и при лечебном введении (табл. 8). Политрж (в дозе 5 мг/кг) обладает иммуностимули-

рующим действием первичного звена иммунитета.

Влияние политрнла на реакцию гнперчувствительностизамедле иного типа _кэрнгроиитам барана у мышей линии СВА_Таблица 8.

№ п/п Наименование соединения Доза мг/кг Количество животных Средний процент увеличения лапки Р

I серия - профилактическое действие

1 Политрил ' 5 8 12,3±1,2 <0,05

2 Политрил 6 8 12,3±1,2 0,05

3 Гидро ксим етилура пил 25 8 13,9±|,3 0,05

4 Байгрил 8 8 17,9±2,1 0,05

5 Контроль - 8 18,6±1,9 -

II серия - лечебное действие

1 Полигрил 5 8 13,1 ±1,2 0,05

2 Политрил 6 8 13,1±1,2 0,05

3 Гидроксиметилурацил 25 8 15,2±1,5 0,05

4 Байгрил 8 8 17,9±2,1 0,05

5 Контроль - 8 19,0±1,6 -

2.6. Влияние политропа на кожу и слизистые оболочки глаз мышей и крыс

при однократном и повторном воздействии выражено слабо.

2.7. Влияние на эффекгориую способность Т-лимфоцитов в реакции транс-плангационного иммунитета политрша осуществляли воспроизведением феномена «трансплантант против хозяина» на белых беспородных крысах. Эксперименты свидетельствуют, чго политрш положительно влияет на эффекторную способ-

ность Т-лимфоцигов в реакции трансплантационного иммунитета. На это указывает значительно больший средний индекс ретракции (5,40±0,54, доза 5 иг/кг) по сравнению с гидроксиметилурацилом (4,87±0.40, доза 50 мг/кг)

2.8. Степень мутагенной аютшности

При испытании политрила с помощью теста 5а1шопе11а/микросомы на разных штаммах ТА98. ТА1950. ТА100 во всех случаях были получены отрицательные результаты, демонстрирующие отсутствие мутагенных свойств. При сравнении числа ревертангов контрольных и опытных данных в каждом варианте не выявлено статистически достоверных различий между ними

2.9. Эмбрнотоксическос действие

В опытах по исследованию эмбриотоксических свойств политрша на крысах установлено отсутствие эмбриотрогшого действия. Результаты (табл. 9) свидетельствуют, что политрип не влияет на число желтых тел в яичнике, мест имшинтации и резорбции в матке. Основные показатели, характеризующие эмбриотропное действие препарата-предимплангационная смертность зигот, постимплантационная гибель эмбрионов и общая эмбриональная смертность у опытных животных, получавших препарат в исследуемых дозах были в близких пределах с контрольными (Р<0,05). При микроскопическом наружном осмотре плодов и их плацент в опытных и контрольных группах изменений не обнаружено. При анатомическом исследовании внутренних органов и костной системы плодов дефектов развития не выявлено, что указывает на отсутств1е эмбрио-токсического действия политрипа.

Влияние политрила на эмбриогенез крыс Таблица 9.

