Автореферат и диссертация по медицине (14.04.01) на тему:Разработка и исследование вагинальных лекарственных форм с рекомбинантными белками теплового шока для стимуляции гуморальных реакций иммунитета, применяемых для лечения рака шейки матки

иичо

На правах рукописи

Ульянов Андрей Михайлович

РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ВАГИНАЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ С РЕКОМБИНАНТНЫМИ БЕЛКАМИ ТЕПЛОВОГО ШОКА ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ГУМОРАЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ ИММУНИТЕТА, ПРИМЕНЯЕМЫХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ШЕЙКИ

МАТКИ

14.04.01. - Технология получения лекарств

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 5 НОЯ 2010

Москва -2010

004614682

Работа выполнена в ГОУ ВПО ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени И.М. Сеченова

Научные руководители:

Доктор биологических наук,

профессор Киселев Всеволод Иванович

Кандидат фармацевтических наук,

доцент Павлова Людмила Анатольевна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук,

профессор Демина Наталья Борисовна

Доктор фармацевтических наук Емшанова Светлана Витальевна

Ведущая организация:

Федеральное Государственное Унитарное Предприятие «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ».

Защита состоится «(Н 10 г. в часов на заседании Диссер-

тационного Совета Д.208.040.09 при Первом Московском Государственном Медицинском Университете имени И.М. Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской Библиотеке Первого МГМУ им. И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан « <22. »2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор фармацевтических наук, профессор / Садчнкова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Диагноз рак шейки матки занимает второе место в мире как причина смерти от онкологических заболеваний среди женщин. Для создания устойчивого иммунного ответа предлагается использовать ранние белки вируса папилломы человека Е7, так как они играют решающую роль в репликации вируса, малигнизации клеток и присутствуют на всех стадиях жизненного цикла вируса папилломы человека (ВПЧ). По данным эпидемиологических исследований самыми распространенными типами ВПЧ в Европе и России являются 16 и 18. Для усиления иммунного ответа целесообразно использование совместно с белком Е7 ВПЧ белка теплового шока 70 из М.йЛегсикш, которые являются прекрасными адьювантами и способны повышать титры антител.

В качестве лекарственной формы было решено выбрать вагинальные лекарственные формы - суппозитории и мягкие желатиновые капсулы, обеспечивающие непосредственный контакт со слизистой оболочкой в месте введения, прямое воздействие композиции рекомбинантных белков, высокую биологическую доступность, что обеспечит терапевтической эффективности.

Всё вышеизложенное определило цели и задачи исследования. Цель исследования

Разработать и исследовать вагинальные лекарственные формы с рекомбинант-ными белками, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с №р 70 из М.ШЬегсикыБ, для стимуляции гуморальных реакций иммунитета, применяемых для лечения рака шейки матки. Задачи исследования

1. Изучил, способность рекомбинантных белков, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с №р 70 из М.шЬегеикж стимулировать гуморальные реакции иммунитета на экспериментальных животных;

2. Разработать состав и технологию вагинальных лекарственных форм (суппозитории, мягкие желатиновые капсулы) с композицией рекомбинантных белков, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18

типов с №р 70 из М.ШЬегсЫсбБ, обеспечивающих терапевшческуго эффективность в месте введения;

3. Разработать методы идентификации и количественного определения композиции ре-комбинаншых белков, состоящих из аминокислошых последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с №р 70 из М.шЬегаЛсж, в субстанции и готовых лекарственных формах;

4. Изучить фармакокинетические характеристики разработанных лекарственных препаратов, содержащих композицию рекомбинатных белков, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с Нзр 70 из М.1иЬсгси1сж, на экспериментальных животных.

Научная новизна результатов исследования

В результате проведенных исследований выявлено, что введение рекомбинатных белков, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с Нзр 70 из М.ШЬегсЫоБ^ (рЕ7/1б-Н$р70 М.ШЬ. и рЕ7/18-Нзр70 М.ШЬ.) вызывает увеличение титра антител в крови экспериментальных животных в 12-16 раз в зависимости от типа белка.

На основании полученной комбинации рекомбинантных белков разработаны составы и технология вагинальных лекарственных форм в виде суппозиториев и мягких желатиновых капсул. Разработаны методики качественного и количественного анализа композиции рекомбинантных белков рЕ7/16-Н5р70 М.ШЬ. и рЕ7/18-НБр70 М.ШЬ. в субстанции, так и в вагинальных лекарственных формах: суппозиториях и мягких желатиновых капсулах, содержащих композицию рекомбинантных белков рЕ7/16-Н$р70 МДиЬ. и рЕ7/18-Н$р70 ММ). Изучены фармакокинетические показатели лекарственной формы рекомбинатных белков рЕ7/16-№р70 М.ШЬ. и рЕ7/18-№р70 М.ШЬ.

Подана заявка в ФИПС и получено положительное решение о вьщаче патента на изобретение №2008146809 «Вагинальные суппозитории для лечения рака шейки матки». Практическая значимость полученных результатов

Разработанные методики качественного и количественного определения композиции рекомбинантных белков рЕ7/16-Н5р70 М.ШЬ. и рЕ7/18-Н5р70 М.ШЬ. могут быть использованы при проведении качественного и количественного анализа субстанции и вагинальных лекарственных форм, полученных на

ее основе. Данные методики внедрены и применяется в НИИ молекулярной медицины ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова. Положения, выносимые на защиту

1. Составы и технология вагинальных лекарственных форм (суппозитории, мягкие желатиновые капсулы) с композицией рекомбинантных белков рЕ7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub., обеспечивающих терапевтическую эффективность в месте введения.

2. Методы идентификации и количественного определения композиции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. в субстанции и готовых лекарственных формах.

Апробация работы

Апробация работы проведена на межкафедральной научно-методической конференции НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М.Сеченова и кафедры технологии готовых лекарственных форм фармацевтического факультета ММА им. И.М.Сеченова 19 мая 2010.

