Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Информативность и дифференциально-диагностическое значение ядовых тестов при нарушениях свертывания крови у детей

Геморрагические заболевания и синдромы относятся к числу распространенных форм клинической патологии, уступающих по частоте встречаемости у гематологических больных лишь анемиям. При этом в педиатрии нарушения в системе гемостаза занимают особое место, поскольку они не только часты сами по себе, но и, вплетаясь в патогенез многих других патологических процессов, существенно влияют на их основную симптоматику, определяют особенности течения, исход и прогноз. Это обусловлено, прежде всего, состоянием данной системы в растущем организме ребенка. За последнее двадцать лет в отечественной литературе опубликован ряд фундаментальных трудов по гемостазиологии (Зубаиров Д.М., 1980; Мача-бели М.С., 1986; Балуда В.П.,997; Баркаган З.С., 1998, 2000; Момот А.П., 1997, 2000), в которых отражены многие вопросы физиологии и патологии системы гемостаза, представлены основные формы нарушений свертывания крови, даны рекомендации по их диагностике, терапии и профилактике. Однако в них содержатся в основном материалы, характеризующие ситуации, встречающиеся у взрослых больных. Вместе с тем среди актуальных вопросов современной гематологии, одной из неоднозначной и противоречивой является проблема диагностики нарушений свертывающей системы крови, возникающих в детском возрасте.

Поздняя диагностика геморрагического синдрома у детей затрудняет назначение направленного лечения, принятия мер социальной защиты больного ребенка. При этом недостаточно изучены современные особенности течения наиболее часто встречающихся геморрагических диатезов в детском возрасте, не определены до сих пор надежные ориентиры для их лабораторной диагностики как в период обострения, так и ремиссии (Белязо О.Е., 1989).

Между тем, современное комплексное исследование системы гемостаза весьма неинформативно, требует больших затрат времени и плазмы больного, не отвечает задачам экспресс-диагностики указанных состояний. Отсюда понятно стремление клиники к поискам новых информативных и легко выполнимых методов диагностики нарушений гемостаза у детей. Давно стало очевидным, что одним из путей совершенствования диагностического процесса в указанной области является использование в качестве реагентов змеиных ядов, в состав которых входят ферменты, избирательно действующие на разные звенья коагуляционного каскада (Цывкина Л.П., 1997, 2001; Баркаган З.С., 1998, 2001; Батрак Т.А., 1999; Шахова Н.В., 2000; Franza B.R., et al.,1975; Denson K.W.E., 1976 и др.). Выполненные в этом направлении исследования показали, что с помощью простых одно- двухступенчатых ядовых тестов может быть проведена быстрая и качественная верификация ряда нарушений гемокоагуляционного каскада среди взрослого контингента больных.

Вместе с тем, если у взрослых ядовые тесты применяются широко, то сведения о использовании их в диагностике нарушений гемостаза в детском возрасте еще лишь единичны и весьма противоречивы. (Перегудова И.Г., 1992; Колесникова О.И., 1999; Стуров В .Г., 2002; Шахова Н.В., 2000).

Трудность ранней диагностики геморрагических диатезов создается низкой и ограниченной чувствительностью имеющихся функциональных методов оценки системы гемостаза при начальных стадиях гемостазиологических сдвигов. При этом регистрируемые нарушения системы гемостаза не всегда укладываются в рамки того или иного геморрагического диатеза. Принципиально новым решением этой проблемы является применение наряду с традиционными коагуляционными тестами диагностических ядовых тестов, позволяющих выявлять более тонкие "поломки" в системе свертывания крови, не фиксируемые как правило рутинными методами исследования.

Изучение, выявляемых нарушений в системе гемостаза с помощью ядовых тестов позволит не только установить характер и механизм нарушения, но и определить диагностическую и прогностическую значимость этих методов исследования, что, несомненно, будет способствовать улучшению диагностики гемостазиологических сдвигов у больных с геморрагическим синдромом в педиатрической практике и проведению патогенетически обоснованной их коррекции.

Вышеизложенное послужило основой для формулировки цели и задач настоящей работы.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Оценить возможности применения гетерогенных коагулаз ядов змей отечественной фауны для диагностики и осуществления лабораторного контроля за эффективностью используемой терапии при основных нарушениях свертывания крови у детей.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. С помощью коагуляционных тестов змей отечественной фауны оценить состояние конечного этапа свертывания крови при наиболее часто встречающихся наследственных формах тромбоцитопатии и гемофилии, в том числе протекающих на фоне недифференцированных вариантов врожденной системной мезенхимальной дисплазии.

2. Изучить при указанных заболеваниях и синдромах диагностические возможности новых методов исследования процессов ауто- и гетерополимеризации фибринов мономера.

3. Уточнить состояние конечного этапа образования фибрина у больных с геморрагическим васкулитом, острым (подострым) и хроническим ДВС-синдромом.

4. Оценить пригодность эхитоксового теста и новых способов исследования процессов ауто- и гетерополимеризации мономеров фибрина для осуществления лабораторного контроля за действием фраксипарина при ДВС крови у детей.

5. Провести анализ информативности вновь используемых лабораторных проб для оценки динамики, тяжести и прогноза при указанных геморрагических и тромбогеморрагических заболевания и синдромах у детей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые в педиатрической практике использован и внедрен в повседневную клиническую практику набор лабораторных проб, основанных на применении ядов змей отечественной фауны, для оценки прцессов фибринообразования при наиболее распространенных геморрагических заболеваниях и ДВС-синдромах.

На базе применения ядовых диагностикумов и методов оценки реакций ауто- и гетерополимеризации мономеров фибрина установлено, что одним из механизмов развития геморрагических расстройств у детей с фоновой дисплазией соединительной ткани являются качественные дефекты молекулы фибриногена.

Установлена обратная корреляционная зависимость между уровнем в плазме РФМК и временем полимеризации мономеров фибрина у больных с геморрагическим васкулитом и ДВС-синдромом, свидетельствующая о тяжести выявляемых нарушений в системе гемостаза и недостаточности основной этио-патогенетической и коррекционно-заместительной терапии.

Впервые показано дозозависимое влияние фраксипарина на динамику времени свертывания в тестах эхитоксовом и ауто- и гетерополимеризации мономеров фибрина, что позволяет использовать их для осуществления лабораторного контроля за эффективностью антитромботической терапии ДВС-синдрома.

При сравнительном исследовании динамики параметров используемых ядовых коагуляционных проб показана высокая информативность эхитоксового теста при распознавании скрытой гиперкоагуляции у больных с острым (подострым) ДВС-синдромом.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Для повседневной педиатрической практики апробирована и внедрена новая лабораторная методология для оценки состояния конечного этапа свертывания крови при наиболее распространенных геморрагических заболеваниях и синдромах, основанная на использовании ядов змей отечественной фауны.

Показана пригодность используемых ядовых тестов и методов оценки процессов полимеризации МФ для выявления скрытых дефектов на конечном этапе свертывания крови у детей с фоновой системной дисплазией соединительной ткани.

Установлена способность ядовых тестов выявлять явную и скрытую гиперкоагуляцию у больных с различными патогенетическими формами ДВС-синдрома, в том числе при наличии гипо- и дисфибриногенемии.

Обоснована целесообразность использования эхитоксовой пробы для комплексной оценки параметров коагулограммы в ходе осуществления антитромботической терапии с помощью низкомолекулярных гепаринов. Показано дозозависимое влияние фраксипарина на показания ЭХТ.

