Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Противопаразитарный препарат "НИАЦИД"

оо СП СП

сжнкт-петербургская государственная

Академия ветеринарной медицины

-

На правах рукописи

мирзаев микаиль нурбагандович

противопаразитарный препарат "ниацид" (Биотехнологические основы биосинтеза, получение и применение в ветеринарии)

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

16.00.04 - ветеринарная фармакология и токсикология

автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

санкт-петербург-1998 г.

Работа выполнена в Институте биотехнологии Акционерного общества "Биотехнология"

НАУЧНЫЕ КОНСУЛЬТАНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Андреева Н.Л. доктор технических наук, профессор Седых Н.В.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук Андросов Н.С.

доктор ветеринарных наук Щустрова Н.В. доктор биологических наук Позмогова И.Н.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Московский Государственный университет им.М.В.Ломоносова

Защита состоится "¿1&" ..¿ЗУ.... 1998 г. в.{(..часов на заседании специализированного совета ДР 120.20.09. при Санкт-Петербургской Государственной академии Еете-ринарной медицины ( 196084, Санкт-Петербург, ул.Черниговская, 5 ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской госакадемии ветеринарной медицины.

Автореферат разослан

1998 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандздат биологических наук,доцент Узюмова О.В.

общая характеристика работы

Постановка проблемы, ее актуальность. Большой интерес, проявляемый к биопрепаратам, обладающим антипаразитарным действием, связан с возможностью замены ими химических пестицидов, загрязняющих окружающую среду и к которым наблюдается выработка резистентности паразитов.

Среди продуктов микробиологического синтеза, открытых в последнее время, особое место занимают макроцикличе-ские соединения-авермектины. Эти соединения синтезируются микроорганизмом Биериэтусез ауегтМНз, отличаются широким спектром паразитоцидной активности и исследуются в качестве основы соответствующих препаратов для растениеводства и ветеринарии.

Однако, несмотря на очевидную перспективность и огромные потребности в экологически чистых антипаразитарных биопрепаратах, в нашей стране до настоящего времени не налажено крупномасштабное производство их. В этой связи актуальной задачей биотехнологии является поиск высокопродуктивных продуцентов авермектинов и создание управляемого биосинтеза целевых продуктов-

Традиционно используемые в биотехнологии приемы управления метаболизмом продуцентов на основе контроля рН, е1), газообмена, концентрации компонентов среды и биомассы и т.д., в последнее время дополнены рядом новых оригинальных подходов. Разработаны аппаратура и методы регистрации подвижности, электрооптических и электрофоретических свойств клеток, позволяющие контролировать не только популяцию, но и влияние на нее факторов среды. При этом, несмотря на значительные успехи в изучении отдельных вопросов управляемого культивирования микроорганизмов, конкретные промышленные процессы до сих пор оптимизируются эмпирическим путем проб и ошибок (Работнова, 1986). Сложившаяся ситуация в определенной мере связана со слабой разработанностью теории адаптации микроорганизмов (Печуркин, Брильков, 1986) и недостатком

знаний в области физиологии биосинтеза вторичных метаболитов.

Как известно, периодическая культура является основой подавляющего большинства биотехнологических процессов, а биосинтез целевых продуктов начинается во второй фазе роста в связи с изменением условий среды и имеет приспособительное значение для популяции (Егоров, 1965; Работнова, 1986; Нава-шин, Сазыкин, 1984). Поэтому для направленного действия на биосинтез вторичных метаболитов необходимо иметь информацию о динамике развития продуцентов, начиная от лаг-фазы и до завершения ферментации. Но исследования поведенческих реакций микроорганизмов-продуцентов на популяционном уровне не нашли широкого развития в связи с тем, что в периодической культуре одновременно изменяется большое количество параметров, а соответствующие методы интегрального контроля до сих пор не разработаны.

Из анализа литературной информации следует, что наиболее перспективной для разработки методов контроля культивируемых популяций микроорганизмов, не нарушая их целостность, представляется электрометрия, которая позволяет получать информацию как о культуральной жидкости в целом, так и ее компонентах. Теоретической базой при этом служат данные, свидетельствующие о наличии связей между такими показателями растворов и суспензий, как тангенс угла диэлектрических потерь удельная электропроводность g, импеданс Z и природой компонентов, содержащихся в жидкой фазе (Брезгунов, Жуков, Зудин, 1979; Мирошников, Фомченков, Иванов, 1986; Седых, 1986 и др.)

В связи с изложенным, большое значение и актуальность приобретает установление корреляции между физиолого-биохимическими и биофизическими показателями культивируемых популяций, разработка на этой основе соответствующих инструментальных методов контроля биотехнологических про-

цессов и создание на этой основе управляемого биосинтеза антипаразитарных препаратов широкого спектра действия

Для решения указанных задач могут быть использованы следующие принципы: 1) рассмотрение микробной популяции микроорганизма-продуцента как целостной системы типа организм-среда; 2) интегральный биофизический контроль систем, не нарушая их целостности

Такой подход, хотя и является достаточно общим, имеет определенные преимущества перед традиционными аналитическими методами-теряя в точности и специфичности, удаляется получить выигрыш в целостности, выявить поведенческие адаптивные реакции популяции, что особенно важно при разработке новых технологий микробиологического синтеза.

Цель работы - создание промышленной технологии получения противопаразитарного препарата НИАЦИД на основе обобщения теоретических и практических исследований по особенностям приспособительного развития микроорганизмов-продуцентов в изменяющихся условиях среды и разработке соответствующих методов интегрального биофизического контроля процессов биосинтеза, а также получение исходных данных для внедрения препарата в ветеринарную практику.

Для достижения поставленной цели решались следующие

задачи:

• экспериментальное обоснование характера развития микроорганизмов в изменяющихся условиях периодической культуры как целостных адаптивных систем типа организм-среда;

• установление возможной корреляции физиологического состояния клеток популяции с интегральными электрофизическими показателями культуральной жидкости в целом и на основе этого разработка экспресс-метода интегрального контроля процессов микробиосинтеза;

• испытание метода контроля при культивировании промышленных микроорганизмов-продуцентов (тилозина, хлортетрацик-лина, лизина, энтомофторина, авермектинов и др.);

• получение высокопродуктивного продуцента авермектинов и разработка технологии культивирования его с применением интегрального электрофизического метода контроля динамики развития;

• изучение процесса выделения авермектинового комплекса из биомассы продуцента и определение антипаразитарной активности его на биотестах;

• разработка оптимальной композиции лекарственной формы препарата, изучение безвредности препарата для теплокровных, проведение лабораторных и производственных испытаний препарата против эндо- и экзопаразитов животных;

• разработка и утверждение НТД для внедрения препарата НИАЦИД в производство.

Научная новизна. Экспериментально подтверждена концепция непрерывности физиологической адаптации микроорганизмов в периодической культуре - показано, что на каждой фазе развития имеются свои характерные субпопуляции, обладающие соответствующими физиолого-биохимическими показателями (термоустойчивость, содержание липидов и свободных аминокислот, антиокислительная активность липидов клеток) и приспособление к конкретным условиям среды.

Разработан и теоретически обоснован новый методический подход управляемого биосинтеза на основе регистрации интегральных электрофизических (ЭФ) показателей культураль-ной жидкости (КЖ) продуцентов, впервые установлено, что в определенных областях электромагнитного поля (ЭПМ) кинетика ЭФ показателей коррелирует с сигмоидной кривой роста микроорганизмов,

Выделены и изучены новые штаммы микроорганизмов-продуцентов: 31т.ауегткШ5 198; 56 - продуценты авермектинов; В.ЬаБ81апа 476-4С - продуценты боверина.

Разработаны новые методы экспресс-оценки биологической ценности микробиологического сырья (мелассы, кукурузного экстракта, кормовых дрожжей), определения биосинтетиче-

ской активности продуцентов авермектинов, тилозина, гидролитических ферментов

На основе комплексных исследований разработаны условия регулируемого культивирования продуцентов авермектинов с целью получения целевого продукта, выделения и очистки авер-мектинового комплекса, создана композиция антипаразитарного препарата, обладающая высокой антгельминтной и акарицидной активностью.

Практическая ценность работы. Разработанный метод электрометрического контроля динамики развития микроорганизмов-продуцентов по интегральным ЭФ показателям КЖ в целом позволяет своевременно вмешиваться в ход биосинтеза (вносить дробные добавки, регулировать аэрацию, определять время завершения технологического цикла и др.), что способствует улучшению экономических показателей процесса, а также ускорению отработки новых технологий микробиосинтеза.

Выявлено, что направленное регулирование физиологической адаптации микроорганизмов путем изменения условий культивирования может быть использовано для интенсификации биосинтеза. Например, фотостимуляция метаболизма некоторых промышленных микроорганизмов в установленных режимах облучения (а.с. 1124472) повышает выход энтомопатогенных препаратов в несколько раз, по сравнению с аналогами.

Экспресс-методы контроля биосинтеза тилозина (а.с. 1592771), авермектинов (патент 1806351), качества микробиологического сырья (а.с. 1459245) и физиологического состояния популяции по электрофизическим показателям дают многократный выигрыш во времени и средствах при отработке технологических регламентов и проведении процесса микробиосинтеза. Это было продемонстрировано в промышленных условиях при производстве лизина, тилозина, биовита (хлоргетрациклина).

Разработана и запатентована технология получения нового антипаразитарного ветеринарного препарата НИАЦИД. Препарат прошел широкие производственные испытания в различ-

ных регионах страны и показал высокую лечебно-профилактическую активность. Фармкомитетом МСХиП РФ утверждены ТУ на препарат, проводятся работы по организации промышленного выпуска его.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на IV Всесоюзном симпозиуме "Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве" (Москва, 1971), на Конференции "Московский университет сельскому хозяйству" (Москва, 1971), Конференции молодых ученых МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва, 1971), Всесоюзной конференции "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности" (Львов, 1984), Всесоюзной конференции "Контроль и управление биотехнологическими процессами" (Горький, 1985), Всесоюзной конференции "Автоматизация микробиологических производств" (Иваново, 1986), Всесоюзной конференции "Управляемое культивирование микроорганизмов (Пущино, 1986), Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" (Красноярск, 1987), Всесоюзной конференции "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов" (Пущино, 1989), Всесоюзной конференции "Микроорганизмы стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных" (Ташкент, 1989), Конференции "100 лет Курской биофабрике" (Курск, 1996), Всероссийской конференции "Инфекционные болезни молодняка с/х животных" (Москва, 1996).

По материалам диссертации опубликовано 44 работы, получено 12 авторских свидетельств и патентов.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Объем диссертации - 312 страниц. Из них 234 страницы текста, 32 рисунка и 46 таблиц. Приложения даны на 11 страницах отдельно. Список литературы включает 555 ссылок, в том числе 171 иностранных.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

В настоящей работе исследованы теоретические и практические аспекты регулируемого культивирования микроорганизмов-продуцентов БАВ.

Разработанные методы интегрального контроля микроорганизмов, рассматриваемых как целостные адаптивные системы типа организм-среда, являются основой для решения народнохозяйственных задач, связанных с фитопатологией, оптимизацией процессов микробиосинтеза. Некоторые разработки защищены 12 авторскими свидетельствами и патентами

Исследования завершены производственным испытанием ряда разработок (электрометрический контроль производства лизина, хлортетрациклина, тилозина с соответствующими актами испытания), организацией опытно-промышленного выпуска препарата НИАЦИД для ветеринарной медицины на основе ТУ, одобренных Департаментом ветеринарии МСХиП РФ. 2.1. Материалы и методы.

В этом разделе приводятся методические подробности проведения исследований: выделение, количественная оценка и идентификация микроорганизмов ризосферы винограда традиционными методами микробиологии, изучение их способности продуцировать фитотоксины и ферменты, разрушающие ткани корней, установление корреляции между физиологическим состоянием растения и развитием микроорганизмов на корнях методами биохимии, биофизики. Описаны методические приемы постановки модельных опытов с искусственным заражением тест-растений филлоксерой и микроорганизмами, культивированием ряда промышленных микроорганизмов при действии различных факторов среды (количество) и физиологическое состояние инокулята, минеральные компоненты среды, ауторегулято-ры, световое излучение, в том числе и лазерное).

