Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Моделирование неоваскуляризации и изучение влияния ангиостатина на глазной ангиогенез.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЛАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ИМ. ГЕЛЬМГОЛЬЦА» МИНЗДРАВА РОССИИ

На правах рукописи

04201356672

Золотых Оксана Владимировна

МОДЕЛИРОВАНИЕ НЕОВАСКУЛЯРИЗАЦИИ И ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АНГИОСТАТИНА НА ГЛАЗНОЙ АНГИОГЕНЕЗ

14.01.07 - глазные болезни

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор НЕРОЕВ Владимир Владимирович

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................... 5

ВВЕДЕНИЕ............................................................................. 6

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................... 12

1.1. Ангиогенез в норме и патологии. Заболевания, сопровождающиеся развитием патологической неоваску ляризации................................................................ 12

1.2. Моделирование глазной неоваскуляризации......................... 14

1.3. Экспериментальный сахарный диабет................................. 22

1.4. Патогенез развития неоваскуляризации............................... 26

1.5. УЕСБ. Структура, функции, место в механизме развития патологической неоваскуляризации.......................................... 29

1.6. Ангиостатин. Структура, функции, место в механизме развития патологической неоваскуляризации................................................ 34

1.7. Лечение заболеваний глаза, сопровождающихся развитием неоваскуляризации............................................................... 39

1.8. Электроретинография в оценке ретинальной функции при экспериментальном моделировании......................................... 45

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................. 49

2.1. Протокол исследования опытных животных........................ 49

2.2. Методы обследования опытных животных........................... 54

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫХ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ У ЗДОРОВЫХ КРЫС.................................................................... 59

3.1. Результаты флюоресцентной ангиографии у здоровых крыс................................................................................. 59

3.2. Результаты ультразвукового исследования состояния кровотока в сосудах глаза и орбиты у здоровых крыс................... 60

3.3. Результаты функциональной активности сетчатки у здоровых крыс................................................................................. 66

3.4. Результаты патогистологического исследования у здоровых крыс................................................................................. 70

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫХ И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ У КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ......... 75

4.1. Результаты биомикроскопического обследования крыс при экспериментальном сахарном диабете........................................ 75

4.2. Результаты ультразвукового исследования состояния кровотока в сосудах глаза и орбиты у крыс при экспериментальном сахарном диабете................................................................. 76

4.3. Изменение функциональной активности сетчатки у крыс при экспериментальном сахарном диабете........................................... 79

4.4. Результаты патогистологического исследования у крыс при экспериментальном сахарном диабете........................................... 90

Глава 5. РАЗРАБОТКА МОДЕЛЕЙ ГЛАЗНОЙ НЕОВАСКУЛЯРИЗАЦИИ.............................................................................. 97

5.1. Моделирование неоваску ляризации глаза с помощью интравитреального введения рекомбинантногоУЕОР здоровым крысам (первая серия эксперимента)......................................... 97

5.2. Моделирование неоваскуляризации глаза с помощью интравитреального введения рекомбинантного VEGF крысам с экспериментальным сахарным диабетом (вторая серия эксперимента)..................................................................... 107

5.3 Результаты ультразвукового исследования состояния кровотока в сосудах глаза и орбиты у крыс при моделировании VEGF индуцированной глазной неоваскуляризации.............................. 110

5.4. Изменение ретинальной функции при моделировании VEGF индуцированной глазной неоваскуляризации.............................. 113

Глава 6. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АНГИОСТАТИНА НА НОВООБРАЗОВАННЫЕ СОСУДЫ В РАЗРАБОТАННОЙ МОДЕЛИ VEGF ИНДУЦИРОВАННОЙ ГЛАЗНОЙ НЕОВАСКУЛЯРИЗАЦИИ..... 121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................................................................125

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................................137

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕДАЦИИ..........................................................................................139

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................140

5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

вмд возрастная макулярная дегенерация

ГА глазная артерия

ДЗН диск зрительного нерва

ДР диабетическая ретинопатия

ЗДЦА задние длинные цилиарные артерии

ИД импульсная допплерография

Кг глиальный индекс

ПДР пролиферативная диабетическая ретинопатия

РН ретинопатия недоношенных

РЭРГ ритмическая электроретинограмма

СД сахарный диабет

ФАГ флюоресцентная ангиография

ХНВ хориоидальная неоваскуляризация

ЦАС центральная артерия сетчатки

ЦВС центральная вена сетчатки

цдк цветовое допплеровское картирование

эк эндотелиальные клетки

ЭРГ электроретинограмма

ЭФИ электрофизиологические исследования

RI индекс резистентности

Vdiast диастолическая скорость кровотока

Vsyst систолическая скорость кровотока

VEGF сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth

factor)

ВВЕДЕНИЕ

Ангиогенез — это фундаментальный биологический процесс регуляции системы кровообращения, характерный для живых организмов. В норме физиологический ангиогенез выполняет полезную защитную функцию, играет важную роль в развитии, нормальном росте ткани и заживлении ран [2]. В здоровом организме существует баланс между активаторами и ингибиторами роста новых кровеносных сосудов. При многих заболеваниях теряется контроль над поддержанием этого равновесия и может возникать устойчивый и нерегулируемый патологический ангиогенез [16,23,26,28,38,41,46,52,63,81,118,192,232].

