Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Клинико-диагностическое значение герпетотоксинов в распознавании основных видов патологии системы гемостаза

РГ8 ОД 2 3 «ЮН 1997

На правах рукописи

\

ЦЫВКИНА Людмила Петровна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГЕРПЕТОТОКСИНОВ В РАСПОЗНАВАНИИ ОСНОВНЫХ ВИДОВ ПАТОЛОГИИ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

14.00.29 - гематология я переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Барнаул - 1997

Работа выполнена в Алтайском государственном медицинском университете.

Член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ доктор мед. наук, профессор З.С.Баркаган

Академик РАМН,, доктор мед. наук, профессор Е.Д.Гольдберг

Доктор мед. наук, профессор А.В.Чупрова

Доктор мед. наук, профессор Г.А.Глазунова

Ведущая организация: Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии (г. Санкт-Петербург).

Защита состоится 1997 г.

в _ часов на заседании диссертационного совета Д 084.25.01

при Алтайском государственном медицинском университете по адрес,

656099, г. Барнаул, пр. Ленина, 40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Алтайского государственного медицинского университета. Адрес библиотеки: 65601' г. Барнаул, ул. Папанинцев, 144.

Автореферат разослан " /Л " 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сдвиги в системе гемостаза занимают одно из центральных мест среди общепатологических процессов. С ними связаны различные вицы кровоточивости, тромбозы, инфаркты и ишемии органов, синдромы диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови и полиорганной недостаточности, нарушения микроциркуляции и ряд других широко распространенных видов патологии (М.С.Мачабели, 1972-1986; З.С.Баркаган, 1980-1989; В.П.Балуда и др., I98I-I9S4; М.Ферстрате, Ж.Фермилен, 1986; И.Н.Бокарев и др., 1989; Д.Д.Зербино, Л.Л.Лукасевич, 1989; В.Г.Лычев, 1993;" o.D.Hat-noff, Ch.D.iorbes, 1984; R.Z.Bick, 1985; u.U.Seghatchian et al., 1996 и др.). Важное место эти нарушения занимают в патогенезе критических и терминальных состояний, ряда форм акушерской патологии, атеросклероза, метастазировании опухолей и многих других широко распространенных видов патологии (З.С.Баркаган, 1980, 1996; O.K. Гаврилоэ, 1981; А.Д.Макацария, 1981; Л.П.Папаян, 1982; Е.И.Чазов, 1983; Д.М.Зубаиров, 1985; Е.Ю.Васильева, 1992; А.В.Чупрова, 1994; Е.Р.Иалиеп et al., 1988; Н.Callender, S,J.Kapaport, 1993; T.Bar-bui et al., 1995; Asherson et al., 1996).

Развитие современного учения о системе гемостаза, как и совершенствование диагностики ее нарушений на всем своем протяжении было неразрывно связано с изучением Эффектов и использованием в клинической практике гетерогенных коагулаз и других активаторов и ингибиторов различных звеньев этой системы. Это относится как к содержащимся в бактериальных клетках и грибах компонентам (стреп-токиназа, стафиллокоагулаза и др.), так и к таковым в продуктах животного происхождения (гирудин, гепарин, коагулазы и ингибиторы из змеиных ядов и др.)

В трудах зарубежных авторов (X.W.E.Denaon et al., 1971;

В.R.Pranza et al., 1975; E.Sakuragawa et al., 1975; W.Kisiel et al., 1976; û.iiebs, 1973; S.S.Bajwa et al., 1930, 1931; F.Korna-lik et al., 1933; 1983; K.P.Stocker, J.Meier, 1988 ), a такте В отечественных работах, в том числе нашей группы (З.С.Баркаган и др., I977--1996; Л.П.Цывкина, 1977-1985; Л.П.Цывкина и др., 19771991; Г.А.Глазунова и др., 1983; Г.А.Глазунова, 1988; Т.П.Угарова, 1989) были расшифрованы точки приложения и механизмы действия гемокоагулирующих змеиных ядов и разработаны на этой основе оригинальные методы диагностики ряда нарушений гемостаза, В, частности, показана возможность с помощью герпетотоксинов выявлять дефицит ряда факторов свертывания, оценивать содержание в плазме тромбинорезистентных компонентов фибриногенового пула, диагностировать ряд предтромботических состояний. Эти методы диагностики прошли широкое клиническое испытание, успешно внедрены в повседневную диагностическую практику, фигурируют в руководствах по лабораторной диагностике (В.П.Балуда и др., I960; Под ред. М.А. Базарновой, 1982; В.Г.Михайлов, Г.А.Алексеев, 1986; Под ред. В.В.Меньшикова, 1987; Иванов Е.П., I99D.

Установлено также, что использование герпетотоксинов и содержащихся в них прогеаз базируется не столько на сходстве, сколько на фундаментальных отличиях этих энзимов от естественных компонентов свертывающей системы крови (З.С.Баркаган, Л.П.Цывкина, 1981 ; Л.П.Цывкина, 1935 и др.).

Последнее десятилетие ознаменовалось значительным прогрессом учения о механизмах свертывания крови, разработкой матричной теории этого процесса (Д. М.Зубаиров, I98U; Д. М.Зубаиров и др.,1985-1991; О.А.Терсенов, А.Ш.Бышевский, 198«; А.Ш.Бышезский и пр.. 1993 и др.), открытием большого числа ранее неизвестных видов патологии системы гемостаза, в том числе большого числа наследственных и приобретенных тромбофилий (З.С.Баркаган, 1991, 1996). В связи

с этим возникла необходимость выяснения степени участия плазменных фосфолипицных мембран (ПФМ) и их аналогов в самих ядах в реализации гемокоагулирующего действия этих энзимов, возможности использования ядов змей отечественной фауны в диагностике ряда вновь выявленных видов патологии, в том числе антифосфолипидного синдрома (АФС) и других тромбофилий, нарушений полимеризации мономеров фибрина, в частности при геморрагических мезенхимальных дисплазиях, выявления в сыворотке "заблокированного" фибриногена при ДВС синдромах.

В настоящей работе, являющейся частью крупномасштабных исследований по проблеме диагностики и терапии нарушений гемостаза,проводимых в Алтайском государственном медицинском университете и зональном гематологическом центре под руководством члена-корреспондента РАМН, доктора мед. наук, профессора З.С.Баркагана, обобщаются результаты наших многолетних исследований по изучению механизмов действия и использованию в диагностике герпетотоксинов отечественной фауны.

Цель работы. Дальнейшее изучение механизмов действия гемокоа-гулирующих змеиных ядов и их фракций на систему гемостаза, определение возможностей их использования в диагностике ряда видов патологии системы гемостаза, в том числе вновь открытых форм геморрагических мезенхимальных дисплазий и тромбофилий, разработка коа-гулометрических вариантов этих методик и создание на этой основе новых диагностикумов.

Задачи исследования.

I. Провести дальнейшее изучение влияния змеиных ядов и входящих в их состав компонентов на разные звенья системы гемостаза с учетом их взаимодействия с компонентами системы гемостаза на плазменных фосфолипидных мембранах и аналогичных надмолекулярных сое-

динениях, содержащихся в самих ядах. Разграничить на этой основе коагулэзы ядов на фосфолипид-зависимые и фосфолипид-независимые.

2. Определить влияние гемокоагулирующих змеиных ядов отечественной фауны на конечный неферментативный этап свертывания крови

- полимеризацию мономеров фибрина, уточнить значение этого влияния на показания коагуляционных тестов в норме и при различных нарушениях гемостаза, в том числе при геморрагических мезенхималь-ных дисплазиях.

