Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Исследование механизмов противоаритмического действия кватернидина

На правах рукописи

АГЕНОСОВА ОЛЬГА ГЕННАДЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ПРОТИВОАРИТМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ КВАТЕРНИДИНА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

I

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Купавна 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева"

Научный руководитель: Научный консультант: Официальные оппоненты:

кандидат медицинских наук Д.С. Блинов

доктор биологических наук, профессор В.П. Балашов

доктор биологических наук профессор Н.М. Митрохин

доктор медицинских наук профессор А.Г. Муляр

Ведущая организация: ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В.Закусова

Защита состоится « »_2005 года в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д 217.004.01 ВНЦ БАВ (142450, Московская обл., пос. Старая Купавна, ул. Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦ БАВ

Автореферат разослан « »_2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор

JI.B. Корольченко

мм™

4ShOê

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Как свидетельствуют многочисленные отечественные и зарубежные исследования перспективным методом создания новых антиаритмических препаратов с уникальными фармакологическими свойствами является модификация аймалина, орнида, лидокаина, триме-каина, пропранолола, полученные путем кватернизации активного азота (Костин Я.В. и соавт., 1987; Костин Я.В., 1989; Балашов В.П. и соавт., 1990; 2005; Костин Я.В., и соавт. 1991; Белова JI.A., 1993; Кузнецова В.А., 1993; Каверина Н.В. и соавт., 1996; 2003; Моисеева И.Я., 2000; Костин Я.В. и соавт., 2003; Моисеева И.Я. и соавт., 2003; Блинов Д.С., Костин Я.В., 2003; Блинов Д.С. и соавт., 2004; Ryden L. et al., 1974; Patterson E. et al., 1988; Von Bogaert P.P. 1992; AI Rasheed N.M. et al., 2001).

Особый интерес представляют результаты изучения 37 четвертичных производных тримекаина с различными алифатическими и гетероциклическими радикалами (Гренадер А.К., 1987; Костин Я.В., 1989; Ильясов Ф.Э., 1989; Балашов В.П. и соавт., 1990; Котляров A.A., 1995; Артемьева О.В., 1998; Моисеева И.Я., 2000; Костин Я.В. и соавт., 2003; Моисеева И.Я. и соавт., 2003), результатом которых стало создание нового отечественного ан-тиаритмика - кватернидина (Офицерова С.И., 1997; Сернов Л.Н. и соавт., 1998, 2004; Шмырева М.В., 1999; Моисеева И.Я., 2000; Моисеева И.Я. и соавт., 2003). Кватернидин обладает высокой активностью в отношении вен-трикулярных аритмий, в том числе, предупреждает фибрилляцию желудочков при острой ишемии миокарда. Препарат практически лишен побочных эффектов. Полный антиаритмический эффект кватернидина продолжается 912 часов после однократного внутривенного введения. Анализ данных литературы, посвященных фармакологии кватернидина свидетельствует, что традиционно данный препарат рассматривается как представитель III класса по систематике E. Vaughan Williams (1984). Однако в публикациях отсутствуют убедительные доказательства этой гипотезы. Все это, на наш взгляд, требует уточнения механизмов реализации противоаритмического эффекта кватернидина.

Цель работы; целью настоящей работы явилось выявление мембранных механизмов противоаритмического действия кватернидина и уточнение его систематической принадлежности.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с научной темой курса медицинской биологии ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» «Фармакологическая коррекция стрессорных и ише-мических повреждений органов и систем» (номер государственной регистрации 01200104129).

Задачи исследования. В соответствии с поставленной целью при выполнении данной работы предполагалось решение следующих задач:

1. Исследование влияния кватернидина на электрофизиологические параметры интактного и ишемизированного 11 illiiii пинки ni" Hillplit прпгр или ной электрической стимуляции. I ^нццщ^*** j

1 ' - »Vtem

2. Исследование противоаритмического действия кватернидина на экспериментальных моделях суправентрикулярных аритмий.

3. Исследование влияния кватернидина на характеристики потенциала действия кардиомиоцитов папиллярной мышцы крысы и проводимость по-тенциалозависимых калиевых каналов нейронов большого прудовика

4. Изучение влияния кватернидина на некоторые первичные звенья ишемического аритмогенеза.

Научная новизна. На основании проведенного комплексного фармакологического исследования показано, что препарат не может быть отнесен к представителям III класса антиаритмиков по систематике Е. Vaughan-Wil-liams (1984). Установлено, что кватернидин при внутривенном введении кошкам снижает возбудимость интактных желудочков, увеличивает продолжительность эффективного рефрактерного периода желудочков, не угнетает процесс проведения импульса по проводящей системе сердца. Показано, что в ишемизированном сердце препарат устраняет вызванные гипоксией негативные электрофизиологические сдвиги. Установлены способность кватернидина купировать аконитиновую фибрилляцию предсердий и отсутствие активности по предотвращению ацетилхолиновой предсердной аритмии. Впервые показано, что кватернидин не влияет на патогенетические первичные звенья ишемического аритмогенеза. В процессе проведения электрофизиологических исследований in vivo впервые показано, что кватернидин снижает амплитуду потенциала действия кардиомиоцитов папиллярной мышцы крысы без изменения его длительности; не угнетает ионного проведения по калиевым каналам задержанного выпрямления нейронов изолированного глоточного кольца большого прудовика и по механизму действия приближается к представителям I класса по классификации Е. Vaughan-Williams (1984).

Практическая ценность работы. Результаты фармакологического исследования кватернидина способствуют расширению представлений о фар-макодинамике препарата, позволят оптимизировать фармакотерапию аритмий за счет уточнения показаний и противопоказаний к назначению препарата, в частности, следует исключить из показаний суправентрикулярные нарушения ритма и назначать кватернидин для лечения больных с желудочковыми аритмиями. Результаты исследования внедрены В' учебный и научно-исследовательский процесс кафедр фармакологии и цитологии, гистологии, эмбриологии.