Обсуждение роли ангиогенеза в офтальмологии связано с многообразием состояний, которые сопровождаются возникновением новообразованных сосудов. Наиболее значимым среди них - является диабетическая ретинопатия (ДР) - глазное осложнение сахарного диабета (СД) и основная причина слепоты и слабовидения у лиц трудоспособного возраста [4,137,138,225]. Учитывая огромную медико-социальную значимость этой проблемы, актуальным представляется комплексное изучение изменений глаза, возникающих при СД. Изучение особенностей электрогенеза и глазного кровотока на начальных этапах развития СД, без клинических признаков поражения глазного яблока или с начальными клиническими изменениями, позволит получить дополнительные сведения о механизмах развития ДР.

Несмотря на интенсивные научные поиски в изучении патогенеза заболеваний, сопровождающихся развитием новообразованных сосудов, многие вопросы остаются до конца неизученными. Важным методом изучения сложных механизмов развития патологических процессов является биологическое моделирование. К настоящему времени предложено множество вариантов моделирования глазной неоваскуляризации на животных, однако каждый из них имеет свои достоинства и недостатки, что обусловливает создание новых, более совершенных моделей

[55,99,101,215,241]. Учитывая анатомическое сходство строения глаза крысы и человека, наиболее перспективным является моделирование сосудистых процессов на крысах. Таким образом, создание простой, надежной и удобной экспериментальной модели глазной неоваскуляризации на крысах является актуальной задачей, решение которой послужит оценке новых методов лечения, а также подбору доз и способов введения препаратов.

Механизм развития патологического ангиогенеза сложен и многообразен. Фундаментальные работы последних лет доказали ведущую роль эндотелиального сосудистого фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF) в качестве стимулятора ангиогенеза в глазу и в организме в целом [37,105,241]. Это обосновывает возможность изучения индукции роста новообразованных сосудов в глазу с помощью местного введения VEGF, открывает новые возможности в изучении патологического ангиогенеза и влияния на этот процесс.

Успех последних лет в лечении заболеваний, сопровождающихся развитием неоваскуляризации, связан с применением VEGF-направленных препаратов [126,211,235]. Однако, по мере открытия и изучения ростовых факторов, способствующих появлению новообразованных сосудов, формировалась концепция существования в тканях, в том числе и в глазу, их антагонистов [82,108].

Одним из специфических эндогенных ингибиторов ангиогенеза, действующих на пролиферирующие эндотелиальные клетки сосудов, является ангиостатин [65,135,142,143]. В литературе имеются единичные экспериментальные работы, посвященные изучению влияния ангиостатина на пролиферативный процесс [11,57]. В связи с этим представляет интерес дальнейшее изучение влияия ангиостатина на новообразованные сосуды глаза.

Цель исследования

Разработать и изучить модели глазной неоваскуляризации, оценить

влияние ангиостатина на патологический ангиогенез, используя комплекс

инструментальных и морфофункциональных исследований.

Задачи исследования

1. Изучить морфофункциональное состояние сетчатки и ангиоархитектонику глаза и орбиты у здоровых крыс. Создать нормативную экспериментальную базу электрофизиологических и гемодинамических показателей.

2. Изучить особенности изменений морфофункционального состояния сетчатки и кровообращения у крыс со стрептозотоциновым диабетом (1 год наблюдения).

3. Разработать модели УЕОБ индуцированной глазной неоваскуляризации на крысах (здоровых и со стрептозотоциновым сахарным диабетом).

4. На основании инструментальных и морфофункциональных исследований провести сравнительный анализ разработанных моделей и оценить развитие глазной неоваскуляризации.

5. Изучить влияние ангиостатина на новообразованные сосуды в разработанной модели УЕвР индуцированной глазной неоваскуляризации.

Научная новизна работы

1. Впервые на основании комплекса инструментальных и морфофункциональных исследований получены дополнительные данные о строении, функциональной активности сетчатки и кровообращении глаза и орбиты у здоровых крыс. Разработана прижизненная схема кровоснабжения глаза и орбиты крысы с использованием современных ультразвуковых допплеровских методов исследования.

2. Впервые на основании комплекса инструментальных и морфофункциональных исследований изучены особенности ранних

доклинических изменений функциональной активности сетчатки и регионарного кровотока при экспериментальном СД (1 год наблюдения). Установлено достоверное снижение показателей скорости кровотока в сосудах глаза и нарушение глио-нейрональных взаимодействий в сетчатке через 4-6 месяцев СД. Патогистологическое исследование выявило начальные нейродегенеративные изменения на фоне васкулопатии через 12 месяцев наблюдения.

3. Разработан способ моделирования неоваскуляризации глаза с помощью интравитреального введения УЕСР, обеспечивающий получение стойкого выраженного неоваскулярного ответа в короткий срок (до 7 суток). Положительное решение о выдачи патента РФ от 19.02.2013 по заявке №2012110780.