Выявленные с помощью ядовых проб и методов оценки скорости полимеризации МФ гемостазиологические сдвиги у обследованных детей позволяют с новых патогенетических позиций подойти к назначению комплексной адекватной корригирующей терапии при наследственных тромбоцитопатиях, гемофилии, геморрагических васку-литах, протекающих на фоне недифференцированных вариантов СМД.

Предложены новые лабораторные критерии неблагоприятного прогноза при остром (подостром) ДВС-синдроме, характеризующиеся прогрессирующим увеличением времени свертывания в эхитоксовом тесте.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

В комплексной диагностике нарушений системы гемостаза у детей целесообразно использование ядовых тестов, имеющих ряд преимуществ перед общими коагуляционными тестами.

Нарушения конечного этапа свертывания крови при наследственных тромбоцитопатиях, гемофилии и геморрагическом васкулите, сочетающихся с недифференцированными вариантами системной дисплазии соединительной ткани и выявляемые с помощью анцистродонового и эхитоксового тестов, качественно однотипны и характеризуются дисфибриногенемией.

Во все фазы развития и прогрессирования острого (подострого) ДВС-синдрома проба с ядом змеи эфы более информативна, чем общие коагуляци-онные тесты и позволяет обнаруживать явную и скрытую гиперкоагуляцию вплоть до появления гипофибриногенемии. У больных с хроническим ДВС крови ядовые тесты выявляют перманентную тромбинемию и заблокированный фибриноген в фибрин-мономерных комплексах.

Прогрессирующее увеличение показаний эхитоксового теста у больных с острым ДВС крови является прогностически неблагоприятным признаком.

При использовании у больных с ДВС-синдромом средник и высоких доз фрак-сипарина контроль за состоянием системы гемостаза следует осуществлять с помощью эхитоксового теста и орто-фенантролиновой пробы, чувствительно выявляющих скрытую гиперкоагуляцию. их количестве в анализах крови, и проявляющиеся геморрагиями по микроциркуля-торному или пятехиально-пятнистому типу.

Наследственные и приобретенные ТП являются одной из наиболее распространенных форм геморрагических синдромов у детей. Частота встречаемости ТП - 36:1000 общего числа больных с кровоточивостью, а при активном выявлении их легких и стертых форм - 60-65% (Иванова Т.Х., 1981; Баркаган Л.З., 1988; Трубников П.Н., 1998; Суворова А.В., 2000; Стуров В.Г., 2002).

Поскольку метаболизм тромбоцитов достаточно сложен и многокомпонентен, то нарушения этого процесса достаточно полиморфны и многочисленны. Мембрана и интрацеллюлярные элементы TP весьма подвержены влиянию различных экзо - и эндогенных факторов, что может привести к их дисфункции или, так называемой, тромбоцитопатии (ТП). Основные типы расстройств -врожденная и приобретенная (вторичная) ТП. Так, если до настоящего времени были известно лишь несколько форм врожденных тромбоцитопатий, обусловленных качественной неполноценностью тромбоцитов (тромбастения Глянцма-на, болезнь Виллебранда), то в настоящее время насчитывается уже несколько десятков заболеваний данной группы (Баркаган З.С., 1988; Васильев С.А., Мазуров А.В., 1997;Colman R., 1993).

Основываясь на данных морфо-функционального исследования тромбоцитов, был предложен ряд классификаций тромбоцитопатий (Баркаган З.С., 1974, 1978, 1980; Ulutin N., 1972, 1977; Weiss Н., 1975), что позволило их систематизировать и решить тем самым ряд существующих диагностических проблем.

На сегодняшний день общепринятой и утвержденной для практического применения в клинике является классификация тромбоцитопатий, разработанная З.С.Баркаганом (1985). Согласно данной классификации, выделяют: А. Наследственные и врожденные формы:

1. Формы с преимущественным нарушением агрегационной функции (ди-загрегационные):

• тромбоцитастения (тромбастения) Гланцмана I и II типов;

• эссенциальная атромбия I и II типов.

2. Формы с преимущественным нарушением адгезии тромбоцитов к коллагену и стеклу:

• плазменного генеза - болезнь фон Виллебранда (I тип и некоторые вариантные формы) и синдром Виллибранда тромбоцитарного типа;

• микроцитарная тромбоцитодистрофия Бернара - Сулье.

3. Формы с дефицитом и снижением доступности фактора 3.

4. Нарушение реакции высвобождения (секреции из тромбоцитарных гранул):

• с аплазией лучевой кости (TAR-синдром);

• с альбинизмом (синдром Хержманского - Пудлака);

• синдром Чедиака - Хигаси;

• формы без альбинизма и аномалий скелета (синдром " серых тромбоцитов" и др.);

5. Сложные аномалии и дисфункции тромбоцитов, сочетающиеся с другими генетическими дефектами (геморрагическая мезенхимальная дисплазия, синдром Элерса-Данлос).

В. Приобретенные тромбоцитопатии:

- при гемобластозах, миелопролиферативных заболеваниях и эссенциаль-ной тромбоцитемии;

- при циррозах, опухолях и паразитарных заболеваниях печени (нарушение ААФТ, вследствие метаболических нарушений, секвестрации тромбоцитов в портальной системе, потребления их при развитии диссеминированного свертывания крови - ДВС-синдрома);

- лекарственные и токсигенные (при использовании ацетилсалициловой кислоты, пиразолона, больших доз папаверина и некоторых антибиотиков, особенно карбенициллина и аминопенициллинов, транквилизирующих средств, мочегонных препаратов, нитрофуранов, антигистаминовых средств, цитостати-ков и других препаратов).

Клиническая симптоматика тромбоцитопатий, в силу разнообразия, обладает выраженной полиморфностью, однако большинство из них проявляется сходной клинической симптоматикой - это рецидивирующие кровотечения со слизистых оболочек, в том числе носовые, маточные, посттравматические геморрагии по типу синячков и петехий на кожных покровах. Иногда наблюдается замедленное заживление ран.

Наиболее часто у детей встречаются следующие виды наследственных тромбоцитопатий.

• Синдром Бернара-Сулъе (СБС), описанный в 1948 г. J.Bernard et L.Soulier, наследуется по аутосомно-рецессивному типу и характеризуется удлинением времени капиллярного кровотечения, выраженным геморрагическим синдромом, нормальной ретракцией кровяного сгутка, умеренной тромбоцитопенией. При этом тромбоциты значительной увеличены в размерах (5-8 мкм в диаметре и более), в них повышается содержание плотных гранул, локализованных в центре, ультраструктурно изменена и легко деформируется мембрана. Геморрагический синдром при этой ТП манифестирует уже в раннем возрасте в виде синяков, петехий, десневых, маточных и длительных посттравматических кровотечений. Геморрагический синдром может быть столь значительным, что требуется для его купирования использование донорской тромбоцитарной массы. В последнее время установлено, что функциональные дефекты TP при СБС ассоциированы с дефицитом комплекса мембранных GP Ib-IX (Nurden A., Caen J., 1996).

• Псевдоболезнь Виплебранда или синдром Виллебранда плазмоцитарного типа. Клинически практически идентичен синдрому Виллебранда lib типа, который ранее объединялся в отдельную нозологическую форму - синдром Виллебранда-Юргенса. Однако, несмотря на клиническое сходство, молекулярная основа этих двух видов патологии принципиально различная - синдром Виллебранда плазмоцитарного типа обусловлен дефектом тромбоцитов, а синдром Виллебранда типа ИЬ является следствием повышенной реактивности дефектного фактора WB. Геморрагический синдром при этом обусловлен, по-видимому, снижением количества фактора WB, причем наиболее активных высокомолекулярных мультимеров, и нарушением в связи с этим адгезии TP к субэндотелию сосудов (Баркаган З.С., 1988; Головина О.Г., Папаян Л.П., Белязо О.Е. и соавт., 1990; 1996; Weiss Н., 1983).