Апробация работы. Результаты исследований, представленные в диссертации докладывались на XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), 59-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2004), ежегодных Огаревских чтениях (научной конференции Мордовского госуниверситета, Саранск, 2003-2005), конференциях молодых ученых Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2003-2004).

Публикации.' ! lo 'теме'диссертации опубликованы 6 работ.

S mí f«".*** \

\ > J

4 WÍ 2

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, четырех глав, в которых изложены результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Работа изложена на 99 станицах машинописного текста, иллюстрирована двенадцатью рисунками и восемнадцатью таблицами. Библиографический список содержит 166 источников, в том числе 77 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на половозрелых кошках обоего пола (п=97). Все манипуляции, сопровождающиеся болью, в обязательном порядке проводили под наркозом. В качестве наркотизирующего средства использовался тиопен-тал-натрий в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно.

Предметом исследования явилось четвертичное производное тримекаина -кватернидин - [М-аллил-Ы-(2,4,6-триметилфениламинокарбо-нилметил) морфо-линий бромид]. В работе использовали субстанцию кватернидина, синтезированную во Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ) в лаборатории химии и технологии лекарственных средств под руководством профессора С.Я. Скачиловой. Структурная формула исследуемого соединения представлена на рисунке 1.

Н—С—СН - N. Вг

Рис. 1. Структурная формула кватернидина

В качестве препаратов сравнения использовали: тримекаин - а- Диэти-ламино-2,4,6-триметилацетанилид гидрохлорид, являющийся структурным предшественником кватернидина. В работе использовали субстанцию тримекаина гидрохлорида (Анжеро-Судженский фармацевтический завод, Россия), четвертичное производное аймалина - N-пропилаймалинбромид, (субстанция, Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия); и лидокаин (2-диэтиламино-2',6'-ацетоксилида гидрохлорид) - использовали официналь-ный 2% раствор в ампулах по 2 мл.

Электрофизиологические исследования у кошек выполняли по методике A.A. Котлярова (2000) в режимах парной и учащающей стимуляции. Оценивали автоматию синусового узла, проводимость по предсердиям, ат-риовентрикулярному узлу и желудочкам, эффективный рефрактерный пери-

од предсердий, атриовентрикулярного узла и желудочков, порог возбуждения предсердий и желудочков.

Для изучения противоаритмической активности кватернидина были использованы модели ацетилхолиновой (Scherf, Chick 1951), а также Schallek (1952) и аконитиновой (Me Leod, Reunolds, 1962) аритмий у кошек.

Изучение влияния исследуемых соединений in vitro на скорость деполяризации переднего фронта потенциала действия (УШ1), амплитуду потенциала действия, длительность потенциала действия выполняли на папиллярных мышцах, выделенных из правого желудочка сердца крыс (п=35) методом «плавающего электрода» (Cohen et al., 1984). Папиллярные мышцы помещали в камеру, сделанную по типу «камерного метода стимуляции» (Kamiyama, Matsuda, 1966).

Изучение изменения калиевого проведения регистрировали с помощью точечной фиксации потенциала (ПЭТЧ-метод) на одиночных калиевых каналах замедленного выпрямления, выделенных из изолированных нейронов (п=5) окологлоточного кольца большого прудовика (Sakman et Neer, 1987).

Влияние кватернидина на содержание катехоламинов в миокарде оценивали флюорометрически по методу по У. Эшлера и Ф. Лишайко в модификации Э.Ш. Матлиной и В.В. Меньшикова. (1967).

Определение влияния кватернидина на интенсивность перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему миокарда кошек с экспериментальным инфарктом проводили методом индуцированной хемилюминес-ценции (Владимиров Ю.А. и соавт., 1992).

Результаты проведенных исследований обрабатывали методами вариационной статистики (Беленький M.JL, 1963; Сернов JI.H., Гацура В.В., 2000). Для каждого вариационного ряда вычисляли среднюю арифметическую и стандартную ошибку. Достоверность различий оценивали с помощью параметрического критерия t Стьюдента и непараметрического критерия «%2».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение электрофизиологических параметров миокарда кошек in vivo методом программной стимуляции миокарда проводили с целью первичной фармакологической оценки влияния препарата на функции проводимости, возбудимости, автоматии, рефрактерности различных отделов сердца. Кватерни-дин вводили внутривенно (4 мг/кг) - максимальной терапевтической дозе, в которой препарат оказывает выраженное и продолжительное противоаритмиче-ское действие на моделях желудочковых аритмий различного генеза. Препарат увеличивал порог возбуждения предсердий и желудочков. У него не было отмечено негативного влияния на автоматик) водителя сердечного ритма - препарат не удлинял времени восстановления функции синусового узла. Проведение волны возбуждения по предсердиям, атриовентрикулярному соединению и желудочкам (длительность Р, PQ, QRS на ЭКГ) не изменялось. Изучаемое производное тримекаина не удлиняло продолжительность эффективного рефрактерного периода АВ-узла, но несколько удлинял рефрактерность миокарда левого предсердия и левого желудочка (табл. 1.).

Таблица 1.