4. Впервые на модели УЕвР индуцированной неоваскуляризации у крыс установлено и морфологически подтверждено, что ангиостатин (плазминоген крингл 1-4,5) тормозит рост новообразованных сосудов и оказывает влияние на глазной ангиогенез.

Практическая значимость

1. Полученные данные о строении, функциональной активности сетчатки и кровообращении глаза и орбиты свидетельствуют о перспективности использования крысиной модели в экспериментальной офтальмологии.

2. Разработанная схема кровоснабжения глаза и орбиты крысы может быть использована в экспериментальной практике для оценки влияния лекарственных препаратов на регионарную гемодинамику.

3. Разработанная модель глазной неоваскуляризации с помощью однократного интравитреального введения УЕвР в дозе 3,5 мкг крысам позволит изучать механизмы действия новых терапевтических агентов и оценивать их эффективность в лечении состояний, сопровождающихся развитием неоваскуляризации.

4. Установленная эффективность ангиостатина в качестве средства, тормозящего патологический ангиогенез, является основанием для изучения возможности его использования в создании нового антиангиогенного лекарственного средства.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Изучена морфофункциональная характеристика глаз здоровых крыс, создана нормативная база электрофизиологических и гемодинамических показателей. На основании ультразвуковых допплеровских методов разработана схема кровоснабжения глаза и орбиты крысы.

2. Установлены ранние нарушения ретинальной функции и регионарного кровотока при экспериментальном СД, предшествующие развитию ДР.

3. На основании серии экспериментов определена оптимальная методика моделирования УЕСБ индуцированной ретинопатии у крыс, которая заключается в однократном интравитреальном введении 3,5 мкг рекомбинантного УЕвР и позволяет получить развитие стойкой выраженной неоваскуляризации в короткий срок (до 7 суток).

4. На модели УЕОБ индуцированной глазной неоваскуляризации у крыс патогистологически доказано, что ангиостатин тормозит развитие патологического ангиогенеза.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «IV Российский общенациональный офтальмологический форум» (Москва, 2011), 11-ой конференции Европейского общества ретинологов «Еигогейпа 2011», 12-ой конференции Европейского общества ретинологов «Еигогейпа 2012», XI научно - практической конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии - 2013» (Москва, 2013), межотделенческой конференции МНИИ ГБ им. Гельмгольца (Москва, 2013).

11

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 в печатных изданиях, рекомендованных ВАК. Положительное решение о выдачи патента на изобретение по заявке № 2012110780 от 19.02.2013 «Способ моделирования неоваскуляризации переднего отдела глаза у крыс».

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов, результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 66 рисунков. Указатель литературы включает 258 источников, из них 56 отечественных и 202 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ангиогенез в норме и патологии. Заболевания, сопровождающиеся развитием глазной неоваскуляризации

Ангиогенез - один из самых распространенных биологических процессов, характерных для живых организмов. Под ангиогенезом понимается образование новых сосудов из предшествующей васкулярной сети [77,181]. В более широком смысле данный термин включает как раскрытие предшествующих коллатералей, так и «прорастание» новых сосудов (неоангиогенез). Ангиогенез это фундаментальный процесс регуляции системы кровообращения. Ангиогенез наиболее активен в фетальном периоде, в то время как у взрослых интенсивность роста сосудистых клеток низкая. Физиологический ангиогенез является неотъемлемой частью репаративных процессов в нормальных органах и тканях [2]. При многих патологических состояниях наблюдается активизация развития кровеносных сосудов, что может рассматриваться как компенсаторная реакция, направленная на изменение условий кровообращения. В здоровом организме существует баланс между активаторами и ингибиторами роста новых кровеносных сосудов [14,76,113]. При многих заболеваниях теряется контроль над поддержанием этого равновесия и может возникать устойчивый и нерегулируемый патологический ангиогенез [16,23,26,27,28,38,41,44,46,52,58,63,69,81,118,192, 232,257].

Обсуждение роли ангиогенеза в офтальмологии связано с многообразием состояний, которые сопровождаются возникновением новообразованных сосудов. Это делает актуальным изучение причин, приводящих к развитию патологического ангиогенеза, а также возможностей влияния на эти процессы.

Формирование патологических новообразованных сосудов наблюдается при различных заболеваниях переднего и заднего отделов глаза. Самыми

распространенными из них являются пролиферативная диабетическая ретинопатия (ПДР), «влажная» форма возрастной макулярной дегенерации (ВМД), ретинопатия недоношенных (РН), окклюзия сосудов сетчатки, неоваскуляризация роговицы. Прогрессирующее развитие патологического ангиогенеза может приводить к тяжелым осложнениям и, как следствие этого, необратимому снижению зрения и развитию инвалидности у людей различных возрастных групп.

ДР является специфичным сосудистым осложнением СД. ДР - основная причина слепоты и слабовидения у лиц трудоспособного возраста в индустриально развитых странах [4,137,138,225]. Слепота у больных сахарным диабетом наступает в 25 раз чаще, че