В работе применены традиционные и специальные физико-химические, биохимические, биофизические, токсикологические методы, в том числе спектрофотометрические, колориметрические, хроматографические, полярографические, хемшноми-несцентные, электрометрические. Представлено подробное описание разработанных нами методов интегрального биофизического контроля систем типа организм-среда, не нарушая их целостности. Приведены материалы, показывающие возможность применения методов хемилюминесценции и электрометрии для решения практических задач биотехнологии. Эти методы корре-лированы на атомно-молекулярном уровне, поэтому их синергизм существенно усиливает ценность получаемой информации.

Все эксперименты, основанные на традиционных подходах микробиологии и биохимии, проводились в 3-5 повторностях, а при отработке новых методов контроля развития популяций в изменяющихся условиях среды опыты повторялись многократно. Результаты опытов обрабатывали статистически с целью установления их достоверности и точности с позиции принятого уровня (Плохинский, 1980).

2.2. Научное обоснование перспективности интегрального биофизического контроля в биотехнологии

Микроорганизмы-продуценты БАВ, также как и любой биологический объект, ведут себя как самоорганизующиеся системы, биосинтез которых самовоспроизводится по эволюционно сложившейся генетической программе. При этом, регистрируемое изменение интенсивности биосинтеза и состава метаболитов, в зависимости от условий среды представляет собой сумму потоков обмена веществ дискретных клеток. В связи с тем, что обмен веществ с окружающей средой является фундаментальным свойством жизни, то изменение состава среды также является результирующей суммой обменных процессов гетерогенных клеток.

Таким образом, интегральные свойства заложены уже в самом объекте контроля и управления биосинтезом - периодиче-

ской культуре микроорганизмов-продуцентов. Одновременное изменение среды и популяции в каждом технологическом процессе сопровождается микроэволюцией продуцента, т.е. от лаг-фазы и до конца вторичного метаболизма имеют место процессы, связанные с физиологической адаптацией, морфологической, физико-биохимической, биофизической и др. гетерогенностью клеток, но интегральным, результирующим показателем состояния популяции (биосинтеза) является кинетика размножения

Это приводит к мысли, что для оперативного контроля и управления промышленным биосинтезом необходимы адекватные методические подходы, позволяющие получать интегральную информацию о динамике системы популяция-среда, не нарушая ее целостности. Такие методы уже разрабатываются для изучения экосистем разной степени сложности, в том числе и микробных, с их помощью получены данные об адаптивности и устойчивости культивируемых популяций микроорганизмов в переменных условиях среды (Терсков, 1984; Печуркин, Бриль-ков, 1984) и нет сомнений в их перспективности для контроля биотехнологических процессов.

2.2.1. Установление особенностей развития микробных популяций как целостных адаптивных систем типа

организм-среда Прежде, чем приступить к решению основной задачи, представлялось необходимым получить информацию о закономерностях адаптивного развития изучаемых микроорганизмов как целостных систем типа организм-среда, о характере влияния исходных и текущих условий среды на их развитие, тем более, что в литературе такой информации очень мало, данные о динамике ризосферой микрофлоры винограда, пораженного филлоксерой вообще отсутствуют, а без этого не представляется возможным интерпретация результатов исследований по разработке соответствующих методов контроля биотехнологических процессов.

Единство среды обитания и микробной популяции прослеживается по многим показателям, традиционно исследуемым в микробиологии. Например, как относительный, так и абсолютный биомассы прирост В.Ьа5з1апа, обусловленный увеличением количества инокулята, достигает определенного значения и выходит на плато. Это напоминает известную закономерность -интенсивность развития популяции сдерживается как при недо-населенности, так и при перенаселенности среды обитания (Одум, 1975). Влияние инокулята на развитие популяции проявляется через лаг-фазу, в которой часть клеток инокулята лизиру-ется, а метаболическая активность развивающихся клеток весьма значительная(табл.1).

Как видно, скорость утилизации углеводов и минерального фосфора культурой в период до 24 ч роста намного выше, чем в период 48-72 ч роста.

Таблица 1.

Утилизация компонентов среды по фазам развития

В. Ьаэз^апа.

№ опыта Углеводы, мкг/мл.час Фосфор, мкг/мл.час

0-24 ч 24-48 ч 48-72 ч 0-24 ч 24-48 ч 48-72 ч

1 94,80 235,4 52,80 4,08 12,90 1,38

2 87,00 214,7 50,20 4,00 11,60 1,80

3 122,30 161,0 68,70 5,70 11,55 1,50

4 172,70 181,0 30,00 6,80 9,54 1,66

5 115,80 170,4 48,90 4,43 9,69 1,55

Сокращение или удлинение лаг-фазы в зависимости от количества инокулята в конечном счете сказывается в выходе биомассы. Поскольку все условия опыта, кроме плотности посева поддерживались постоянными, можно думать, что сокращение лаг-фазы и увеличение скорости роста являются результатом кооперативного эффекта. Не исключена также возможность обогащения среды готовыми метаболическими блоками лизировав-шихся клеток инокулята.

Перечисленные эффекты связаны с адаптивной стратегией популяции через гетерогенность, т.е. чем больше число клеток

в инокуляте, тем больше гетерогенность и способность к адаптации. Та часть популяции, которая в наибольшей степени соответствует конкретным условиям среды, дает старт развитию системы популяция-среда, а селективное действие среды обеспечивает отбор соответствующих клеток. Именно этим, видимо, объясняется опредёленная синхронность первых делений в периодической культуре микроорганизмов и ее исчезновение в процессе развития и возрастания гетерогенности.

Многочисленные исследования, проведенные нами на продуцентах тилозина, рибофлавина, авермектинов, боверина, хлортетрациклина, показывают, что возраст инокулята и способ его приготовления являются также одним из важнейших факторов успешного проведения биосинтеза. Например, культура В.ЬаБзшпа наиболее интенсивно развивается при использовании инокулята, находящегося в начале экспоненциальной фазы -30 ч роста, а наихудшее развитие наблюдается при использовании инокулята 8-13 ч роста. Поскольку в этих опытах посевной материал выращивался на той же среде, что и последующего опыта, то говорить о необходимости адаптации к новым источникам питания не приходится. В данном случае, вероятно, следует говорить о каких-то других механизмах влияния инокулята на развитие популяции. Действительно, удлинение лаг-фазы при использовании инокулята 8-13 ч возраста можно объяснить тем, что культура этого возраста находится в стадии прорастания спор и перестройки метаболизма. Наши исследования показывают, что на этой стадии клетки наиболее чувствительны к внешним воздействиям, т.е. наименее способны к дополнительным адаптивным изменениям.

В случае 30 ч инокулята клетки прошли стадию физиологической перестройки и в "новых" условиях растут с минимальной лаг-фазой. На каждой фазе развития культуры имеются свои превалирующие группы клеток (субпопуляции) с соответствующими морфологическими и физиолого-биохимическими показателями. Так, при высеве 36-44 ч культуры В.Ьа551апа 467-4С на

среду Сабуро 80-90% колоний имеют размер в пределах 15-19 мм в диаметре и серовато-кремовый цвет, а к концу культивирования, т.е. на 70-76 ч роста в высеве возрастает число мелких колоний диаметром менее 15 мм, появляются аспорогенные колонии. По ходу развития гриба термоустойчивость клеток изменяется волнообразно и имеет минимальное значение в период прорастания спор, а максимальная термоустойчивость отмечена в стационарной фазе (рис.1)

Популяция гетерогенна также по содержанию липидов в биомассе (рис.1) и белоксинтезирующей активности. Последнее подтверждается данными по содержанию свободных аминокислот в мицелии (табл.2).

Таблица 2.

Содержание аминокислот в мицелии В. Ва$з1апа, мкм/гс.в.

Аминокислоты 36 час 72 час 84 час 96 час

Вапин 3,25 2,81 2,90 2,70

Алании 6,11 2,18 2,35 1,29

Глицин 1,92 0,79 1,06 0,86

Серии 1,10 0,32 0,30 0,22

Рис.1. Динамика физиологических показателей В.Ьаз$1апа. А - Общие липиды, мг/г сухого вещества В- Термоустойчивость, % прорастания С - Антиокислительная активность, отн.ед.

Особого внимания заслуживает то, что увеличение удельного содержания липидов в биомассе сопровождается возрастанием доли ненасыщенных жирных кислот в них - об этом свидетельствует повышение антиокислительной активности (АОА) липидов по фазам роста культуры.

Если исходить из того, что антиоксиданты липидной природы являются универсальным неспецифическим регулятором метаболизма и фактически контролируют адаптацию организмов к условиям среды (Тарусов, Веселовский, 1978; Мирзаев, 1978), становится очевидным непрерывность адаптационного процесса в периодической культуре микроорганизмов из-за синхронного изменения среды и популяции. Приведенные материалы демонстрируют также наличие жесткой связи между условиями культивирования, физиолого-биохимическими характеристиками клеток, морфологией и структурой популяции в периодической культуре микроорганизмов, т.е. динамичная система популяция-среда существует реально, не является теоретическим построением и может служить объектом интегрального анализа.

Аналогичные данные получены при исследовании особенностей развития микроорганизмов в природных условиях (ризосфера виноградного растения) и в моделях, имитирующих природные экосистемы (искусственное внесение чистых культур ризосферной микрофлоры под корни саженцев). Интенсивность размножения микроорганизмов на корнях варьируют в процессе вегетации, параллельно наблюдается колебание физиологического состояния растения, что выражается в изменении интенсивности дыхания, электрохемилюминесценции пасоки, активности окислительно-восстановительных ферментов, АОА тканей (Мирзаев, 1972)

В природных биоценозах ризосферная микрофлора находится в постоянном контакте с растением-хозяином и селективное действие растения определяет качественный и количественный состав ее на корнях. Так, из корней винограда, пораженного филлоксерой, выделены нами представители разных системати-

ческих групп, но наиболее часто встречаются Fusarium oxysporum Schiecht, Trihoderma Lignorum и Pseudomonas Lequetaciens. Эти микроорганизмы в большей степени приспособлены к развитию в корневой зоне растения с нарушенным обменом

Проведенные исследования показали, что Fus.oxysporum и Tr.Lignorum продуцируют гидролазы, разрушающие ткани -целлюлазы, пектиназы, причем, высев из корней отличается значительной гетерогенностью по ферментативной активности.

В процессах адаптивного перехода сапрофитных форм микрофлоры ризосферы к паразитизму определенная роль принадлежит и токсинам. Например, Fus.oxysporum продуцирует метаболит, обладающий фитотоксическим действием широкого спектра действия и идентифицированный нами как фузариновая кислота (Мирзаев, 1972).

Таким образом, микробные популяции как в природных, так и в искусственных условиях ведут себя как целостные адаптивные системы типа организм-среда. Приспособительные реакции имеют место на протяжении всего цикла развития и фактически понятия "развитие" и "адаптация" тождественны.

В природных условиях, а именно, в ризосфере, идет чередование видов с изменением среды, а в искусственных средах наблюдается чередование субпопуляций. При этом поддержание потока веществ и энергии через клетки в изменяющихся условиях среды является основой существования популяции, ибо прекращение движения в этом потоке означает прекращение жизни (Куражсковский, 1990) из-за нарушения механизмов адаптации, связанных с термодинамическим состоянием организмов (Рей-мус, 1994).

2.2.2. Выявление возможности контроля культивируемых микроорганизмов методом электрометрии культуральной жидкости.

В связи с тем, что развитие культивируемых микроорганизмов сопровождается непрерывным изменением как среды, так и популяции, то можно ожидать и соответствующее изменение

характеристик культуральной жидкости в целом. Действительно, утилизация компонентов среды, выделение в не продуктов обмена, накопление клеток с параллельным возрастанием их морфологической и физиолого-биохимической гетерогенности не может не сказаться на таких интегральных электрофизических параметрах культуральной жидкости как, например, электопрово-достью, импеданс, коэффициент поляризации. Однако для регистрации указанных величин с высокой точностью приходится конструировать электрометрические установки на основе существующих кондуктомеров и импедансомеров из-за отсутствия соответствующего оборудования, позволяющего работать в широком диапазоне частот электромагнитного поля и отвечающего высокой точности анализов. Кроме того, установки для электрометрического анализа биотехнологических сред включают дополнительные узлы, которые промышленно не выпускаются (датчики разной конструкции, теплообменники для термостати-рования образцов и др.).