Основные положения работы и практические результаты работы доложены на методической конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность (Москва, 2008 г.), X международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009 г.). Связь задач исследования с проблемным планом

Диссертационная работа является частью исследований, которые проводятся в НИЦ ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, № Государственной регистрации - № 01.2.006 06352. Публикации

По результатам диссертационного исследования опубликовано 4 печатные работы, в том числе две статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Подана одна заявка на патент № 2008146809 от 27.11.08. Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 151 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: Введение; Обзор литературы; Материалы и методы исследования; Идентификация композиции рекамбинантных белков pE7/16-Hsp70 Mtub. и pE7/18-Hsp70 Mtub. в субстанции и оценка их способности стимулировать гуморачьные реакции иммунитета; Разработка технологии получения вагинальных суппозиториев, содержащих композит

ifuio рекомбинантных бежов pE7/I6-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 Mtab. Оценка качества i изучение стабильности полученных вагиначьных суппозиторигв; Разработка технологии / лучения вагинальных мягких желатиновых капсул, содержащих композицию рекомбинантных белков pE7/l&lIsp70 M.tub. иpE7/18-Hsp70 Mtub. Оценка качества и изучение стабшь-ности; Результаты исследований на биологических объектах и микробиологических исследований; Общие выеоды; Список литературы, включающий 184 источников (43 отечественный, 141 зарубежных); Приложения. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 35 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть исследования проводилась в лаборатории биологически-активных соединений НИИ молекулярной медицины ГОУ ВПО Первый МГМУ им. ИМ. Сеченова

Методы исследования

1. Методы идентификации и количественного определения композиции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70M.tub. и pE7/18-Hsp70M.tub. в субстанции и лекарственных формах

1.1. ДСН -электрофорез в полиакриламидном геле

Электрофорез рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70M.tub. и рЕ7/18-

Hsp70M.tub. проводили по методике, предложенной Ю. Лэммли в камере Mini-PROTEAN («Bio-RAD», США) с размером стекол 10x5,5см.

1.2. Сиекгрофотометрическое определение рекомбинантных белков рЕ7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. с применением бицинхониновой кислоты

При спектрофотометричсском определении общего белка в субстанции рекомби-

нангаых белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub, в суппозиториях и мягких желатиновых капсулах испсяьзовали набор ВСА Protein Assay Kit («Pierce», США). Все операции проводили согласно инструкции производителя. Для анализа использовали спектрофотометр Titerstek («Multiskan МСС», США) при длине волны 540±2 нм (микрометод) и спектрофотометр Spectronic 2РС («Genesys», США) при длине волны 562±2 нм (макрометод).

2. Методы определения физико-химических и структурно-механических свойств суппозиториев и мягких желатиновых капсул

Определение средней массы суппозиториев проводили согласно ГФ XI, вып. 2, с. 152.;

определение температуры плавления суппозиториев проводили по методике ГФ XI, вып. 1, с. 16.; определение температуры затвердевания суппозигорной массы проводили по методике ГФ XI, вып. 1, с20.; время полной деформации суппозиториев определяли по методике ГФ XI, вып. 2, с. 153.; определение значения рН водных растворов проводили согласно ГФ XI, вып. 1, с. 114.; определение средней массы МЖК проводили согласно ГФ XI, вып. 2, с. 144.; определе-

ние однородности дозирования МЖК проводили согласно ГФ XI, вып. 2, с. 144.; определение распапаемосш МЖК проводили согласно ГФ XI, вып. 2, с. 144, с. 158-159.; определение растворения МЖК проводили согласно ГФ XI, вып. 2, с. 145, с. 159.

3. Фармакокинетическне методики

Исследования проведены на кроликах-самках породы Шиншилла массой 3.00±0.10

кг. Животные содержались в стандартных клетках при 12-часовом режиме освещения и свободном доступе к корму и воде. Длительность карашина (акклиматизационного периода) животных состааляла 14 дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день кролики наблюдались в клетках.

Препарат вводили интравагинально кроликам из расчета 1 суппозиторий на животное с утра натощак.

Показатели Tmax, Стах и р оцениваются из вида кривой концентрации.

4. Иммунизация мышей для стимулирования гуморальных реакции иммунитета

10 мышей линии В ALB/c (самки массой 16—18 г) были дважды иммунизированы с

двухнедельным интервалом в подушечки задних лап. В качестве иммуногена использовали рекомбинангные белки pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. в количестве 20 мкг.

Для усиления иммунного ответа был использован полный адьюванг Фрейцда («Gibco», США). Для иммунизации по 20 мкг белков смешивали с 70 мкл полного адиоваета Фрейнда и 50 мкл ФСБ и вводили мышам внутрибрюшинно. Вторую иммунизацию проводили с неполным адьювангом Фрейнда.

Ттр специфических ангител определяли методом иммуноферменгного анализа

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ НССЛВДОВАННЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ /.. Идентификация композициирекамбинантных белковpE7/16-Hsp70M.tuh ирЕ7Д8-

Hsp70M.tub.

Для подтверждения подлинности, полученной композиции рекомбинангаых белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. в субстанции, необходимо было разработать методики, позволяющие провести идентификацию композиции рекомбинангных белков рЕ7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. и их количественный анализ. На основании данных литературы были выбраны следующие методы анализа; электрофорез в полиакриламвдном геле, иммуноферменшый анализ, спектрофотометрическое определение общего белка по ОФС 420053-07 в модификации с применением БХК.

1.1. Идентификация композициирекомбинанпшых белковpE7/16-Hsp70M.tiih ирЕ7Д8-Hsp70 M.tub. с памощыо элекпум/ю/хза в тхшакриламидиам геле Для подтверждения структурной целостности полученных рекомбинашных белков рЕ7/16-

5

Hsp70 M.tub. и pE7/l 8-Hsp70 M.tub. был выбран метод элегарофореза в псдиакриламвдном геле. В результате проведенного эксперимента были получены следующие данные, представленные на рис.1.

-36.W-

63.29-

3S9-

-88.SL:

"64 £3L

«79,33

-116Ä -37,40

-SS .20

Рис.1. Элеирэфореграмма композиции реюмбииапных бггажш pE7/16-Hsp70 Mtub. и pE7/18-Hsp70 Mtub.l, 2,3, Фреюм&шаншые белки pE7/16ttp70 Mtub. и pE7/18-Hsp70 Mtub.; 5-сгацщр1ы молекулярного массы

Представленные данные на рис. 1 демонстрируют, что молекулярная масса субстанции рекомбинашных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub составляет 79,93 и 61,93 Юа; 8638 и 63,23 кОа; 88,35 и 64,63 кОа соответственно.

