Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка бактериологического метода выделения и идентификации Pseudomonas aerugnosa

На правах рукописи

АФОНИН ЭДУАРД АНАТОЛЬЕВИЧ

РАЗРАБОТКА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

16,00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной ст кандидата биологических нау

УЛЬЯНОВСК- 1999

Работа выполнена на кафедре микробиологии, эпизоотологии ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственн сельскохозяйственной академии.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Васильев Д А.

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, с.н.с. ВНИИЗЖ Русалеев B.C.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник ВН' ИВВ и М Власов H.A., _ '

кандитат медицинских наук, заведующий отделом особо опа ных инфекций Ульяновского областного центра санитара эпидемиологического надзора Нафеев A.A.

Ведущая организация:

Саратовский государственный аграрный университет им. Вав

лона' ' jLj>

Защита состоится "а/" 20qq ГОда в асов на з

седании диссертационного совета при Ульяновской государственна сельскохозяйственной академии.

Адрес: г. Ульяновск, Бульвар Новый Венец, I.

С диссертацией можно ознакомиться s библиотеке УГСХА.

Автореферат разослан Ученый секретарь диссертационого совета, кандидат ветеринарных наук, доцент Козин А. И.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы существенно повыси-ась этиологическая роль Pseudomonas aeruginosa в медицинской и етеринарной практике. Псевдомонадные инфекции стали занимать едущее место среди нозокоиинальных заболеваний (Ильюхин В.И. 985). Pseudomonas aeruginosa всё чаще выделяется, в воде открытых эдоёмов и объектах внешней среды. Поэтому возрастает интерес к анному микроорганизму (J. Vincent 1995, G. Gillardi 1991, A. Darzins 997).

Однако при изучении роли Pseudomonas aeruginosa в патологии ;ловека и животных приходится сталкиваться с тем, что длительное эемя внутри рода Pseudomonas отсутствовали чёткие маркёры, по вторым типировали данный вид Pseudomonas aeruginosa. Описано >0 видов, относящихся к бактериям данного рода, но из них всего ) имеют определительные критерии в справочнике Берджи (1997г). сложняют работу бактериологам-практикам отсутствие оптпмаль-.IX методов выделения Pseudomonas aeruginosa из патологического сериала и объектов внешней среды. Это привело к тому, что мно-е выделенные культуры, имеющие родовые признаки Pseudomonas, гагностируются как вид Pseudomonas aeruginosa хотя могут не яв-:тся таковыми. Более детальная идентификация отдельных видов иного рода стала разрабатываться лишь в последнее время..

Цель исследования. Целью настоящей работы являлось усо-ршенствование методов бактериологической идентификации eudomonas aeruginosa. Для выполнения поставленной цели необхо-мо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод выделения и идентификации Pseudomonas ruginosa из патологического материала.

2. Разработать метод выделения и идентификации Pseudomonas rugmosa из объектов внешней среды.

3. Разработать накопительную среду для выделения Pseudoinas aeruginosa.

4. Разработать элективные среды для выделения Pseudomonas ■uginosa.

Научная новизна работы. Разработаны новые, менее трудоем-г и более точные, методы выделения и идентификации ;udomonas aeruginosa из патологического материала и объектов гшней среды, которые позволяют сократить сроки исследования на часа по сравнению с разработанными методами. Разработаны но-s элективные среды, которые по чувствительности не уступают г имеющимся, но более специфичны по отношению к росту воз-

можных ассоциантов. Разработана накопительная среда для выде! ния Pseudomonas aeruginosa, которая позволяет накапливать микрс ную массу из концентрации от 10 микробных тел в см3.

, Практическая значимость. Разработанные методы бактер! логического выделения Pseudomonas aeruginosa позволяют выделл и идентифицировать микроорганизм данного вида в течении 72-часов.

Разработанные элективные среды УГСХА-Ps.als и УГСХ Ps.23 имеют чуствительность способную выделить Pseudomor aeruginosa из возможных ассоциантов в концентрации ог 20 микрс ных тел в смг.

Разработанная накопительная среда УГСХА-Рб.Зэ позволяет течении 24-48 часов накапливать Pseudomonas aeruginosa из kt центрации 10 микробых тел в см3, при этом ингибируется рост ас< циантов.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Конструирование бактериологических методов выделенш идентификации Pseudomonas aeruginosa из: а) патологического ма' риала; б) объектов внешней среды.

2. Конструирование среды накопления для Pseudomoi aeruginosa.

3. Конструирование элективных сред для Pseudomoi aeruginosa.

Апробация результатов исследований. Материалы диссер ционной работы доложены на научных конференциях: 9-ая Межго дарственная межвузовская научно-практическая конференция. Сан Петербург 1997 г. Научно-практическая конференция "П] филактика я меры борьбы с инфекционными болезнями молодш КРС и свиней." Новосибирск 1996 г., на научно-практических кош ренциях в Ульяновской ГСХА 1996-1998 г.г.

Публикации по работе. По материалам диссертации опубли] вадо 5 печатных работ и 2 находятся в печати.

Обьем и структура работы. Материалы диссертации изложе на 148 страницах машинописного текста и состоят из следуюп разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, резу таты исследований, обсуждение, выводы, практические предложен список лигературы, содержащий 171 отечественный и зарубежл источник. Диссертация имеет 36 таблиц и 8 рисунков.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

2.1.1. Штаммы, оборудование, методы

Рефереис-штаммы Pseudomonas aeruginosa 02; 03: 06, а также 53 шбораторных штамма. Штаммы (количество) Pseudomonas putida -to шт; Proteus mirabilis - 10 шт; Staphylococus aureus - 16 шт; Citrobacter - 13 шг; Escherichia coli - 22 шт; Listeria monocytogenes - 7 пт; Morganella mordanii - 21 шт; Proteus vulgaris - 21 шт; Klebsiella 5neumoinae - 5 шт; Salmonella paratyphi - 8 шт; Streptococus pyogenes ? шт; Staphylococus albi - 5 шт.