• Тромбастения Гланцмана (ТГ). Это заболевание впервые описано

Glanzman et al. в 1918 г., а к настоящему времени в мировой литературе охарактеризовано около 200 больных с данной патологией. ТГ наследуется по ауто-сомно-рецессивному типу и характеризуется повышенной кровоточивостью по микроциркуляторному типу. Характерно появление петехий, экхимозов, частых десневых, носовых, маточных и длительных посттравматических кровотечений. Основные диагностические критерии ТГ следующие: 1) отсутствие агрегации TP в ответ на воздействие большинства известных индукторов агрегации (АДФ, адреналин, коллаген, тромбин) за исключением ристомицина; 2) отсутствие или резкое снижение ретракции кровяного сгустка. Несмотря на отсутствие АДФ-индуцированной агрегации, связывание АДФ и тромбина с тромбоцитами при ТГ не нарушено. Сохраняется способность к секреции из плотных гранул и сыгранул, а также к синтезу тромбоксана А2. Выявление и подробное обследование разных больных с ТГ показало существенную гетерогенность данного синдрома, что привело к выделению 2-х типов патологии (по Caen J./1972). При этом I тип тромбастении Гланцмана характеризуется тем, что тромбоциты неспособны к агрегации и в них отсутствует внутритромбоцитарный фибриноген. У этих больных не возникает и ретракция кровяного сгустка, не выявляются GP lib, GP Ша, резко нарушено или полностью отсутствует взаимодействие тромбоцитов с сыворотками против аллоантигенов, а связывание специфических моноклональных антител к GP lib, GP Ша составляет менее 5% от нормы. II тип ТГ встречается значительно реже. У этой категории больных также отмечается тотальная гипоагрегация на основные индукторы, но ретракция сгустка лишь умеренно снижена. Тромбоциты содержат фибриноген, хотя в сниженных количествах. Содержание GP Ilb-IIIa колеблется от 5 до 20% при субнормальном соотношении обоих белков (YoshidaN., 1978; Coller В., 1980).

В последнее время в литературе появились работы отечественных и зарубежных исследователей, посвященные возможности сочетания наследственной тромбоцитопатии с клиническими признаками дисплазии соединительной ткани (Баркаган З.С., 1980; 1985; 2000; Папаян А.В., 1990; Яковлев В.М., 1990; Суханова Г.А., 1992; McEver R., 1991; Kenny D., Marateck P., Montgomery R., 1999) у взрослого контингента больных. Авторы дают довольно широкое представление о нарушениях системы гемостаза, развивающихся при сочетании указанных синдромов. Однако в литературе имеются лишь единичные и весьма противоречивые публикации об особенностях данной патологии в детском возрасте (Суворова А.В., 2000; Пшеничная К.И., 2002; Стуров В.Г., 2002).

Гематомный тип кровоточивости бывает почти исключительно при нарушениях во внутреннем механизме формирования протромбиназной активности. До настоящего времени нарушения свертывания крови при наследственной коагулопатии связывали исключительно с дефицитом антигемофильных факторов (VIII, IX, XI, XII) и с возможным наличием в крови больных антител к этим факторам. Однако при углубленном обследовании этих больных давно уже было подмечено, что у части из них нарушаются агрегационная функция тромбоцитов и/или конечный этап свертывания крови, особенно при наличии ингибиторов к фактору VIII (Баркаган З.С., 1980, 1985, 1987; Буевич Е.И., 1987;Свирин П.В., Шиллер Е.Э., Вдовин В.В. с соавт.,2002).

Позднее была выделена группа пациентов, у которых наряду с типичными гемартрозами и гематомами возникают многочисленные петехиальные высыпания и экхимозы на коже и слизистых оболочках, столь не характерные для данной формы патологии. У всех этих больных обнаруживаются типичные признаки наследственной неполноценности соединительной ткани (ННСТ), а при оценке состояния системы гемостаза - дефицит антигемофилических факторов VIII (IX) в сочетании с теми или иными дефектами в других параметрах свертывания крови: замедление скорости аутополимеризации РФМК, снижение показателей агрегации тромбоцитов и уровня фактора Виллибранда в плазме крови и др. (Цывкина Л.П., 1997, 2000; Батрак Т.А., 1999). Причем указанные сдвиги были выявлены на базе использования ядовых тестов, а не рутинной коагулограммы. Отсутствие подобного рода исследований в педиатрии не позволяет до настоящего времени судить о роли этих дефектов в генезе кровоточивости у больных гемофилией, протекающей на фоне ННСТ, что учитывалось при выполнении данной работы.

В детской практике васкулитно-пурпурный тип кровоточивости наиболее часто встречается при геморрагическом васкулите. Это иммунокомплексное заболевание, в патогенезе которого важную роль играет процесс множественного тромбирования микрососудов, в первую очередь кожи, суставов, кишечника и почечных гломерул с последующими дистрофическими изменениями в них, вплоть до некрозов, что в значительной степени определяет тяжесть и исход заболевания (Баркаган JI.3., Архипов Б.Ф., 1980; Балабина Н.М., 1987; Баркаган Л.З., Анмут С.Я., Чупрова А.В., 1990; Мазурин А.В., 1994; Плахута Т.Г., Цымбал И.Н., Якунина Л.Н., 1996; Michel В. et al., 1992; Claudy А., 1995; Watts R., Scott D., 1995). Потенциально наиболее опасны абдоминальный и почечный синдромы. Первый связан с тромбированием мелких сосудов стенки кишечника и может осложниться ее перфорацией и инвагинацией кишечника, определяя ургентность возникшей ситации (Мазурин А.В., 1996; Осипова М.А., Ардуванова Г.М., 1996; Кривошеев О.Г., Семенкова Е.Н. и др., 1997; Altinors et al., 1991; Alquacil et al., 1992). Почечный синдром обусловлен асептическим воспалением почечных сосудов и их тромбированием, что сопровождается микро- либо макрогематурией. В более редких случаях наблюдается нефротический синдром, но наиболее драмматичны случаи возникновения смешанной формы гломерулонефрита с прогрессирующей почечной недостаточностью (Савицкий С.Н., Гордеев А.В., 1992; Маркова И.В., 1994; Мазурин А.В., 1996; Мышенцева Е.Н., 1996; Балашова И.И., Нагаева Т.А., 1997; Грин-штейн Ю.И., 1998; Папаян А.В., Савенкова Н.Д., 1998; Петросян Э.К., 1998; Jeger L., 1990; Miura М, 1992; Gauthier В., 1993; Claudy А., 1995; Watts R., Scott D., 1995). При этом все авторы подчеркивают важную роль нарушения свертывания крови в генезе указанных синдромов.

В последние годы в отечественной литературе появились публикации, посвященные изменению свертывающей системы крови при геморрагическом васкулите, протекающем на фоне ННСТ, существенно изменяющей клиническую и лабораторную характеристику основного заболевания (Ненашева Т.Л., Волоскова Н.И., Платонова Т.А., 1997; Колесникова О.И., 1999, Шахова Н.В., 2000). При фоновой ННСТ у больных появляются петехии, экхимозы, более часты желудочно-кишечные и почечные кровотечения, а также склонность к хронически-рецидивирующему течению ГВ. Большинство из этих работ выполнены с привлечением ядовых тестов, причем в терапевтической клинике. Имеются лишь единичные сообщения о возможной роли ННСТ в генезе ГВ у детей (Колесникова О.И., 1999; Шахова Н.В., 2000). Между тем изучение этого вопроса представляется нам весьма важным, так как позволит не только улучшить диагностику гемостазиологических нарушений, развивающихся у детей с иммунокомплексным микротромбоваскулитом, но и проводить патогенетически обоснованные методы коррекции выявленных нарушений.