Динамика электрофизиологических параметров сердца кошек при введении __кватернидина___

Регистрируемые параметры Время наблюдения, мин Контроль М±ш Лидокаин М±т Кватернндин М±т

Порог возбуждения левого предсердия, % 1-5 100 *130±11 -

10-20 100 105+3 115±5

30-40 100 97±5 **117±6

50-60 94±4 97±5 **124±17

Порог возбуждения левого желудочка, % 1-5 100 *125±7 -

10-20 110±7 115±5 105±5

30-40 112±5 100 **129±7

50-60 112+4 100 **130±8

Интервал Р, % 1-5 , 100 100 -

10-20 100 100 100

30-40 100 100 100

50-60 100 100 100

Интервал Р(2, % 1-5 100 112+10 -

10-20 102±2 100 108±5

30-40 100 100 109±4

50-60 102±2 100 108±2

Интервал 01*8, % 1-5 100 100 -

10-20 103+3 109±8 110±6

30-40 103±3 109+8 113±9

50-60 103±3 109+8 109±4

Интервал РР, % 1-5 100 111±10 -

10-20 111 ±7 128+13 106+6

30-40 121±5 120±8 117+5

50-60 127±7 127±7 123+4

Время восстановления функций синусого узла, % 1-5 100 107±8 -

10-20 112±3 111±7 111+7

30-40 123±4 117+10 128+9

50-60 129±7 133+8 130±9

Эффективный рефрактерный период предсердий, % 1-5 100 100 -

10-20 102+3 105+3 104±2

30-40 107+3 105+3 113+3

50-60 106±3 108+7 121±6*

Эффективный рефрактерный период атриовентри- кулярного узла, % 1-5 100 105±7 -

10-20 108+3 112+6 105+3

30-40 114+6 116±9 111±4

50-60 119±6 128±13 126±5

Эффективный рефрактерный период желудочков, % 1-5 100 126±2* -

10-20 103+5 110+5 120+5*

30-40 108+5 118+10 127+5*

50-60 114+7 112+6 130±6*

Примечания: * - различия достоверны при сравнении с контролем при р<0,05; ** - различия достоверны при сравнении с контрольными значениями и лидокаином при р<0,05;" - различия при сравнении с лидокаином достоверны при р<0,05

При этом следует отметить, что при сравнении с лидокаином, вводимым в дозе 10 мг/кг (высшая терапевтическая доза, равная 5% от 1Л55о, опре-

деленного для мышей при внутрибрюшинном введении), вектор изменений изучаемых показателей у кватернидина был коллинеарным и сонаправлен-ным. Обращает на себя внимание различие во времени возникновения эффекта и его продолжительности: лидокаин модифицировал электрофизиологические параметры миокарда кратковременно - в течение 10-20 минут после внутривенного введения, при введении кватернидина динамика рефрактерно-сти и возбудимости, как правило, начиналась не сразу, а через 10-20 минут после инъекции, достигая максимума к завершению часового наблюдения. Полученные фармакологические феномены могут быть объяснены фармако-кинетическими особенностями препаратов.

Поскольку в многочисленных клинических и экспериментальных исследованиях подчеркивается наибольшая антиаритмическая эффективность кватернидина при ишемических желудочковых нарушениях сердечного ритма, мы посчитали необходимым провести определение электрофизиологических параметров при введении кватернидина животным с развивающимся острым коронарным синдромом. Результаты опытов систематизированы в табл. 2.

Установлено, что кватернидин предотвращает развитие ишемически-опосредованной тахикардии. Препарат не изменяет предсердное проведение, восстанавливает проводимость по желудочкам и проявляет тенденцию к увеличению атриовентрикулярной задержки электрического импульса. Рефрак-терность левых предсердия и желудочка на фоне кватернидина также увеличивается. При этом показатели достоверно отличаются от значений контроля с ишемией, но не превышают значений контрольной группы на интактных кошках. Кватернидин снижает возбудимость левого предсердия через 20 мин после введения и левого желудочка на всем протяжении опыта. Причем для препарата свойственна способность к большей батмодепрессии в условиях ишемической альтерации левого желудочка, чем при введении интактным животным. Необходимо подчеркнуть, что увеличение рефрактерности, в частности, в клетках миокарда левого желудочка теоретически может объясняться как удлинением фазы деполяризации (фаза 3) потенциала действия, так и снижением крутизны его переднего фронта (фаза 0).

При реализации первого механизма значительный рост рефрактерное™ должен сопровождаться и значительным удлинением потенциала действия вследствие блокады быстрой компоненты выхода калия через каналы задержанного выпрямления в фазу 3 потенциала действия. Во втором случае - потенциал действия удлиняться не будет, поскольку увеличение рефрактерно-сти не столь велико и происходит вследствие блокады быстрого входящего натриевого тока. Анализ суммарных данных по электрофизиологическому исследованию с большой долей вероятности позволяет предположить, что увеличение рефрактерное™ кватернидином развивается по второму варианту. В частности это подтверждается и тем, что препарат не удлиняет интервал QT на ЭКГ. Поэтому кватернидин не может быть отнесен к III классу ан-тиаритмиков.

Таблица 2

Динамика электрофизиологических параметров сердца кошек с острой ишемией миокарда при введении кватернидина

Регистрируемые параметры Время, мин Контроль М±ш ОКА М±ш Кватернидин М±ш

Порог возбуждения предсердия, % 10-20 100±0 98±2 116±11

30-40 100±0 98±2 6150±31*а

50-60 94±4 99±2 б158±32*а

Порог возбуждения желудочка, % 10-20 юо±о °93±2* ь123±16*а

30-40 100±0 "93±3* 6118±12*а

50-60 100±0 97±4 °128±12*а

Интервал РР, % 10-20 111±7 117±2* 105±6

30-40 121±5* **108±1* 120±7*

50-60 127±7* 107±2* а123±8*

Время восстановления функций синусового узла, % 10-20 112±3* 114±3* 105±13

30-40 123±4* **108±3* 116±5*

50-60 129±7* **108±7 111±7

Интервал Р, % 10-20 100 98±3 108±6

30-40 100 95±5 111±8

50-60 100 95±5 111+8

Интервал РС2, % 10-20 102+2 107±4 111±7

30-40 100 104±2 **113±7*

50-60 102±2 100 113±7*

Интервал ОИв, % 10-20 103±3 94±3 100

30-40 103±3 94±3 100

50-60 103±3 **88±2* 100"