Электрофизические характеристики культуральной жидкости микроорганизмов (полный импеданс - Ъ \\ коэффициент поляризации - К) мы исследовали в диапазоне электромагнитных волн от 0,5 кГц до 110 мГц с помощью установки, собранной нами на основе импедансомеров ВМ 507 и ВМ 538 (фирмы "Тесла", Чехия). Погрешность измерений находится в пределах 3-5%. Коэффициент поляризации, определяемый как отношение импе-дансов, регистрируемых на разных частотах, позволяет оценить фактор поляризации клеток микроорганизмов.

Для получения исчерпывающей информации о динамике популяции в условиях ограниченных ресурсов периодической культуры, электрофизические параметры культуральной жидкости регистрировали на разных частотах, начиная с лаг-фазы и до начала лизиса клеток при исчерпании источников питания и накопления продуктов метаболизма

Первые же опыты показали, что корреляция между физиологическим состоянием популяции и электрофизическим по-

казателем Ъ культуральной жидкости в целом наблюдается только в определенных режимах работы. Например, импеданс ЮК продуцента энтомофторина при разных частотах тока варьирует в широком пределе (табл.3).

Таблица 3.

Импеданс культуральной жидкости Е. 1Ьах1ег1апа на разных частотах электромагнитного поля._

Время Роста час Частота электромагнитного поля, мГц

0,5 5,0 25 50 75 100 110

0 52,0 49,0 25,14 9,48 3,50 6,37 10,38

24 65,6 59,6 25,40 9,37 2,93 6,16 10,09

48 69,6 61,8 25,20 9,31 2,80 6,36 10,20

72 74,5 61,2 25,20 9,23 2,83 6,28 10,20

96-100 66,5 60,6 25,00 9,30 2,72 6,13 10,15

130-144 60,5 55,2 24,80 9,33 2,95 6,13 10,20

В процессе развития культуры импеданс ЮК возрастает на частотах 0,5-5,0 мГц, а на более высоких частотах такой зависимости не наблюдается. Общий характер динамики электрофизических показателей идентичен у всех изученных микроорганизмов - Е.Шах1епапа, Б.аигеоГаЫепз, Вгеу1Ьас1епит Бр., З.ауегггЩШБ, Б-Гга^ае и др.

Отличаются только абсолютные величины показателей и диэлектрические спектры. Например, высокочастотный минимум импеданса ЮК продуцента энтомофторина находится в области 75 мГц, а продуцентов хлортетрациклина, авермектинов и тило-зина - в области 5-10 мГц (рис.2)

На тех частотах, которые характеризуются наибольшей крутизной дисперсии наблюдается постоянство электрофизических показателей ЮК в динамике развития популяции микроорганизмов. По этой причине эта область частот не может быть использована для получения информации о состоянии популя-

ции. Другое дело - низкочастотная область электромагнитных волн 1 кГц-5 мГц. Наблюдаемое в этой области частот явление гигантской низкочастотной диэлектрической дисперсии (ГНДД), способствует превалирующему вкладу клеток в общую поляризацию КЖ в целом (Липин, Минц и др., 1981; Мирошников, Фомченков, Иванов, 1986). На основе этого нами собрана малогабаритная установка, работающая в области 1100 Гц. С помощью этой установки в производственных условиях проведен анализ КЖ продуцентов лизина и хлортетрациклина, культивируемых в аппаратах 100 и 64 мЗ соответственно. Из полученных данных следует, что изменение импеданса КЖ по ходу ферментации коррелирует с динамикой утилизации углеводов, накоплением биомассы, а также целевых продуктов биосинтеза (рис.3)

На основе анализа более 20 промышленных ферментации при производстве лизина определены коэффициенты корреляции импеданса КЖ и накопления биомассы Brevibacterium sp. Средняя величина коэффициента корреляции составляет 0,7 (табл.4), что свидетельствует о возможности контроля процесса биосинтеза по интегральным электрофизическим показателям КЖ в целом.

Привлекает особое внимание обнаруженное впервые явление вначале развития культур микроорганизмов в отдельных опытах наблюдается скачкообразное снижение импеданса и коэффициента поляризации КЖ, предположительно связанное с лизисом части инокулята и свидетельствующее о наличии в лаг-фазе более сложных процессов, чем принято считать.

Снижение Z и коэффициента поляризации отмечается и в конце развития популяции. В том случае, когда популяцию продолжают. культивировать после выхода на стационарную фазу, наблюдается снижение Z до исходного значения, что означает прекращение существования системы популяция-среда

Рис.2.Диэлектрический спектр КЖ:

I. £ ЛЬ^еНыа; 2.5 .Ноские

х с г хтц

50- 5- 5- ^с —.................. -—

40- 4- 4- ^ -

30- 3- з- 2 / —

20- 2- 2-

100- 1-6- —6- / ' '.1 ■ 1-1—--1-1-г-1-

24 36 48 60 72 и

Рис^З. Динамика импеданса КЖ и физиологических показателей продуцента хлортетрациклина

X - биомасса, г/л -Ъ - импеданс, Ом

С — . - редуцирующие вещества, Я ХТЦ - хлортетрициклин, мкг/дд хюоо

Таблица 4.

Корреляция между импедансом и концентрацией биомассы в культуральной жидкости Вгеу^а^епит 5р._

№ опыта Коэффициент № опыта Коэффициент кор-

п/п корреляции п/п реляции

1 0,733 11 0,762

2 0,542 12 0,852

3 0,846 13 0,557

4 0,745 14 0,225

5 0,485 15 0,448

6 0,600 16 0,845

7 0,712 17 0,870

8 0,849 18 0,590

9 0,296 19 0,590

10 0,662 20 0,620

Электрофизические показатели КЖ могут быть использованы для получения конкретных значений концентрации клеток микроорганизмов. Для этого существуют разные соотношения, связывающие концентрацию клеток С, электропроводность фильтрата культуральной жидкости V и электропроводность культуральной жидкости Vi (Челидзе, Деревенко, Куриленко, 1977; Бегунков, Жуков, Зудин, 1979; Седых, Кристопсон, 1990; Hanai, Koizumi, 1967).

Например, при работе на низких частотах и КЖ с невысоким содержанием клеток

2(1 - и/и,)

С = ...................

(2-и/и,)

Для более высоких концентраций клеток (более 10 г/л) предлагается соотношение:

1> 2/3

С = 1-(...)

и, 20

Известны и другие более сложные соотношения, в которых учитывается электропроводность самих клеток, двойные электрические слои клеток и др. Однако все известные соотношения могут иметь практическое применение только при условии, что питательная среда стандартна, клетки имеют постоянные электрофизические характеристики. На деле, особенно, в промышленной микробиологии, это не возможно, т.к. питательные среды готовят на основе малостандартного сырья, непостоянен состав воды, качественно варьирует посевной материал и др. Все это ведет к снижению точности анализов.

Обычно, в процессе отработки промышленного регламента накапливаются исходные данные о росте культуры и характере биосинтеза во времени. Поэтому особое значение приобретает информация, именно, о динамике изменения интегральных характеристик КЖ в целом, ибо этого достаточно для того, чтобы на основе регламентных данных и интегральных показателей системы популяция-среда, коррелирующих с физиологическим состоянием клеток, вмешиваться в биосинтез в нужном направлении.

Связь между ЭФ свойствами КЖ и физиологическим состоянием популяции можно объяснить тем, что диэлектрическая проницаемость и электропроводность клеточных суспензий определяется вкладом в поляризацию различных структурных элементов самих клеток, внеклеточных метаболитов и составом среды. На низких частотах тока основную роль играет поверхностная поляризация, включающая поляризацию двойного электрического слоя клеток (Мирошников, Фомченков, Иванов, 1986).

Сложная по архитектуре поверхность клетки постоянно перестраивается в процессе развития, отдельные молекулы и целые комплексы молекул перемещаются вдоль и внутрь клетки благодаря активному и пассивному транспорту (Роо, 1981). В результате этого происходит перераспределение заряженных частиц как вокруг, так и внутри клеток и каждая клетка приобретает ЭФ свойства, которые соответствуют конкретной физиоло-

гической фазе, адаптированной к сложившимся параметрам среды.

Утилизация компонентов среды, выделение в среду компонентов жизнедеятельности и накопление клеток, вокруг которых формируются двойные электрические слои, ведет к изменению ЭФ свойств КЖ в целом. Поэтому стабильность ЭФ показателей КЖ в начале культивирования является сигналом о не оптимальности исходных условий и, наоборот, изменение их по сигмоидной кинетике указывает на интенсивное развитие популяции.

2.3. Разработка технологических приемов применения интегрального контроля в процессах мнкробносннтеза.

2.3.1. Оценка влияния качества микробиологического сырья на интенсивность биосинтеза

На стадии отработки лабораторных и опытно-промышленных регламентов устанавливают наиболее технологичные среды, режим культивирования и диапазон биосинтетической активности продуцента. В дальнейшем задача биотехнологов заключается в точном соблюдении установленных режимов технологического цикла и получении максимально возможного количества продукции. Однако на практике постоянно приходится сталкиваться с трудностями, связанными с нестандартностью сырья (меласса, кормовые дрожжи, кукурузный экстракт и др.), на основе которых готовятся питательные среды. Поэтому возникает необходимость предварительного контроля качества сырья путем определения содержания углеводов, азота, фосфора и проведения биоконтроля, т.е. процесса культивирования продуцента в колбах или малообъемных ферментах, что требует дополнительных затрат.

Таким образом, наличие методов экспресс-контроля качества сырья позволило бы повысить экономическую эффективность биотехнологических процессов.

Экспериментальным подтверждением сказанному служат следующие данные. В результате анализа более 30 партий кормовых дрожжей, используемых в производстве многих БАВ, выявлены существенные отличия их по таким показателям, как электропроводность, импеданс, тангенс угла диэлектрических потерь. Продукция различных заводов, отвечающая по качеству существующим ГОСТам, достоверно различается по ЭФ показателям. В связи с этим возникает вопрос, а как эти партии дрожжей отличаются между собой по биологической эффективности в качестве ингридиентов питательных сред. При положительном ответе на этот вопрос, т.е. при наличии соответствующих отличий в биологической ценности дрожжей автоматически решается вопрос о возможности биофизического экспресс-контроля их качества.

Установлено, что дрожжи отличаются по биологической ценности и на основе этого разработан и запатентован способ контроля качества кормовых дрожжей, позволяющий во много раз ускорить процедуру биоконтроля и прогнозировать ожидаемый выход целевого продукта. Например, ожидаемый выход спор В.1:Ьиг^1еп515 определяют по уравнению прогноза:

У = 34,522х + 1,488;

где У - титр спор, млрд/мл; х - электропроводность 1-20% суспензии дрожжей, См/м.

Расхождение между экспериментальными и расчетными данными по определению выхода биомассы микроорганизма на разных партиях дрожжей не превышает 8%.

Одним из важнейших малостандартных компонентов промышленных питательных сред, используемых в микробиосинтезе, является кукурузный экстракт (КЭ). Продукт этот содержит большое количество биологически ценных компонентов и при хранении заражается разными микроорганизмами. В силу этого, а также из-за процессов естественного "старения" теряет свои ценные качества. Кроме того, по нашим данным партии КЭ отличаются по содержанию сухих веществ (49,05-61,40 %) и дру-

гих компонентов, имеется определенная связь между содержанием сухих веществ и ЭФ показателями. Поэтому для объективной оценки качества партий КЭ их предварительно следует "стандартизировать" до одного (3%) значения сухих веществ.

Многочисленные опыты, проведенные в качалочных колбах, лабораторных и промышленных ферментерах, показали, что количество хлортетрациклина и авермектинов, синтезируемые соответствующими продуцентами, достоверно коррелирует с ЭФ показателями КЭ. Интенсивное накопление БАВ отмечается в тех процессах, когда имеет место более высокие значения импеданса. При этом концентрация ХТЦ и авермектинов колеблется в пределах 5-13 тыс. мкг/мл и 50-500 мкг/мл соответственно, а разность ЭФ показателей варьирует в пределах 5,9-8,3 Ом; 117,2160,4 мСм.