Смешанный тип кровоточивости характерен для болезни Виллибранда, дефицита факторов V, VII, XIII, а также для приобретенных форм нарушений гемостаза, в первую очередь для ДВС-синдрома. Являясь неспецифическим общепатологическим процессом, ДВС-синдром, осложняет в 17-70% случаев течение многих тяжелых заболеваний, критических и терминальных состояний у детей. При этом он во многом определяет тяжесть, особенности течения и неэффективность основной этиопатогенетической терапии и у 1- 55% больных заканчивается летальным исходом.

В детском возрасте превалируют острые и подострые формы ДВС-синдрома, выявляемые на фоне тяжелых инфекционных заболеваний, особенно при вирусемии и грам-негативном сепсисе, а также при различных видах шока, ГУС-синдроме, тяжелых отравлениях, травмах, краш-синдроме (Папаян А.В., Шабалов Н.П., 1982; Савенкова М.С., 1985; Вакульчик В.Г., 1986; Теблоева JI.T. и соавт., 1987; Якунина JI.H. и соавт., 1987; Мишарев О.С. и соавт., 1989; Баркаган JI.3, 1993; Чупрова А.В. и соавт., 1999-2002 гг.; Dutta P. et аЦ 1989; Rowe P. et al., 1991; Sassetti В. et al., 1999; Mertens R. et all, 1999; Tucciarone L., 2000). Могут встречаться случаи острого (подострого) ДВС крови при укусах детей ядовитыми насекомыми и змеями (Баркаган З.С., 1961-1973; Раби К., 1974; Папаян А.В., Шабалов Н.П., 1982; Lifshitz М., 2000)

В педиатрической практике нередки случая развития и хронического ДВС крови. К многочисленной группе заболеваний, течение которых он осложняет, относятся такие распространенные в детском возрасте иммунные и иммунноком-плексные болезни, как системная красная волчанка, системная склеродермия, ювенильный ревматоидный артрит с висцеральными проявлениями. Хронические формы ДВС-синдрома существенно утяжеляют течение заболеваний, характеризуясь пролонгированными тромботическими расстройствами, кожной геморрагической сыпью с некротическим элементами, легко возникающей контактной кровоточивостью при проведении различных манипуляций (Зербино Д.Д., Лукасевич Л.Л., 1989; Квачадзе И.М., Чахунашвили Г.Н., 1991; Рожкова Л.Е., 1994; Соловьев О.Н., 1994; Пикапов И.В., 1995; Нага Н. et al., 1988; Smiley J., Moore S., 1989).

Таким образом, даже краткий обзор специальной литературы наглядно свидетельствует о том, что различные формы патологии свертывания достаточно широко распространены у детей, что требует применения для их своевременной диагностики соответствующих методических подходов.

1.2.Современные методы диагностики нарушений свертывания крови

В настоящее время для диагностики нарушений свертывания крови используется более ста лабораторных методов и этот набор продолжает увеличиваться. Данное обстоятельство существенно затрудняет работу лабораторий, удлиняет время обследования больных, нередко сопровождается произвольной трактовкой полученных результатов. Однако знание механизмов развития основных геморрагических заболеваний и синдромов, а также понимание принципиального различия между ними позволяет правильно выбрать диагностические пробы и их комбинации в каждом конкретном случае. Так, при распознавании "геморрагических диатезов" проблема диагностики решается установлением дефицита либо аномалии того или иного фактора свертывания крови или тромбоцитов. Однако при выявлении ДВС-синдрома и других тромботических ситуаций более важно обнаружение признаков (маркеров) внутрисосудистой активации тромбоцитов и новых комплексных соединений - продуктов повышенной ферментативной деятельности тромбина и плазмина (Лычев В.Г., 1985; 1993; 1998; Баркаган З.С., 1988, 2000; Балуда В.П., Деянов И.И., 1989; МомотА.П., 1997;BickR., 1984; Baker W., 1989).

В повседневной клинической практике для диагностики нарушений в со-судисто-тромбоцитарном звене системе гемостаза в настоящее время используются 2 основные группы лабораторных проб: скрининг-тесты и более сложные методы, высокочувствительные, но достаточно трудоемкие и не всегда выполнимые в обычных условиях.

К скрининг-тестам следует отнести пробы на определение резистентности (ломкости) капилляров, количество тромбоцитов в общих анализах крови, длительность кровотечения, ретракцию кровяного сгустка. С их помощью можно легко установить снижение числа тромбоцитов в анализах крови, но лишь предположить присутствие тромбоцитопатии. К тому же следует учитывать, что такие методы диагностики, как длительность кровотечения и ретракция кровяного сгустка относятся к недостаточно чувствительным пробам, поэтому они нередко дают ошибочные результаты (из-за раннего склеивания краев ранки и других причин). В этой связи при многих тромбоцитопатиях их показатели не нарушаются вообще либо изменяются лишь при тяжелых формах тромбоцитопатии, что существенно снижает и ограничивает их диагностическое значение (Лычев В.Г., 1998; Баркаган З.С., Момот А.П., 1999, 2001).

К более сложным лабораторным пробам относятся методы определения адгезии тромбоцитов и их агрегации с добавлением или без добавления различных индукторов агрегации, а также способы оценки реакции высвобождения тромбоцитарны факторов (ЗПФ, 4ПФ, АДФ и др.) в процессе агрегации тромбоцитов. Несмотря на чувствительность и специфичность, им также присущи определенные недостатки. Так, изучение агрегационной функции тромбоцитов требует строгой стандартизации условий выполнения используемой методики, обязательного соблюдения рекомендаций по подбору доз для агрегирующих агентов, вызывающих значительную, необратимую или двухволновую агрегацию. Последим необходима для характеристики реакции высвобождения тромбоцитов (вторая волна). Так же для регистрации процесса агрегации необходимы дорогостоящие специальные приборы - агрегометры и агрегографы, спектрофотометры или фотоэлектрокалориметры, модифицированные помешивающими, записывающими и другими устройствами. В последние годы нашли применения также агрегометры, основанные на кондуктометрическом и иных принципах регистрации процесса склеивания тромбоцитов между собой (Бар-каган З.С., 1975; Лычев В.Г., 1975; Балуда В.П. и соавт., 1980; Баркаган Л.З. 1983, 1986; Шитикова А.С. 1984; Михайлова В.Г., Алексеева Г.А., 1986; Суханова Г.А., Дорохов А.Е., 1991; Мельшикова В.В., 2000; Born G., 1962).

При распознавании коагулопатий наследственного и приобретенного генеза также используется 2 группы тестов. Такие рутинные пробы, как время рекальци-фикации плазмы, АПТВ и АКТ демонстрируют удлинение времени свертывания, если снижено содержание в крови того или иного фактора во внутреннем механизме гемокоагуляции. С их помощью можно предположить дефицит следующих коагулирующих белков - факторов I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII, кроме VII. Указанные методики быстро выполнимы, поэтому пригодны для осуществления скрининг-диагностики ряда коагулопатий, в частности, гемофилии. Вместе с тем они также не лишены недостатков, поскольку оценивают только лишь суммарное содержание указанных факторов свертывания, а также присутствие избытка в плазме антикоагулянтов или ингибиторов этих факторов (Баркаган З.С., Момот А.П., 2001). Не менее важно то, что даже такие чувствительные, высокостандартизиро-ванные пробы, как АПТВ и АКТ начинают увеличиваться лишь при выраженном дефиците того или иного фактора свертывания крови - менее 10-15 % от нормы (Баркаган Л.З., 1979,1993; Лычев В.Г, 1998;CaenJ., 1968).