№№ Наименование показателей «Политрил», мг/кг Кот-роль

5 25 50

1 Число желтых тел беременности 13,7 + 0,40 13,8 ±0,75 14,5+0,23 14,4 ±0,42

2 Число мест им плантации 13,2 ±0,35 • 13,2 ±0,54 14,2 ±0,20 13.0 ±0.20

3 Число мест резорбций 0,4+0,16 0,2 ±0,14 0,3+0,19 0,2 ±0,18

4 Число живых плодов 12,7 + 0,44 13,0 + 0,62 12,8 ±0,12 12,5+0,28

5 Масса плода, м г 2185+18,72 2344±19,60 2180+25,28 2175+26,43

6 Длина плода, мм 28,7 ± 0,65 22,5 +0,38 31,5 ±0,40 32,4 ±0,34

7 Масса планцеты.мг 465 ± 12,24 480 ± 7,36 482+ 17,29 479 ± 16,42

8 Размер плаценты, мм 12,6 ±0,35 13,0 ±0,35 13,2 ±0,35 11,9 ±0,27

9 Плодо-планцентный ко-эфф. 0,20 0.21 0,23 0,22

10 Смертность предим плантационная, % 4,9 ± 1,85 5,0 ±0,81 3,2 ± 1,36 2,9 ± 1,29

11 Смертность постим плантационная, % 3,0 ± 1,45 0,7 ±0,82 2,8 ± 1,27 2,9 ± 1,28

12 Смертность общая эмбри-онная, % 7.9 ±2,39 5,7 ±1,95 6,1 ±2,18 5,7 ± 1,90

13 Количество самок/самцов в помете 55,3/44,7 43,0/57,0 51,1/48,9 57,2/42,8

2.10. Канцерогенная активность

Канцерогенная активность политрила исследована на аквариумных рыбках гуппи. В течение 8 недель эксперимента в контрольной группе умерло 6 голов рыб, во второй опытной - 3 головы, в третьей - опытной - 7 голов. Сохранность поголовья за первые 8 недель эксперимента по группам составила 63,0%, 92,5% и 82,5% соответственно.

Данные (табл. 10) свидетельствуют об отсутствии канцерогенной активности политрила.

Результаты испытания канцерогенной активности политрила _на рыбках гуппи_Таблица 10._

Периоды опыта, недели Группы Исследовано Патологические изменения в печени

голов Жировая днетроф ия Точечный некроз Опухоли

1 конт 10 1 - -

4 2 опыт 3 опыт 10 10 3 1 1 _

1 конг. 16 2 1 -

8 2 опыт 13 1 - -

3 опыт 17 2 - -

1 КОШ'. 14 4 1 1

20 2 опыт 17 1 1 -

3 опыт 13 3 2 -

1 кот. 40 7 2 1

Итого: 2 опыт 40 5 2 -

3 опыт 40 6 2 -

2.11. Антибактериальные свойства

Антибактериальная активность препарата была проверена для музейных штаммов, а также полевых штаммов бактерий, изолированных от больных животных. Значения минимальных подавляющих концентраций политрила-яяя полевых штаммов бактерий приведены в табл. 1!. Как видно, политрш обладает значительной активностью по отношению к различным видам бактерий, в т.ч. к синегнойной палочке. Наиболее чувствительным микроорганизмом к тестируемому веществу оказался стафилококк, рост которого ингибировался при концентрации 0,19 мкг/мл.

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) политрила для полевых штаммов бактерий_Таблица 11.

Штамм МПК препарата, мкг/мл

E.coli 510 <0,19

S aureus 509 0,39

P. aeruginosa 157 3,13

S.dublin 504 0,78

Политрш проверен на наличие у него химиотерапевтнческого действия на модели экспериментальной эшерихиозной септицемии. Результаты эксперимента отражены в табл. 12. Политрил обладает превентивными свойствами при заражении животных патогенной культурой кишечной палочки. В опытной группе гибели животных не зарегистрировано, в отличие от контрольной, где пало 8 мышей.

Превентивная активность политрнла при колнсепснсе (E.coli 510)

у белых мышей_____Таблица 12.

Группа Доза препарата Количество животных Пало Выжило

Опытная 5 м г/гол 12 - 12

Контрольная 0,4 м л дистиллированной воды 12 8 4

2.12. Влияние на структуру печени кур

С цглью выявления токсического действия политрипа на структурные элементы печени кур и с лечебной целью опыты проводили на курах с признаками общей дистрофии. Установлено: в печени 1 группы (контрольная - стандартный рацион) и 2 группы (опытная — назначение политрша в дозе 5 мг/кг в течение 14 сугок) кур были обнаружены пат о,морфологические шменения в виде дистрофии цитоплазмы, гепатоцитов и очагов воспалительных процессов в паренхиме, наиболее выраженных у гггиц 1 группы. В 3-ей группе животных (опытная - назначение попитоида в дозе 5 мг/кг в течение 21 суток) морфологическая картина печени соответствовала норме.

2.13. Использование политрнла при лечении колнбактерноза и сальмонеллеза молодняка крупного рогатого с кота в учебно-опытном хозяйстве Башкирского государственного аграрного университета показало, что препарат политрш в дозе 0.5 мл на 10 кг живой массы, применяемый внутрь пероралыю, эффективен для лечения колибактериоза в течение 3 дней и сальмонеллеза в течение 5 дней.