1.2. Идентификация композиции рекомбинашных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. с помощью иммуноферментного метода анализа

В связи с необходимостью подтверждения специфического взаимодействия композиции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. с антителами при применении разработанных технологических схем получения вагинальных суппозиториев и МЖК, а также для идентификации субстанции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. и количественного определения был разработан иммуноферментный метод анализа (ИФА). В настоящем исследовании была использована методика, описанная Kohler G., Milstein С [1975]. В результате применения данной методики были получены следующие данные, представленные в табл. № 1.

Таблица № 1

Концентрация композиции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub.__

№ Разведение п Оф Кощапращыв Определенная Опюапелшая Стандартов

пр. (А=450) пробе, мгЛга концентрация в проба, мгАш гогрвшпосп^ % сгшюнаше

1 1/25000 5 0,98 0,071±0,0034 0,071±0,0062 8,6% 0,005

2 1/50 000 5 0,49 0,0713±0,0027 0,0712±0,0059 7,9% 0,005

Представленные выше данные показывают, что при применении ИФА определенная концентрация в пробе составляет 0,071±0,0062 при разведении 1/25 ООО и 0,0714±0,0059 при разведении 1/50 000, что составляет 99% от первоначально внесенной концентрации пробы. Статистические данные показывают воспроизводимость и достоверность полученных результатов, что позволяет использовать данный метод для идентификации и количественного определения композиции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и рЕ7/18-Hsp70 M.tub. в субстанции, лекарственных формах и биологических объектах.

1.3. Спектрофотометрическое определение композиции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub., в модификации с применением БХК

Для экспресс-анализа, постадийного контроля в процессе получения суппозиториев и МЖК с композицией рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. нами была изучена возможность применения метода спектрофотометрического определения общего белка по ОФС 42-0053-07 в модификации с применением БХК.

Данный метод описан в литературе в двух модификациях: макрометод и микрометод. Применение макрометода позволяет получать статистически более достоверные данные при невысоком содержании белка в пробе, по сравнению с микрометодом, однако, микрометод позволяет проводить экспресс - анализ одновременно до 24 образцов, что позволяет значительно ускорить проведение контроля на различных стадиях технологического процесса.

1.3.1. Методика спектрофотометрического определения композиции рекомбинантных белковpE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub., в модификации макрометода с применением БХК

На основании методики, описанной в п. 1.2. было проведено количественное измерение субстанции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и

pE7/18-Hsp70 M.tub., результаты анализа представлены в табл. № 2.

7

Таблица №2

Результаты спекгрофотометрического определения композициии рекомбинангных белков рЕ7/16-Н5р70 1ШиЬ. и рЕ7Я8-№р70 МЛиЬ. в субстаншш с применением БХК

Макромегод

Количество бака в субстанции, мг Количество обнаруженного бглка в субстанции, мг п Опюсигелшая погрешность, % Сганиартэе отклонение

0,5±0,0198 0,5±0,0156 5 2,6% 0,0224

Микромегод

Количество белка в субстанции, мг Количество о&ируженюго бежа в субстанции, мг п Ошосшелшая погрешность,0/» Стандартное отклонение

0,5±0,0198 0,498±0,0121 5 5,6% 0,М24

Представленные выше данные показывают достоверность данной методики, что позволяет использовать ее для экспресс-детекции на различных стадиях технологического процесса.

1.4. Стимулирование гуморальных реакций иммунитета экспериментальных животных белками теплового шока Для оценки способности белков Е7 ВПЧ 16 и 18 типов и синтезированной

композиции рекомбинантных белков рЕ7/16-Нвр70 МЛиЬ. и рЕ7/18-Н5р70 М.шЬ. стимулировать гуморальные реакции иммунитета, а также подтверждения способности Нбр 70 из МЛиЬегси1о51з усиливать иммунный ответ были проведены следующие исследования.

1.4.1. Безадыовантная иммунизация Для безадьюванпюй иммунизации использовали только чистые белки Е7 ВПЧ 16 и 18 и рекомбинашные белки рЕ7/16-№р70 М.шЬ. и рЕ7/18-№р70 М.шЬ. (всего четыре аншгена). На рис2 показаны результаты тестирования сывороток для каждой пары антигенов.

Бевдыованшая иммунизация белками Е7 ВПЧ 16 и 18 типов не привела к заметной продукции антител против Е7, что вполне согласуется с известными данными о низкой им-муногенности -белков вируса папилломы человека. Иммунизация соответствующими рекомбинантными белками дала более высокий уровень сывороточных антител, что указывает на выраженный адъювантный эффект белка Нзр70. Результаты позволяют применять Нзр70 для усиления иммунного ответа при разработке вакцинных препаратов для предупреждения и лечения РШМ.

1И 1<Н 10®

концентрация

Ríe. 2 Тестирование сывороток мышей, имм)«из!рэванных либо Е7-ВПЧ, либо реюмбниашиыми батками pE7/16-Hsp70Mtub. npE7/l&-Hsp70Mtub. А) алигиисоашегатюгВПЧ 16тша;Б) атшты соответствуют ВПЧ 18 типа Все иммунпзащш проводила белками без апьювапов

1.4.2. Иммунизация с использованием адъюванта Фрейнда В качестве адъюванта использовали полный адъювант Фрейнда, в качестве антигенов- Е7 ВПЧ 16 и рекомбинантные белки pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. Данные иммунизации каждым антигеном приведены на рис. 3.

Анализируя данные, представленные на рис. 3, можно сделать вывод, что применение адъюванта Фрейнда дает усиление антителопродукции при иммунизации белками Е7. Средний титр антител после иммунизации Е7-ВПЧ-16 составил 1:10 ООО, Е7-ВПЧ-18 1:4 ООО. Таким образом, применение рекомбинант-ных белков позволило увеличить титры антител более чем в 10 раз по сравнению с Е7-ВПЧ-16 и Е7-ВПЧ-18.