Эффективный рефрактерный период предсердия, % 10-20 102±3 "72±3* 6121±5*а

30-40 107±3 "78+2* 119±6*а

50-60 106±3 680±1* 5121±6*а

Эффективный рефрактерный период атриовентрикуляр-ного узла, % 10-20 108±7 97±7 106±3

30-40 114±6* 101±6 111±3*

50-60 119±6* "89±16 119±2*а

Эффективный рефрактерный период желудочка, % 10-20 103+5 "87±5* 109±5"

30-40 108±5 °79±4* 106±8"

50-60 114±7 "85±9* 117±5*а

Примечание. * - отличие от исходных значений достоверно при р<0,05; ** - отличие от контроля достоверно при р<0,05; * - отличие от ОКА достоверно при р<0,05; 8 - отличие от кватернидина достоверно при р<0,05

Кроме того, в силу отсутствия у него негативного действия на синоат-риапьное и атриовентрикулярное соединения, препарат, очевидно, не может рассматриваться и как представитель II и IV классов. Совокупность получен-

ных нами данных позволяет осуществлять дальнейшую логику диссертационного исследования исходя из предварительной идеи о принадлежности кватернидина не к антиаритмикам III класса, а к противоаритмическим средствам I класса, наиболее вероятно - к В подклассу (табл. 3.).

Таблица 3.

Влияние кватернидина на основные электрофизиологические характеристики сердца

Класс анти-аритмиков Возбудимость миокарда желудочков Проводимость Автома-тия синусового узла Рефрак-терность желудочков Эффективны при аритмиях

IA 1 11 1 TT Предсердных и желудоч ковых ишемических и не ишемических

IB «-> <—► т Ишемических желудочковых, аконити-новой, строфантиновой

кватерни-дин 1 Tt Ишемических, желудочковых, строфантиновых, аконитиновых

1С и 14 1 TT Предсердных и желудочковых, в т.ч. ишемических

II (Р-блокаторы) 1 1 11 т Предсердных, узловых, и ишемических желудочковых

III *—* 4-* «—► TT Предсердных и желудочковых, в т.ч. ишемических

IV (антикальциевые) 1 11 t (в СУ и AB узлах TT) Предсердных и узловых, в т.ч. ишемических

На следующем этапе нашего исследования определена антиаритмическая активность кватернидина при предсердных аритмиях. При изучении антиаритмической активности кватернидина были использованы две модели воспроизведения фибрилляции предсердий - ацетилхолиновая и аконитино-вая. Проведение данного раздела работы, несмотря на имеющиеся многочисленные исследования по спектру противоаритмической активности кватернидина, осуществлено в рамках выдвинутой нами предварительной гипотезы и продиктовано, с одной стороны, возможностью косвенного суждения о наличии антихолинергического или натрий-блокирующего компонента в механизме действия препарата, с другой - необходимостью подтверждения или исключения активности кватернидина в отношении предсердных нарушений сердечного ритма.

На ацетилхолиновой модели в первой серии опытов, антиаритмик титровали со скоростью 0,05 мг/кг в минуту. Трепетание предсердий устраня-

лось на фоне действия препарата в среднем через 3,85±0,79 минут. Различия между продолжительностью предсердной аритмии в контроле (7,36±1,44 минут) и на фоне действия кватернидина были статистически недостоверны (рис. 2.). Во второй серии опытов препарат вводили кошкам со скоростью 1,6 мг/кг в минуту. Кватернидин не укорачивал продолжительность ацетилхоли-новых предсердных нарушений ритма. Напротив, длительность трепетания предсердий в присутствии кватернидина в среднем увеличивалась до 10,20±1,69 минут против 7,36±1,44 минут в контроле.

Н--Н rt

_

12

мин

Рис. 2. - Противоаритмическая активность кватернидина при суправентрику-лярных аритмиях, вызванных аппликацией ацетилхолина: А - кватернидин 1,6 мг/кг; Б - кватернидин 0,05 мг/кг; В - контроль.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о неэффективности кватернидина на модели ацетилхолинового трепетания предсердий у кошек. Данный экспериментальный факт хорошо согласуется с высказанными нами сомнениями о принадлежности кватернидина к противоарит-мическим средствам III класса.

На аконитиновой модели фибрилляции предсердий в качестве препарата сравнения использовали лидокаин. При этом противоаритмическое действие лидокаина характеризовалось чрезвычайной кратковременностью: после его накопления в среднем в дозе 5 мг/кг ритм восстанавливался у всех животных, однако максимально до 6,1 минуты. Дальнейшее увеличение дозы препарата не приводило к удлинению терапевтического эффекта. Противоаритмическая активность кватернидина изучена на 7 животных. Препарат вводили со скоростью 0,25 мг/кг/мин до восстановления синусового ритма,

которого добились в 100% случаев в то время, когда введенная доза составляла 4,0±0,6 мг/кг (рис. 3.).

кватернидин

лидокаин

о

1

2

3

4 мг/кг

Рис. 3 Противоаритмическая эффективная доза кватернидина и лидокаина при трепетании предсердий, вызванном аппликацией нитрата аконитина

Очевидно, что полученные результаты позволяют с большой уверенностью предполагать присутствие в механизме действия у кватернидина способности блокировать натриевый ток через мембрану кардиомиоцитов. Однако установленная эффективность препарата на аконитиновой модели аритмий, совершенно не доказывает наличие у кватернидина активности в отношении предсердных аритмий в клинике, имеющих более сложный механизм возникновения.

Поскольку определение систематической принадлежности препарата невозможно без изучения его влияния на характеристики потенциала действия, в рамках электрофизиологических исследований in vitro на желудочковом миокарде крыс исследовали влияние кватернидина на характеристики потенциала действия (табл. 4.). Существенное значение для проявления про-тивоарит-мического действия антиаритмиков III класса имеет их способность увели-чивать длительность потенциала действия. В связи с этим, мы регист-ри-ровали возникающие под влиянием кватернидина изменения длительности потенциала действия на уровне 80% реполяризации (ДПД80). Кроме того, изучили изменения амплитуды потенциала действия (АПД) и скорости деполяризации его переднего фронта (Vmax). Кватернидин исследовали в двух сериях экспериментов в дозах 5 и 10 мг/л. В качестве препаратов сравнения использовали тримекаин (не удлиняющий потенциал действия) и N-пропилаймалин бромид (удлиняющий потенциал действия).