2.14. Испытание политрнла на свиноматках п хряках прою водителях (ЗАО «Индустриальный» Тимашевского района Краснодарского края): экспери-мешы, полученные при использовании политрша для лечения от ft. Aeruginosa (100% заражённость) и £ coli (14% заражённость), показали, что его эффективность у свиноматок 92,2% (контроль 71,3%), у хряков 90,6% (контроль 72.4%). 2.15. Гематологические показатели крови кур и цыплят Для изучения влияния политрша на систему кроветворения измеряли кли-нико-лабораторные показатели периферической венозной крови кур в возрасте 150 дней. Политрш (доза 5 мг/кг и 6 мг/кг) на седьмые сутки достоверно изменял картину периферической крови.

Сравнение эффекта политрша (5 мг/кг) и фуразолидона (5 мг/кг) показало, что последний отрицательно влиял на изменение каргины периферической крови. Так, в группе, получающей фуразолидон, происходило снижение содержания эритроцитов и гемоглобина с достоверным одновременным повышением содержания лейкоцитов и цветного показателя.

Влияние политрнла на показатели крови ку р в возрасте 150 суток Таблица 13

Группа Доза пре- Лейкоциты, Эр|ГГрОШЛЫ 10'"'/л Гемоглобин, Цветной

парата 10 9/л г/л показатель

Исходные - 3,60-Ш,29 3,3±0,12 110,0±0,62 2,0±0,18

Полигрил 5 мг/кг 3,72±0,30 3,29±0,17 118,19±0,58 2,1 ¿0,20

Полигрил 6 мг/кг 3,84*0,31 3,31±0,15 118,22±0,55 2,0*0,15

Байтрил 5 мг/кг 3,88±0,27 3,1 (>±0,21 114,17±0,47 2,17±0,20

Фуразолидон 5 мг/кг 3,58±0,32 3,12±0,03 109,2±0,35 2,1*0,14

Контроль - 3,54±0,16 3,2*0,04 109,4±0,20 2,0±0,17

выводы

I Осуществлён лабораторный сшггез представителя фторохинолонов - 1,4-дигидро-7-(морс|)олинил-4)-4-оксо-6ч|)торо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты, позволивший отработать условия создания отечественной технологии его получения; современными физическими методами доказано строение соединения.

2. Впервые разработана технологическая схема производства и в промышленных условиях (предприятие «Авангард» г. Стерлитамак) выпущено 1,5 тонны субстанции (полифлоксацин), ш которой произведён препарат политрил для проведения широкомасштабных испытаний биологической активности, лечения животных и птиц, удовлетворения потребностей ветеринарной медицины. Широкие производственные испытания Нояитрича обеспечили сохранность молодняка телят, свиной, птиц и показали, что препарат не уступает по эффективности и безопасности, превосходит по экономическим показателям применяемые импортные препараты Бсштрип и Абактан.

3. Изучение фармакотоксикологичсских свойств субстанции и препарата по-литрш показало, что это малотоксичное вещество (4 класс опасности), у которого отсутствуют - канцерогенное, мутагенное, эмбриогоксическое и тератогенное действие. При испытаниях в производственных условиях субстанция и препарат похитрил проявили ярко выраженную а1ггибактериальную активность по отношению к грамположигельным и грамотрицательным микроорганизмам (в том числе, к си-негнойной палочке).

4. Препарат обладает выраженным противоязвенным действием, не отмечены побочные эффекты при длительном его применении. При воздействии на кожу и слизистые оболочки глаз подопытных животных местное раздражающее действие политрила выражено слабо.

5. Политрил положительно влияет на эффекторную способность Т-лимфоцигов в реакции трансплантационного иммунитета; в дозе 5 мг/кг не изменяет морфологическую картину печени кур, оставляет её в соответствии с нормой и обладает иммуностимулирующими свойствами.

6. На основании широких лабораторных и производственных испытаний биологической активности получена в установленном порядке разрешительная документация !И производство и применение субстанции (полифлоксацин) и препарата похитрил на территории Российской Федерации. Субстанция выпускается на заводе «Авангард» (г. Стерлитамак). препарат-ООО «Поливит» (г. Уфа).

7. Препарат политрил с содержанием 10 % действующего вещества принят к применению в ветеринарной практике при лечении и профилактике инфекционных болезней крупного рогатого скота, свиней и гтгиц, как высокоэффективное и безопасное химиотерапевтическое средство, не уступающее импортным аналогам.