-,-(—,—....... —1.........""'—'—'—' ' '' )-

104 И4 105

гониснтрадая

рЕ7/18-Нгр70Мус

--.-<—<—' ' ' ' ' )-'-'-'-' ' ' ' м-

кг» ИГ1 10*

канцгнгрзщи

Рис. 3 Тестирование сывороток мышей ИФА, иммунизированных либэ Е7-ВПЧ, либо рекомйииншыми белками рЕ7/16-№р70 ММ). и рЕ7/18-№р70 МшЬ. А) антигены соответствуют ВПЧ16 тала; Б) ашигены соответствуют ВПЧ 18тапа Bcem^^I)raет^IЩпpoюдшI^íьэ^^yлш^a^бшкacaдьквштомФpa^нIИ.

2. Разработка технологии получения вагинальных суппозиториев, содержащих композициюрекомбинантных белковрЕ7/16-Шр70 МЛиЪ. и рЕ7/18-Ньр70 МЛиЪ. Оценка качества полученных вагинальных

суппозиториев

Состав суппозиторной основы подбирали исходя из физико-химических

характеристик основ.

2.1. Разработка технологии получения вагинальных суппозиториев на

дифильной основе В качестве дифильной основы использованы сочетания твердого жира типа

А/витепсола Н-15, с ПЭГ 400 и ПЭГ 1500 в различных соотношениях (табл. № 3).

В качестве гидрофильной основы использована смесь ПЭГ 400 и ПЭГ

1500 (1:9). Раствор композиции рекомбинантных белков рЕ7/16-Н5р70 М.шЬ. и

рЕ7/18-№р70 МЛиЬ. с хитозаном вводили в расплав гидрофильного компонента

суппозиторной основы. Далее в термостатируемый фарфоровый стакан

(39±1°С), содержащий расплав гидрофобной основы, вводили по частям при

постоянном перемешивании расплав смеси ПЭГ 400 и ПЭГ 1500, содержащей

10

композицию рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. и хитозан. Перемешивание вели в течение 60 мин. Скорость вращения мешалки 250 об/мин. Формование суппозиториев осуществляли в готовых контейнерах торпедообразной формы из пленки поливинилхлоридной (ПВХ).

Изучен процесс высвобождения лекарственного вещества из модельных вагинальных суппозиториев всех составов, приведенных в таблице № 3. В связи с тем, что композиция рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и рЕ7/18-Hsp70 M.tub. представляет собой высокомолекулярное соединение, была разработана методика, позволяющая определять скорость высвобождения ВМС из вагинальных суппозиториев: в стеклянный стакан, содержащий 100 мл 0,01 М раствора трис-HCl (рН-8,0), помещали вагинальный суппозиторий. Стакан тер-мостатировали при 37°С. Отбор проб в количестве 2 мл проводили, при постоянном перемешивании, через 0,5;1;2;3;4;8;12 ч после начала эксперимента, возобновляя отобранное количество 0,01 М раствором трис-HCl (рН-8,0). В качестве экспресс-метода для количественного определения композиции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. был использован спектрофотометрический метод, в модификации с применением БХК.

Наиболее полное высвобождение обеспечивают вагинальные суппозитории, приготовленные на дифильной основе (ПЭГ 400 и ПЭГ 1500 в соотношении 1:9- 15% и витепсол Н-15 85%). За время эксперимента высвободилось 86,10% действующего вещества. На основании представленных выше данных для дальнейших исследований были выбраны суппозитории на дифильной основе №11 (таблица № 3).

Выбранные суппозитории были оценены качественно и количественно с помощью иммуноферментного и спектрофотометрического анализа. Результаты иммуноферментного анализа вагинальных суппозиториев на дифильной основе №11 представлены в таблице № 4. Результаты спектрофотометрического определения общего белка в вагинальных суппозиториях с применением ВСА в модификации макро- и микрометода по методике представлены в таблице № 5.

Таблица № 3

Состав вагинальных суппозиториев с компдаицей рекомбинангных белков рЕ7/16-Н$р70 \T.tub. и рЕ7/18-Няр70 МЛиЬ.

Наименование ингредиентов/ номер композиции Количество ингредиентов

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Композиция ре-комбипантных белков 0,0005 г

Раствор трио-НС1 0,5 мл

Хигозан 0,00165 г 0,00165 г 0,00165 г 0,00165 г 0,00165 г 0,00165 г 0,00165 г 0,00165 г 0,00165 г 0,00165 г 0,00165 г

ПЭГ 1500 2,64 г 234 г 035 г 236 г 0,25 г 0,5 г 0,45 г

ПЭГ 400 03 г 1,0 г 0,65 г 0,28 г 0,5 г 0Д5г 0,05 г

ВигепсшН-15 2,94 г 0,45 г 1,94 г 0,15 г 2,44 г 2,44 г 2,44 г 2,44 г

Твердый жир типа А 2,94 г 1,79 г

Нипагин 0,0556 г 0,0556 г 0,0556 г 0,0556 г 0,0556 г 0,0556 г 0,0556 г 0,0556 г 0,0556 г 0,0556 г 0,0556 г

Эмульгатор «Ланит» 0,15 г 0,15 г 0,15 г

Итого 3,0 г 3,0 г 3,0 г 3,0 г 3,0 г 3,0 г 3,0 г 3,0 г 3,0 г 3,0 г 3,0 г

Таблица №4

Количество композиции рекомбинашных белков рЕ7/16-Шр70 МЛиЬ. и рЕ7/18-Н5р70 МЛиЬ. в вагинальных суппозиториях

Лекарственная Разведение 1>ф п V Шф белка, мг Относительная Стандартное

форма (450нм) белка образца, погрешность, отклонение

в образце, мг/мт мл %

Суппозитории 1/25000 1.11 5 0,165±0,006 3,00 0,49510,003 8,6% 0,005

1/50000 0,555 5 0,164±0,006 3,00 0А92М,003 7,9% 0,005

Таблина № 5

Результаты спекгрофотометрического определения компюишпт рекомбинангных белков рЕ7/16-№р70 [\l.tub. и рЕ7/18-№р70 МЛиЬ. _в вапшальных суппозиториях_

Макрометод

Лекарственная форма Количество введенного белка, мг Количество обнаруженного белка, мг Объем выборки, п Относительная погрешность, % Стандартное отклонение