3. Разработать на основе кинетического способа методику определения некоагулирующих (заблокированных) компонентов фибриногено-вого пула, в том числе тромбинорезистентных, с помощью ядовой коа-гулазы с целью создания нового теста для распознавания ДВС синдрома. Сопоставить его результаты с показаниями новых количественных методов определения РФЖ и ранних ЦДФ - ортофенантролинового теста (0-ФТ) и сывороточного теста склеивания стафилококков (ТСС).

4. Изучить с помощью реагентов из змеиных ядов и оригинального образца эталонной плазмы без фактора У возможности создания доступных диагностических тестов для распознавания ряда наиболее распространенных тромбофилий - резистентности к протеину С, анги-фосфолипидного синдрома и др.

5. Дать сравнительную характеристику влияния нефракционирован-ного и низкомолекулярных гепаринов на гемокоагулирующие эффекты ядов змей отечественной фауны, обосновать использование этих гетерогенных коагулаз для дифференциации различных видов гипокоагуля-ции - коагулопатии потребления, гепариновой и др.

6. Адаптировать ядовые диагностические тесты для их выполнения на коагулометрах разных конструкций, дать сравнительный анализ мануальных и аппаратных вариантов методик.

7. Создать на основе проведенных исследований новые диагностические наборы.

6. Провести широкую клиническую апробацию ядовых тестов при различных видах патологии системы гемостаза, определить их информативность и возможности использования для проведения экспресс-диагностики.

Научная новизна.

1. Впервые изучено влияние плазменных фосфолипидных мембран и надмолекулярных компонентов, содержащихся в самих змеиных ядах на гемокоагулирующие эффекты этих токсинов. Обосновано разделение всех ядовых коагулаз на фосфолипид-зависимые и фосфолипид-незави-симые. Разработана методология использования коагулаз змеиных ядов для оценки степени фосфолипидной активации процесса свертывания крови и блокады ее антифосфолипицными антителами.

2. Выявлено неодинаковое влияние нефракпионированного гепарина СНГ) и низкомолекулярных гепаринов (НМГ) на гемокоагулирующие эффекты змеиных ядов. Показано, что чувствительность гетерогенных коагулаз к НМГ раскрывает новые возможности терапевтического воздействия на токсигенные ДВС синдромы.

3. Впервые показана возможность использования гемокоагулирую-щих ядов змей отечественной фауны для выявления эффектов различных видов антикоагулянтов волчаночного типа, диагностики антифосфоли-пидного синдрома.

4. Выявлено ранее неизвестное тормозящее влияние змеиных ядов на конечный этап свертывания крови - полимеризацию мономеров фибрина, что может служить основой для разработки новых методов использования этих токсинов для выявления дисфибриногенемией и оценки степени активации фактора ХШ.

5. Разработан (совместно с А.Н.Мамаевым) новый вариант методики распознавания с помощью реагента из змеиного яда тромбофилии, обусловленной резистентностью фактора Уа к активированному протеи-

ну С. Впервые показана высокая частота этой аномалии в российской популяции Сибири (Приоритетная справка на изобретение "Способ диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью фактора Уа к активированному протеину С", 96116110, 1996 г. Россия).

6. Показана возможность определения с помощью ядов песчаной и многочешуйчатой эфы.;содергания в сыворотке крови растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) и других производных фибриногена (Авторское свидетельство на изобретение ?? 1146002, 1984 г. СССР).

У. Впервые установлена высокая частота мезенхимальной дисплазии, сочетающейся с нарушениями полимеризации мономеров фибрина у значительной части больных гемофилией.

Практическое значение.

Разработаны оригинальные методики диагностики нарушений гемостаза и дефицита ряда факторов свертывания крови (X, П, I) с помощью ядовых коагуляционных проб. Разработан новый способ диагностики антифосфолипидного синдрома ( АФС )<••.'.-.■ с помощью теста с разведенным ядом гюрзы (совм. с И.Я.Цеймах). Создан совместно с А.Н.Мамаевым доступный метод фенотипической диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью к активированному протеину С.

Показана возможность использования ядовых тестов для выявления нарушений конечного этапа свертывания крови - полимеризации мономеров фибрина и определения пула заблокированного фибриногена в сыворотке крови, диагностики этих нарушений при ГЭДЦ и ДВС синдромах. Установлена возможность диагностики с помощью, ядовых тестов гииеркоагуляиии, в т.ч. замаскированной гепаринотерапией.

Разработан (совм. с И.Я.Цеймах) автоматизированный вариант выполнения коагуляционных тестов с ядами змей и проведено сравнительное изучение их показаний в мануальном исполнении и на опти-

веском и шариковом коагулометрах. Определены нормативные показатели этих тестов.

Разработана планшетная технология создания ядовых диагностических наборов, предназначенных для выявления нарушений в системе гемостаза, что упрощает методику и значительно уменьшает затрату времени и реагентов на выполнение исследований.

Внедрение в практику.

Разработанные методы и диагностические наборы внедрены в практику работы в лаборатории гемостаза Алтайского краевого гематологического центра, Алтайской краевой клинической больницы, гематологического центра РАМН (г. Москва), клинико-диагностической лаборатории НИИ Педиатрии и детской хирургии Ш России (г. Москва), лаборатории гемостаза Тульской областной больницу и других научно-исследовательских и лечебных учреждений РФ и СНГ.

Налажен выпуск соответствующих диагностикумов фирмой "Технология-Стандарт" (г. Барнаул).

Предложенные способы диагностики изложены в следующих методических рекомендациях:

1. Диагностика нарушений гемостаза с помощью змеиных ядов. Ш СССР, М., 1988. - 21 с. (совм . с 3.С.Баркаганом, И.Б.Калмыковой, В.А.Макаровым и др.).

2. Антикоагулянты волчаночного типа. Клиническое значение, диагностика, лечение. Барнаул, 1993. - 18 с. (совм. с 3.С.Баркаганом,. Г.В.Сердюк, А.Е.Дороховым).

По результатам НИР получены авторские свидетельства на изобретения:

1. Способ количественного определения фибриногена в плазме крови. № 1146002, 1964, СССР. (совм. с З.С.Баркаганом).

2. Способ определения пригодности змеиных ядов для коагулоло-

гических исследований, f 1628698, 1990, СССР (совм. с З.С.Баркага-ном, И.Б.Калмыковой, В.А.Макаровым, Т.М.Шелеповой).

3. Получена приоритетная справка по заявке на изобретение "Способ диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью фактора Ya к активированному протеину С" (совм. с З.С.Баркаганом, А.Н.Мамаевым) 96II6II0, 1996, Россия.

Результаты выполненных исследований получили частичное отражение в следующих руководствах и монографиях:

1. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Е.Д. и др. "Лабораторные методы исследования системы гемостаза" Томск, I960.

2. Руководство по клинической лабораторной диагностике /под ред. М.А.Базарновой. Киев, 1982.

3. Михайлов В.Г., Алексеев Г.А. "Исследование системы гемостаза". Ташкент, 1986.

4. Лабораторные методы исследования в клинике /под ред. В.В. Меньшикова. М., 1987.

5. Иванов Е.П. "Руководство по гемостазиологии", Минск ,1991.