В Приложении имеются акты испытаний биологической активности субстанции полифлоксацин. препарата политрил и разрешительшя документация на применение в ветеринарии

Основныерезультатыработыизложены в следующих публикациях:

1. Фассахова, Л.Ф. Синтез, строение и биологическая активность 1,4-дигндро-7-(морф0ЛШШл-4)-4-оксо-6-фт0ро-1-эт11Л-хннолннкарбо1Ю8ой-3 кислоты (Полнтрила) /Л.Ф. Фассахова, Б.П. Струнин, H.A. Фролова, Г1.А. Гуревнч // Вестннк Казанского технол. ун-та. - 2006. - JVs 2. - С. 208-210.

2. Струнин, Б.П. Политрнл - новое антимикробное средство/ Б.П. Струнин, Л.Ф. Фассахова, Ю.Е. Сапожников, С.Ю. Гармонов, П.А. Гуревнч. //Вестник Казанского технол. ун-та. - 2006. -Ла 5-С. 27-31.

3. Струнин, Б.П. Изучение биологической активности политрнла / Б.П. Стру-■Iни, Л.Ф. Саттарова, Л.К. Шарипова, II.A. Фролова, C.FO. Гармонов, А.Ф. Нсмагилова, П.А. Гуревнч. // Вестник Казанского технол. ун-та. - 2007. - № 2.-С. 34-45.

4. Струнин, Б.П. Строение нового антимикробного средства политрнл / Б.П. Струнин, Л.Ф. Саттарова, РЛ. Мусин, А.Т. Губайдуллин, П.А. Гуревнч. // Вестник Казанского технол. ун-та. - 2008. -№ .4- С. 18-21.

5. Струнин, Б.П. Технология производства нового антибактериального средства политрнл. / Б.П. Струнин, Л.Ф. Саттарова, П.А. Гуревнч. // Вестннк Казанского технол. ун-та. - 2008. - Mi 4. - С. 22-34.

6. Струнин, Б.П. Синтез, строение и биологическая активность 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6ч1>торо-1 -этил-хинолинкарбоновой-З кислоты (Политри-ла)/ Б.П. Струнин, H.A. Фролова, П.А. Гуревич, Л.Ф. Фассахова // Актуальные проблемы современной науки Естественные науки. 4.9. Органическая химия. Труды 2-го Международного форума молодых ученых (7-й Международной конференции): Тез. докл. - Самара. - 2006. - С.51 -54.

7. Фассахова, Л.Ф. Технология производства кормовой добавки «Полизон» / Л.Ф. Фассахова, H.A. Фролова // VIII Всероссийская конф. молодых учёных с международным участием «Пищевые технологии»: Тез. докл. - Казань. - 2007 - С. 8990.

8. Фассахова, Л.Ф. Синтез и биологическая активность 1,4-дигидро-7-(морфолннил-4)-4-оксо-6ч|)Торо-1-этил-хинолинкарбоновой-З кислоты (Политрила) /Л.Ф. Фассахова, Б.П. Струнин, H.A. Фролова, П А. Гуревич // Научная сессия Каз. гос. техн. ун-та. Аннотации сообщений: Казань, КГГУ. - 2007. - С. 37.

9. Гуревич, Г1.А. Синтез 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты - нового антимикробного средства / П.А. Гуревич, Б.П. Струнин, Л.Ф. Сатарова. Р.З. Мусин, А.Т. Губайдуллин // Научная сессия Каз. гос. техн. ун-та. Аннотации сообщений: Казань, КГТУ. - 2008. - С. 39.

10. Гуревич П.А. Новые конденсированные гетероциклические системы с фрагментом ЗН-бешопиррол-З-она / Г1.А. Гуревич, A.C. Петровский, Л.Ф. Сатарова // Научная сессия Каз. гос. техн ун-та. Аннотации сообщений: Казань, КГТУ. - 2008. -С. 40.

11. Саттарова, Л.Ф. Биологическая активность 1,4-дигидро-7-(морфолшшл^})-4-оксо-6ч|)торо-1-этил-хинолинкарбоновой -3 кислоты (препарата политрил) I Л.Ф. Сатарова. П.А. Гуревич, Б.П. Струнин // VIII Республиканская школа студентов и аспиратгов «Жить в XXI веке». Казань, КГГУ. - 2008. - С. 146-148.