Для диагностики нарушений реакций гемокоагуляции во внешнем механизме гемокоагуляции используется протромбиновое время. Последнее суммарно оценивает плазменную концентрацию протромбина, факторов X, V, VII и фибриногена.

Состояние конечного этапа свертывания крови анализируют при помощи тромбинового времени и определения в плазме уровня фибриногена. К недостаткам этих проб следует отнести, высокую чувствительность их от избытка в крови антитромбинов и гепарина, а также продуктов деградации фибриногена и фибрина или парапротеинов, количественного (гипер- или гипофибриногене-мии) и качественного дисфибриногенемии) дефектов фибриногена (Кузник Б.И., 1981, 1983; Баркаган Л.З., Чупрова А.В., 1982; Лычев В.Г. с соавт., 1983; Баркаган З.С. с соавт., 1988; Момот А.П., 1997).

Во 2 группе лабораторных тестов, используемых при распознавании геморрагических заболеваний (диатезов), следует выделить количественные методы и коррекционные пробы, на базе которых можно уточнить содержание того или иного фактора свертывания крови. С этой целью могут быть использованы как коагуляционные пробы (в том числе АПТВ, АКТ), так и иммунные методы диагностики, хромогенные субстраты (Баркаган З.С., 1991; Баркаган J1.3., 1993; Барка-ган З.С., Момот А.П., 1999,2001; Ingram G., Brozovis М., Slater N., 1982).

К специфическим методикам исследования конечного этапа свертывания крови относятся тесты, оценивающие кинетику полимеризации МФ. Процесс полимеризации МФ имеет достаточно стабильные временные характеристики у здоровых людей и изменяется лишь при патологических состояниях (Лившиц И.Г., 1991; Перегудова И.Г., 1992; Суханова Г.А., 1993; Цывкина Л.П., 1997; Колесникова О.И., 1999; Батрак Т.А., 1999; Шахова Н.В., 2000). Для исследования конечного этапа свертывания существует метод определения аутополиме-ризации фибрин - мономера, проводящегося на основе предложенного А.Ш.Бышевским с соавт. (1985) метода. Принцип ее состоит в том, что фибриноген исследуемой плазмы превращают в мономерный фибрин с предупреждением дальнейшего процесса аутополимеризации раствором мочевины. После этого, не выделяя мономерный фибрин из среды, в которой он образовался, запускают самосборку его путем добавления буфера, снижающего концентрацию мочевины в растворе. Регистрируется время от момента приложенного инициирующего воздействия разведения мочевины до времени появления фибрина.

С помощью метода аутополимеризации МФ возможно установить лишь факт нарушения полимеризации МФ, но нельзя выявить в исследуемой крови ингибиторы полимеризации МФ. Для обнаружения ингибиторов полимеризации МФ в крови Г.А.Сухановой (1993) и И.Г.Перегудовой (1994) эта методика была модифицирована. При этом используются растворимые МФ, полученные из плазмы здорового человека по методу И.М.Радзевич, Е.П.Холодовой (1969) в модификации А.Ш.Бышевского и Е.А.Чирятьева (1983). По удлинению времени образования фибринового сгустка при добавлении нормальных донорских МФ в плазму исследуемого больного судят о наличии ингибитора полимеризации.

Принципиально иные подходы применяются при лабораторной верификации микротромбоваскулитов, тромбозов и ДВС-синдромов. Так, для своевременного распознавания острого (подострого) ДВС крови в настоящее время предложено определение следующих параметров и механизмов:

1. Концентрации растворимых фибрин-мономерных комплексов в плазме.

2. Уровня фрагмента протромбина 1+2 (F1+2), фибринопептида А и тром-бин-антитромбинового комплекса (ТАТ).

3. Концентрации ПДФ, особенно фибрина-Д-димера, а также плазмин-антиплазминового комплекса.

4. Уровня ATIII, протенов С, S, тромбомодулина.

Определение АПТВ, ПВ имеет меньшее значение в связи со скоротечностью возникающих сдвигов, а исследование тромбинового времени и уровня фибриногена диагностически значимо лишь при значительной гипергепаринемии((в этом случае она устраняется добавлением протамина сульфата) и в III фазе ДВС-синдрома (Балуда В.П. и соавт., 1980; Архипов Б.Ф., 1982; Чупрова А.В., Соловьев О.Н., Рожкова Л.Е., 1992; Момот А.П., 1995,1997; Лычев В.Г., 1998; Hamilton Р., Stalker A., Douglas А., 1978; BickR., 1982; Beal A., Cerra F., 1994).

Выявление РФМК, как индикаторов тромбинемии, можно проводить с помощью иммунных и неиммунных методик (Дранник Г.Н., 1987; Иванов Е.П., 1991; Bick, 1982 и др.). К сожалению, эти высокоточные иммунологические определения сложны, продолжительны по времени выполнения и дорогостоящие, поэтому мало пригодны для экспресс-диагностики.

Для широкой клинической практики разработаны новые, простые и, быстро выполнимые тесты, позволяющие отследить выраженность и динамику тромбинемии в процессе развития заболевания и лечения. К ним относится предложенная В.А.Елыкомовым и А.П. Момотом (1987) ортрофенантролиновая проба (ОФТ), основанная на оценке времени появления в исследуемой бедной тромбоцитами плазме хлопьев (зерен) фибрина после добавления к ней солянокислого ортофенантролина. ОФТ является хорошей заменой этанолового (ЭТ) и протаминсульфатного теста (ПСТ), которые недостаточно информативны из-за качественной оценки результатов, не позволяют отследить динамику и выраженность тромбинемии при заболевании, а количественные варианты этих методик дают нестабильные результаты и мало пригодны для экспресс-диагностики, в связи с чем они подвергаются обоснованной критике. ОФТ более надежен и чувствителен, способен обнаруживать тромбинемию даже в период развития глубокой гипофибриногенемии и связанной с ней гипокоагуля-ции, что позволило его рекомендовать для диагностики ДВС крови в педиатрической практике (Чупрова А.В. и соавт., 1990-2002; Баркаган Л.З и соавт., 1991; Соловьев О.Н. и соавт., 1993, 2002; Момот А.П., Елыкомов В.А., Баркаган З.С., 1996; Анохина Т.Ю. и соавт., 2001, 2002).

Другим значимым методом является тест склеивания стафилококков (ТСС) с отечественным диагностикумом, полученным при культивировании эталонного штамма золотистого стафилококка Newmann D2C. Тест основан на способности данного штамма стафилококка взаимодействовать с двумя участками молекулы фибриногена, фибрин-мономера или фрагмента X. Такое взаимодействие учитывается визуально по агглютинации бактериальных клеток. ТСС позволяет исследовать сыворотку плазмы, в которой после свертывания фибриногена тромбином остаются продукты фибринолиза. При разведении стафилококка возможно количественно определение в первую очередь РФМК и фибрин-мономеров ив 10-15% случаев ранних ПДФ (Воробьев П. А., 1997; Момот А.П., 1997).