Основные положения работы доложены и обсуждены: на 9-м Европейском симпозиуме по животным, растительным и бактериальным токсинам (Лохусалу, Эстония, 1990); 26-м Гамбургском симпозиуме по свертыванию крови (1993); У1 Международном симпозиуме по антифос-фолипидным антителам (Левен, Бельгия, 1994); II Всемирном конгрессе по животным , растительным и микробным токсинам (Тель-Авив, Израиль, 1994); 14 Международном конгрессе по тромбозам (Монпелье, Франция, 1996); ХУ1 Международном конгрессе по тромбозам и гемостазу (Флоренция, Италия, 1997). На Всесоюзных конференциях: "Про-тивотромботическая терапия в клинической практике. Новое в терапии, диагностике, лечении" (М., 1986); 6 и 7-й Всесоюзных герпетологических конференциях (Ташкент, 1985; Киев, 1989); Конференции "Биологически активные вещества" (Вильнюс, 1988); "физиология и патология

гемостаза" (Полтава, 1991); 3-м Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (Киров, 1991); 2-й Всесоюзной токсинологической конференции (Ашхабад, 1991); на Республиканской научно-практической конференции работников службы крови РФ (Кемерово, 1986); Съезде гематологов и трансфузиологов Грузии (Боржоми, 1988); Всероссийском съезде терапевтов (Горький, 1989); Конференции врачей-лаборантов Эстонии ,"Актуальные вопросы лабораторной диагностики" (Таллин, 1989); Российских конференциях "Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 1995); "Тромбозы и геморрагии, ДВС синдром. Проблемы лечения" (М., 1997).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 39 работ, из них 2$ в центральной и 8 - в зарубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 256 стр. машинописи, иллюстрирована 72 таблицами и 21 рисунком. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 9 глав с изложением результатов собственных наблюдений и исследований, заключения, выводов и списка литературы (363 источника).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. По гемокоагулируюцему действию змеиные яды и их коагулазы могут быть подразделены на фосфолипид-зависимые и фосфолипиц-не-зависимые. К первой группе из ядов змей отечественной фауны относится яд гюрзы, ко второй - яды эф и щитомордников. Выявление этой закономерности служит базой для более рационального использования ядов в диагностике нарушений гемостаза.

2. Тест с разведенным фосфолипиц-зависимым ядом гюрзы может быть использован для диагностики антифосфолипидного синдрома и выявления эффектов волчаночного антикоагулянта, а также для контроля за достаточностью элиминации из крови больных "фосфоли-пид-антительных" комплексов в процессе лечения.

3. Гемокоагулирующие змеиные яды тормозят неферментативную фазу конечного этапа свертывания крови - полимеризацию мономеров фибрина, в связи с чем тесты с токсинами эфы и щитомордника могут быть использованы для диагностики нарушений этого процесса при геморрагических мезенхимальных дисплазиях.

4. Установлено различное влияние на гемокоагулянию, вызываемую змеиными ядами, обычного и низкомолекулярных гепаринов: первый не препятствует действию ядов эфы и щитомордника, в то время как низкомолекулярные гепарины тормозят свертывание этими ядами.

6. У больных гемофилиями А и В наряду с основным дефектом свертывания в 18,0rfo выявляется врожденная мезенхимальная дисплазия, сопровождающаяся нарушением полимеризации мономеров фибрина, что говорит о необходимости исследовать у указанных больных конечный этап свертывания крови.

6. Разработанный совместно с А.Н.Мамаевым плазменный реагент с активированным протеином С позволяет проводить фенотипическую диагностику одной из наиболее частых форм тромбофилии - обусловленной резистентностью аномального фактора Ya к активированному протеину С (АПС-Р).

7. АПС-Р - частый вид патологии гемостаза в российской популяции Сибири.

Работа выполнена на кафедре внутренних болезней и гематологии (зав. - член-корр. РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор мел. наук, профессор З.С.Баркаган) Алтайского государственного медицинского университета (ректор - доктор мед. наук, профессор В.М.Брюханов) по основному плану НИР (тематическая карта " 140-02) в соответствии с утвержденным Комитетом по науке и технике при Совете Министров Российской Федерации планом приоритетных научных работ по программе 0.69.06. раздел 02.01.Д.

Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю и учителю, д.м.н., профессору З.С.Баркагану за постоянный интерес к работе, ценные советы и замечания.

Выражаю искреннюю признательность за товарищескую помощь и совместные исследования профессору В.Б.Гервазиеву, доценту С.И. Колтаковой, старшему научному сотруднику, к.м.н. А.П.Мзмоту, к.м.н. А.Е.Дорохову, к.м.н. А.А.Карпенко, к.м.н. И.Г.Перегудовой, аспирантам А.Н. Мамаеву и И.Я.Цеймах, сотрудникам лаборатории гемостаза Г.А.Сухановой, врачам Е.Ф.Котовщиковой, Т.А.Соломиной, лаборантам О.А.Черепановой, Т.А.Лапшиной, 'Г.Г.Усовой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа состоит из двух разделов - экспериментального и клинико-лабораторного.

Экспериментальный раздел включает в себя следующие виды исследований (20 серий опытов, 600 исследований):

1. Модельные опыты по изучению ранее неизвестных или мало изученных механизмов влияния ядов змей отечественной фауны на разные звенья системы гемостаза, в том числе их взаимодействия с плазменными фосфолипидными (матричными) мембранами (ПФМ).

2. Исследование влияния ядов на неферментную фазу конечного этапа свертывания крови - полимеризацию мономеров фибрина (Ш).

3. Изучение влияния на коагулирующие эффекты ядов нефракпиони-рованного гепарина (НГ) и низкомолекулярных гепаринов (НМГ).

4. Разработку новых и модификацию ранее созданных, в том числе и нами, методов исследования системы гемостаза с использованием змеиных ядов и их компонентов, в том числе создание метода суммарного количественного определения концентрации в плазме и сыворотке компонентов фибриногенового пула, включая тромбино-резистентный фибриноген и РФМК в тесте с ядом эфы у больных с ДВС синдромом.

5. Разработку на базе теста с разведенным ядом гюрзы метода диагностики антифосфолипидного синдрома (АФС) по эффектам волча-ночного антикоагулянта (ВА).

6. Разработку модифицированного способа фенотипической диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью к активированному протеину С.

7. Совершенствование методологии лабораторных исследований, выполняемых со змеиными ядами, в том числе разработка методик идентификации ядов и оценки их пригодности для лабораторных исследований,

8. Перевод ядовых тестов с мануального варианта выполнения на коагулометрический; создание стандартных ядовых планшетных ди-агностикумов.

Экспериментальные исследования выполнены на 200 образцах плазмы здоровых людей, на 50 образцах референтной пулированной плазмы и на очищенном фибриногене фирм "Технология-Стандарт" (Барнаул) и "ЗеКгз-гцсЧГермания).