Тримекаин в зависимости от дозы оказывал угнетающее влияние на параметры потенциала действия, являющиеся функцией быстрого натриевого тока - отмечалось статистически достоверное снижение крутизны нарастания переднего фронта и АПД без изменения других регистрируемых параметров. Как и в других исследованиях (Сосунов Е.А. и соавт., 1985; Балашов В.П.и соавт., 1990), мы не отмечали увеличения длительности ПД клеток желудочкового миокарда.

Таблица 4

Влияние кватернидина на параметры потенциала действия папиллярной мышцы правого желудочка сердца крысы при ____частоте стимуляции 3 Гц__

АПД ^тах ДПД50

Препарат Доза, мг/л п Исходные значения, мВ После воздействия, мВ Изменение в % Исходные значения, В/с После воздействия, В/с Изменение в% Исходные значения, мс После воздействия, мс Изменение в %

ШАБ 1,0 6 103±1,4 90±1,0* - 12 120±1,б 63±1,9* -47 21±1,0 30±1,5* +39

1ЧПАБ 0,5 5 101±1,9 93±2,1* -8 122±4,2 83±4,1* -32 24±3,4 31±3,3 +29

Тримекаин 5,0 10 100±2,1 95±2,3* -6 116±4,9 89±6,9* -23 23±2 23±2 0

Тримекаин 2,5 4 106±0,7 103±1,1 -3 124±4,9 103±7,8* -17 22±1 22±1 -2

КватериндннА 10,0 5 104±2 94 ±2* -10 124±2 68±6* -45 88±10 86±9 -2

КватернидинА 5,0 5 104±2 102±1 -2 124±2 102±5* -18 88±10 8б±17 -2

Примечание: "-изменения достоверны при р<0,05; -длительность ПД измерена на уровне 80% реполяризации.

Четвертичное производное аймалина - N-пропилаймалин бромид - как и тримекаин в зависимости от дозы уменьшал амплитуду потенциала действия и замедлял скорость быстрой деполяризации ПД. Особенностью фармакоди-намики NIIAB является его способность увеличивать длительность электрического спайка на уровне 50% реполяризации в концентрации 1,0 мг/л. Такой эффект описан в литературе ранее (Балашов В.П. соавт. 1990). Удлинение ПД в среднем составляет 39%.

Кватернидин, как и предполагалось, проявил свойства противоаритми-ческих средств 1 класса. Препарат заметно угнетал скорость нарастания переднего фронта ПД и (в дозе 10,0 мг/л) его амплитуду. Длительность потенциала действия, измеренная на уровне 80% реполяризации, не подвергалась статистически достоверным изменениям в присутствии препарата. Комплекс полученных данных, свидетельствует о том, что кватернидин ни в одной из исследуемых концентраций не увеличивает продолжительность потенциала действия миокарда правого желудочка сердца крыс. Напротив, в исследуемом диапазоне доз, препарат весьма эффективно уменьшает скорость быстрой деполяризации потенциала действия. Полученные данные подтверждают высказанное нами ранее предположение, что четвертичное производное три-мекаина - кватернидин - не может быть отнесен к представителям III класса противоаритмических средств и, скорее всего, принадлежит к одному из подклассов 1 группы антиаритмиков (V.-Williams, 1984).

Для окончательного решения цели диссертационного исследования мы совместно с М.Е. Асташевым провели серию экспериментов по регистрации токов через изолированные калиевые каналы нейронов из окологлоточного кольца ганглиев большого прудовика в лаборатории электрофизиологии Института биофизики клетки РАН (руководитель - зам. директора Института, доктор физ.-мат. наук В.Н. Казаченко). Результаты прямых измерений калиевого тока позволяют однозначно ответить на вопрос о характере влияния кватернидина на данный механизм купирования сердечных аритмий.

Результаты экспериментов показали, что кватернидин не оказывает влияния на проводимость калиевых каналов задержанного выпрямления при его применении, как с внутренней, так и с наружной стороны клеточной мембраны в концентрациях вплоть до 10 4 М. В частности, на рисунке 4 представлены записи токов через клеточную мембрану нейрона прудовика (эксперимент на целой клетке, конфигурация «whole-cell», п=5) при приложении к мембране ступеньки напряжения от -70 мВ до 80 мВ с шагом 10 мВ длительностью 0,25 с (потенциал покоя клетки - 70 мВ). Видно, что добавление 100 мкМоль/л кватернидина не приводит к блокаде калиевых токов, протекающих через потенциалзависимые калиевые каналы задержанного выпрямления. Отмечается лишь небольшое уменьшение токов (порядка 15% для потенциала 80 мВ), что, скорее всего, вызвано временным ухудшением состояния клетки или изменением внутриклеточного ионного состава за счет диффузии раствора из пипетки. Данный процесс наблюдался в ходе всего эксперимента и являлся временной тенденцией. При действии препарата в

концентрации 10"4 М/л с внутренней стороны мембраны трансмембранный потенциал во всех случаях был равен 0 мВ. Применение кватернидина (10~8 -10"4 М/л) не оказывает заметного действия на активность каналов.

Протокол опыта: прямоугольные импульсы длительностью 0,25 сек,

80 мВ -----------

-70 мВ

Рис. 4 Запись токов через калиевые каналы нейрона прудовика в конфигурации "whole-cell".