Установлена также зависимость между ЭФ свойствами меласс и выходом лизина на них при культивировании Вгеу|Ьас1егшт эр. На Трипольском биохимическом заводе, при испытании экспресс-метода оценки меласс в динамике развития продуцента лизина, контролировали накопление биомассы, лизина и импеданс мелассы, внесенной в среду. Статистическая обработка данных показала, что зависимость между контролируемыми параметрами описывается уравнением:

У = -0,90Х + 0,17711 + 100,22, где X - сухие вещества;

Я - импеданс мелассы; У - концентрация лизина, г/л, и объективно характеризует биологическую ценность конкретной партии мелассы при производстве лизина.

2.3.2. Изучение влияния факторов среды на биосинтез В связи с тем, что высокая лабильность метаболизма и постоянная готовность дать отклик на изменение условий среды является основой существования микроорганизмов, задача исследователя в практическом плане сводится к выбору тех факторов воздействия, которые легко реализуемы и обладают целена-

правленным эффектом. При этом для первичной экспресс-оценки ответной реакции организмов могут быть использованы электрофизические параметры КЖ и биомассы продуцентов, что подтверждается данными по изучению влияния некоторых факторов среды на метаболизм ряда промышленных микроорганизмов,. Как известно, для культивирования продуцента боверина B.bassiana предложена регламентная среда N 15 (Кондратьев, Алешина и др., 1971), обеспечивающая достаточно высокий выход целевого продукта. Однако длительные усилия по усовершенствованию технологии получения препарата не привели к успеху из-за того, что споровая биомасса теряет жизнеспособность при хранении, но нами была выявлена связь жизнеспособности клеток с влажностью препаратов. Так, влажность боверина, полученного на среде N 15 в 7 раз выше по сравнению с влагоем-костью препарата, полученного на той же модифицированной нами среде (снижение содержания СаС12 до 0,1% и дополнительное внесение Fe, Mn, Zn). Соответственно отличаются и ЭФ свойства и жизнеспособность препарата (рис.4)

На модифицированной среде популяция имеет следующие физиолого-биохимические показатели: лаг-фаза - 15 час; скорость потребления углеводов - 158 мг/час; скорость потребления фосфора - 5,16 мг/час; энергетический коэффициент УаТф -17,542; выход споровой биомассы - 580 млн/мл. Те же показатели на регламентной среде N 15 имеют следующие величины: 20,6 час; 84,30 мг/час; 2,60 мг/час; 13,502; 243 млн/мл и свидетельствуют о не оптимальности условий роста

Оценка жизнеспособности биомассы и интенсивности биосинтеза имеет большое значение и при изучении влияния светового излучения и ауторегуляторов на микроорганизмы в связи с тем, что в последнее время стали появляться работы, показывающие возможность использования указанных факторов для повышения эффективности биотехнологических процессов (Скворцова, Мир-заев и др., 1984; Шабурова, 1984; Подобрянский, 1993). Анализ

опубликованной информации свидетельствует о высокой специфичности ауторегуляции и фотометаболизма.

Рис.4. Влияние состава среды на качество боверина. 1, 2, 3 - среда N 4, содержащая 0,6%, 0,3% и 0,1% СаС12, контроль - среда N 15 По ординате - % от контроля, а - влагоемкость, б - число живых спор,

в - коэффициент поляризации суспензии спор. До сих пор отсутствуют общие теории и подходы к объяснению указанных явлений и поэтому каждый организм требует индивидуального изучения.

Стабильная фотостимуляция отмечена при облучении ШИотрзот, В.ЬаБ51апа и Риз.охуэрогит, растущих поверхностно, и Е.АзЬЬу! в глубинных условиях. Световое излучение синей области спектра (440 нм) в дозах 800-1600 эрг/с.см2 стимулирует развитие указанных микроорганизмов. У знтомопатогенных грибов выход жизнеспособных спор возрастает в несколько раз в зависимости от дозы облучения и колеблется в пределах 103-108 клеток/см2 мицелия

Реакция микроорганизмов на световое излучение зависит от физиологического состояния и систематического положения. Например, лазерное излучение 632,8 нм в отдельных опытах стимулирует развитие вегетативных клеток В.Шипп§1епз15, проду-

%

Ф 2.0

3

100 Ю № 30

а

центы хлортетрациклина и рибофлавина не реагируют на это излучение в плане повышения биосинтеза целевых продуктов. Установлено стимулирующее действие света 440 нм на продуцент рибофлавина - после некоторого периода угнетения облученная культура начинает развиваться более интенсивно и превосходит контрольный вариант по выходу витамина на 10-15%.

Механизмы фоторегуляции метаболизма микроорганизмов, видимо,заключаются в адаптивном изменении липогенеза. Так, под действием света 440нм (1400 эрг/с.см2) АОА липидных вытяжек F.oxysporum возрастает на 60% с одновременным возрастанием содержания общих липидов, а по опубликованной информации, адаптивные возможности организмов зависят от антиокислительной системы, контролирующей свободноради-кальные процессы в липидах мембран 41 (Бурлакова, Дзюба, Пальмина, 1969; Имщенецкий, Демина, Лысенко, 1987). Кроме того мембраны с более высоким содержанием ЖК отливаются высокой устойчивостью к факторам среды (Владимиров, Арча-ков, 1972; Феофилова, Терешина, Михайлова, 1993; Colcoff, Gargett,1981).

При изучении возможности регуляции биосинтеза с помощью аутометаболитов установлено, что автолизат биомассы B.bassiana, E.ashbyi, F.oxysporum, взятой именно в конце экспоненциальной фазы, стимулирует накопление биомассы и скорость роста самих культур. В теоретическом и практическом плане особый интерес представляет сокращение лаг-фазы на 5055% и стимуляция спорообразования. Как известно, принято считать, что вторичный метаболизм активизируется в идиофазе, когда утилизируются компоненты среды и накапливаются продукты обмена. В экологическом плане антибиотикообразование рассматривается как фактор адаптации. (Навашин, Сазыкин, 1984). Спорогенез также считается результатом вторичного метаболизма (Работнова, 1984). В связи с изложенным, следавало бы ожидать отрицательное влияние автолизата биомассы на спорообразование при стимуляции вегетативного роста. Однако полу-

ценные данные показывают наличие стимулирующего эффекта на выход как общей биомассы, так и конидиоспор.

На модифицированной регламентной среде выход спор В.Ьаэ5|апа составляет 412+32 млн/мл, лаг-фаза - 20,3 часа, а возрастание 2-19,85%. Те же показатели на среде с автолизатом составляют 656+49,5 млн/мл, 16,5 час и 27,42% соответственно.

Таким образом, представленные материалы показывают перспективность интегрального контроля при отработке технологических приемов экспресс-оценки качества микробиологического сырья и влияния факторов среды на биосинтез.

На основе полученных результатов разработаны новые способы получения энтомопатогенных препаратов (а.с.1124472), биоконтроля БВК (а.с.1459245)?КЭ и мелассы при производстве биовита и кормового лизина в промышленных условиях. 2.4. Разработка контролируемого биосинтеза, выделения и очистки авермектинов

Авермективный комплекс, продуцируемый З^ауегтМНз и обладающий антипаразитарным действием, относится к макро-циклическим лактонам и состоит из 8 компонентов, отличающихся сочетанием радикалов С2Н5,ОН, Н, СНз, С2Н5О. Эмпирическая формула наиболее активных компонентов В 1а и В1 в -С48Н72014 и С47Н70О14 соответственно. Образование подобных крупных химических структур считается общим свойством биосинтеза на стадии вторичного метаболизма продуцентов, а наличие многозвенного метаболизма, приводящего к биосинтезу компонентов разной активности, свидетельствуют о необходимости строгого контроля и регуляции культивирования микроорганизма-продуцента, оптимизации выделения и очистки целевого продукта.

2.4.1. Разработка условий культивирования продуцента авермектинов.

а) Подготовка инокулята. Впервые в странах бывшего СССР исследования по разработке технологии получения авермектинов на основе культивирования 51:.ауеггшйНз были начаты

нами в НПО биотехнологии (МГП "Бифидум") с использованием штамма ВКМ АС 1301, полученного из музея Института микробиологии РАН. Путем селекции штамма 1301 получены различные варианты культуры многократно преврсходящие по активности родительскую форму. Штаммы 50 и 56 депонированы в коллекции ВНИИСХМ и используются для дальнейшей селекции и работы.

В результате многочисленных экспериментов установлено, что микроорганизм интенсивно развивается и хранится ( более 6 месяцев) на ГКА (глюкозо-картофельный агар), имеющим следующий состав в % : глюкоза 2,0-4,0; агар-агар 2,0; картофельный отвар- остальное. Косяки на ГКА служат для приготовления инокулята - вегетативного посевного материала (ВПМ), вносимого в жидкую среду. Установлено, что оптимальным режимом культивирования микроорганизма в качапочных колбах является: температура «27-29оС; скорость вращения качалки 220-240 об/мин; рН - 7,0-7,2; заполнение колб 100 мл/750 мл»

Для выращивания инокулята составлена питательная среда следующего состава в %: соевая мука - 1,2; БВК (кормовые дрожжи)0,6; мел технический - 0,6; кукурузный экстракт - 0,3; глюкоза 4,0; вода водопроводная - остальное.

Выход биомассы и интенсивность развития микроорганизма, определяемые по скорости накопления мицелия и степени возрастаниа импеданса КЖ в период 24-48 час., коррелируют с количесвом инокулята, но увеличение количества инокулята сверх 10% не приводит к пропорциональному увеличению интенсивности развития продуцента. Скорость роста популяции при плотности посева 0,5% составляет 0,9 г/л.час, а скорость изменений Ъ - 0,12 %/час. Те же величины при плотности посева 10% и 20% составляют 1,63 г/л.час, 1,85 г/л.час и 0,32 %/час и 0,29 %/час. Таким образом, оптимальные концентрации инокулята находятся в пределах 3-10%.

б)| Проведение биосинтеза на производственной среде. Исходя из накопленного опыта в практике микробиосинтеза и

учитывая природу продуцента авермектинов (стрептомицеты), в качестве базовых нами использованы известные прописи сред, например, для биосинтеза тилозона и корморина (Макухина и др. 1984;)

В результате оптимизации соотношения известных источников питания подобрана производственная среда практически не отличающаяся от выше упомянутой посевной, что обеспечивает адаптированность клеток инокулята при пересеве на ферментационную среду в производственных аппаратах. Интенсивное развитие микроорганизма обеспечивается при аэрации подачей воздуха в количестве 0,8-1,0 об/об КЖ. Подача воздуха может быть снижена, когда заканчивается стадия интенсивного роста (60-72 ч) и популация переходит к фазе вторичного метаболизма.

Следует отметить, что авермектиновый комплекс находится в биомассе продуцента, но прямой связи между накоплением биомассы и выходом авермектинов не всегда наблюдается. Более того, при несбалансированных условиях биосинтеза (повышение температуры, добавление излишков фосфора, цинка в среду и др.) наблюдается накопление больших количеств биомассы и низкое содержание авермектинов. Характерным признаком развития популяции является снижение рН на 1,0-1.5 единицы с последующим возрастанием до нейтрального значения.

Особенностью проведения биосинтеза авермектинов, связанной с локализацией целевого продукта в мицелии, является необходимость точного контроля времени завершения ферментации. Дело в том, что при лизисе биомассы в идиофазе авермекти-ны входят в КЖ и разрушаются.

Окончание процесса биосинтеза в момент стабилизации Ъ позволяет устранять возможные потери целевого продукта, а по величине изменения Ъ относительно исходного значения оценить интенсивность развития продуцента. При проведении ферментации в пределах разработанных условий технологического режима выход авермектинов, так же как и других БАВ,

коррелирует с Ъ. Выход целевых продуктов тем выше, чем больше ЧЪ (табл.5) Таблица 5.