Клинико-лабораторный раздел включает результаты комплексного исследования системы гемостаза у 642 больных с различными видами патологии гемостаза 1табл. I) и 360 контрольных исследований на образцах обычной и пулированной плазмы.Контрольные исследования всегда проводились параллельно с основными. Кроме разработанных ядовых тестов проводилось исследование системы гемостаза традиционными методами. Они включали в себя следующие методики: а) тесты, характеризующие сосудисто-тромбоцитарный гемостаз : подсчет количества тромбоцитов в камере Горяева при фазовом контрасте или на счетчике Селл-Дин 3500 фирмы "Abbott"(США), определение спонтанной агрегации тромбоцитов по Н.И.Тарасовой (1979), исследование индуцированной (АДФ, коллаген, тромбин, адреналин, ристоцитин) агрегации тромбоцитов на тромбоагрегометре фирмы "Эритрон" (Москва),

Таблица I

Распределение обследованных больных по видам патологии, полу и среднему возрасту

Вид патологии

ЯЧисло обследованных больных¡Средний : всего : М : К :возраст

. Х+т

I. Наследственные коагулопатии 72 60 12 19,0+1,0

2. Геморрагические мезенхималь-ные дисплазии 182 59 123 26,4+2,4

3. Печеночная дксфибриногенемия 27 16 12 36,7+3,9

4. ДВС синдром 91 33 58 36,5+2,3

5. Острые тромбозы 102 51 ¿1 45,3+2,9

6. Привычное невынашивание беременности 20 _ 20 28,1+1,9

7. Системная красная волчанка СКВ - (без АФС и ВА) 48 р 46 37,5+2,1

8. Гематогенные тромбофилии 80 27 53 33,5+2,8

9. Неидентифииированный рецидивирующий тромбо-эмболический

синдром Всего

20 14 6 36,3+2,8

642 261 381

определение активности фактора Виллебранца; б) тесты, характеризующие коагуляционный гемостаз: каолиновое время бедной тромбоцитами плазмы (БТП), АПТВ, протромбиновый и тромбиновый тесты, определение содержания в плазме факторов ХП, XI, IX, УШ, УП, X, У и П, а также концентрации фибриногена гравиметрически по Р.А.Рут-берг (1961) и по С1аизз на коагулометре; в) антикоагулянты и фибринолитики: активность антитромбина Ш по АЬИ^аага et а1. (1970) в модификации К.М.Бишевского (1979), содержание протеина С (на хромогенных субстратах и коагулометрически), ХПа-зависимый

лизис эуглобулинов по Г.Ф.Еремину, А.Г.Архипову (1982); г) тесты, выявляющие тромбинемию по наличию в плазме и сыворотке РФМК: этаноловый тест ОТ), количественный ортофенантролиновый тест по , В.А.Елыкомову, А.П.Момоту (1987), тест склеивания стафилококков в сыворотке по методу З.С.Баркагана, А.П.Момота,(1990); д) тесты, выявляющие в плазме волчаночный антикоагулянт: каолиновый тест, АПТВ:( обычный тест и с плателином ЪБ фирмы "Органон-Текника"), протромбиновый тест с разведенным тромбопластином; подтверждающие коррекпионные тесты (с нормальной БТП и с разрушенными отмытыми тромбоцитами или тромбоцитином фирмы "Технология-Стандарт" (Барнаул).

С перечисленными тестами сравнивались изучавшиеся нами ядо-вые коагуляционные тесты.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Механизмы действия змеиных ядов на систему гемостаза и анализ возможностей их использования в диагностике коагулопатий

При комплексном исследовании системы гемостаза, в том числе с помощью ядовых тестов у больных с врожденными коагулопатиями была подтверждена возможность диагностики дефицита фактора X и дифференциации его с дефицитом фактора УП с помощью яда гюрзы-с применением ранее разработанного нами способа. Подтверждена также возможность применения яда эфы для выявления дефицита фактора П и разграничения последнего с недостатком других факторов протромби-нового комплекса (рис. I).

Анализ влияния гемокоагулирующих ядов на процесс полимеризации мономеров фибрина выявил ранее неизвестный феномен торможения этого процесса изучавшимися ядами (табл. 2).

Коагуляционная активность (%)

120

Рис.1

12 3 4 Контроль

12 3 4

Дефицит фактора VII

12 3 4

Дефицит фактора X

12 3 4

Дефицит фактора II

Показания АПТВ (1), протромбинового (2), лебетокс-кефалинового (3) и эхитоксового тестов у больных с дефицитом различных факторов протромбинового комплекса.

Таблица 2.

Влияние змеиных ядов на скорость полимеризации мономеров фибрина

Рд.^.ц^,, ¡Скорость полимеризации мономеров геагенты ._фибрина (сУ____

:В основных тестах:В смеси ядов с противо-___:_:ядными сыворотками

Разведение МФ буфером без ядов (контроль)

С введением в тест-систему яда гюрзы

С введением в тест-систему яда эфы

С введением в тест-систему яда щитомордника

С введением в тест-систему'анцистрона-Н

С введением в тест-систему рептилазы

11,5+0,8 12,8+0,8

44,6+1,3 42,7+1,4

нет полимеризации

нет полимеризации 62,5+1,5 65,3+1,5

37,4+0,6 38,5+1,1

Это послужило основанием для использования тестов с ядами эфы и щитомордника для распознавания нарушений конечного этапа свертывания крови у больных с геморрагическими мезенхимальными дисплазиями (ГЭДЦ). При исследовании 182 таких больных впервые была показана возможность выявления нарушений конечного этапа свертывания крови тестами с ядами эфы и щитомордника, установлено, что почти у 30% больных с ГВД имеется нарушение полимеризации МФ. Этот вариант патологии легко диагностируется по замедлению свертывания в пробах с ядом эфы и щитомордника, (табл. 3).

У 5,о% больных ГВД выявлено не описанное ранее нарушение -замедление свертывания только в тесте с ядом эфы, которое может трактоваться как наличие диспротромбинемии.

Таблица 3

Результаты исследования коагуляционного гемостаза .у больных ГОД

КонтрольгПоказания (Х+ л) тестов у больных ГЩ :при разных дйспластических синдромах

(л+:п) ;с ангй0_ ;с поракени-:с пролап-:с нефро-:дисплази-:ем опорно-:сом мит- :птозом :ями ;двигатель- :рального :

: :ного аппа- :клапана :

: :рата

: (п=56) : (л-77) : (п=30) : (п=19)

АПГВ, с 42,а+С,5 46,2+1,1 49,3+1,2 49,0+1,6 47,5+1,6

Р 0,001 0,001 0,001 0,01

Протромбино-вый, с 16,8+0,1 16,7+0,3 15,9+1,1 17,0+0,4 16,2+0,5

Р 0,5 0,5 0,5 0,5

Тромбиновый, с 15,5+0,I 15,9+0,7 16,6+0,5 10,4+0,2 15,3+0,9

Р 0,5 0,5 0,5 0,5

С ядом эфы, с 30,4+1,1 32,4+2,4 34,9+1,9 34,5+1,0 34,8+1,7

Р 0,5 0,05 0,01 0,05

С ядом щитомордника, с "29,5+1,1 33,5+2,2 38,4+1,3 36,1+1,4 35,6+1,5

Р 0,2 0,001 0,001 0,01

Фибриноген, г/л 3,1+0,2 3,2+0,2 3,4+0,5 3,1+0,1 3,1+0,3

Р 0,5 0,э 0,5 0,5

Аутополимери-зация МФ 16,1+0,1 19,5+1,4 23,4+0,9 26,4+1,6 20,3+1,2

Р 0,02 0,001 0,001 0,01

Гетерополиме-ризапия МФ 15,3+0,1 16,8+1,2 17,5+0,8 17,5+0,9 17,4+1,2

Р 0,5 0,01 0,0а 0,1

Примечание: Р - показатель достоверности отличия от контроля.

При клинико-лабораторном обследовании 150 больных гемофилией мы у 27 из них (18%) выявили признаки мезенхимальной дисплазии.