Соискатели^.

Саттарова Л.Ф.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 10.10.2008г. Усл. /ил 1,4 ЗаказМ К-6576. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Актуальность проблемы.

В настоящее время в медицине широко используются высоко активные антибактериальные препараты - ингибиторы ДНК-гиразы бактерий, относящиеся к классу 6-фторопроизводных 4-оксохинолинкарбоновых-З кислот.

Фторохинолоны широко применяют в клиниках России, в первую очередь при инфекциях мочевыводящих путей, при заболеваниях, передаваемых половым путем, инфекциях нижних дыхательных путей, кожи, мягких тканей, раневой инфекции, в том числе у онкологических больных, при различных бактериальных кишечных инфекциях.

Промышленное производство субстанций для изготовления лекарственных препаратов класса фторохинолонов, в том числе для использования в ветеринарии, в Российской Федерации отсутствует. Имеющиеся в настоящее время на рынке РФ фторохинолоны приобретаются исключительно за рубежом. Широкие производственные испытания Политрила в Краснодарском крае, Башкортостане, Татарстане, Белгородской, Волгоградской, Курской, Омской областях показали, что препарат не уступает по эффективности и безопасности, превосходит по экономическим показателям применяемые в настоящее время импортные препараты Байтрил и Абактан.

Поэтому актуальным является создание отечественной технологии для удовлетворения потребностей ветеринарной медицины.

Актуально и внедрение в ветеринарную практику новых соединений, поскольку при длительном применении какого-либо препарата у микроорганизмов появляется резистентность и вырабатываются штаммы, устойчивые к воздействию лечебного средства.

Научный консультант диссертационной работы д.т.н., и.о. профессора кафедры оборудования пищевых производств КГТУ Струнин Борис Павлович

Настоящая работа является продолжением исследований, проводимых ООО «Поливит» (г. Уфа) и кафедрой органической химии Казанского государственного технологического университета по синтезу соединений, обладающих потенциальной биологической активностью, поиску их практического применения в качестве антимикробных и лекарственных средств.

Целыо диссертационной работы являлись:

- разработка методологии синтеза представителя фторохинолонов, пригодного для организации промышленного производства (с учётом доступности сырья, растворителей, утилизации отходов);

- создание технологии и промышленный выпуск субстанции — 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1 -этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты; многоплановое исследование её биологической активности, изучение возможных отдалённых последствий влияния лекарственного препарата (по-литрил) при лечении сельскохозяйственных животных и птиц.

Для достижения поставленной цели было необходимо:

- синтезировать из доступного сырья 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновую-3 кислоту (с учётом доступности реагентов и растворителей); установить её строение с использованием современных физико-химических методов

ИК-, ЯМР 'Н, 13С, I9F — спектроскопия; масс-спектрометрия, РСА);

- разработать технологию промышленного производства 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты -субстанции для производства лекарственного средства политрил;

- изучить биологическую активность синтезированного соединения и установить возможные отдалённые последствия (в частности, эмбриотокси-ческое, мутагенное и тератогенное действие) влияния политрила на животных и птиц при использовании в качестве лекарственного средства.

Методы исследования. Для синтеза целевого соединения использовали общие методы синтетической органической химии. Состав и строение соединений устанавливали с помощью элементного анализа; ИК-, ЯМРспектроскопии !Н, 13С, 19F; масс-спектрометрии; рентгеноструктурного анализа. Микроскопические исследования проводили на световом микроскопе JENAVAL фирмы «CARL ZEISS». Для количественного определения целевого продукта при промышленном производстве применяли высокоэффективную жидкостную хроматографию (для этой аналитической операции разработаны ТУ 9336-004-39988364-2006).

Научная новизна. Разработана методология лабораторного синтеза одного из представителей класса фторохинолонов - 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1 -этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты;

- впервые в стране создана технология получения в заводских условиях субстанции этой кислоты (полифлоксацин) и на её основе в промышленных масштабах изготовлен антибактериальный препарат политрил; впервые для политрила систематически изучены различные виды биологической активности и возможные отдалённые последствия влияния на сельскохозяйственных животных и птиц.