Связь между изменением импеданса КЖ и биосинтезом анти-

№ Б. аигеоГааепБ Б. аУегткШз

опыта

п/п Импеданс в Хлортетра- Импеданс Авермек-

конце рос- циклин, в конце тины,

та, % к ис- мкг/мл роста, % к мкг/мл

ходному исходному

1 139,02 12600+420 127,30 313+15

2 127,40 11030+450 139,14 490+27

3 139,20 11950+310 130,28 238+9

4 134,15 10050+390 135,10 295+10

5 121,90 7300+290 110,00 52+4

6 106,64 5600+240 140,64 480+25

7 135,36 11230+400 125,60 195+8

8 140,38 12540+480 115,40 97+7

9 118,40 6300+252 120,00 128+8

10 119,45 7000+240 123,15 110+11

11 121,27 9600+310 109,88 74+5

12 120,81 10000+366 138,31 369+26

в). Выделение и очистка авермектинового комплекса. Ав-ремектиновый комплекс практически не растворим в воде, но хорошо растворим в органических растворителях (этанол, изо-пропанол, эфиры, ацетон, хлороформ и др.). Поэтому перед экстракцией отфильтрованную на нутч-фильтре биомассу промывают дистиллированной водой для удаления остатков среды и водорастворимых метаболитов, промытый мицелий трехкратно экстрагируют каждый раз используя равный объем (относительно биомассы) этилового или изопропилового спирта. Полученный экстракт выпаривают под вакуумом и осадок растворяют в

этаноле. Спиртовой раствор охлаждают до -15оС и выпавший осадок отфильтровывают, раствор выпаривают под вакуумом и получают авермектиновый комплекс в виде янтарного цвета масла. Дальнейшую очистку проводят с использованием хлороформа или на хромйтографических колонках с силикагелем. В очищенном экстракте определают концентрацию ДВ и стандартизируют до 0,6-1,2% спиртового раствора на основе данных о подлинности по ВЭЖХ (рис.5).

Таким образом, разработана биотехнологическая схема контролируемого электрометрическим методом культивирования продуцента авермектинов, установлены режимы выделения и очистки целевого продукта из биомассы микроорганизма. Как видно из рис.6, технологическая цепочка включает только традиционные в микробиосинтезе операции и, соответственно, комплектуется промышленно освоенным отечественным оборудованием. Разработанная технология является практически безотходной и относительно безвредной для окружающей среды т.к. биомасса, остающаяся после экстрации, содержит определенное количество авермектинов и может быть использована для изготовления,

2

3

1

г

з

1

т

7

6

Рис.5. Хрбматограммы авермектинового комплекса

2-9 - авермектиновые фракции; 1 - неидентифицированное вещество.

лекарственных форм типа премиксов и гранул, а органические растворители регенерируются и возвращаются в технологический цикл.

ь_

с. 6 ■ е -

и

г

М

А;

I

7

<5--

Рис. 6. Принципиальная схема получения авермектов. а - холодная вода в - стерильный воздух с - инокулят

Д - пар 0

е - вода оборотная, Т= 16 - 18 С ф - фильтрат КЖ н- спирт 1 - стабилизатор

1 - посевной аппарат, 2 - рабочий аппарат, 3 - фильтр, 4 - сушилка, 5 - экстрактор,

6 - автомат для разлива готовых форм,

7 - автомат для укупорки и этиектирования.

2.5. Разработка антипаразитарного препарата НИА-ЦИДна основе авермектинов.

В предварительных работах нами было установлено, что авермектиновый комплекс, выделяемый из биомассы продуцента, обладает высокой биологической активностью. Средняя летальная концентрация (СК50) для клещей РэогорНз составляет 0,0001%, а 100%-ный паралич нематод АрЬе1епс1ю1^е5 Ьевве! и олигохет ТиЫАас1ае наблюдается при разведениях авермектинов в 10-12 тыс.раз

Эти данные послужили стимулом для дальнейших исследований по разработке лекарственной формы препарата на основе авермектинов.

2.5.1. Подбор оптимальной композиции и препаративной формы авермектов.

Для составления лекарственной формы антипаразитарного препарата было проверено множество вариантов композиций, включающих различие ингредиенты, известные и разрешенные в фармакологии. Исходя из результатов определения биологической активности на тест-объектах, как наиболее перспективные, были выбраны рецептуры, содержащие сочетание следующих компонентов: авермектины, диметилсульфооксид (ДМСО), поли-этиленгликоль (ПЭГ-400), глицерин, н-бутанол, Твин-80, спирт этиловый или изопропиловый.

Композиция, составленная из авермектинов, ПЭГ-400, Твина-80, ДМСО и в определенных соотношениях спирта под названием НИАЦИД использована для дальнейшего изучения.

2.5.2. Токсичность НИАЦИДа для животных

При определении токсичности НИАЦИДа использовали белых мышей с массой 18-20 г, которым препарат вводили перо-рально с помощью шприца с затупленной иглой. Исходя из литературной информации о токсичности авермектинов (30-50 мг/кг), препарат вводили животным в дозе 30, 40, 50, 60, 70, 80 мг/кг. Контролем служила группа животных, которым вводили композицию препарата без действующего вещества.

Токсикологические симптомы наблюдались в зависимости от дозы препарата и выражались в слезовыделении, одышке, нарушении координации движений и смерти. Как видно из данных табл.6 доза препарата менее 40 мг/кг для мышей практически не токсична.

Среднесмертельная доза ЛД5о НИАЦИДа, вычисленная методом прямолинейной регрессии из данных табл.6, составляет ] 18361314,9 или 47,34*1,26 по ДВ.

Представленные данные позволяют отнести НИАЦИД к мадотоксичным препаратам, т.к. его ЛД50 выше 1000 мг/кг (Швейкова, 1975). .

2.5.3. Действие препарата НИАЦИД на гематологические показатели и иммунобиологический статус животных.

Таблица 6.

Токсичность различных доз НИАЦЩ ,а для мышей.

Доза Число животных % гибели

мг/кг по ДВ мг/кг по препарату мл/ животное

30 7 500 0,15 6 2,5(0)

40 10 000 0,20 6 33,3

50 12 500 0,25 6 66,6

60 15 000 0,30 6 83,3

70 17 500 0,35 6 100(97,5)

80 20 000 0,40 6 100

Среди множества функций крови важнейшей является защита организма путем выработки и транспортировки антител, антитоксинов. При патологических состояниях состав крови изменяется соответствующим образом и это может служить одним из тестов для определения характера отрицательного влияния внешних факторов на организм животных,

Действие НИАЦИДа на гематологические показатели животных мы изучали на овцах и телятах. Препарат вводили подкожно в дозе 1мл/50кг массы.

Как следует из полученных данных, препарат не оказывает существенного влияния на гематологические показатели животных. Например, содержание эритроцитов (6,0-6,8 млн/мкл), лейкоцитов (8,3-9,0 тыс/мкл), гемоглобина (9,0-9,6 %) и общего белка (7,0-7,8 %) в крови овец обработанных и не обработанных препаратом находится на одном уровне и в пределах физиологической нормы.

Как известно, линии Т- и В-лимфоцитов, обеспечивающих функционирование клеточного иммунитета, составляют более трети всех лейкоцитов крови и мгновенно реагируют на появление чужеродного агента (Коляков, 1986). Сущность и характер иммунного ответа обеспечивается кооперативным взаимо-

действием иммуннокомпетентных клеток и сопровождается образованием клеток-эффекторов, осуществляющих те или иные конкретные ответные реакции (Кабанов, Петров, Хаитов, 1986; Соколов, Урбан, 1996),

При этом вся скоординированная система охраны гомео-стаза организма может измениться в зависимости от антигенно-сти чужеродного агента, а степень отклонения от физиологической нормы легко проконтролировать по антителообразованикп

Влияние НИАЦИДа на антителообразующую активность (АОК) мы изучали на белых мышах. Животным опытной группы вводили препарат в дозе 0,02 мг/кг по ДВ. Количество АОК в селезенке определяли в жидкой среде с помощью счетной камеры (Лефковитс, Пернис, 1981). Относительное количество АОК в селезенке опытных и контрольных животных, т.е. индекс стимуляции (ИС) дает картину влияния препарата на иммунную систему. Из полученных данных следует, что ИС в опыте имеет величину 1,0, 'т.е. трансформация В-лимфоцитов под действием НИАЦИДа практически не изменяется, количество АОК находится в пределах физиологической нормы.

В настоящее время известен ряд методов дифференциации Т- и В-лимфоцитов на основе различий по поверхностным антигенам. Однако для подсчета лимфоцитов обеих видов, в основном, используют тесты: розеткообразование с ЭБ (спонтанное или Е-розетки), положительный для Т-клеток, розеткообразование с ЭБ, несущими комплекс антиген-антитело (ЕА-розетки) -положительный для В-клеток (Коляков, 1986).

При изучении действия НИАЦИДа на содержание Т- и В-лимфоцитов на белых мышах (20 опытных и 20 контрольных) установлено, что препарат не оказывает заметного влияния на динамику В-лимфоцитов. Отмечено увеличение ауто-РОК через сутки и на 5-й день опыта до 4,6+0,30%, а в последующие дни (до 30) их количество находится на уровне контроля 1,2+0,22 -1,8+0,25 (рис.7)

%

20 15 10 5

-РОК

1

5

/5 5>0 1

время анализа, сутки

Рис.7. Содержание В- и Т-лимфоцитов в крови мышей после введения НИАЦИДА. - контроль | | - опыт

Действие препарата на накопление в селезенке мышей клеток, образующих розетки с ЭБ, проявляется в снижении их количества, примерно в 2 раза, на 5-й день опыта с последующим (на 20-30 день) выравниванием с контролем.

Имеет место незначительное снижение продукции антител под действием НИАЦИДа, но в целом препарат не оказывает существенного влияния на иммунную систему животных.

Сенсибилизирующие свойства НИАЦИДа изучено на морских свинках в реакции непрямой дегрануляции тучных клеток (Фрадкин, 1978). Препарат вводили дважды подкожно и внутримышечно в дозе 1 мл. Для получения тучных клеток использовали белых крыс массой 140-200 г.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что НИАЦИД не вызывает сенсибилизации организма, т.к. количество деградировавшихся клеток составляет 1-6%.

Отсутствие отрицательного действия НИАЦИДа на иммунную систему и гематологические показатели животных позволяет отнести его веществам с низкой иммунногенностью или

слабыми антигенными свойствами, хотя, как отмечают некоторые авторы, понятия "сильный" или "слабый" антиген не всегда отражают свойства самого вещества (Кабанов, Петров, Хаитов, 1986).

2.5.4. Изучение эффективности НИАЦИДа при лечении паразитов животных.

Эффективность препарата против возбудителей псороп-тоза проверялась в полупроизводственных условиях на овцах и телятах. В опытах было использовано 15 телят и 30 овец. Все животные спонтанно поражены псороптозом, что подтверждено внешними признаками и наличием клещей в соскобах кожи. Животных делили на 3 группы по 5 и 10 голов, соответственно, и опытным группам вводили ИВОМЕК и НИАЦИД в дозе 1 мл/50кг массы, контролем служили необработанные препаратами животные. Препараты вводили двукратно с интервалом 7 дней

Установлено, что у опытных животных каких-либо отклонений от нормы нет, на 15-16 день клиническая картина практически не наблюдается, в соскобах кожи живые клещи не обнаруживаются. Гематологические показатели находятся в пределах нормы

Производственные испытания НИАЦИДа проводились в хозяйствах Ставропольского края и Республики Дагестан. В процессе испытаний было обработано 830 голов овец, спонтанно заболевших гельминтозами и псороптозом. Диагноз зараженности животных паразитами установлен по результатам двукратной гельминтово- и лярвоскопии, а также микроскопированием со-скобов из пораженных участков кожи. Препарат вводили в дозе 1мл/50кг массы животного в локтевую складку. Здоровым животным препарат вводили с целью проверки его профилактической эффективности при однократном введении в указанной дозе. Через 15 и 34 дня после введения НИАЦИДа определяли его эффективность по результатам гельминтово- и лярвоскопии проб фекалий, а также микроскопирования соскобов кожи.

Показано, что введение препарата не сказывается на общем поведении животных. Лечебная эффективность препарата даже при однократном введении составляет 90-100% при диктиокаулезе и стронгилятозах желудочно-кишечного тракта (табл.7)

Таблица 7.

Эффективность НИАЦИДа против экто- и эндопаразитов овец при однократном введении. __

Контролируемые параметры Время контроля, сутки

До 10 15 34

обра-

ботки

Количество животных, пора-

женных:

- псороптозом 254 56 56

- эндопаразитами 830 83 17

Местная и общая реакция - Нет от- Нет от; Нет от-

животных на введение препа- кло- кло- кло-

рата нений нений нений

% эффективности против:

- псороптоза - - 66-75 75

-стролянгитозов - - 90- 97,8

97,8

- диктиокаулеза - - 100 100

- дикроцелий - - 0 0

- мониезий - - 0 0

После однократной обработки овец эффективность против псороптоза составляет 66,7-75% Профилактическая эффективность препарата составляет 100%, т.е. здоровые овцы, находившиеся в одной отаре с пораженными в течение 34 дней не заболели. При двукратном введении препарат проявляет 100% эффективность против псороптоза.