Показания ядовых тестов и скорости полимеризации мономеров фибрина у больных гемофилией с признаками мезенхимальной дисплазии и без них представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Показания тестов соо змеиными ядами у больных гемофилией с признаками мезенхимальной дисплазии и без них

Показатели гемостаза Показания тестов в подгруппах Контроль

с ВД : без Щ

: JC+.H :% к конт-:ролю : Х+Л1 :% к конт-: :ролю Х+Л1

Тест с ядом эфы, с 38,2+1, 8 77,2+6,1 29,8+1,6 99,0+5,4 29,5+0,7

Рк 0,001. 0,5

Тест с ядом щитомордника, с 35,2+1, 6 do, 2+5,3 30,+1,1 99,7+3,7 30,0+0,9

Рк 0,01 0,5

Аутополимери-зация Ш>, с 24,0+3, 6 49,2+7,4 11,7+1,2 106,8+10,9 12,5+1,2

Рк 0,001 0,5

Из таблицы видно, что у больных гемофилией с ВД» как и у больных с ГВД, закономерно выявляется нарушение конечного этапа свертывания крови зз счет замедления полимеризации МФ. Тесты с ядами эфы и щитомордника четко выявляют это нарушение.

Таким образом, нами впервые выявлено сочетание гемофилии А и Б с нарушением конечного этапа гемокоагуляпии - полимеризации мономеров фибрина.

2. Влияние матричных фосфолипидных мембран (ПФ.М) и собственных надмолекулярных компонентов (НК) на гемокоагулирующие эффекты змеиных ядов. Разработка на этой основе способа диагностики АФС

При исследовании с помощью метода микрофильтрации влияния плазменных фосфолипипных мембран и надмолекулярных компонентов самих ядов на их гемокоагулирующие эффекты нами установлено, что свертывающее действие яда гюрзы в значительной степени зависит от содержания в плазме ПФМ, тогда как коагулирующее действие ядов эфы и щитомордника не зависит от ПФМ (рис. 2). По этому признаку змеиные ялы могут быть подразделены на фосфолипид-зависимые (яд гюрзы) и {¡осфолипид-независимые (яды э$ът и щитомордника). Выявление этого неизвестного ранее факта стало основой разработки отечественного теста с разведенным ядом гюрзы для эффектов АФС и ЗА по аналогии с зарубежным тестом с разведенным ядом гадюки Рас-селлп, имеющим большое сходство с ядом гюрзы по механизмам и точкам приложения действия в гемокоагуляционном каскаде.

Исследования, проведенные на образцах плазмы 50 больных с АФС (20 - с первичным и Зи - с вторичным), показали высокую диагностическую информативность теста с разведенным ядом гюрзы. Так, у больных с достоверным ВА, отобранных по Международным критериям,, частота диагностически значимого гипокоагуляпионного сдвига в пробе с разведенным ядом гюрзы выявилась в 90,0$ случаев. Для сравнения нами бнл-и обследованы 48 больных СКВ и 20 женщин с невынашиванием беременности без клинико-лабораторных признаков анти-фосфолипидного синдрома. В этих случаях тест с разведенным ядом гюрзы не выявил свойственной эффектам ВА гипокоагуляши. Так, время свертывания в указанном тесте в контроле составило в среднем

46,5+2,3 с,при АФС - 62,4+5,3 с(Р 0,001),невынашивании беременности без АФС - 47,0+1,8 с(Р 0,1). Слеловптельно, тест с разведен-

Коагуляционная активность (%)

120 т

100

76,3

100

95,6

100 99,6

о

Тест с ядом гюрзы

Тест с ядом эфы

тест с ядом щитомордника

Рис.2 Влияние элиминации ПФМ на показания ядовых коагуляционных тестов. 1 - исходная коагуляционная активность; 2 - после удаления ПФМ.

ным ядом гюрзы не только высоко чувствителен к воздействию ВА, но и достаточно специфичен для этой патологии, поскольку при СКВ и невынашивании беременности у больных без ВА его результаты не отличаются от нормальных показателей.

Помимо этого нами впервые выявлена новая редко встречающаяся, но высоко тромбогенная форма АФС, при которой кроме замедления свертывания в фосфолипид-зависимых тестах нарушено свертывание БТО в фосфолипид-независимом тесте с ядом эфы. Эта форма, найденная нами у 10,0е! обследованных с ВА характеризуется наибольшим числом тромботических осложнений. Так, число тромботических эпизодов в этой группе составило, в среднем, на одного больного 3,2, а у больных без нарушения свертывания в тесте с ядом эфы - 0,6, т.е. было в 5 раз меньшим. Нарушение свертывания в тесте с ядом эфы связано, вероятно, с тем, что при данной форме ВА нарушается взаимодействие фактора П (протромбина) с белково-липидными комплексами.

3. Использование ядовых тестов в диагностике тромбозов и ДВС синдромов

При исследовании 102 больных с острыми тромбозами выявилось, что из всех ислытывавшихся тестов проба с ядом эфы выявляет в наибольшей степени гиперкоагуляционный сдвиг, особенно при артериальных тромбозах. Важно, что эта гиперкоагуляция сохраняется и в условиях проведения гепаринотерапии, поскольку на эффект коагу-лазы яда эфы гепарин не оказывает влияния. Результаты этого теста не связаны с уровнем активации свертывания крови плазменными фос-фолипидными мембранами, тогда как тест с ядом гюрзы, напротив, более эффективно выявляет гиперкоагуляционный сдвиг при венозных тромбозах, сопровождающихся повышенной прокоагулянтной активностью ПФМ.

При исследовании 91 больного с ДВС синдромом нами подтверждена способность коагулазы яда эфы трансформировать протромбин в мейзотромбин (или тромбин ЕМ), вызывающий коагуляцию в плазме и сыворотке всех компонентов фибриногенового пула, в том числе РФМК и тромбино-резистентных производных фибриногена (табл. 5).

Таблица о.

Сравнительное определение фибриногена в плазме в тестах с тромбином и ядом эфы у больных в терминальной фазе ДВС синдрома

•.Число Коагулирующий:опре-агент :делений :Частота полной :свертываемости, не-:Уровень фибриногена (г/л) , % :при наличии коагуляции

Тромбин 22 63,6 0,6+0,06

Яд эфы 22 4,6 2,6+0,6

Р 0,0001

На этой основе разработан кинетический (с использованием коагуло-метра) метод определения фибриногена и его производных с помощью яда эфы.

4. Результаты исследования больных гематогенными тромбофилиями. Разработка новых тестов на основе применения компонентов змеиных ядов

Комплексное исследование системы гемостаза с целью идентификации тромбофилий проведено нами у 80 больных молодого и среднего возраста с рецидивирующими тромбоэмболиями и акушерской патологией.

В соответствии с классификацией 3.С.Баркагана (1996) у 60 из этих больных был идентифицирован антифосфолипидный синдром (см. выше), у 10 - резистентность к протеину С, у II - дефицит протеина С, у 3 - дефицит антитромбина Ш, у 3 - гиперагрегация тромбоцитов

(синдром вязких тромбоцитов), у трех - повышение уровня фактора Виллебранда.

При всех этих формах, за исключением антифосфолипидного синдрома, ядовые тесты давали либо нормальные результаты, либо выявляли гиперкоагуляцию, как это свойственно тромбозам (см. выше).

Для диагностики АПС-резистентности нами, как и другими авторами, использован специальный реагент из змеиного яда, обозначаемый в литературе, как "протак". На этой основе нами совместно с А.Н.Мамаевым создан специальный плазменный препарат, содержащий активированный протаком протеин С и лишенный фактора V, разработана простая методика определения АПС-резистентности. Степень выраженности этой резистентности оценивается индексами Я, и МП Снижение первого из них менее 2,0. и второго менее 0,8 говорит о наличии АПС-резистентности. В таблице б представлены результаты этих исследований.