Таким образом, исследование электрофизиологических свойств кватернидина на препаратах желудочкового миокарда белых крыс и изолированных калиевых каналах нейронов пресноводного моллюска надежно подтверждает высказанное ранее предположение о не принадлежности данного антиаритмика к III классу по систематике V.-Williams (1984). На основании проведенных экспериментов можно с высокой степенью вероятности утверждать о правомочности нашей рабочей гипотезы о проявлении препаратом свойств одного из подклассов I группы антиаритмиков.

Анализ публикаций в центральных изданиях (Костин Я.В. и соавт., 2003; Моисеева И.Я. и соавт., 2000, 2003; Сернов JI.H. и соавт., 2004), а также результаты диссертационных исследований (Климович Ю.Г., 1997; Офице-рова С.И., 1997; Шмырева М.В., 1999; Шумкин В.Н., 2000; Моисеева И.Я., 2000; Султанова О.В., 2005), посвященных изучению фармакологии кватер-нидина, свидетельствует о его высокой эффективности при желудочковых аритмиях ишемического генеза. Кроме того, по данным Моисеевой И.Я. (2000), кватернидин обладает определенными противоишемическими свойствами, поскольку в опытах на крысах с экспериментальным инфарктом миокарда уменьшает отношение зоны некроза к зоне ишемии. В связи с этим целью следующего раздела диссертационной работы явилось исследование возможного влияния кватернидина на первичные патогенетические механизмы ишемического аритмогенеза.

Известно, что уменьшение степени ишемической альтерации миокарда может обеспечиваться различными физиологическими и биохимическими механизмами, но одним из наиболее действенных из них является ограничение симпатоадреналовых воздействий. Учитывая данное обстоятельство, мы изучили влияние кватернидина на содержание катехоламинов в миокарде левого желудочка кошек с экспериментальным инфарктом миокарда.

Исследование показало, что у кошек с экспериментальным инфарктом миокарда, в зоне повреждения левого желудочка концентрация адреналина имеет тенденцию к возрастанию с 0,49±0,09 нмоль/г до 0,83±0,23 нмоль/г.

Таблица 5

Содержание катехоламинов в миокарде сердца кошек при экспериментальном инфаркте и действии кватернидина

Катехоламины Объект Условия эксперимента

Контроль нмоль/г Кватернидин, нмоль/г

Адреналин Желудочек, удаленная зона 0,49±0,09 0,41 ±0,06

Адреналин Желудочек, зона ишемии 0,83±0,23 0,44±0,09

Адреналин Предсердие 0,56±0,07 0,30±0,16

Норадреналин Желудочек, удаленная зона 0,56+0,16 0,96±0,14

Норадреналин Желудочек, зона ишемии 1,17±0,14 2,22±0,45*

Норадреналин Предсердие 0,79±0,3б 0,82±0,19

Примечание: * - отличия от строки норадреналин/желудочек удаленная зона достоверны при р<0,05.

Содержание норадреналина в зоне повреждения также стремилось к увеличению. Близкая картина содержания катехоламинов в ишемизирован-

ном миокарде описана и другими авторами (Ольбинская Л.И., Литвицкий П.Ф., 1986; Верещагина B.C. и др., 2002).

Как свидетельствуют полученные данные, кватернидин не оказывает статистически достоверного эффекта на содержание адреналина в неповрежденных и поврежденных участках миокарда кошек с экспериментальным инфарктом и способствует повышению концентрации норадреналина в зоне ишемии. Таким образом, комплекс полученных данных не позволяет утверждать,что механизм противоишемического действия кватернидина реализуется за счет предупреждения накопления адреналина в зоне повреждения.

Утверждение концепции о биологической значимости ПОЛ в формировании ишемической альтерации миокарда является одним из фундаментальных достижений современной молекулярной кардиофармакологии (Кудрин А.Н. и соавт, 1978; Ланкин В.З. и соавт., 1979, 1981, 1982, 2000, 2001, 2004; Биленко М.В., 1989; Гацура В.В., 1996; Сернов Л.Н. и соавт., 1997; Галенко-Ярошевский П.А., Гацура В.В., 2000; Maza S., Frishman W., 1987; Gatsura V., Gukasov V., 1988). Активация ПОЛ при ишемической альтерации миокарда является одним из механизмов возникновения и поддержания аритмической активности в сердце Накопленный к настоящему времени опыт изучения противоаритмических и противоишемических средств убеждает в необходимости исследования у них антиоксидантной активности как компонента реализации патогенетически значимого механизма действия (табл. 6.).

Таблица 6.

Влияние кватернидина (2,0 мг/ кг) на свободнорадикальные процессы и антиоксидаитную систему в различных отделах сердца кошек при _ экспериментальном инфаркте миокарда_

Объект исследования ПОЛ, имп/с АОА, имп/с

контроль кватернидин контроль кватернидин

предсердие 4,98±1,36 5,45±0,99 54,78*21,99 80,88±29,26

желудочек, удаленная зона 3,52+0,94 6,30±1,18 52,64±13,80 81,01±28,84

желудочек, зона ишемии 5,45±0,99 6,80±1,34 49,98+1,36 84,14+26,25

Кватернидин в дозе 2 мг/кг не оказывал статистически достоверного влияния на оксидантную и антиоксидаитную системы ишемизированного миокарда кошек.

Таким образом, механизм противоаритмического действия кватернидина не может быть объяснен его вмешательством в патогенетически первичные звенья аритмогенеза, или замедлением фазы реполяризации ПД. Наиболее значимыми эффектами препарата является его способность угнетать параметры ПД, являющиеся функцией быстрого натриевого тока.

выводы

1 При программной электрической стимуляции сердца интактных кошек кватернидин (2,0 мг/кг), как и лидокаин (10,0 мг/кг), не изменяет функции-ональную активность синоатриального узла, возбудимость, проводимость левого предсердия и желудочка, рефрактерность атриовентрикулярного соединения, но стабильно, в течение 1 часа наблюдения, увеличивает эффективный рефрактерный период желудочков. Рефрактерность предсердий возрастает лишь на поздних сроках эксперимента.