Практическая значимость диссертационной работы определяется:

1) выбором рационального способа синтеза 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты {полифлоксацин), пригодного для организации промышленного производства; разработкой технологической схемы получения; реализацией впервые в России выпуска субстанции в заводских условиях, её наработке в количестве более 1 тонны (завод «Авангард» г. Стерлитамак) и производстве препарата политрил (ООО «Поливит», г. Уфа);

2) получением в установленном порядке разрешительной документации на производство и применение субстанции и препарата политрил.

Имеются:

Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных — 10% раствор для орального применения политрш — ПВР-2-4.5/01548 от 6.02.2006 г.;

- Инструкция по применению политрила для лечения заболеваний сельскохозяйственных животных, в том числе птиц бактериальной этиологии, утвержденная Заместителем Руководителя Россельхознадзора 6.02.2006 г.;

- Технические условия ТУ 9336-004-39988364-2006;

- Сертификат соответствия № РОСС RU. П096. В10344 от 06.03.2006 г., выданный Всероссийским НИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ);

- Свидетельство на товарный знак политрил № 170210 от 4.12.1998 г.

3) На основе материалов диссертации подготовлено, издано и используется в обучении студентов (специальности: 24090165 «Биотехнология», 26020465 «Технология бродильных производств и виноделие», 24050265 «Технология переработки пластических масс и эластомеров», 24080365 «Рациональное использование материальных и энергетических ресурсов») учебно-методическое пособие «Введение в химию биологически активных веществ» (авторы П.А. Гуревич, Л.Ф. Саттарова, Б.П. Струнин).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- разработка лабораторной методики получения 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты и результаты по изучению её строения современными физическими методами (ЯМР 'Н, 13С, 19F, ИК-спектроскопия; РСА, масс-спектрометрия);

- создание технологической схемы получения 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1-этил-хинолинкарбоновой -3 кислоты, осуществление выпуска субстанции в заводских условиях и препарата политрил в промышленном масштабе;

- результаты исследования биологической активности и фармакотоксико-логических свойств субстанции и препарата политрил для установления отдалённых последствий влияния препарата на животных и птиц; и, как следствие, -обоснование возможности применения политрила в качестве антибактериального средства в ветеринарии.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на:

2-ом Международном форуме молодых ученых (7-й Международной конференции) «Актуальные проблемы современной науки. Естественные науки. Органическая химия» (Самара-2006), научных сессиях КГТУ (Казань, 2006, 2007, 2008), 7 и 8 Республиканских школах студентов и аспирантов «Жить в XXI веке» (Казань, 2007, 2008).

Публикации. Материалы работы опубликованы в 5 статьях (в Вестнике Казанского технологического университета — журнале, рекомендованном ВАК) и 6 тезисах докладов на конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа построена в классическом стиле и состоит из введения, литературного обзора (по химии фторохинолонов, методам получения и сведениях о биологической активности соединений этого класса), обсуждения результатов, экспериментальной части (химической, биологической, технологической), выводов, списка цитируемой литературы из 145 наименований, приложения. Диссертация изложена на -162 страницах, включая 19 таблиц и 15 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлён лабораторный синтез представителя фторохинолонов - 1,4-дигидро-7-(морфолинил-4)-4-оксо-6-фторо-1 -этил-хинолинкарбоновой-3 кислоты, позволивший отработать условия создания отечественной технологии его получения; современными физическими методами доказано строение соединения.

2. Впервые разработана технологическая схема производства и в промышленных условиях (предприятие «Авангард» г. Стерлитамак) выпущено 1,5 тонны субстанции (полифлоксацин), из которой произведён препарат политрил для проведения широкомасштабных испытаний биологической активности, лечения животных и птиц, удовлетворения потребностей ветеринарной медицины. Широкие производственные испытания Политрила обеспечили сохранность молодняка телят, свиней, птиц и показали, что препарат не уступает по эффективности и безопасности, превосходит по экономическим показателям применяемые импортные препараты Байтрил и Абактан.

3. Изучение фармакотоксикологических свойств субстанции и препарата политрил показало, что это малотоксичное вещество (4 класс опасности), у которого отсутствуют - канцерогенное, мутагенное, эмбриотоксиче-ское и тератогенное действие. При испытаниях в производственных условиях субстанция и препарат политрил проявили ярко выраженную антибактериальную активность по отношению к грамположительным и грамотрицатель-ным микроорганизмам (в том числе, к синегнойной палочке).