Таблица 6

Результаты определения АПС-резистентности у разных

групп больных с ранним тромбо-эмболическим синдромом и в контроле

Специальные определения:

Показания тестов и индексов у разных •.групп обследованных_

:Больные с АПС-:Больные с тром-: Здоровые

:резистентно- :боэмболиями без: (контроль) :стью :АПС-резистент- : :ности :

: п=Ю) : п=20__: п=15

АПТВ при введении в тест-систему буфера

АПТВ при введении в тест-систему реагента с активированным протеином С

Коэффициент Я

Коэффициент ш

69,1+1,4 66,6+2,4

81,2+3,8

1,31+4,07

0,59+0,03

181,4+11,4 2,69+0,13 1,04+0,05

64,8+2,1

174,1+9,8 2,68+0,12 1,02+0,04

Таким образом, с помощью разработанной нами модифицированной методики получения плазменного реагента с активированным протеином С, основанной на использовании активатора протеина С из змеиного яда, нами впервые в Российской популяции осуществлена идентификация недавно открытого вида тромбофилии, обусловленной АПС-резистентностью и установлена достаточно высокая частота этой формы патологии среди больных с ранними рецидивирующими тромбоэм-болиями (20% всех случаев среди первичных гематогенных тромбо-филий).

У больных с другими видами тромбофилий исследования часто выполнялись нами повторно в периоды обострения болезни и возникновения свежих тромбозов и в периоды ремиссии, а также на фоне лечения. Проведенные исследования показали, что в период ремиссии показания традиционных и базисных ядовых тестов по средним значениям не отличались от нормы, тогда как при возникновении тромбоэмболии сдвиги показаний ядовых тестов совпадают с таковыми при острых тромбозах, В частности, при синдроме "вязких" тромбоцитов умеренная гиперкоагуляпия регистрировалась в тесте с ядом гюрзы (135,0% при норме 100%). В еще большей степени'такой сдвиг наблюдался в тесте с ядом эфы при дефиците антитромбина Ш (183,3%).

5. Влияние гепаринов на гемокоагулирующие эффекты змеиных ядов

В опытах на образцах бедной тромбоцитами плазмы (БТП) и

на лабораторных животных нами проведено -сравнительное изучение влияния нефракционированного гепарина (НГ) и низкомолекулярных гепаринов (НМГ) на гемокоагулирующее действие змеиных ядов. Установлено, что НГ в терапевтических и более высоких дозах тормозит свертывающее действие яда гюрзы, но не влияет на коагулирующие эффекты ядов эфы и щитомордника. В отличие от этого, фракси-

парин и кливарин подавляют гемокоагулирующее действие всех из.у-чавшихся нами ядов. В опытах на белых крысах установлено, что НГ не препятствует возникновению и развитию токсигенного ДВС синдрома и гибели животных при внутривенном введении ДД^до яда эфы. В отличие от этого, фраксипарин оказывает выраженное профилактическое действие и.препятствует развитию этого ядового ДВС синдрома (табл. 7).

Таблица 7.

Влияние НГ' и НМГ на развитие острого гемокоагуляционного шока, индуцируемого внутривенным введением ДЛэд^ яда эфы

Препарат

Дозы, ед/кг:Число за- ¡Число крыс :Время смерти с

¡травленных:погибших отгмомента затравки : крыс : шока :

100 10 10 10-20

Гепарин 200 20 20 э-20

вОС 10 10 5-20

2оО 2 2 10

Фраксипарин оОО о I о

760 3 О

Гаким образом, использование ядовых диагностических тестов позволяет 'з сравнительно простых и доступных методиках распознавать и дифференцировать многие нарушения гемостаза - дефицит ряда факторов свертывания крози, наличие явной и фоновой гиперкоагуляции при тромбозах и ДВС синдромах, выявлять в плазме и сыворотке так называемые "заблокированные" производные фибриногенового пула, диагностировать такие распространенные виды тромбофилий, как АФС и резистентность к активированному протеину С, диагностировать нарушения полимеризации мономеров фибрина, свойственные геморрагическим мезенхимальным дисплазиям и другим формам патологии.

Они облегчают разграничение разновидностей СКВ с наличием и отсутствием тромботического статуса и нарушений беременности, связанных и не связанных с АФС. Показания ядовых тестов при ряде из перечисленных видов патологии могут служить критерием адекватности и достаточности проводимого лечения.

Для широкого внедрения методов диагностики нарушений гемостаза, основанных на использовании змеиных ядов, нами разработаны разные варианты методик и-диагностических наборов, пригодных как для мануальных, в том числе на основе планшетной технологии, так и для коагулометрических определений. Эта часть работы выполнялась под нашим руководством аспирантом И.Я.Цеймах.

Широкая клиническая апробация ядовых диагностических тестов, показавшая их диагностическую значимость и воспроизводимость, послужила основанием для разработки технологии и налаьивания серийного производства ядовых диагностикумов, осуществляемого фирмой "Технология-Стандарт" (г. Барнаул).

ВЫВОДЫ

1. По взаимодействию с плазменными фосфолипидными мембранами гемокоагулирующие змеиные яды могут быть подразделены на фос-фолипид-зависимые и фосфолипид-независимые. К первым относится яд гюрзы, ко вторым - яды эфы и щитомордника. В самих ядах имеются надмолекулярные соединения, потенцирующие их свертывающие эффекты. Гемофильтраиия позволяет удалить из токсинов эти компоненты, что ведет к снижению коагулирующей активности ядов.

2. Все изученные гемокоагулирующие яды обладают тормозящим влиянием на неферментативную фазу конечного этапа свертывания крови - полимеризацию мономеров фибрина.

3. Обнаружено новое различие эффектов нефраяиионированного и низкомолекулярных. гепаринов. Нефракционированный гепарин в терапезтических концентрациях тормозит гемокоагулирующее действие яда гюрзы, но не влияет на показания тестов с ядами эфы и щитомордника. Низкомолекулярные гепарины тормозят действие всех изучавшихся ядов.

4. Базисные яцовые тесты позволяют идентифицировать дефицит фактороз X (тест с токсином гюрзы), П (тест с ядом эфы) и нарушения конечного этапа свертывания крови (тесты с ядами эфы и щито--мордника).

о. При меэенхимальных дисплазиях у 1/3 больных имеется нарушение полимеризации мономеров фибрина, легко выявляемое тестом с ядом щитомордника.

В нашем исследовании впервые выявлено, что у 1'8,0>% больных гемофилией имеются также признаки врожденной мезенхимальной лис-ллазии., в том числе с нарушением полимеризации мономеров фибрина.

Выявлено неизвестное ранее нарушение гемостаза у больных с

геморрагической мезенхимальной дисплаэией - изолированное нарушение свертывания в тесте с ядом эфы, обусловленное диспротромбине-мией.

6. У больных тромбозами магистральных сосудов тест с ядом эфы выявляет гиперкоагуляцию чаще и в большей степени, чем другие коагуляционные тесты, однако при повышенной.свертываемости, связанной с гипермембранеыией, более информативна проба с ядом гюрзы, что чаще встречается при венозных тромбозах.