2 В опытах на кошках с экспериментальным инфарктом миокарда кватернидин устраняет негативное действие острой ишемии на функциональные показатели ритма сердечной деятельности: тахикардию, сужение комплекса ОЯЯ, уменьшение эффективных рефрактерных периодов предсердия, атриовентрикулярного узла и желудочка, повышает порог возбуждения миокарда камер сердца.

3. Препарат не эффективен на модели ацетилхолинового трепетания предсердий кошек, но успешно купирует фибрилляцию предсердий у кошек вызванную модификацией быстрых натриевых каналов локальным воздействием нитрата аконитина.

4. Кватернидин (5,0 и 10,0 мг/л) не увеличивает длительность потенциала действия папиллярных мышц сердца крысы, но уменьшает скорость быстрой деполяризации электрического спайка. В концентрациях 10'8- 10"4 М/л кватернидин (при наружном и внутреннем приложении) не изменяет проводимость через одиночные калиевые каналы задержанного выпрямления.

5 Кватернидин не оказывает влияния на адренергический контроль миокарда в зоне ишемии и не проявляет прямых и непрямых антиоксидантных свойств.

б. Кватернидин нельзя отнести к антиаритмическим средствам III класса. Препарат можно систематизировать как антиаритмик I класса, отличающийся от классических представителей группы длительностью терапевтического действия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные расширяют представления о фармакодинамикс кватернидина и позволяют уточнить показания и противопоказания к его клиническому применению, в частности, следует исключить из показаний суправентрикулярные нарушения ритма и назначать кватернидин для лечения больных с желудочковыми аритмиями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Балашов В. П., Балыкова Л. А., Агеносова О. Г., Маркелова И. А. Моделирование ацетилхолиновой фибрилляции предсердий у кошек // Некоторые вопросы теоретической и клинической медицины Межвуз. Сборник науч. трудов. - Вып. 1. - Саранск: СВМО. - 2000. - С. 9 - 10.

2. Балашов В. П., Зиганшин А.У., Агеносова О. Г., Маркелова И. А. Исследование противоаритмической активности пиридоксальфосфат-6-азофенил-2,4-дисульфоновой кислоты // Современные методы диагностики и лечения в медицине: проблемы, перспективы. Межвузовский сборник научных трудов. - Саранск: СВМО. - 2000. - С. 3 - 4.

3. Балашов В. П., Шеворакова Т. И., Седова Д. Г., и др. Влияние длительной противоаритмической терапии на смертельность в условиях эксперимента. (Тезисы) // Вестник аритмологии. Санкт-Петербург. - 2000. - № 15. -С. 94.

4. Таланова Е. В., Агеносова О. Г., Киселева Р. Е., и др. Исследование влияния некоторых противоаритмических средств на перекисное окисление липидов в миокарде при экспериментальной ишемии // Материалы IX науч. конф. молодых ученых, аспирантов и студентов Мордовского госуниверситета имени Н.П. Огарева. Часть 2. Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. -2004. - С. 63-64.

5. Русскина Е.А., Агеносова О.Г., Блинов Д.С., Еремкина И.Л., Балашов В.П., Кругляков П.П., Ховряков A.B. Ультраструктурная организация и адре-нергический конгроль миокарда при введении производных местных анестетиков // Мат. XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М. - 2005. - С. 701.

6. Балашов В.П., Блинов Д.С., Белова JI.A., Казаченко В.Н., Асташев М.Е., Агеносова О.Г., Балыкова Л.А., Седова Д.Г. К вопросу о механизмах противоаритмического действия кватернидина // Мат. XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М. - 2005. - С. 639.

Подписано в печать 26.04.05. Объем 1,0 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 872.

Типография Издательства Мордовского университета 430000, г. Саранск, ул. Советская, 24

i-8705

РНБ Русский фонд

2006-4 15308

Актуальность исследования. Как свидетельствуют многочисленные отечественные и зарубежные исследования перспективным методом создания новых антиаритмических препаратов с уникальными фармакологическими свойствами является' модификация аймалина, орнида, лидокаина, тримекаина, пропранолола, полученные путем кватернизации активного азота (Костин Я.В. и соавт., 1987; Костин Я.В., 1989; Балашов В.П. и соавт., 1990; 2005; Костин Я.В., и соавт. 1991; Белова JI.A., 1993; Кузнецова В.А., 1993; Каверина Н.В. и соавт., 1996; 2003; Моисеева И .Я., 2000; Костин Я.В. и соавт., 2003; Моисеева И.Я. и соавт., 2003; Блинов Д.С., Костин Я.В., 2003; Блинов Д.С. и соавт., 2004; Ryden L. et al., 1974; Patterson E. et al., 1988; Von Bogaert P.P. 1992; Al Rasheed N.M. et al., 2001).

Особый интерес представляют результаты изучения 37 четвертичных производных тримекаина с различными алифатическими и гетероциклическими радикалами (Гренадер А.К., 1987; Костин Я.В., 1989; Ильясов Ф.Э., 1989; Балашов В.П. и соавт., 1990; Котляров А.А., 1995; Артемьева О.В., 1998; Моисеева И .Я., 2000; Костин Я.В. и соавт., 2003; Моисеева И.Я. и соавт., 2003), результатом которых стало создание нового отечественного антиаритмика - кватернидина (Офицерова С.И., 1997; Сернов JI.H. и соавт., 1998, 2004; Шмырева М.В., 1999; Моисеева И .Я., 2000; Моисеева И.Я. и соавт., 2003). Кватернидин обладает высокой активностью в отношении вентрикулярных аритмий, в том числе, предупреждает фибрилляцию желудочков при острой ишемии миокарда. Препарат практически лишен побочных эффектов. Полный антиаритмический эффект кватернидина продолжается 9-12 часов после однократного внутривенного введения. Анализ данных литературы, посвященных фармакологии кватернидина свидетельствует, что традиционно данный препарат рассматривается как представитель III класса по систематике Е. Vaughan Williams (1984). Однако в публикациях отсутствуют убедительные доказательства этой гипотезы.