Суппозигорш 0,5=Ш,0156 0,495=ь0,0253 5 53% 0,0186

Мнкромегод

Лекарственная форма Количество введенного белка, мг Количество обнаруженного белка, мг Объем выборки, п Относительная погрешность, % Спи щаргное отклонение

Суппозитории 0,5±0,0156 0,496±0,0278 5 5,6% 0,0224

2.2 Оценка качества вагинальных суппозиториев с композицией рекамбинантных белков рЕ7/16-1Ьр 70 М.йОх и рЕ7Л8-№р70МмК

Оценку качества полученных суппозиториев на дифильиой основе проводили в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 и ГФ XI изд. вели по следующим показателям: внешний вид , средняя масса, отклонения от средней массы, температура плавления, однородность суппсш-тория, однородность дозирования, время полной деформации, микробиологическая чистота, количественное определение композиции рекамбинантных белков рЕ7/16-НБр70 ММ), и рЕ7/18-№р70 ММ».. Результаты представлены в таблице № б.

Таблица №6

Нормы качества вагинальных суппозигорив с композицией рекомбинангных белков _рЕ7/16-№р70 М.М). и рЕ7/18-№р70 ШиЬ. на дифильиой основе._

Показатели Методы Нормы

Описание Визуально Сутаозгории цилиндрически формы бзюго цвета с желговашм отгенюм, на продольном срезе отсутствуют вкрапления

Подлинность Электрофора Весгерн-блот анализ Характерные полосы на ожидаемом уровне молекулярных масс

Средняя масса (ГФХ1щд,вып.2,с. 151) 2,93 г±5%

Темперахура плавления По мегома (ГФ XI юд, вып. 1, с.18) Небэлее37°С

Время полюй деформации (ГФХ1изд,вып.2,с. 151) Не более 15 минут

Микробиологическая чистота (ГФ XI щд, вып. 2, с 193. Категория За

Количественное определение км-юзиции рекшбинаишых белюв рЕ7/16-№р70 ММ), и рЕ7/18-Нзр70М.1иЬ. Спекгрофотометрия в модификации метода с ВСА ИФА В1 суппозитории должно Сьпь от 0,47 до 0,53 мг

3. Разработка технологии получения вагинальных мягких желатиновых капсул, содержащих композициюрекамбинанптых белковрЕ7/16-1кр70МЛиЬ. ирЕ7/18-Ну>70 М.ШЬ. Оценка качества полученных вагшипьных.тгких желатиновых капсул В качестве оболочки мягких желатиновых капсул (МЖК) был выбран желатин типа Б

(щелочная форма), что обусловлено его физико-химическими свойствами. При выборе вспомогательных веществ в ходе разработки состава содержимого капсулы учитывались физико-химические свойства композиции рекомбинангных белков рЕ7/16-Нзр70 ММ), и рЕ7/18-№р70 ММ>. и эцдоэкшогические условия влагалища

Для исследования были использованы желатиновые оболочки состава, представленного в таблице №7.

Таблица №7

Состав желатиновой оболочки доя мягких желатиновых капсул и ее характеристики

№ № п/п Состав желатиновой оболочки (ввес.ч.) Характеристика оболочки Вшкость, при+25°С Время распадземосги (мин)

1 Желатин Глицерин Вода очищенная 12,5 30,0 36,0 Оболочка хорошо формируется, соответствует всем требованиям ГФ XI 2,112 3±0,31

2 Желатин Глицерин Моноглицеродистшлят Вода очищенная 12,5 30,0 1,33 36,0 Оболочка хорошо формируется, отделяется от формы, соответствует требованиям ГФ XI 2,689 6Ь0,48

3 Желатин Глицерин Моноглицеродисгаллят Вод а очищенная 12,5 30,0 0,65 36,0 Оболочка хорошо формируется, отделяется от формы, соответствует требованиям ГФ XI 2,187 4±0,25

4 Желали Глицерин Твин-80 Вода очищенная 12,5 30,0 1,33 36,0 Масса жид кая, оболочка капсул не формируется 1,887

5 Желатин Глицерин Твин-80 Вода очищенная 12,5 30,0 0,42 30,0 Масса жидкая, оболочка капсул не формируется 1,648

Для дальнейших исследований бьи выбран состав желатиновой оболочки №3, так при использован™ других составов не наблюдаюсь формирования оболочки или время падаемосш не удовлетворяло требованиям.

Таблица ЛГ>

Соотношение компонентов в наполнителе дня мягких желатиновых капсул и их хар ^_ терисгика __

№№ Состав ктшозшшн ВСС.Ч. Характеристика компози- Усгончи

п/п ции восп. (ч]

1 Композиция реюмбинашных бглков рЕ7/16№р70 МшЬ. ирЕ7/1&-№р70 Хитозан 6 18 Суспензия неодаородная, обра!укжя агломерапл

Лактоза 100

Нипагин 10

Масло ооевое 1000

2 Композиция реюмбинашных белков рЕ7/16№р70М.ШЬ. ирЕ7/18-Нф70 Хигозаи 6 18 Суспеюия расслаивался п> сле окончания диспершрова-ния 2,0

Декиран40000 Нипагин 100 10

Масло ооевое 1000

3 Комтзишя реюмбинаншых бглков рЕ7/16-Нф70М(иЬ. ирЕ7/18-Нф70 Хигозаи 6 18 Суспепзия расслаиваггся п> сле окончания диспергирования

Лактоза 100 2,5

Декиран40000 Нипагин 100 10

Масло соевое 1000

4 Композиция реюмбинашных белков рЕ7/16-№р70 МШЬ. ирЕ7/18-№р70 Хитозан 6 18 Суспензия расслаивался п> сле окончания дасперпфова-ния

Лактоза 100 4,0

Декиран40000 Нипагин 200 10

Масло ооевое 1000

5 Комгозиииярекомбшашных бглков рЕ7/16-№р70 МШЬ. ирЕ7/18-Нф70 Хитозан 6 18 Суспензия устойчива

Лактоза 100 6,0

Декстран40000 Нипагин 300 10

Масло ооевое 1000

В ходе предварительных исследований установлено, что наилучшее см шивание и распределение композиции рекомбинантных белков рЕ7/16-Нзр М.ШЬ. и рЕ7/18-НБр70 М.ШЬ. наблюдалось при использовании соевого масл Состав компонентов наполнителя представлен в таблице № 8.