Результаты производственных испытаний оформлены соответствующими актами.

Таким образом, препарат НИАЦИД, действующим началом которого являются авермектины, получаемые на основе разработанной технологии регулируемого культивирования продуцента, обладает высокой антипаразитарной активностью, безвреден для теплокровных и может быть рекомендован для практической ветеринарии.

ВЫВОДЫ

1. В результате последовательного изучения микроорганизмов-продуцентов БАВ в природной среде (ризосфера виноградного растения) в моделях, имитирующих природные условия и на искусственных средах установлено, что развитие их идет адаптивно по типу самоорганизующихся систем организм-среда.

2. Выявлено, что в периодической культуре микроорганизмов, являющейся основой подавляющего большинства биотехнологических процессов, адаптация не завершается в лаг-фазе и имеет место на протяжении всего цикла развития. Фактически понятия развитие и адаптация тождественны. По фазам роста культуры от лаг-фазы и далее идет последовательная смена субпопуляций, что подтверждается гетерогенностью популяции по многим показателям (содержание аминокислот и липидов в биомассе, термоустойчивость клеток, АОА липидов биомассы и др.).

3. Выявлена тесная корреляция основных физиолого-биохимических характеристик (длительность лаг-фазы, скорость роста, активность метаболизма) микроорганизмов-продуцентов с интегральными электрофизическими показателями культураль-ной жидкости в целом. При этом впервые показано, что для каждой культуры существуют свои характерные области частот электромагнитного поля, при которых наблюдается корреляция ЭФ показателей КЖ с интенсивностью развития популяции. Оптимальные области частот установлены для продуцентов тилози-на, энтомофторина, хлортетрациклина, авермектинов, лизина.

4. Впервые показано, что кинетика изменения импеданса и коэффициента поляризации КЖ совпадает с известной сигмо-идной кривой роста периодической культуры микроорганизмов-продуцентов. На основе этого разработан новый методический подход интегрального контроля и управления процессами микробиосинтеза. Испытание метода в промышленных условиях производства элортетрациклина, лизина, тилозина, энтомопато-генных препаратов при контроле динамики развития продуцентов и экспресс-оценке качества микробиологического сырья (БВК, кукурузный экстракт, меласса) подтверждает его практическую ценность.

5. Разработаны технологические приемы применения интегрального контроля при оптимизации параметров биосинтеза авермектинов (возраст и доза инокулята, аэрация, рН), получены новые штаммы Б.ауегткШБ продуцента авермектинов - N 50 и 56.

6. Разработаны условия поддержания и хранения продуцента авермектинов, сконструированы среды на основе дешевых и доступных видов отечественного сырья для размножения вегетативного посевного материала и биосинтеза авермектинов.

7. Установлено, что авермектиновый комплекс, продуцируемый новыми штаммами З^уелтийНв 50 и 56, содержит известные 8 компонентов, обладает высокой токсичностью в отношении широкого спектра паразитов.

На основе авермектинов, получаемых по разработанной технологии биосинтеза, выделения и очистки, создан новый высокоэффективный отечественный антипаразитарный препарат НИАЦИД.

8. Препарат НИАЦИД безвреден для теплокровных -ЛД50 для белых мышей составляет 11836+314,9 мг/кг, обладает высокой эффективностью при профилактике и лечении эндо- и эктопаразитозов животных. В дозе 1мл/50кг массы животного при однократном применении лечебная эффективность препарата против псороптоза и гельминтозов овец колеблется в пределах 66,7-75,0 и 90-97% соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработана и внедрена в практику совместного производства АО "Агровет" и НПО "Экобиовет" технология получения антипаразитарного препарата НИАЦИД. Разработана и утверждена научно-техническая документация (ТУ, Наставления), необходимая для промышленного производства и применения препарата в практической ветеринарии.

2. Разработанные нами методические подходы интегрального контроля культивируемых популяций микроорганизмов-продуцентов БАВ рекомендованы для контроля промышленного производства ветеринарных препаратов фрадизина, лизина, что подтверждено соответствующими актами внедрения (Протокол производственного совещания Трипольского БХЗ от 28.02.86 г. и Акт производственного испытания ЭФ метода контроля биосинтеза тилозина, ХЗ "Прогресс", 26.06.89 г.).

Основные положения диссертации изложены в следующих работах:

1. Perovv N.N., Mirzaev M.N., Kitlaev B.N. Funkce pudni microflory v toxikoze revu vinne napadene msickou revokasem. // Vinohrad. - 1970.-N 11.- C.184-185

2. Тарусов Б.Н., Маммаев A.T., Мирзаев M.H., Китлаев Б.H. Электрохемилюминесценция пасоки винограда. II Тезисы докладов IV Всесоюзного симпозиума "Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве. - М., 1971. - С.53

3. Мирзаев М.Н., Перов H.H., Китлаев Б.Н., Маммаев А.Г. Ав-торегуляторная роль антиоксидантов больного филлоксерой виноградного растения. // Сельскохозяйственная Биология. - 1972. - N 4. С.628-630

4. Перов H.H., Мирзаев М.Н. О роли почвенных микроорганизмов в токсикозе винограда, пораженного филлоксерой. // Докл. ВАСХ-НИЛ, - 1971. - N 9. - С.24-25

5. Маммаев А.Т., Мирзаев М.Н. Антиокислительная активность липидных вытяжек виноградного растения. // Сборник трудов молодых ученых СКЗНИиВ,-Краснодар, 1971. - С.211-215

6. Perow N.N., Mirzaev M.N., Kitlaev B.N., Mammajev A.T. Antioxidachy system vinica hrosnoredeho napadnuteto voskou vinicovou. // Vinohrad. - 1972.-N 1.-P.8-9

7. Мирзаев M.H., Перов H.H. Токсические свойства метаболитов Fus.oxysporum, выделенных из поврежденных филлоксерой корней винограда. // Микология и фитопатология. - 1978. - Т. 12, N 5. С.393-345

8. Мирзаев М.Н., Бабаян Е.Ю., Попков Г.П. Исследование возможности осаждения биомассы B.bassiana, полученной глубинным методом. // Микробиологическая промышленность. - 1982. - N 4. С.8-10.

9. Мирзаев М.Н. Развитие B.bassiana в связи с плотностью посева. // I Республиканская конференция "Патология членистоногих и биологические средства борьбы с вредными организмами": Тезисы докладов. - Канев, 1982. - С.157-158

10. Мирзаев М.Н., Дрягина Т.Н. и др. Способ определения ферментативной активности: Авторское свидетельство N 1027202, 1983.

11. Скворцова М.М., Мирзаев М.Н. и др. Действие светового излучения на развитие некоторых промышленных микроорганизмов. // Всесоюзная конференция "Проблемы фотоэнергетики растений и повышения урожайности": Тезисы докладов. - Львов, 1984.

12. Малькова А.И., Орловский В.И., Мирзаев М.Н. и др. Способ получения конидиоспор энтомопатогенных грибов: Авторское свидетельство N 1124472,1984

13. Мирзаев М.Н. Эффективность энергетического обмена B.bassiana в зависимости от обеспечения микроэлементами. // Всесоюзная конференция "Контроль и управление биотехнологическими процессами": Тезисы докладов. - Горький, 1985. - С.35.

14. Мирзаев М.Н., Кононова С.Ю. Удельное потребление углерода B.bassiana при росте на жидкой среде. // Конференция "Производство и применение грибных энтомопатогенных препаратов": Сборник трудов. - Москва, 1985. -С.45-49

15. Мирзаев М.Н., Скворцова М.М. и др. О возможности применения электрофизического анализа для контроля за процессом роста микроорганизмов. // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Автоматизация микробиологических производств. - Иваново, 1986. С.87-88

16. Алешина O.A., Захарова Г.М., Мирзаев М.Н. и др. Штамм B.bassiana - 476-4С, используемый для получения энтомопатогенного препарата боверина. Авторское свидетельство N 982630, 1982.

17. Мирзаев М.Н., Скворцова М.М. и др. Сравнительное изучение электрофизических характеристик кормовых дрожжей. // IV Всесоюзная конференция "Управляемое культивирование микроорганизмов: Тезисы докладов. - Пущино, 1986. - С Л 48.

18. Седых Н.В., Мирзаев Н.М., Липин А.Л. Особенности диэль-кометрического и кондуктометрического контроля процессов в ферментационном аппарате. // "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических Препаратов". - Москва, 1987. -С.154-155.

19. Мирзаев М.Н., Скворцова М.М. и др. Изучение электрофизических свойств растущей культуры Str.aureofacies. // Всесоюзная конференции "Биофизика микробных популяций": Тезисы докладов. Красноярск, 1987.-C.I48

20. Мирзаев М.Н., Джаиумов Д А., Седых Н.В. Электрофизическая установка для контроля биотехнологических процессов. // там же, С.127.

21. Мирзаев М.Н., Джанумов Д.А., Рогожина Л.В. Исследование перспективности электрометрического принципа для контроля производства тилозина. // Труды ВНИИ биотехнология: Вопросы биотехнологии, 1989. - Ч. 2.-С.66-68.

22. Мирзаев М.Н. Биофизические аспекты системного анализа культивируемых популяций микроорганизмов. // Труды ВНИИ биотехнология: Вопросы биотехнологии, 1989. - Ч. 2. - С.80-85.

23. Мирзаев М.Н., Мелкумян В.Г. и др. О возможности использования электрофизических показателей культуральной жидкости для моделирования роста микроорганизмов. // Всесоюзная конференция "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов": Тезисы докладов. - Пущино, 1983. - С.59-60

24. Мирзаев М.Н., Седых Н.В. Современные методы автоматического контроля структурно-функциональной организации мембран микроорганизмов. - М.: ЦБНТИ Минмедбиопром СССР, 1987. - 40 с.

25. Мирзаев М.Н., Липин А.Л. и др. Способ контроля качества кормовых дрожжей.//Авторское свидетельство N 1459245, 1988.

26. Мирзаев М.Н., Лазарева В.В. Механизм адаптации некоторых почвенных сапрофитов к паразитизму на растениях. // Всесоюзная конференция "Микроорганизмы-стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных. - Ташкент, 1989. - С. 134.

27. Мирзаев М.Н., Джанумов Д.А. Экспресс-контроль фитопа-тогенных свойств микроорганизмов. // Там же, С. 133.

28. Мирзаев М.Н. Некоторые особенности физиологической адаптации микроорганизмов в периодической культуре. // Труды ВНИИ биотехнология, 1990. - Ч. 2. - С.67-71

29. Мирзаев М.Н., Джанумов Д.А. Способ определения концентрации тилозина: Авторское свидетельство N 1592771, 1990.

30. Мосин В.А., Дриняев В.А., Мирзаев М.Н. Авермектины: колориметрический метод определения в культуральной жидкости и кристаллических препаратах. // Биотехнология. - 1993. -N 1. С.9-12.

31. Мосин В.А., Дриняев В.А., Мирзаев М.Н. Способ определения авермектинов. // Патент N 1806351. - 1992

32. Мирзаев М.Н. Электрометрические параметры культуральной жидкости как критерий оценки развития периодической культуры микроорганизмов. // Всесоюзная конференция "Бйофизика микробных популяций": Тезисы докладов. - Красноярск, 1987. - С.126.

33. Дриняев В.А., Землякова Л.Г., Зиновьев O.A., Мирзаев М.Н. и др. Штамм S.avermitilis-51 - продуцент авермектинов. // Патент РФ N 2048520. - 1994.

34. Дриняев В.А., Чижов В.Н., Ковалев В.Н., Мирзаев М.Н. и др. Способ определения нематоцидной активности авермектинов. // Патент РФ, N 2013053. - 1994.

35. Дриняев В.А., Савченков С.Н., Стерлина Т.С., Мирзаев М.Н. и др. Препарат для профилактики и лечения псороптозов животных. // Патент РФ, N 2033150. - 1995.

36. Савченков С.Н., Мирзаев М.Н., Филиппов В.В. и др. Препарат для профилактики и лечения паразитозов животных. // Патент, N 2067861, 1996.