В педиатрической практике работы по применению ТСС с отечественными штаммами стафилококка у больных с ДВС-синдромом выполнены, главным образом, в нашей клинике (Баркаган Л.З, и соавт., 1991; Пикалов И.В., 19921993; Чупрова А.В. и соавт, 1994, 1997; Анохина Т.Ю. и соавт., 2001, 2002; Соловьев О.Н. и соавт., 2002).

В последнее время появились работы, в которых детализируется состояние конечного этапа свертывания крови при ДВС-синдроме, причем с привлечением новых лабораторных методик. В частности, Т.А.Батрак (1999) изучены нарушения неферментативной фазы конечного этапа свертывания крови у больных с острым

ДВС-синдромом, которые носили этапный характер. При этом в фазе гиперкоагуляции было отмечено ускорение полимеризации МФ, а в фазе гипокоагуляции и кровотечений - прогрессирующее замедление, обусловленное снижением уровня фибриногена в плазме крови. При хроническом ДВС-синдроме, по данным этого же автора, процесс полимеризации МФ был замедлен.

В литературе имеются лишь единичные сообщения (Колесникова О.И., 1999) об особенностях реакций полимеризации МФ при развитии острого и хронического ДВС-синдрома у детей. Поскольку указанные расстройства вносят существенную лепту в генез кровоточивости при данной форме патологии, а их обнаружение возможно на базе использования ядовых тестов, то это определило одну из задач настоящей работы.

1.3.3начение ядовых тестов в распознавании нарушений в системе гемостаза

Развитие современной гемостазиологии, так же как и совершенствование диагностики и терапии нарушений в этой системе, на всем своем протяжении было неразрывно связано с изучением эффектов и использованием в клинико-лабораторной практике (в том числе с целью контроля за лечением антикоагу-лянтными препаратами) ряда гетерогенных коагулаз, входящих в состав змеиных ядов отечественной фауны. Расшифровка дефектов в определенных звеньях системы свертывания крови, связана со способностью ферментов змеиных ядов к узконаправленному гемокоагуляционному воздействию на свертывающую систему крови (Таранина Т.С., Волкова И.А., 1983; Цалихин А.Д., Цывки-наЛ.П., 1985, 1991; Глазунова Г.А., 1988; Fink Е., 1989).

Одновременно компоненты змеиных ядов начали широко применяться в диагностической и лечебной практике (Люсов В.А., Белоусов В.А., 1987; Пере-гудова И.Г., 1991; Баркаган З.С., 1996; Цывкина Л.П., 1997-1998). В ряде работ зарубежных авторов (Denson К., Borrett R., Biggs R., 1988; Girolami A., Peruffo R. et al., 1990; Becker I., Bartl.K., Wahlefeld A., 1994), а также в исследованиях, проведенных на базе Федерального Академического Центра по диагностике и лечению нарушений гемостаза (Барнаул, Россия), была показана возможность при помощи реагентов из змеиных ядов выявлять количественный дефицит ряда факторов свертывания крови, их качественную неполноценность, в совокупности с рутинными коагуляционными тестами проводить углубленное изучение отдельных компонентов системы гемокоагуляции. Представлялось также реальным оценивать содержание в плазме заблокированного фибриногена и фибрин-мономерных комплексов, диагностировать ряд предтромботических состояний (Цывкина Л.П., 1981-1989; Угарова Т.П., 1989; Якунин Г.А. и соавт., 1989; Баркаган З.С.,1991; StockerK., 1990; MarklandF, 1998).

В последующих работах выявились более широкие возможности использования компонентов змеиных ядов в диагностике широко распространенных видов патологии гемостаза. Так, протеазы коагулирующего действия, содержащиеся в змеиных ядах, получили широкое применение в диагностике ряда нарушений гемостаза при определении дефицита фактора Виллебранда (Brinkhous К., 1983; Howard М., Perkin I., Salem Н. et al., 1984) и протеина С (Баркаган З.С., Белых С.И., 1992; Kisiel W., Kondo S., Smith К. et al., 1987; Martinoli J., Stocker K., 1986; Meier J., Stocker K., 1986). Оказались они пригодными и для диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью фактора V к активированному протеину С (Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Мамаев А.Н., Цеймах И.Я., 1997; Цывкина Л.П., Момот А.П., Мамаев А.П., 2000; Hankey С., Symons С, 1966; Meier J., Stocker К., 1990; Kraus М., 1995; Dick A., Spannag] М., Schramn W., 1997). Большую роль играют ядовые пробы также при выявлении волча-ночных антикоагулянтов (Баркаган З.С., Сердюк З.С., Цывкина Л.П., 1993, 1994; Шахова Н.В., 2000), а также определении фибриногена в плазме в условиях возникающей гипофибриногенемии (Цеймах И.Я., Цывкина Л.П., Баркаган З.С., 1997), что позволяет их широко использовать при трактовке патогенеза наиболее часто встречающихся тромбо-геморрагических состояний. О возрастающей актуальности проблемы использования коагулирующих компонентов из змей в диагностической практике свидетельствует продолжающийся поток информации и публикаций по этой проблеме.

Использование ядов змей и входящих в их состав коагуляционных протеаз в расшифровке патологии свертывания крови основывается на сходстве и, вместе с тем, на существенном отличии их от естественных ферментов, участвующих в процессе свертывания крови. В частности, яд эфы многочешуйчатой (Echis multisquamatus) - эф-фермент, обладающий полным прямым активирующим действием на протромбин (фактор II) с образованием мейзотромбина. Яд щитомордника обыкновенного (Agkistrodon halys halys) содержит протеазу, которая отщепляет от фибриногена лишь фибринопептиды А с образованием рыхлого дез-АА-фибрина, при этом он не активируют фактор XIII и не вызывают ретракции фиб-ринового сгустка (Глазунова Г.А. и соавт., 1988; Цывкина Л.П., 1997). Коагуляция указанными субстанциями не блокируется терапевтическими дозами нефракцио-нированных гепаринов и комплексом "гепарин-антитромбин ИГ', однако она весьма чувствительна к антикоагулянтному действию низкомолекулярных гепаринов (Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Колтакова С.И., 1993; Цывкина Л.П., 1997; Шилова А.И., Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Момот А.П., 2001).

Эти особенности коагулаз дают возможность выявлять фоновое состояние свертывающей системы крови в периоды проведения гепаринотерапии, дифференцировать гепариновую гипокоагуляцию с гипокоагуляцией, связанной с коагу-лопатией потребления, а также определять прогноз некоторых гемокоагуляцион-ных дисфункций (Баркаган З.С., 1988; Момот А.П., 1997; Цывкина Л.П., 1997).

Патологические эффекты на плазменный гемокоагуляционный каскад змеиных ядов, обладающих гемокоагулирующими свойствами, известны уже очень давно (Boffa М., Josso F., Boffa G., 1972; Denson К., Russel F., Almagro D. et al., 1972), однако механизмы этого действия длительное время оставались невыясненными. Это было связано с тем, что многие стороны процесса свертывания были расшифрованы лишь в последние десятилетия.

Согласно современным представлениям, в состав ядов многих змей входят сериновые протеазы либо металлопротеиназы, вызывающие внутрисосудистое свертывание с нарушением сосудистой проницаемости и реактивности (Колтакова С.И., 1984; Цывкина Л.П., 1985; Глазунова Г.А., 1988; Баркаган З.С., 2000;

Miller R., Tu A., 1989; Shimokawa K., Takahaschi H., 1993). В ядах некоторых видов змей содержатся, вместе с тем, и компоненты, препятствующие свертыванию крови, причем механизмы этого антикоагулянтного действия различны и реализуются на разных уровнях коагуляционного каскада (Цывкина Л.П., Угарова Т.П., 1989; Ouyand С., Jand F., 1975,1976; Сох А.С., 1993; Kini R.,1996). Одним из этих антикоагулянтов является фосфолипаза А2, вызывающая гидролиз мембранных фосфолипидов, на которых согласно современным представлениям, активируются и взаимодействуют факторы свертывания крови (Ami R., Ward R., 1996). Найдены и различные протеазы, обладающие фибрино - и/или фибриногенолитическим действием (Baker В., Tu А., 1996).