16

В ходе проведенных экспериментальных исследований удалось установить, что наилучшими характеристиками при изучении стабильности полученной суспензии обладают соевое масло, декстран и лактоза. Оптимальным является соотношение компонентов для содержимого вагинальных МЖК № 5. При данном соотношении компонентов удалось получить однородную суспензию, устойчивую в течение 6 часов.

3.1. Технология получения мягких желатиновых капсул с композицией рекам би-нантных белковpE7/16-Hsp70 М.tub. и pE7/18-Hsp70 М.tub. для интравагинального

введения

Желатиновые оболочки капсул готовили методом погружения. Оставляли желатин для набухания в течение 30-40 мин, прибавляя после этого глицерин и моно-глицеродистштлят (МГД). Желатиновую массу готовили нагреванием смеси на водяной бане, при этом температура смеси не должна была превышать 42°±10С. Формование оболочек осуществляли методом погружения металлических олив, охлажденных до температуры 5±2°С. Наполнение оболочек мягких желатиновых капсул производили в асептическом блоке при помощи шприца. Готовые запаянные капсулы помещали в батарейный стакан с изопропанолом и закрывали крышкой. Обработку изо-пропанолом проводили в течение 15 минут.

3.2. Оценка качества вагинальных мягких желатиновых капсул с композицией

рекомбинантных белковpE7/16-Hsp70 M.tub. иpE7/18-Hsp70 M.tub.

Оценку качества полученных вагинальных мягких желатиновых капсул с композицией рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. вели по следующим критериям: внешний вид, средняя масса, отклонения от средней массы, микробиологическая чистота, однородность дозирования (ГФ XI) и время распадае-мости, количественное содержание композиции рекомбинантных белков рЕ7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. Результаты иммуноферментного анализа вагинальных МЖК представлены в таблице № 9. Результаты спектрофотометрического определения общего белка в вагинальных МЖК с применением ВСА в модификации макро- и микрометода представлены в таблице № 10.

В таблице № 11 приведены данные, характеризующие качество разработанных МЖК с составом оболочки №3 и составом содержимого №5.

Таблица № 9

Количество композиции рекомбинангиых белков рЕ7/16-Н8р70 М1иЬ. и рЕ7/18-11ьр70 .\T.tub. в вагинальных МЖК

Лекарственная Разведение оф п V т^ белка, мг Относительная Стандартное

форма (450пм) белка образца, погрешность, отклонение

в образце, мг/мл мл %

МЖК 1/25000 1,11 5 0,165±0,006 3,00 0,497^0,001 8,5% 0,005

1/50000 0,555 5 0,164±0,006 3,00 0,495±0,005 8,1% 0,005

Таблица № 10

Результаты спекгрофотометрического определения композицию! рекомбинантных белков рЕ7/16-1Ьр70 М.ШЬ. и рЕ7/18-Н5р70

М.ПЛ. в вагинальных МЖК

Макромегод

Лекарственная Количество Количество Объем Относительная Ставдаршое от-

форма введенного белка, мг обнаруженного выборки, погрешность, % клонение

белка, мг п

МЖК 0,5±0,0151 0,490±0,0237 5 3,6% 0,0215

Мнкромегод

Лекарственная Количество Катнчество Объем Отноагтельная Стандартное от-

форма введенного белка, мг обнаруженного выборки, погрешность, % клонение

белка, мг п

МЖК 0,5±0,0263 0,5±0,0155 5 5,2% 0,0224

Таблица №11

Нормы качества вагинальных МЖК с композицией рекомбинантых белков рЕ7/16-_Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub._

Показатели Методы Нормы

Описание Визуально Эллипп нсская форма, поверхность капсул гладкая, безговреждешш (отмечаются следа запайки), видимых воздушных и механических включений

Подлпшюсп, Электрофорез Весгфн-Оеютанатщ Харшаер! ые полосы I и ожидаемом уровне молекуляр1 ых масс

Средняя маха (ГФ XI щд, вып. 2, с 144) 3,0г±5%

Время распздаемосги (ГФ XI изд, вып. 2, с. 144) 4,2±ДЗмш

Время дезинтеграции (ГФ XI щд, выл 2, с 144) 4,ФД1мин

Микройшюшческая чистота (ГФ XI щд, вып. 2, с. 193. КагегорняЗа

Количествешюеопределение юм-позпщм ремэм&шшных бетюв pE7/16-Hsp70 Mtub. и рЕ7/18-Hsp70 Mtub. Спегарофотометри в модифша-цшмегода сВСА ИФА В1 МЖКдэлж1Ю&,пьотО,47до 0,53 мг

4.Результаты исследований на биологических объектах 4.1. Фармакокинетические показатели

Рассчитанные значения фармакокинетических показателей приведены в таблице № 12.

Концентрация рекомбинантных белков начинает определяться в системном кровотоке уже через 15 минут после введения. Наибольшая концентрация рекомбинантнтных белков в плазме крови отмечается через 2 часа после введения препарата (215.38±10.50 нг/мл). Последующее снижение концентрации характеризуется временем половинного убывания (t1G) порядка 5 часов (5.23±0.13 час). Общее среднее время присутствия в организме — показатель MRT составляет порядка 7.4 час (7.45±0.14 час). Эффективная длительность действия составляет около 12.5 часов. Величина кажущегося стационарного объема распределения — показатель Vss —составляет порядка 250 мл/кг.

При интравагинальном пути введения наблюдается быстрое начало действия, достаточная для выработки антител продолжительность действия, препарат хорошо распределяется в тканях.