37. Мирзаев М.Н., Савченков С.Н. и др. Новый антипаразитарный препарат НИАЦИД. // Всероссийская конференция "Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных". Тезисы докладов, Москва. - 1966.' - С.99-100.

38. Мирзаев М.Н., Девришов Д.А., Седых Н.В. Практические аспекты интегрального контроля развития микроорганизмов. // Биотехнология. - 1996.-N4.-C.58-62.

39. Мирзаев М.Н., Савченков С.Н. и др. Некоторые аспекты оптимизации культивирования микроорганизмов-продуцентов ветеринарных антибиотиков. - Тез.докл.научно-производственной конф. 100 лет

Курской биофабрике и агробиологической промышленности России. Курск. - 1966. - С.207-208.

40. Савченков С.Н., Мирзаев М.Н. и др. К вопросу выделения и очистки авермектинового комплекса биомассы Str.avermitilis. //. Там же

41. Петрова Н.Т., Филиппова Н.Б., Павлова Н.М., Джанумов Д.А., Мирзаев М.Н., Мукумов М.Р. Штамм актиномицета S.avermitilis ВНИИСХМ-56-продуцент авермектинов. Положительное решение о выдаче патента по заявке N 95109696/13(016874) от 29.08.96.

42. Зиновьев O.A., Дриняев В.А., Мирзаев М.Н. и др. Способ получения штаммов стрептомидетов - продуцентов авермектинов //Патент № 2074256. - 1997.

43. Савченко С.Н., Мирзаев М.Н., Девришов Д.А. Некоторые особенности технологии получения авермектов //Биотехнология. - 1997. -№3.-С.35 - 38.

44. Мирзаев М.Н., Девришов Д.А., Савченков С.Н. Эффективность и безвредность Ниацида // Ветеринария,- 1997. - № 9 С.26 - 27.

Ризограф. Подписано в печать 19.03.98 г. Объем 2,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ 71.

Типография Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина. 109472,Москва, ул.Академика Скрябина, 23

Биотехнология является одной из наиболее бурно развивающихся и наукоемких отраслей народного хозяйства. Наблюдается постоянный рост номенклатуры и объема продуктов, выпускаемых на основе промышленного биосинтеза. Особое внимание уделяется микробиологическому синтезу экологически чистых веществ, способных заменить химические пестициды, как, например, авермектины, не уступающие по антгельминтной и акари-цидной активности известным хлорорганическим, фосфороргани-ческим и др. соединениям и являющиеся наиболее перспективными для разработки новых антипаразитарных препаратов.

Однако, несмотря на очевидную перспективность и огромные потребности в экологически чистых антипаразитарных биопрепаратах, в нашей стране до сих пор не налажено крупномасштабное производство их. В этой связи актуальной задачей биотехнологии и является поиск высокопродуктивных штаммов-продуцентов авермектинов и создание управляемого биосинтеза целевых продуктов.

Традиционно используеыме в биотехнологии приемы контроля и управления метаболизмом продуцентов на основе регистра-' ции рН, Eh, газообмена, концентрации компонентов среды и биомассы и т. д., в последнее время дополнены рядом новых оригинальных методов. Разработаны аппаратура и методы регистрации подвижности, электрооптических и электрофоретических свойств клеток, позволяющие контролировать не только популяцию, но и влияние факторов среды на нее. При этом, несмотря на значительные успехи в изучении отдельных вопросов управляемого культивирования микроорганизмов, конкретные промышленные процессы до сих пор оптимизируются эмпирическим путем проб и ошибок [266, 267] из-за отсутствия разработанной теории адаптации и микроорганизмов [247] и недостатка знаний в области физиологии вторичного метаболизма.

В отношении периодической культуры микроорганизмов, являющейся основой большинства биотехнологических процессов, принята точка зрения по которой лаг-фаза и есть период адаптации, т.е. адаптация как бы завершается в лаг-фазе и далее культура развивается проходя известные физиологические фазы [221, 222, 240, 274] без адаптации.

Трудности в изучении вопросов адаптации микроорганизмов связаны с рядом причин. Во-первых, мир микроорганизмов, как известно, чрезвычайно многообразен и отличается высокой степенью лабильности метаболизма. Например, микроорганизмы приспособились к развитию в горячих источниках [174], гипертонических растворах солей [117, 499], подземных водах нефтяных пластов [144], на дне океанов при громадных давлениях [423] и других необычных условиях, что, естественно, усложняет их изучение.

Во-вторых, при изучений микроорганизмов очень мало внимания уделяется нетрадиционным в микробиологии методам анализа. Как известно, в последнее время во многих областях науки широкое применение находят методы системного анализа, имеющие определенные преимущества перед традиционным редукционизмом [11, 103]. Ясно, что такие методы анализа особенно ценны при изучении поведенческих реакций организмов в изменяющихся условиях среды. Однако исследований, посвященных целостному рассмотрению культивируемых популяций микроорганизмов, явно недостаточно. Можно лишь отметить некоторые работы, в которых микробные популяции и биотехнологические процессы рассматриваются как целостные системы [20, 120, 275, 294], хотя идеи единства организма и среды выдвигались еще в работах выдающегося ученого Вернадского [44, 45].

Физиологическая адаптация, являясь интегральным показателем приспособительных реакций, имеющих место на всех уровнях биологической организации от клеточной и выше, проявляется в характере роста и размножения культуры в целом. Поэ-' тому для ее изучения необходимы как целостный, системный подход, так и соответствующие интегральные биофизические методы контроля.

По имеющейся в литературе информации о поведении организмов в различных условиях среды видно, что важнейшими свойствами, обеспечивающими их выживание, являются целесообразность организации и опережающее отражение. В результате эволюционно сложившейся целесообразной структурно-функциональной организации клеток микроорганизмы реагируют на изменение условий развития путем индуцированного синтеза новых или адаптивной перестройки имевшихся в клетке энзиматических систем. Такая лабильность метаболизма и готовность дать отклик на любое внешнее воздействие обеспечивает микроорганизмам высокую степень приспособляемости, а исследователям возможность регулирующего воздействия на процесс микробиосинтеза.

Это следует из данных многих авторов, которые показали зависимость скорости роста, состава метаболитов, энергетической эффективности усвоения субстрата, качества целевого продукта и др. от условий роста [23, 89, 110, 260, 380].

Из сказанного ясно, что в практической микробиологии имеются огромные возможности направленного регулирования метаболизма продуцентов и повышения эффективности биотехнологических процессов на основе интегрального экспресс-контроля биосинтеза. При этом в качестве регуляторов метаболизма могут быть использованы самые различные нетрадиционные методы. Например, чрезвычайно экономически выгодна фоторегуляция развития некоторых промышленных микроорганизмов. При минимальных затратах на облучение удается повысить бродильную активность дрожжей на 20-25% [366], а выход энтомопатогенно-го препарата в несколько раз [179, 349].

Известны и другие отдельные работы по интенсификации метаболизма микроорганизмов путем воздействия внешними факторами [330], но, к сожалению, широкого практического использования они не нашли.

Сложность решения вопросов оптимизации биотехнологических процессов в немалой степени связана с тем, что эти процессы базируются на многих областях науки и техники. Например, микробиологическая технология базируется на принципах технологичности штаммов, доступности сырья, популяционной технологичности, аппаратурной реализуемости и др. [184].

Отчасти целенаправленное регулирование метаболизма культивируемых популяций сдерживается отсутствием надежных экспресс-методов контроля и недостатком знаний по вопросу адаптивного поведения в периодической культуре. Существующее мнение о том, что адаптация завершается в лаг-фазе не соответствует представлению об организмах как о самоорганизующихся системах, при таком подходе трудно объяснить гетерогенность развивающейся популяций по многим физиолого-биохимическим показателям. В то же время, ряд косвенных данных' позволяет предполагать, что по фазам развития периодической культуры происходит непрерывная смена субпопуляций.

Из представленного анализа следует, что актуальной задачей современной биотехнологии является также разработка комплексных методических подходов, базирующихся на интегральном биофизическом контроле микробных популяций, рассматриваемых как целостные системы типа организм-среда.

Исследование целостных поведенческих реакций культивируемой популяции в периодической культуре будет способствовать дальнейшему развитию теории адаптации микроорганизмов, а разработка методов интегрального контроля систем популя--ция-среда позволит контролировать биотехнологические процессы и сократить время и расходы на отработку новых технологий. Кроме того, методические разработки по инструментальному контролю биотехнологических сред представляют самостоятельный интерес и они могут быть использованы в других областях науки.

В связи с изложенным, целью работы является создание промышленной технологии получения противопаразитарного препарата НИАЦИД на основе обобщения теоретических и практических исследований по особенностям приспособительного развития микроорганизмов-продуцентов в переменных условиях среды ж разработке соответствующих методов интегрального биофизического контроля процессов биосинтеза, а также получение исходных данных для внедрения препарата в ветеринарную практику.

- И

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- экспериментальное обоснование характера развития микроорганизмов в изменяющихся условиях среды как целостных адаптивных систем типа организм-среда (в природной среде -ризосфера винограда, модели, имитирующие природные условия,' искусственные среды);

- установление корреляции физиологического состояния клеток популяции с интегральными биофизическими показателями культуральной жидкости в целом и, на основе этого, разработка экспресс-метода интегрального контроля процессов микробиосинтеза;

- испытание метода контроля при культивировании промышленных микроорганизмов-продуцентов (тилозина, хлортетрацик-лина, лизина, энтомофторина, авермектинов);

- селекция высокопродуктивного продуцента авермектинов и разработка технологии культивирования его с применением интегрального электрофизического контроля динамики развития;

- изучение процесса выделения и очистки авермектинового комплекса из биомассы продуцента и установление антипаразитарной активности его на биотестах;

- разработка оптимальной композиции лекарственной формы препарата, изучение безвредности препарата для животных, проведение лабораторных и производственных испытаний препарата против паразитозов животных;

- разработка и утверждение научно-технической документации для производства и внедрение препарата в ветеринарию (технологический регламент, ТУ, наставления).

- 12

ОСНОВНЫЕ ИТОГИ И КРАТКИЕ ВЫВОДЫ

1. В результате последовательного изучения микроорганизмов-продуцентов БАБ в природной среде ( ризосфера виноградного растения ), в моделях, имитирующих природные условия и на искусственных, средах установлено, что развитие их идет адаптивно по типу самоорганизующихся систем организм-среда .

2. Выявлено, что в периодической культуре микроорганизмов, являющейся основой подавляющего большинства биотехнологических процессов, адаптация не завершается в лаг-фазе и имеет место на протяжении всего цикла развития. Фактически понятия развитие и адаптация тождеотвенны. По фазам роста культуры от лаг-фазы и далее идет последовательная смена субпопуляций, что подтверждается гетерогенностью популяции по многим показателям ( содержание аминокислот и липидов е биомассе, термоустойчивость клеток, АОА липидов биомассы и др.).

3. Выявлена тесная корреляция основных физиолого-би-охимических характеристик ( длительность лаг-фазы, скорость роста, активность метаболизма) микроорганизмов-продуцентов с интегральными электрофизическими показателями культураль-ной жидкости в целом. При этом впервые показано, что для каждой культуры существуют свои характерные области частот электромагнитного поля, при которых наблюдается корреляция ЭФ показателем Ж. с интенсивностью развития популяции.

Оптимальные области частот установлены для продуцентов тилозина, энтомофторина, хлортетрациклина, авермектинов, лизина.

4. Впервые показано, что кинетика изменения импеданса к коэффициента поляризации 10;, совпадает с известной оип-ло-идноВ кривой роста периодической культуры шкроорганизшв-п] продуцентов. На основе этого разработан новый методический подход интегрального контроля и управления процессами микробиосинтеза. Испытание метода е промышленных условиях производства хлортетрациклина, лизина, тилозина, энтомопатогенных препаратов при контроле динамики развития продуцентов и экспресс-оценке качества микробиологического сырья ( БВК, кукурузный экстракт, меласса) подтверждает его практическую ценное

5. Разработаны технологические приемы применения интегрального контроля при оптимизации параметров биосинтеза авермектинов (возраст и доза инокулята, аэрация, рН), получены новые штаммы . а е продуцента авермектинов 50 и 56.