Так, при исследовании яда щитомордника (Agkistrodon halys halys) были обнаружены содержащиеся в нем протеолитические компоненты, которые обладают прямым фибринолитическим действием, но не оказывают активирующего влияния на плазменные компоненты системы фибринолиза (Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Перегудова И.Г. с соавт., 1988; Цывкина И.Г., Угарова Т.П., 1989; Перегудова И.Г., 1992). Герпетоксины содержат также компоненты, оказывающие влияние на тромбоциты, причем, как подавляющие спонтанную и индуцированную агрегацию (Kamiguti A.S.; 1995), так и активирующие агрегацию тромбоцитов (Hafner G., Niemann F., Erbes H. et al., 1997).

Кроме того, в ядах некоторых представителей рода Bothrops обнаружена металлопротеиназа, вызывающая фактор Виллебранда-зависимую агглютинацию формалинизированных и лиофилизированных тромбоцитов, которая прямо пропорциональна концентрации в плазме и мультимерности фактора Виллиб-ранда (Read М., Potter Y., Brinkhous К., 1983). В связи с чем их стали использовать для диагностики болезни Виллибранда (Brinkhous К., Read М., 1980; Brinkhous К., Read М., Fricke W. et al., 1983).

Однако наиболее важны компоненты змеиных ядов, обладающие гемокоа-гулирующим действием, способные активировать факторы свертывания крови на разных уровнях гемокоагуляционного каскада.

В настоящее время гемокоагулирующие фракции ядов применяются в гемостазиологии при решении следующих четырех основных задач:

1. Для расшифровки патогенетических механизмов и создания экспериментальных моделей некоторых широко распространенных видов патологии гемостаза, в частности, тромбозов и ДВС синдромов (Глазунова Г.А., 1988; Момот А.П., 1997; Батрак Т.А., 1999; HasibaU. et al., 1975).

2. Для углубленного изучения малоизвестных механизмов функционирования и взаимодействия, отдельных компонентов системы гемостаза, при нарушениях конечного этапа свертывания (Баркаган З.С. и соавт., 1988, 1994; Ца-лихин А.Д., 1991; Перегудова И.Г., Суханова Г.А., 1993; Цывкина Л.П., 1997; Chester. A., Crauford G., 1982; Kagawa Н. et al., 1991).

3. В качестве реагентов для лабораторной диагностики нарушений гемостаза и контроля за эффективностью проводимой терапии (Баркаган З.С., Цывкина Л.П., 1984, 1988; Калмыкова И.Б. и соавт., 1988; Ехпег Т., Papadopulos G., Koutts J., 1990).

4. В качестве лечебных препаратов, например, дефибринирующего анти-тромботического действия (Stocker К., William R., 1988).

Важным звеном в исследовании змеиных ядов было определение узкоспецифических точек приложения последних в гемокоагуляционном каскаде, и отличие их влияния на систему гемостаза от естественных ферментов (рис. 1).

Согласно локусам воздействия на систему гемостаза, все гемокоагулирующие эффекты ядов подразделяются на следующие четыре группы (Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Калмыкова И.Б., 1989; Nahas L., Kamiguti A., Barras А., 1979):

1) активация фактора X; 2) активация фактора V; 3) активация фактора II; 4) активация фактора I (фибриноген). К активаторам фактора X и V из представителей отечественной герпетофауны относится гюрза обыкновенная (Vipera lebetina turanica) (Баркаган З.С., 1960-1964; Aronson D., 1988). Установлено, что гемокоагуляционный эффект этого яда, действующего через прямую активацию фактора X, реализуется в присутствии ионов кальция, фактора V и фосфолипидного компонента тромбоцитов (Баркаган З.С., 1977; Цывкина Л.П., 1985, 1997). На этой основе были разработаны лабораторные методы исследования системы гемостаза, в том числе способ ко личественного определения фактора X; методика разграничения дефицита фактоконтакт

Тканевой

Ха+3 пф+Са++ г

Яд эфы -II -Ila -XIII

Яд щитомордника-фибриноген ХШа фибрин — фибрин S — Фибрин I мономер

Рис. 1 Точки приложения действия змеиных ядов в гемокоагуляционном каскаде ров VII и X; способ оценки доступности фосфолипидного компонента тромбоцитов (3 пластиночного фактора) в процессе свертывания крови (Цывкина Л.П., 1985; Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Калмыкова И.Б., 1989; Иванов Е.П., 1991; Сахарова О.И., Шадыбекова О.Б., 1995).

Совсем недавно были обнаружены новые свойства яда гюрзы обыкновенной, коагуляционный эффект которого в значительной степени зависит от уровня ПФМ в крови. В связи с этим тест с указанным ядом (лебетоксовый тест) получил новое применение - выявление "волчаночных" антикоагулянтов (ВА), циркулирующих в крови при таком широко распространенном состоянии, как антифосфолипидный синдром (АФС) (Баркаган З.С. и соавт., 1991-1996; Дорохов А.Е., Сердюк Г.В., 1991; Цывкина Л.П., 1997; Ехпег Т., Papadopulos G., Koutts J., 1990; Petri M., Nelson L. et al., 1991).

Специальные фундаментальные исследования, проведенные на молекулярном уровне, показали, что яд гадюки Рассела, как тромбин и трипсин, превращает присутствующие в плазме разновидности фактора X в активную форму этого белка - фактор Ха, и в отличие от двух последних, яд не активирует фактор II (протромбин), хотя гемокоа-гулирующий эффект яда блокируется преимущественно нефракционированным гепарином и в меньшей степени низкомолекулярными гепаринами (Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Колтакова С.И., 1993; Цывкина Л.П., 1997; Шилова А.И. и соавт., 2001; Aung-Khin М., Ма-Ма К., Zin Т., 1977).