7. Разработанный нами новый тест, основанный на использовании разведенного яда гюрзы, с высокой степенью надежности выявляет наличие волчаночного антикоагулянта. Эта проба может быть использована в комплексе с другими тестами для диагностики антифосфолипид-ного синдрома и контроля за эффективностью элиминации волчаночного антикоагулянга из плазмы больных.

8. Разработанный нами совместно с А.Н.Мамаевым плазменный реагент с активированным протеином С может быть использован для эффективной диагностики частого вида тромбофилии - резистентности к нему фактора Уа.

9. В проведенном нами исследовании выявлен новый высокотром-богенный вариант волчаночного антикоагулянта, нарушающий свертывание в фосфолипид-независимом тесте с токсином эфы многочешуйчатой, что подтверждено контрольными исследованиями, проведенными в лаборатории по стандартизации определения волчаночного антикоагулянта профессором E.N.Harris (США).

10. При диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови проба с ядом эфы позволяет выявлять в сыворотке крови производные фибриногена, не подвергшиеся коагуляции под влиянием тромбина. Выявление этой "заблокированной" фракции говорит о наличии тромбинемии.

II. Разработанные в нашем центре варианты коагуляционных тестов, основанных на планшетной технологии и использовании современных коагулометров разных конструкций, позволяют объективизировать результаты ядовых тестов и делают их более доступными для повседневного использования в лабораторной практике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанные ядовые тесты могут быть использованы при диагностике следующих видов патологии гемостаза:

1. Дефицита фактора X и дифференциации его с дефицитом фактора УП; дефицита фактора П и его дифференциации с недостаточностью других факторов про'тромбинового комплекса, а также в распознавании цисфибриногенемии и нарушения полимеризации мономеров фибрина, в частности, при геморрагических мезенхимальных дисплазиях.

2. В выявлении тромбогенных сдвигов, в том числе "скрытой" гиперкоагуляции на фоне гепаринотерапии.

3. Для оценки общего содержания компонентов фибриногенового пула в плазме и сыворотке, в том числе тромбино-негативного заблокированного фибриногена и РФЖ, что имеет значение в диагностике ДВС синдрома.

4. Разработанный тест с разведенным ядом гюрзы может применяться для выявления волчаночного антикоагулянта в плазме больных антифосфолипидным синдромом.

о. Тест с ядом эфы для выявления редкой, но высоко тромбоген-ной вариантной формы волчаночного антикоагулянта.

6.Разработанный нами модифицированный способ получения плазменного реагента позволяет проводить диагностику одного из наиболее часто встречающихся видов тромбофилии - резистентности фактора % к активированному протеину С.

Предлагаемые ядовые тесты относятся к методам экспресс-диагностики, проводятся в одноступенчатой постановке исследования, в том числе в мануальном и коагулометрическом вариантах и на основе планшетной технологии производства ядовых диагностикумов, не требуют дополнительного оборудования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Структура фибриногенового пула и его аномалии при внутри-сосудистом свертывании крови. // Противотромботическая терапия в клинической практике. Новое в терапии, диагностике и лечении: Тез. докл. Всесоюзной конференции. - М., 1966. - С. э-6. (соавт. З.С.Баркаган, Г.В.Брискина, И.В.Тамарин, А.П.Момот, И.Г.Перегудо-ва, Я.А.Аскалонова).

2. Сочетание второго типа ТАР-синдрома с дефицитом фактора X, иммунной недостаточностью и пролабированием митрального клапана. // Тер. архив, 1966. - 9. - С. 137-141. (соавт. З.С.Баркаган, И.В.Тамарин, Г.Б.Кондакова, А.Ю.Александрова).

3. Новые методы диагностики и терапии острого ДВС синдрома и тромбофилических состояний. // Тез. докл. научно-практической конференции работников службы крови РСФСР. - Кемерово, 1986. -С. 120-122. (соавт. З.С.Баркаган, В.Г.Лычев, Н.И.Тарасова, А.П. Момот, К.М.Бишевский, И.В.Тамарин, В.А.Елыкомов, А.Е.Дорохов).

4. Изучение гемокоагулирующих свойств фракции яда среднеазиатского щитомордника. // В кн.: Механизмы свертывания крови. -Тюмень, 1988. - С. 2. (соавт. З.С.Баркаган, Л.В.Медведь, Т.П.Угарова).

5. Методика изучения гемокоагулирующих свойств фракций яда среднеазиатского щитомордника. // Ангиология и гемостаз: Методические разработки для врачей и студентов. - Барнаул, 1988. -'

С. 28-29. (соавт. З.С.Баркаган, Л.В.Медведь, Т.П.Угарова),

6. Методика оценки гемокоагулирующего действия ядов закавказской и армянской гадюк. // Ангиология и гемостаз: Методические разработки для врачей и студентов. - Барнаул, 1988. - С. 30-31. (соавт. К.М.Лунин, А.И.Агасян).

7. Новые общедоступные маркеры внутрисосудистого свертывания крови. // Тез. докл. П Республиканского съезда гематологов и транс-фузиологов Грузии. - Тбилиси,1988. - С. 24-25. (соавт. З.С.Барка-ган, В.А.Елыкомов, А.П.Момот, И.В.Тамарин, И.Г.Перегудова).

8. К патогенезу и терапии неотложных состояний, обусловленных нарушениями гемостаза. // Тез. докл. б Всероссийского съезда терапевтов. - Горький, 1989. - С. 274.

9. Анализ влияния цельного яда среднеазиатского щитомордника и его гемокоагулирующей фракции - "анцистрона-Н" 'на конечный этап свертывания крови. // В кн.: Механизмы регуляции гемостаза на уровне . молекулярных взаимодействий. - Свердловск, 1989. - С. 102-106. (соавт. З.С.Баркаган, И.Г.Перегудова, Л.В.Медведь).

10. Новые методы экспресс-диагностики нарушений гемостаза. // В кн.: Актуальные вопросы лабораторной диагностики. Тез. докл. конференции врачей-лаборантов Эстонии. - Таллин, 1989. - С. 13. (соавт. З.С.Баркаган).

11. Идентификация змеиных ядов по особенностям действия на систему гемостаза и опыт создания диагностических наборов. // Вопросы герпетологии. Тез. докл. УП Всесоюзной герпетологической конференции. - Киев, 1989. - С. 22-23. (соавт. З.С.Баркаган, И.Б. Калмыкова).

12. Анализ влияния на гемостаз антикоагулянтной и фибриноли-тической фракции яда щитомордника обыкновенного. // Вопросы герпетологии. Тез. докл. УП Всесоюзной герпетологической конференции.

- Киев, 1989. - С. 275. (соавт. Т.П.Угарова).

13. Action on-the Haemostasia system and diagnostic application oí' venoms or some middle-asian snakes. // 9th European symposium on Animal, plant and microbial toxins. - Lohusalu (Estonia}. 1990. - P. 28. (with. Z.S.Barkagan, I.G.Peré¿judova).

14. The study of anticoagulant, fibrinolytic and antipoly-merization effects of some Agkistrodon snake venoms. // 9t!i European symposium on Animal, plant and microbial toxins. - Lohusalu (¿stonia). - 1990. - P. 55. (with A. D. îsalicniri).

15. Новое поколение ядовых коагуляционных тестов и их клиническое применение. // Физиология и патология гемостаза. Тез. докл. Всесоюзной конференции. - Полтава, 1991. - С. 241. (соавт. А.Г1. Mo— мот).

16. Сравнительный анализ использования в лабораторной практике коагуляционных тестов с цельным ядом щитомордника и его коагулирующей фракцией - анцистроном-Н. // Физиология и патология гемостаза. Тез. докл. Всесоюзной конференции. - Полтава, 1991. - С. 235236. (соавт. И.Г.Перегудова).