6. Разработаны условия поддержания и хранения продуцента авермектинов, сконструированы среды на основе дешевых и доступных видов отечественного сырья для размножения вегетативного посевного материала и биосинтеза авермектинов.

7. Установлено, что авермектиновый комплекс, продуцируемый новыми штаммами . а е 50 и 56, содержит известные 8 компонентов, обладает высоком токсичностью в отношении широкого спектра паразитов.

На основе авермектинов, получаемых по разработанной технологии биосинтеза, выделения и очистки, создан новый высокоэффективным отечественный антипаразитарный препарат НИАЦМ

8. Препарат ШШЩ безвреден для теплокровных - ЛД для белых мышей составляет II836 * 314,9 мг/кг, обладает высокой эффективностью при профилактике и лечении эндо-и эктопаразитозов животных. Б дозе I мл/50 кг массы живо! ного при однократном применении лечебная эффективность пре парата против псороптоза и гельминтозов оЕец колеблется в пределах 66,7 - 75,0 и 90 - 977* соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработана и внедрена в практику совместного производства АО "Агровет" и НПО "Экобиовет" технология получения антипаразитарного препарата НИАЦИД. Разработана и утверждена научно-техническая документация (ТУ, Наставления), необходимая для промышленного производства и применения препарата в ветеринарии.

2. Разработанные нами методические подходы интегрального контроля культивируемых популяций микроорганизмов-продуцентов БАВ рекомендованы для контроля промышленного производства ветеринарных препаратов фрадизина, лизина, что подтверждено соответствующими актами внедрения (Протокол производственного совещания Трипольского БХЗ от 28.02.86 г. и Акт производственного испытания ЭФ метода контроля биосинтеза тилозина, ХЗ "Прогресс", 26.06.89 г.).

3. Теоретические положения диссертации включены в обзор "Современные методы контроля структурно-функциональной организации мембран микроорганизмов", М., ЦБНТИ Минмедбиопром СССР, 1987, 40с., Мирзаев М.Н., Седых Н.В.

- 237 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, исследовано адаптивное развитие микробных популяций в переменных условиях среды. Последовательное изучение поведенческих реакций микроорганизмов в природных условиях (ризосфера виноградного растения), в модельных системах, имитирующих природные экосистемы и на искусственных средах показало, что развитие идет путем саморегуляции.

Находясь в неразрывной связи с окружающей средой и являясь компонентом системы популяция-среда, микроорганизмы реагируют на малейшее отклонение в условиях культивирования. В ризосфере это проявляется в том, что количественный и качественный состав микрофлоры варьирует в зависимости от физиологического состояния растения-хозяина. Например, число микроорганизмов на корнях растения изменяется в процессе вегетации, при заражении филлоксерой. Обработка больных растений MnS04 приводит к повышению активности окислительно-восстановительных процессов, интенсивности дыхания и фотосинтеза [236]. В результате этого мобилизуются защитные механизмы растения, изменяется состав корневых выделений и резко уменьшается число условно патогенных микроорганизмов на корнях.

В условиях искусственного культивирования единство среды и популяции проявляется в адаптивной подгонке метаболизма к изменению химического состава среды, ^внесению в среду ау-тометаболитов или облучению видимым^светом. Регулирующее действие указанных факторов на популяцию можно направить таким образом, что удается интенсифицировать технологические

- 238 процессы, например, производство рибофлавина, энтомопатоген-ных препаратов. Характер развития в периодической культуре зависит также от исходных параметров самой популяции, т. е. от качества и количества инокулята.

Анализ полученных экспериментальных данных совместно с известной литературной информацией о динамике открытых самоорганизующихся систем позволяет думать, что развитие микробных популяций в периодической культуре представляет собой непрерывный процесс адаптации. Физиологическая адаптация не завершается в лаг-фазе и имеет место на протяжении всего цикла развития, а прямым подтверждением этого является гетерогенность популяции в динамике развития по многим физио-ло-биохимическим показателям: термоустойчивость, содержание липидов, аминокислот, синтез индивидуальных ферментов, антиокислительная активность биомассы и др.

Привлекает внимание также то, что в лаг-фазе имеет место гораздо более сложные процессы, чем принято считать. В зависимости от оптимальности исходных условий, в этот период наблюдается достаточно высокая метаболическая активность (утилизация углеводов, фосфора, лизис части инокулята).

Итак, развитие периодической культуры микроорганизмов представляет собой саморегулируемый автосинтетический процесс. При этом на каждой фазе развития имеются свой превалирующие группы клеток, которые отличаются по многим физио-ло-биохимическим показателям, т.е. в процессе изменения среды адаптивно изменяется соотношение ферментов и др. структур, обеспечивающих максимально возможную скорость роста в данной фазе развития.

Понятно, что параллельное изменение среды и состава популяции представляет собой естественный процесс, ведущий к увеличению гетерогенности популяции, а значит и устойчивости системы организм-среда. Здесь проявляются фундаментальные противоречия между требованиями биотехнологов (получение максимального производства) и требованиями природы к популяции (максимальная устойчивость). Как известно, в качестве одной из мер устойчивости биосистем используется его разнообразие [299]. Чем более гетерогенна популяция, тем она устойчивее относительно колебаний среды. Однако, для организации микробиологического (или любого биотехнологического) производства отбираются штаммы (сорта) организмов, свойства которых "ограничены" поддерживающей селекцией. Это, естественно, уменьшает гетерогенность. В идеальном случае следовало бы работать с монокультурой, но это не реально, т.к. она неустойчива, из-за невозможности создания идеальных условий культивирования. Поэтому существующие биотехнологические процессы основаны на разумном сочетании требований природы и наших возможностей, соответствующим современным достижениям науки.

Для отобранных штаммов микроорганизмов эмпирическим путем устанавливают по возможности оптимальные условия культивирования. Но из-за того, что время генерации намного меньше всего периода культивирования последовательно происходит отбор клеток, более приспособленных к конкретным условиям среды.

Изложенное согласуется с известными моделями роста и развития биосистем на ограниченных ресурсах. Действительно,

- 240 рассматривая динамику культивируемой популяции с позиций самоорганизации в неравновесных системах [261, 300], можно видеть следующее:

AS = Si - Se = К^/ЗЯГ3 - К24ЯГ2

Производство энтропии клеткой радиусом г пропорционально объему клетки, а поток отрицательной энтропии из среды в клетку пропорционален площади поверхности и зависит от концентрации питательных веществ в среде. (Кг и К2 - коэффициенты пропорциональности).

В стационарных состояниях AS = 0; г = ЗКг/Кг. Состояние, при котором г > 3K2/Klf не реально, так как производство энтропии не компенсируется притоком питательных веществ. Когда в среде имеются все необходимые условия для роста, клетки функционируют по эволюционно выработанной генетической программе и, достигнув определенного размера, делятся на две дочерные клетки. При этом восстанавливается необходимое соотношение объема и поверхности клетки, AS становится отрицательным и клетка снова готова к росту.

На популяционном уровне рост числа клеток можно представить известным уравнением [42]: dX

- = КХ (N - X) - d0X dt где X. - число особей;

К - коэффициент рождаемости; d0 - коэффициент смертности;

N - показатель оптимальности среды для популяции.

Это уравнение аналогично модели [41], согласно которой

- 241 размножение микроорганизмов в периодической культуре представляет собой результат двух противоположных процессов: образование клеток со скоростью, пропорциональной концентрации субстрата и гибели клеток в зависимости от условий среды.

Анализируя эти модели совместно с выше приведенными данными о физиоло-биохимической гетерогенности развития популяции, можно отметить следующее. Поскольку в динамике развития периодической культуры условия среды постоянно меняются, то имеет место соответствующий отбор наиболее приспособленных кластеров, причем, параметры популяции на более поздних стадиях роста характеризуются тем, что обеспечивают неравенство

Щ - dj/Kj > N0 - d0/K0, т.е. кластер с индексом 1 вытесняет предыдущий и т.д. По мере развития популяции в среде накапливаются продукты обмена, исчерпываются источники питания и наступает фаза отмирания клеток.

Таким образом, развитие микробных популяций как в природных биоценозах, так и в искусственных условиях культивирования происходит по принципу самоорганизующихся систем. С учетом этого задача практической микробиологии заключается в выявлении и поддержании оптимальных условий с помощью разных манипуляций [411] и методов контроля [191, 182, 194], разработанных на основе установленной корреляции основных физио-ло-биохимических характеристик биосистем с их интегральными биофизическими показателями. Эти методы позволяют исследо

- 242 вать динамику популяций не нарушая их целостности и идентифицировать роль каждого из компонентов в сложных системах. Так, методом ФИХ впервые доказана роль ризосферных микроорганизмов в токсикозе и гибели виноградного растения, пораженного филлоксерой. Получены прямые доказательства об участии филлоксеры и микроорганизмов в развитии патологического процесса. Эти данные имеют большое практическое значение, ибо позволяют научно обоснованно подойти к решению вопроса о защите растения от карантинного вредителя и условно патогенной микрофлоры.

При решении многих вопросов биотехнологии может быть использована электрофизическая методика контроля развития микробных популяций в периодической культуре. В ограниченном пространстве ферментера культура развивается как открытая система, находящаяся далеко от равновесия. Происходящее при этом перераспределение энергии и вещества внутри ферментера приводит к изменению интегральных биофизических показателей культуральной жидкости, импеданса, коэффициента поляризации.

Однако, такая корреляция между развитием (накоплением биомассы) и изменением электрофизических показателей имеет место только на строго определенных частотах тока. Поэтому предварительно приходится проводить соответствующие исследования по установлению области часто, характерной культивируемой популяции.

Общая закономерность, установленная для многих микроорганизмов, выражается кривой коррелирующей с известной сигмо-идной кривой роста (рис.32). С помощью разработанного метода впервые обнаружен скачок электрофизических показателей в

- 243 лаг-фазе, что еще раз доказывает наличие более сложных процессов в этой фазе развития культуры. Отмечено, что это явление связано с длительностью лаг-фазы, т.е. чем ярче выражен спад Z, тем продолжительнее лаг-фаза и тем менее оптимальны исходные условия для роста микроорганизма. Как видно из рисунка 32, при продолжении культивирования популяции после стационарной фазы, через определенное время клетки полностью лизируются и величина электрофизических показателей после некоторых флуктуаций возвращается к исходному значению. Это свидетельствует о прекращении существования системы организм-среда и установлению равновесия.

Анализ кинетики изменения электрофизических показателей культуральной жидкости показывает также то, что разработанный метод позволяет целенаправленно вмешиваться в ход ферментации. Для этого регистрируют, например, импеданс КЖ и, при достижении культурой определенной фазы развития, вносят дробные добавки или определяют время завершения ферментации, что способствует повышению выхода целевого продукта, экономии воды, электроэнергии и т.д. Разработанный метод может быть использован также в целях стандартизации микробиологического сырья [198, 201] и других областях исследований.

Практическая ценность разработанного метода интегрального контроля развития продуцентов БАВ продемонстрирована на примере разработки технологии получения антипаразитарного препарата НИАЦИД и при контроле существующих технологий микробиосинтеза ряда препаратов сельскохозяйственного назначения (кормовой лизин, хлортетрациклин - основа биовила, тило-зин - основа фрадизина, энтомофторин). ш

Время

Рио. 32. Динамика электрофизических показат^й и биомассы в периодичеокой культуре организмов* X - число: живых клеток

Z- электрофизические показатели,например,импеданс Кj и Kg - максимальные для конкретных условий.^реды значения импеданоа и биомассы

Экспресс-контроль динамики развития продуцента авермектинов позволил резко сократить время и средства на оптимизацию технологии получения целевого продукта. По степени изменения импеданса КЖ в процессе развития микроорганизма удается прогнозировать выход авермектинового комплекса, т. е. косвенно судить об оптимальности конкретных условий среды для биосинтеза. Значительную экономию времени и средств дает также своевременное прекращение ферментации по информации, получаемой электрометрическим датчиком.

Авермектиновый комплекс, получаемый по разработанной технологии содержит все известные 8 компонентов и обладает высокой токсичностью для паразитов животных (гельминты, клещи). Препаративная форма (НИАЦИД) также обладает эффективностью против эндо- и экзопаразитов животных, что подтверждено лабораторными и производственными испытаниями. Препарат по полученным данным безвреден для животных и разрешен к применению.