Таблица №12

Фармакокинетические показатели композиции рекомбинангных белков рЕ7Я6-1Ьр70 М.Ц|Ь. и рЕ7/18-Н$р70 М.М>. при _шправагинальном введении_

Показатель

Тщах Стал Л1Х24 АиСш мкг а V, Тл Тзфф

ч/мин нг/мл иг^ч'мл т*ч/мп ч'мин мл/кг/ч мл/кг чАшн ч'мин

Средни значениз рЕ7/1<ИЬр70М.ШЬ. 1.49 215.38 2599.01 2687.05 7.45 31.46 243.56 523 12.45

Ошибка среднего рЕ7Л6-Шр701ШиЬ. 0.11 10.50 155.04 164.06 0.14 1.05 7.31 0.13 0.31

Сгацларпюе опоикние рЕ7Я6-1Ьр70Мй1Ь. 0.26 25.71 379.78 401.86 0.34 2.58 17.90 0.31 0.77

Среднее значениг рЕ7/18-Нвр70 ШиЬ. 1.51 214.57 2586.12 2684.01 7.42 32.46 239.61 5.27 12.54

Ошибка среднего рЕ7Л8-Н$р70 \ltub. 0.13 11.34 157.13 167.08 0.12 1.15 7.43 0.16 0.33

Сгавдартэе шмюнаже рЕ7Л8-1Ьр70№иЬ. 0.29 24.73 377.87 405.83 0.37 3.63 18.89 033 0.75

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В опыте на эксперимаггальных животных - мышей линии ВАЬВ/с доказана способность белков теплового шока 70 из ММэегсикйБ стимулировать гуморальные реакции иммунитета;

2. Предложены составы и технология получения вагинальных суппозиториев с композицией рекомбинангных белков рЕ7/16-№р70 ММ), и рЕ7/18-№р70 ММ>. на гидрофобной, гидрофильной и дифильных основах. Доказано, что оптимальными параметрами высвобождения композиции рекомбинангных белков рЕ7/16-№р70 ММ>. и рЕ7/18-№р70 ММ>. обладают суппозитории на дифильной основе. Проведена оценка качества, изучена стабильность полученных вагинальных суппозиториев. Доказано, что через 18 месяцев содержание композиции рекомбинангных белков рЕ7/16-№р70 М.шЬ. и рЕ7/18-№р70 М.шЬ. в суппозиториях соответствует изначально введенной;

3. Разработаны составы желатиновой оболочки доя вагинальных МЖК с композицией рекомбинангных белков рЕ7/16-№р70 ММ), и рЕ7/18-№р70 ММ). Доказано, что оптимальными параметрами высвобождения композиции рекомбинангных белков рЕ7/16-№р70 М.ШЬ. и рЕ7/18-№р70 М.шЬ. облапает оболочка, содержащая 12,5 вес. ч. желатина, 30,0 вес. ч. глицерина, 36,0 мл воды очищенной и 0,65 вес. ч. МГД. Проведена оценка качества, изучена стабильность полученных вагинальных МЖК. Доказано, что через 18 месяцев содержание композиции рекомбинашных белков рЕ7/16-№р70 М.шЬ. и рЕ7/18-№р70 ММ), в капсулах соответствует изначально введенной;

4. Проведена стандартизация рекомбинангных белков рЕ7/16-НБр70 М.шЬ. и рЕ7/18-№р70 ММ> по показателю молекулярной массы и разработаны методы идентификации и количественного определения композиции рекомбинашных белков рЕ7/16-№р70 ММ), и рЕ7/18-№р70 М.ШЬ. в лекарственных формах с помощью электрофореза, вестерн-блог анализа, иммуноферменгаого и спекгрофотометрическош анализа;

5. В результате проведенных фармакокинетических исследований вагинальных суппозиториев с композицией рекомбинашных белков рЕ7/16-№р70 ММ), и рЕ7/18-Ньр70 ММ>. Установлено, что максимальный уровень концентрации рекомбинашных белков рЕ7/16-Няр70 М.ШЬ. и рЕ7/18-Н5р70 М.шЬ. (180-250 нг/мл) в крови экспериментальных животных достигается через 2 часа после ишравагинального введения суппозиториев.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ульянов A.M., Киселев В.И., Свешников П.Г., Павлова JI.A. Количест венное определение общего белка в суппозитории / В сб.: Методическа' конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». Тез. докла дов. -М.: 2008.-С.100-101.

2. Ульянов A.M., Киселев В.И., Свешников П.Г., Городецкая С.Б., Шемчу кова О.Б., Солопова О.Н., Боков М.Н., Варламов Н.Е., Лютова Е.М., Бу дарина С.О., Ашрафян Л.А. Моноклональные антитела против онкобел ков Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов в свете разработки эф фективных тест-систем для ранней диагностики рака шейки матки // Мо лекулярная медицина, 2009.-№ 4, С.45-50

3. Ульянов A.M. Количественное определение общего белка в вагинальны? суппозиториях и МЖК / В сб.: X международный конгресс «Здоровье i образование в XXI веке». Тез. Докладов. - М.: 2009,- С.962-963.

4. Ульянов A.M., Городецкая С.Б., Свешников П.Г., Бударина С.О., Солопо ва О.Н., Шемчугова О.Б., Боков М.Н., Варламов Н.Е., Лютова Е.М., Кисе лев В.И., Ашрафян Л.А. Значение исследования уровня экспрессии онко белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов в цервикальном мат риксе в диагностике неопластических образований шейки матки // Моле кулярная медицина, 2010.-№ 5, С.9-12

Подписано в печать 01.11.2010г. Тираж 100 экз. Заказ № 3899 Отпечатано в типографии «ДЦ «Каретный Двор»» 101000, Москва, Лубянский пр., д.21, стр.5-5а Тел.: (499) 263-00-50 Факс: (499) 263-00-51 www.allaprint.ru

Актуальность темы

Диагноз рак шейки матки занимает второе место в мире как причина смерти от онкологических заболеваний среди женщин. При этом средний возраст заболевших составляет 25-30 лет. За последние 15 лет эпидемиологические и вирусологические исследования однозначно подтверждают связь этой патологии с вирусами папилломы человека.

По данным эпидемиологических исследований самыми распространенными типами ВИЧ в Европе и России являются 16 и 18, поэтому для создания устойчивого иммунного ответа было предложено использовать ранние белки вируса папилломы человека;Е7, так как они играют решающую роль в-репликации вируса, малигнизации клеток и присутствуют на всех стадиях жизненного цикла ВПЧ [17,18].