Наряду с ядом гюрзы для исследования свертывания крови используют также и яд эфы многочешуйчатой (Echis multisquamatus), обладающий прямым активирующим влиянием на фактор II (Franza В., Aronson J., 1975). Указанное обстоятельство было подтверждено при испытании очищенных коагулаз яда эфы (экарина). На основе этих фактов были разработаны и апробированы методы лабораторного контроля за терапией антагонистами витамина К, способы количественного определения фактора II и дифференциации дефицита и качественной аномалии протромбина и других факторов свертывания с использованием ядовых диагностикумов (Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Калмыкова И.Б. и соавт., 1988; Цывкина Л.П., 1997; Denson К., Borrett R., Biggs R., 1971; Tellersrud О., Helgeland L., 1986; Kornalik F., 1988; Exner Т., 1993). Установлено, что механизмы трансформации протромбина в тромбин при физиологическом свертывании крови, а также при активации гемокоагуляции энзимами змеиных ядов существенно отличаются друг от друга. Так, яд эфы многочешуйчатой, являясь активатором протромбина, не потенцируется тромбоцитами и кефалином. Вместе с тем, образующийся мейзотромбин, в отличие от обычного альфа-тромбина, не блокируется гепарином и комплексом "антитромбин III - гепарин", однако сохраняет чувствительность к антикоагулянтному действию низкомолекулярных гепаринов. Это обстоятельство позволяет использовать тест с ядом эфы (эхитоксовый тест) для оценки фонового состояния гемокоагуляци-онного каскада на фоне проводимой терапии гепарином, а также для дифференциальной диагностике между гепарининдуцированной гипокоагуляцией и гипокоагуляции, вызванной нарушениями свертывания крови при ДВС синдроме. Одним из важных свойств яда эфы является способность свертывать не только обычный фибриноген, но и тромбинрезистентные высокомолекулярные производные фибриногена, так называемый "заблокированный" фибриноген, количество которого резко возрастает при тяжелых формах внутрисосудистого свертывания крови (Баркаган З.С. и соавт., 1982; Баркаган З.С. и соавт., 1983-1984; Цывкина Л.П., 1985, 1997; Момот А.П. и соавт., 1988; Цывкина Л.П., Момот А.П., 1991; Момот А.П., 1997). При этом, тест с ядом эфы наиболее достоверно и надежно, в отличие от других коагуляционных тестов, выявляет гиперкоагуля-ционный сдвиг при тромбозах магистральных сосудов, у больных с острым ДВС-синдромом, в том числе на фоне гепаринотерапии, а также в стадии гипокоагуляции при ДВС-синдроме, определяя истинное содержание в плазме производных фибриногена (Цывкина Л.П., 1997; Батрак Т.А., 1999). Это делает указанный герпетоксин уникальным инструментом при лабораторной диагностике ДВС-синдрома, позволяет более полно оценивать содержание в плазме и сыворотке крови компонентов фибриногенового пула. Эти разработки еще больше расширяют сферу применения змеиных ядов в лабораторной диагностике.

Среди токсинов змей, вызывающих свертывание крови, наиболее полно изучены яды, точкой приложения которых является фактор I (фибриноген). В литературе их принято называть тромбиноподобными, хотя ни один из них не обладает полным спектром свойств тромбина (Kornalik F., 1985; Stacker К., Meier I., 1988). Из ядов отечественной герпетофауны для исследования свертывания крови на уровне его конечного этапа наиболее часто используется яд щитомордника обыкновенного (Agkistrodon halys halys). Гемокоагулирующее свойство данного яда впервые началось изучаться в 1965-1966 гг. (Баркаган З.С., Мительман Л.Ш., 1965).

Ранее в исследованиях ведущих отечественных гемотрансфузиологов (Колта-кова С.И., Цывкина Л.П., 1980; Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Медведь Л.В. и соавт., 1988; Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Перегудова Л.П. и соавт., 1988) было показано, что в яде щитомордника обыкновенного (Agkistrodon halys halys) содержится про-теаза, отщепляющая от фибриногена только фибринопептиды А и образующая тем самым рыхлый дез-АА-фибрина. В настоящее время его используют как анцистро-доновый диагностикум с тромбиноподобным действием. В отличие от естественного тромбина, коагулаза яда от каждой молекулы фибриногена отщепляет лишь пептиды А, оставляя интактными пептиды В, не активирует фактор XIII и не вызывает ретракцию кровяного сгустка, образует не нестабилизированный фибрин, легкорастворимый в 5М мочевине. Указанный яд с успехом используется не только для расшифровки нарушений конечного этапа свертывания крови (Перегудова И.Г., Цывкина Л.П., 1991; Угарова Т.П., Мельник В.Н., Горницкая О.В., 1995), но и в терапии тромбозов. Коагуляционный эффект яда щитомордника не блокируется неф-ракционированным гепарином и комплексом "антитромбин III - гепарин", но чувствителен к антикоагулянтному действию низкомолекулярных гепаринов (Глазунова Г. А. и соавт., 1988; Цывкина Л.П., 1997).

Несмотря на имеющиеся сведения о значении гетерогенных коагулаз ядов змей отечественной фауны для распознавания отдельных нарушений течения гемостазиологического каскада, большинство вышеприведенных работ посвящены изучению данного вопроса у взрослого контингента больных. Поскольку до настоящего времени отсутствуют данные о применении ядовых диагности кумов в распознавании и дифференциации нарушений системы гемостаза у детей, то это составило предмет настоящих исследований.

153 ВЫВОДЫ

1. По данным эхитоксового и анцистродонового тестов, при наследственных тромбоцитопатиях и гемофилии возможны нарушения на конечном этапе свертывания крови, связанные с дисфибриногенемией. У детей с фоновой системной мезенхимальной дисплазией они встречаются чаще, чем в группе больных без СМД - в 55,8% и 79,1% случаев соответственно и при этом существенно влияют на течение указанных геморрагических заболеваний.

2. При проявлениях фоновой СМД у 88,4% из этих больных одновременно нарушен процесс аутополимеризации мономеров фибрина, что подтверждает наличие фоновой (скрытой) дисфибриногенемии.

3. Аналогичные сдвиги на базе ядовых проб и методов оценки процессов аутополимеризации мономеров фибрина обнаруживаются у 94% больных геморрагическим васкулитом, протекающем на фоне СМД. Сопутствуя ГВ, дисфибриногенемия определяет выраженность и нетипичность геморрагического синдрома, склонность его к затяжному течению, а также недостаточную эффективность проводимой патогенетической терапии.

4. В ходе развития и прогрессирования острого (подострого) ДВС-синдрома эхитоксовый тест более чувствительно и специфично обнаруживает скрытую гиперкоагуляцию, чем другие ядовые и традиционные коагуляционные пробы. При этом скорость полимеризации мономеров фибрина замедляется по мере увеличения в плазме уровня РФМК, свидетельствуя о наличии «заблокированного» фибриногена.

5. К новому лабораторному признаку, свидетельствующему о возможном неблагоприятном исходе острого ДВС крови, следует отнести прогрессирующее увеличение времени свертывания крови в эхитоксовом тесте.

6. ЭХТ чувствительно оценивает эффект средних и высоких доз фраксипарина у больных с ДВС синдромом, что позволяет его использовать для лабораторного контроля за действием НМГ.

7. Ядовые пробы и способы оценки процессов ауто- и гетерополимеризации мономеров фибрина высоко чувствительны, специфичны, существенно дополняют результаты исследования системы гемостаза с помощью общих коагуляционных тестов при различных нарушениях свертывания крови и не уступают им по степени информативности, что позволяет широко использовать их в педиатрической практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1) Для выявления фоновой дисфибриногенемии у детей с наследственными тромбоцитопатиями, гемофилией и геморрагическим васкулитом, сочетающихся с системной дисплазией соединительной ткани, следует дополнительно применять быстро выполнимые диагностические тесты с использованием коагуляционных ядов змей отечественной фауны, а также методы, оценивающие скорость ауто- и гетерополимеризации мономеров фибрина.

2) При уточнении состояния конечного этапа свертывания крови у больных с тромботическими и тромбогеморрагическими синдромами могут быть использованы тесты с ядом щитомордника, ядом эфы, а также методы исследования скорости ауто- и гетерополимеризации мономеров фибрина.

3) Для выявления явной и скрытой гиперкоагуляции у больных с микротром-боваскулитами и ДВС-синдромами рекомендуется применение эхитоксового теста.

4) Лабораторный контроль за действием фраксипарина у больных с ДВС-синдромом может осуществляться с помощью яда эфы, чувствительно обнаруживающего скрытую гиперкоагуляцию вплоть до стадии развития гипофибриногене-мии.

5) Ядовые тесты имеют ряд преимуществ перед традиционными методами исследования системы гемостаза, не уступают им по информативности, оперативны, доступны для любой лаборатории, что позволяет их рекомендовать для широкого применения в педиатрической практике.