4. Препарат обладает выраженным противоязвенным действием, не отмечены побочные эффекты при длительном его применении. При воздействии на кожу и слизистые оболочки глаз подопытных животных местное раздражающее действие политрила выражено слабо.

5. Политрил положительно влияет на эффекторную способность Т-лимфоцитов в реакции трансплантационного иммунитета; в дозе 5 мг/кг не изменяет морфологическую картину печени кур, оставляет её в соответствии с нормой и обладает иммуностимулирующими свойствами.

6. На основании широких лабораторных и производственных испытаний биологической активности получена в установленном порядке разрешительная документация на производство и применение субстанции {полифлокса-цин) и препарата политрил на территории Российской Федерации. Субстанция выпускается на заводе «Авангард» (г. Стерлитамак), препарат — ООО «Поливит» (г. Уфа).

7. Препарат политрил с содержанием 10 % действующего вещества принят к применению в ветеринарной практике при лечении и профилактике инфекционных болезней крупного рогатого скота, свиней и птиц, как высокоэффективное и безопасное химиотерапевтическое средство, не уступающее импортным аналогам.

В заключение обзора [18] авторы делают выводы о связи структуры фто-рохинолонов с биологической активностью. В частности, отмечается, что накопленный экспериментальный материал позволяет сделать выводы о целесообразности модификации различных положений фторохинолоновой системы. Подобные сведения приводятся и в обзоре 2006 года [76].

Фрагмент С3—С4, содержащий кето- и карбоксигруппы, является необходимым для связывания хинолонов с ДНК-гиразой, и удаление этих заместителей или замена их на другие остатки приводит к значительному снижению активности или полной инактивации полученных соединений. Исключение составляют заместители, способные трансформироваться in vivo в кар-боксигруппу. В частности, замена группы СООН в норфлоксацине, пефлок-сацине, ципрофлоксацине на формильную резко снижает активность in vitro, однако in vivo эти вещества обладают высокой активностью.

Первые представители коммерческих фторхинолонов содержали у N1 этильную группу (норфлоксацин, пефлоксацин, эноксацин), фторэтильную (флероксацин) или метиламиногруппу (амифлоксацин). Введение циклопро-пильного заместителя способствовало повышению их активности в отношении Enterobacteriaceal, Е. Coli, Ps aeruginosa и позволило создать новые высокоактивные препараты — ципрофлоксацин и энрофлоксацин. Фенильная группа с одним или двумя атомами фтора также оказывает благоприятное воздействие, увеличивая активность фторхинолонов в отношении анаэробных бактерий (то-зуфлоксацин, дифлоксацин, темафлоксацин). трет-Ъутш1ъшш заместитель повышает активность в отношении грамположительных микроорганизмов. Введение заместителей в циклопропильный остаток или замена его на четырёх- и пятичленные циклы снижает активность по сравнению с ципрофлоксацином.

Таким образом, заместитель при N1 оказывает существенное влияние на уровень антибактериальной активности и спектр действия фторхинолонов .

Практически все хинолоны, нашедшие применение в клинике, содержат атом F в положении 6 хинолоновой или нафтиридоновой структуры. Замена фтора у С6 в норфлоксацине приводит к уменьшению активности в следующем ряду заместителей: F>C1>CN>N02>SCH3>C0CH3.

Для 7-замещенных 6-фторохинолонов широко изучена взаимосвязь «структура — активность». Введение карбокси-, карбоксиамидо-, окси-, эток-си-, циклопропиламино-, аллиламино-, гидразино-, аминогрупп вызывает резкое снижение активности в отношении Ps aeruginosa и St. Aureus. Инактивируют молекулу хинолона также остатки гетероциклов (оксазол-2-ил, изоксазол-2-ил, имидазол-2-ил, фурил-2), связанные непоп средственно с С или через атом S (тиазолил-2-тио-, имидазолил-2-тио-, пиридил-2-тио, пиридил-4-тио-, пиримидил-2-тио-).