В ряде исследований: было высказоношредположение, что для усиления иммунного ответа- целесообразно использование белка теплового шока 70г из М;ШЬегси1оз18, которые являются прекрасными» адъювантами и способны повышать титры антител [18];

Поэтому представляется* актуальным? создание препарата, представляющего в качестве действующего начала композицию рекомбинантных, белков, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса; папилломы человека 16 и 18 типов с белком теплового, шока 70 из; М:и1Ьегси1о818 для имму нотерапии и профилактической вакцинации опухолевых заболеваний ано-генитальной сферы, ассоциированных с вирусами папилломы человека. Выбор лекарственной формы был обусловлен необходимостью обеспечения! прямого воздействия композиции рекомбинантных белков: на иммунокомпетентные клетки слизистой, что должно было обеспечить повышение ее терапевтической эффективности. Поэтому в качестве, лекарственной формы были выбраны вагинальные суппозитории и вагинальные мягкие желатиновые капсулы.

Цель и задачи планируемого исследования

Цель настоящего экспериментального исследования разработать и исследовать вагинальные лекарственные формы с рекомбинантными белками, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с Hsp 70 из М.tuberculosis, для стимуляции гуморальных реакций иммунитета, применяемых для лечения рака шейки матки.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить способность рекомбинантных белков, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с Hsp 70 из M.tuberculosis стимулировать гуморальные реакции иммунитета на экспериментальных животных;

2. Разработать составы и технологию вагинальных лекарственных форм (суппозитории, мягкие желатиновые капсулы)' с композицией рекомбинантных белков, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с Hsp 70 из M.tuberculosis, обеспечивающих терапевтическую эффективность в месте введения;

3. Разработать методы идентификации и количественного определения композиции рекомбинантных белков, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с Hsp 70 из M.tuberculosis, в субстанции и готовых лекарственных формах;

4. Изучить фармакокинетические характеристики разработанных лекарственных препаратов, содержащих композицию рекомбинантных белков, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с Hsp 70 из M.tuberculosis, на экспериментальных животных. t

Научная новизна результатов исследования

В результате проведенных исследований выявлено, что введение реком-бинатных белков, состоящих из аминокислотных последовательностей белка Е7 вируса папилломы человека 16 и 18 типов с Hsp 70 из М.tuberculosis вызывает увеличение титра антител в крови экспериментальных животных в 12-16 раз в зависимости от типа белка.

На основании полученной комбинации рекомбинантных белков разработаны составы и технология вагинальных лекарственных форм в виде суппозиториев и мягких желатиновых капсул.

Разработаны методики качественного и количественного анализа композиции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. в субстанции, так и в вагинальных лекарственных формах: суппозиториях и мягких желатиновых капсулах, содержащих композицию рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub.

Изучены фармакокинетические показатели лекарственной формы рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub.

Подана заявка в ФИПС и получено положительное решение о выдаче патента на изобретение № 2008146809' «Вагинальные суппозитории для лечения рака шейки матки».

Практическая значимость полученных результатов

Разработанные методики качественного и количественного определения композиции рекомбинантных белков pE7/16-Hsp70 M.tub. и pE7/18-Hsp70 M.tub. могут быть использованы при проведении качественного и количественного анализа субстанции и вагинальных лекарственных форм. Данные методики внедрены и применяется в НИИ молекулярной медицины ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова. Личный вклад соискателя

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. В опыте на экспериментальных животных - мыши линии ВАЬВ/с доказана способность белков теплового шока 70 из МШЬегсикш стимулировать гуморальные реакции иммунитета;

2. Предложены составы и технология получения вагинальных суппозиториев с композицией рекомбинантных белков рЕ7/16-НБр70 М.ШЬ. и рЕ7/18-Нзр70 МШЬ. на гидрофобной, гидрофильной и дифильных основах. Доказано, что оптимальными параметрами высвобождения композиции рекомбинантных белков ■ рЕ7/16-Нф70 М.йдЬ. и рЕ7/18-Нф70 МШЬ. обладают суппозитории на дифильной основе. Проведена оценка качества, изучена стабильность полученных вагинальных суппозиториев. Доказано, что через 18 месяцев содержание композиции рекомбинантных белков рЕ7/16-НБр70 М.ШЬ. и рЕ7/18-№р70 М.ШЬ. в суппозиториях соответствует изначально введенной;

3. Разработаны составы желатиновой оболочки дшвагинальныхМЖК с композицией рекомбинантных белков рЕ7/16-Н5р70 М.й1Ъ. и.рЕ7/18-Нф70 М.ШЬ. Доказано, что оптимальными параметрами высвобождения; композиции1; рекомбинантных. белков. рЕ7/16-Няр70 М.ШЬ. и рЕ7/18-Нф70 М-ШЬ. обладает оболочка, содержащая 12,5 вес. ч. желатина, 30,0 вес: ч. глицерина, 36,0 мл вода очищенной:и 0,65 вес. ч. МГД Проведена оценка качества, изучена стабильность полученных вагинальных МЖК Доказано, что через: 18 месяцев содержание композиции рекомбинантных белков рЕ7/16-Н5р70 М.ШЬ: и рЕ7/18-Нзр70 М.ШЬ. в капсулах, соответствует изначально введенной;

4. ^ Проведена стандартизация рекомбинантных белков рЕ7/16-Нф70 М:ШЬ. и рЕ7/18-Нф70 М.ШЬ по показателю молекулярной массы и разработаны методы идентификации и количественного определения композиции рекомбинантных белков рЕ7/16-Нф70 М.ШЬ. и рЕ7/18-Нф70 М.ШЬ. в лекарственных формах с помощью электрофореза, вестерн-блот анализа, им-муноферментного и спектрофотометрического анализа;

5. В результате проведенных фармакокинешческих исследований вагинальных суппозиториев с композицией рекомбинантных белков рЕ7/16-1-Ьр70 ММ>. и рЕ7/18-Нзр70 М.ШЬ. Установлено, что максимальный уровень концентрации рекомбинантныхбелков рЕ7/16-Бзр70 МШЬ. ирЕ7/18-Нф70 МШЬ. (180-250 нг/мл) в крови экспериментальных живошых досшгаегся через 2 часа после ишраваганального введения суппозиториев.