17. Использование яда гюрзы в тесте с плазмофильтратами для оценки прокоагулянтной активности эндогенных липидов. // Проблемы теоретической и прикладной токсинологии. Тез. докл. Всесоюзной конференции. - Ашхабад, 1991. - С. 30-31. (соавт. А.П.Момот, K.M. Бишевский, Г.В.Сердюк).

18. Динамика показателей ядовых коагуляционных тестов в плазме больных с волчаночными антикоагулянтами. // Проблемы теоретической и.прикладной токсинологии. Тез. докл. Всесоюзной конференции. - Ашхабад, 1991. - С. 36. (соавт. Г.В.Сердюк, А.Е.Дорохов).

19. Влияние ядов некоторых змей и их фракций на процесс самосборки фибрин-мономеров. // Проблемы теоретической и прикладной токсинологии. Тез. докл. Всесоюзной конференции. - Ашхабад, 1991. - С. 44-45. (соавт. А.Д.Цалихин).

20. Влияние специфических антисывороток на процесс взаимодействия змеиных ядов с системой гемостаза. // Проблемы теоретической и прикладной токсикологии. // Тез. докл. Всесоюзной конференции. - Ашхабад, 1991. - С. 45. (соавт. А.Д.Цалихин).

21. Информативность и цифференииально-диагноетическое. значение некоторых методов выявления внутрисосудистого свертывания крови. // Тез. докл. Ш Всесоюзного съезда гематологов и трансфу-эиологов. - М., 1991. - С. 554-555. (соавт. З.С.Варкаган, А.П.Мо-мот).

22. The study of! anticoagulant, fibrinolytic and antipoly-merization effects of some Agkistrodon snake venoms (references). // Toxicon, 1991. - Vol. 29. - К 3. - P. 298. (with A.D.Tsali-chin).

23. Способность низкомолекулярного гепарина (фраксипарина) преодолевать действие экзогенных коагулаз - фундаментальное отличие от нефракционированнаго гепарина. // Бюлл. экспер. биол. мед.

- 1993. - 10. - С. 405-407. (соавт. З.С.Варкаган, С.И.Колтакова).

24. On unusual results of the phospholipid independent snake venom test in the patients with lupus anticoagulant (LA) and high thrombotic tendency. // Lupus, 1994. - Vol. 3. - И 4. - P.351. (vvith Z.d.Barkagan, G.V.Serdyuk. A.E.Dorochov).

25. The influence of plasma phospholipid membranes and Lupua "anticoagulant (LA) on snake venoms clottong action. // 11th World Congress on Animal, Plant and ilicrobial Toxina. - Tel Aviv, Israel, 1994. - P. 80. (with Z.S.Barkagan, A.Ii.Mamaev).

26. Повышение эффективности выявления антикоагулянтов волча-ночного типа с помощью эхитоксовых тестов. // Клин. лаб. диагностика. - 1994. - ,г- 6. - С. 27-29. (соавт. З.С.Варкаган, Г.В.Сердюк).

и

27. Untersuchungen über neue Eigenschaften von Sulfapoly-sacchariden. // Throaibophilie and Anticoagulation. 26 Hamburger Symposion über Blutgerinnung. - Basel-Grenzach-Wyhlen . - 1994. -Vol. 1. - P. 55-59. (with Z«S.Barkagan, W.A.lialcarow, ii.i'.Drozd).

28. Сравнительный анализ гравиметрического и кинетического методов определения фибриногена в плазме крови. // В кн.: Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии. Тез. докл. Российской конференции. - С.-Петербург, 1995. - С, I2I-I22. (соавт. З.С.Баркаган, И.Я.Цеймах, Д.В.Федоров).

29. О возможности применения коагулометров различных конструкций для исследования гемокоагулирующих свойств змеиных ядов. // В кн.: Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии. Тез. докл. Российской конференции. - С.-Петербург, 1995. - С. 204-205. (соавт. З.С.Баркаган, И.Я.Цеймах, Д.В.Федоров).

30. Анализ участия микромембран в гемокоагулирующих эффектах змеиных ядов, // В сб.: Актуальные проблемы герпетологии и токсинологии. - Тальятти, 1995. - С. 15*-17. (соавт. З.С.Баркаган, А.П.Момот, А.Н.Мамаев, И.Я.Цеймах).

31. Влияние некоторых змеиных ядов на процесс полимеризации фибрина. // В сб.: Актуальные проблемы герпетологии и токсинологии. - Тольятти, 1995. - С. 9-15. (соавт. З.С.Баркаган, И.Г.Пере-гудова, Д.Н.Ерин, Т.А.Соломина).

32. Влияние нефракционированного и низкомолекулярных гепари-нов на гемокоагулирующие эффекты ядов змей. // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии Сибирского региона. Тез. докл. научной конференции. - Барнаул, 1996. - С. 49-50. (соавт. И.Я.Цеймах).

33/№e influence of different heparins on haemocoagulant action of central-asian snake venonis. // riaemostasis, 1Э96. - Vol. 26. - Suppl. 3. - Abst. 033. (with Z.S.Barkagan, I.Ya.Tseimakh,

A.H.Iûamaev).

34. Первый опыт диагностики тромбофилии, обусловленной резистентностью к активированному протеину С. // Тер. архив. 1997.

- 2. - С. 35-37. (соавт. З.С.Баркаган, В.Б.Гервазиев, А.Н.Карпенко, И.Я.Цеймах, А.Н.Мамаев).

35. Предварительные данные о частоте тромбофилии, обусловленной резистентностью к активированному протеину С в российской популяции региона Сибири. // В кн.: Тез. докл. Ш Всероссийской конференции "Тромбозы и геморрагии, ДВС синдром. Проблемы лечения".

- M., 1997. - С. 16-17. (соавт. З.С.Баркаган, И.Я.Цеймах).

36. К методике фенотилической диагностики резистентности к протеину С. // В кн.: Тез. докл. Ш Всероссийской конференции "Тромбозы и геморрагии, ДВС синдром. Проблемы лечения". - М., 1997. - С. 18-20. (соавт. З.С.Баркаган, И.Я.Цеймах, А.Н.Мамаев).

37. Связь илеокавальных тромбозов в области имплантации кава-фильтров с гематогенными тромбофилиями. // В кн.: Тез. докл. Ш Всероссийской конференции "Тромбозы и геморрагии, ДВС синдром.

и

Проблемы лечения. - M., 1997. - С. 45-46. (соавт. В.Б.Гервазиев, З.С.Баркаган, А.А.Карпенко).

38. Prevalence of APC-reaistance (APC-R) among the patients with early thromboses in the sibirian region of Russia. // In. XVI Congress of the international. Soc. on Thrombosis and Haemostasia. - Florence, -1997. - Abst. 32. -(With Z.S.Barkagan, A,;;.".Harnaev).

39. Баркаган 3.C., Цывкина Л.П., Мамаев A.H., Цеймах И.Я. Распространенность, диагностика, и клиническое значение тромбофилии, обусловленной резистентностью фактора Va к активированному протеину С. // Веста. Росс. Акад. Мед. Наук. - 1997. - №2. - С.39-41.

Подписано к печати 14.05.97. Тираж 100 экз. Объем 2 п.л. Печать офсетная. Заказ № д-6

Типография Издательства АГУ: 656099, г. Барнаул, ул. Димитрова, 66