Все это, на наш взгляд, требует уточнения механизмов реализации проти-воаритмического эффекта кватернидина.

Цель работы: целью настоящей работы явилось выявление мембранных механизмов противоаритмического действия кватернидина и уточнение его систематической принадлежности.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с научной темой курса медицинской биологии ГОУВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева» «Фармакологическая коррекция стрессорных и ишемических повреждений органов и систем» (номер государственной регистрации 01200104129).

Задачи исследования. В соответствии с поставленной целью при выполнении данной работы предполагалось решение следующих задач:

1. Исследование влияния кватернидина на электрофизиологические параметры интактного и ишемизированного сердца кошек методом программной электрической стимуляции.

2. Исследование противоаритмического действия кватернидина на экспериментальных моделях суправентрикулярных аритмий.

3. Исследование влияния кватернидина на характеристики потенциала действия кардиомиоцитов папиллярной мышцы крысы и проводимость потенциалозависимых калиевых каналов нейронов большого прудовика.

4. Изучение влияния кватернидина на некоторые первичные звенья ишемического аритмогенеза.

Научная новизна. На основании проведенного комплексного фармакологического исследования показано, что препарат не может быть отнесен к представителям III класса антиаритмиков по систематике Е. Vaughan-Wil-liams (1984). Установлено, что кватернидин при внутривенном введении кошкам снижает возбудимость интактных желудочков, увеличивает продолжительность эффективного рефрактерного периода желудочков, не угнетает процесс проведения импульса по проводящей системе сердца. Показано, что в ишемизированном сердце препарат устраняет вызванные гипоксией негативные электрофизиологические сдвиги. Установлены способность кватернидина купировать аконитиновую фибрилляцию предсердий и отсутствие активности по предотвращению ацетилхолиновой пред-сердной аритмии. Впервые показано, что кватернидин не влияет на патогенетические первичные звенья ишемического аритмогенеза. В процессе проведения электрофизиологических исследований in vivo впервые показано, что кватернидин снижает амплитуду потенциала действия кардиомио-цитов папиллярной мышцы крысы без изменения его длительности; не угнетает ионного проведения по калиевым каналам задержанного выпрямления нейронов изолированного глоточного кольца большого прудовика и по механизму действия приближается к представителям I класса по классификации Е. Vaughan-Williams (1984).

Практическая ценность работы. Результаты фармакологического исследования кватернидина способствуют расширению представлений о фармакодинамике препарата, позволят оптимизировать фармакотерапию аритмий за счет уточнения показаний и противопоказаний к назначению препарата, в частности, следует исключить из показаний суправентрику-лярные нарушения ритма и назначать кватернидин для лечения больных с желудочковыми аритмиями. Результаты исследования внедрены в учебный и научно-исследовательский процесс кафедр фармакологии и цитологии, гистологии, эмбриологии. "

Апробация работы. Результаты исследований, представленные в диссертации докладывались на XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), 59-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2004), ежегодных Огаревских чтениях (научной конференции Мордовского госуниверситета, Саранск, 20032005), конференциях молодых ученых Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева (Саранск, 2003-2004).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 6 работ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Кватернидин не обладает электрофизиологическими эффектами ан-тиаритмиков III класса.

2. Кватернидин следует систематизировать как представитель одной из подгрупп I класса.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, четырех глав, в которых изложены результаты собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Работа изложена на 99 станицах машинописного текста, иллюстрирована двенадцатью рисунками и шестнадцатью таблицами. Библиографический список содержит 167 источников, в том числе 77 иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. При программной электрической стимуляции сердца интактных кошек кватернидин (2,0 мг/кг), как и лидокаин (10,0 мг/кг), не изменяет функциональную активность синоатриального узла, возбудимость, проводимость левого предсердия и желудочка, рефрактерность атриовентрикулярного соединения, но стабильно, в течение 1 часа наблюдения, увеличивает эффективный рефрактерный период желудочков. Рефрактерность предсердий возрастает лишь на поздних сроках эксперимента.

2. В опытах на кошках с экспериментальным инфарктом миокарда кватернидин устраняет негативное действие острой ишемии на функциональные показатели ритма сердечной деятельности: тахикардию, сужение комплекса QRS, уменьшение эффективных рефрактерных периодов предсердия, атриовентрикулярного узла и желудочка, повышает порог возбуждения миокарда камер сердца.

Препарат .не .эффективен, на модели ацетилхолинового трепетания предсердий кошек, но успешно купирует фибрилляцию предсердий у кошек вызванную модификацией быстрых натриевых каналов локальным воздействием нитрата аконитина.

4. Кватернидин (5,0 и 10,0 мг/л) не увеличивает длительность потенциала действия папиллярных мышц сердца крысы, но уменьшает скорость быстрой деполяризации электрического спайка. В концентрациях 10"8 - 10"4 М/л кватернидин (при наружном и внутреннем приложении) не изменяет проводимость через одиночные калиевые каналы задержанного выпрямления.

5. Кватернидин не оказывает влияния на адренергический контроль миокарда в зоне ишемии и не проявляет прямых и непрямых антиоксидантных свойств.

6. Кватернидин нельзя отнести к антиаритмическим средствам III класса. Препарат можно систематизировать как антиаритмик I класса, отличающийся. от классических представителей группы длительностью терапевтического действия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные данные расширяют представления о фармакодинамике кватернидина и позволяют уточнить показания и противопоказания к его клиническому применению, в частности, следует исключить из показаний суправентрикулярные нарушения ритма и назначать кватернидин для лечения больных с желудочковыми аритмиями.