Высокой антибактериальной активностью обладают фторохинолоны,. содержащие у атома С7 пиперазин [112] и его ал кил производные: нор-флоксацин, амифлоксацин, эноксацин (пиперазинил-1), флероксацин, диф-локсацин, пефлоксацин, офлоксацин (4-метилпиперазинил-1), ломефлокса-цин, темафлоксацин (З-метилпиперазинил-1), спарфлоксацин (3,5-диметилпиперазинил-1). Модификация пиперазинильного остатка при N4 не приводит к сколько-нибудь значительному повышению антибактериальной активности. Введение пирролидина в положение 7 [112] дает соединения, обладающие высокой активностью в отношении не только грамотри-цательных, но и грамположительных штаммов бактерий.

Значительное влияние на антибактериальную активность, особенно в отношении грамположительных микроорганизмов, оказывает заместитель у С5. Так, 5-аминопроизводные в 2 - 16 раз более активны, чем их 5-незамещенные аналоги. Алкилирование или ацилирование аминогруппы, либо замена её на другие остатки снижают активность. Высокоактивны также соединения, содержащие у С5 метильную группу.

42 Q

Варьирование заместителей у С изучалось менее подробно, однако можно отметить, что замена атома F на группы ОСНз, СН3 и CN не оказывает на активность фторхинолонов существенного влияния.

В публикации [38] приводится описание синтеза полифториро-ванных производных 2-фторалкил-6,7-дифторхинолон

3-карбоновых кислот - ключевых интермедиатов в схемах получения антибактериальных веществ фторхинолонового ряда: о

CN Et3OBF4

N ^CF2CF2II Fx ^N CF2CF2H

H H n^X;F2cf2H

Поиск противораковых соединений среди полиядерных производных фторхинолонов побудил авторов [54] синтезировать ряд соединений названного типа и изучить противоопухулевую активность in vitro в Национальном Институте Рака (США). Наибольшей активностью обладало ниже приведённое соединение:

Исследования показали, что карбоксильная группа активнее воздействует на подавление раковых клеток, чем сложные эфиры кислот и замена атомов водорода на фтор так же р содействует увеличению противоопухолевой активности.

Интересные сведения по модификации положения 7 фторохинолонов за счёт реакций диполярного циклоприсоединения с участием в качестве диполя азометиноксида приведены в статье [55]:

H2C)n\7 >-° Et

СООН

СООН

СН2)т

Взаимодействием гидразидов 3-хинолинкарбоновых кислот с эфирами 2-(полифторбензоил)-3-этоксиакриловой кислоты синтезированы этиловые эфиры 1 -(7-2-6-фтор-4-оксо-1 -этил-1,4-дигидрохинолин-З -карбониламино)-5-Х-4-оксо-6,7,8-трифтор-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновых кислот (X = Н, F; Z = пирролидино-, пиперидино-, гексаметиленимино-, морфолино-, тио-морфолино-) [63]:

В работе [69] описан синтез 23 новых производных фторохинолонов, проявляющих туберкулостатическую активность:

Et f

COOEt

R = OH, OEt, NHNH2, NHN=CH-PhNMe2 R1 = Et, NH-C(0)-CH2-CN, -NH-C(0)-^~^n Nr2,r4 = h, f

R3 = —N^^NH,—N^ О ^

Авторами обнаружено, что фторохинолоны 1 обладают более высокой туберкулостатической активностью, чем пефлоксацин. Наибольшую активность (МИК 0,2 мкг/мл) проявили соединения, имеющие в положении 1 остаток аминохиноксалина, цианометилкарбомоильный заместитель и содержащие в положении 7 фрагмент 1-пиперидино-2,3,4-триазаби-цикло[3.3.0]октена. В ряду тиадиазинохинолонов 2 наиболее активными в отношении микобактерий туберкулёза оказались соединения с R1 = пирроли

2 3 дин, R = F или морфолин-4-ил; отмечено, что при замене R = Н на F активность заметно снижается, а замена атома фтора в этом положении на морфо-лин вновь приводит к повышению туберкулостатической активности.

В качестве альтернативного способа синтеза фторохинолонов авторы работы [113] предложили использовать в качестве исходного реагента арил-алкилформамид, который при термоциклизации (катализ хлористым сульфу-рилом) образовывал два конкурирующих продукта (это было отмечено и нами при попытке проведения термоциклизации в серной или в хлорсульфоно-вой кислоте):

В 1980 году японские авторы [114] описали получение 6-фторохинолинкарбоновой-З кислоты с морфолиновым фрагментом в положении 7. В таблице 2 приведены сравнительные характеристики субстрата политрила, полученного нами и описанного в работе [114].