Оборудование: термостаты TC-80M-2; микроскопы МБИ-3; лу-ia бинокулярная МБС-9; холодильники бытовые; колбы мерные; пи-гетки пастеровские; пипетки мерные на 1.0, 2.0, 5.0 см3; флаконы ¡мкостью 50, 100, 200 см*; стёкла покровные; стёкла предметные; [ашки Пегри; пробирки; стандарты мутности на 0.5, 1.0 млрд. мик-юбных клеток.

Метод определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Летод определения чувствительности бактерий к нитрофурановым грепаратам. Статистическая обработка результатов исследований. !се опыты ставили троекратно. Цифровые данные подвергали ста-истической обработке средних величин и их ошибок. Достоверность татистической разницы между величинами определяли по разнос ому методу Стъюдента - Фишера.

2.1.2. Реактивы и питательные среды

Мясо-пептонный (МБП); мясо-пепгонный агар (МПА); среды [лоскирёва, Эндо; цетилпиридиния хлорид агар; мясо-иептонная же-апгаа; АГВ-агар. Реактивы: пептон; глицерин; калий серно-кислый; агний хлористый: агар-агар; калий фосфорнокислый двузамещён-ый; магний сернокислый; натрий хлористый; глюкоза; бромтимоло-ый голубой; аммоний фосфорно-кислый однозамещённый; калий осфорно-кислый двузамещённый; ацетамид; нитрат калия; этанол. ;иски для определения антибиотикоустойчивости: пенициллин -10 г Lachema (Чехия); тетрациклин 30 мг Lachema (Чехия); эритроми-ин 15 мг Lachema (Чехия); стрептомицин серия №4 НИЦФ г. Санкт-етербург (Россия); карбециллии НИЦФ г. Санкт-Петербург >оссия). Краски микробиологические.

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Спеиифичиость элективных сред. Ацетатамидиая

среда и её роль в выделении и типизации Pseudomonas aeruginosa. Оценка роста бактерий Psendomonas в присутствии хлорида бария

В рамках диссертационных исследований изучали специфи1 ность действия трёх элективных сред, ЦПХ-агара, цетримид arapi ТТХ-агара. Специфичность определяли по спектру подавления рост ассоциантов (Pseudomonas putida; Proteus mirabilis; Staphylococi aureus; Citrobacter; Escherichia coli; Listeria monocytogene! Morganella mordanii; Klebsiella pneumoinae; Salmonella paratyph Streptococus pyogenes; Staphylococus albi). Результаты свидетел! ствуют, что на цетримидном агаре возможен рост Morganeî] morganii, Citrobacter. На цетилпиридиния хлорид агаре возможе рост штаммов Pseudomonas putida, Proteus mirabilis, Staphylococi aureus, Citrobacter. На трифенилтетразол хлорид агаре наблюдал рост Pseudomonas putida, Citrobacter. Таким образом, установили, чт испытанные среды не обладают достаточной специфичностью, и ci ществует возможность роста ассоциантов. Отсюда следует, что эле! тивность испытанных сред недостаточная. Также были проведен опыты по испытанию сред, включающих в себя ацетамид (МПА ацетамидом и ацетамид на агар-агар). Опыты производили путём ш сева на ацетамидный агар и на ыясо-пептонный агар с ацетамидо по С.М. Булю и соавг. (1978), а так же на питательный агар для koi троля. Результаты свидетельствуют, что на мясо-пептонном агаре ацетамидом растут Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putidi Proteus mirabilis, Citrobacter, Escherichia coli, Listeria monocytogene; Morganella mordanii, Klebsiella pneumoinae, Salmonella paratyph Streptococus pyogenes, Staphylococus albi. На ацетаиидном агаре pa< тут Pseudomonas aeruginosa и Listeria monocytogenes.

При выделении и идентификации Pseudomonas aeruginosa во: никла необходимость в контроле элективной среды, поэтому бых: изучена способность роста Pseudomonas aeruginosa и их возможны ассоциантов на питательных средах содержащих хлорид бария, пр< вели опыт по следующей схеме: суточные культуры Pseudomonî aeruginosa, Pseudomonas putida, Proteus mirabilis, Staphylococi aureus. Citrobacter, Escherichia coli. Listeria monocytogenes, morganeî morganii, Klebsiella pneumoinae, Salmonella paratyphi, Streptococi pyogenes, Staphylococus albi. Засевали на питательный агар с хлор! дом бария (2 г/1000 мл). Культивировали при 37°С 24 часа. Резульг, ты: на питательном агаре с хлоридом бария не растут Pseudomom

leruginosa и Pseudomonas putida. Возможные ассоцианты растут на lamioii питательной среде. Отсюда следует, что питательный агар с шорндом бария можно использовать в качестве контроля элективной :реды.

2.2.2. Конструирование элективных сред 2.2.2.1. Подбор элективного агента

В рамках конструирования элективных сред, были проведены щыты по изучению устойчивости Pseudomonas aeruginosa, 'seudomonas putida, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococus iureus, Citrobacter, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, ¿organella morganii, Klebsiella pneumoinae, Salmonella paratyphi, îtreptococus pyogenes, Staphylococus albi к воздействию фуразолина и эурадонина в дозах до 150 мкг/мл. Исследования проводили стандартным методом определения устойчивости к нитрофурану. Часть юлученных данных приведена в таблице 1.

Таблица 1

Устойчивость Ps. aeruginosa и ассоциантов к фуразолину и фурадонину

№ Вид бактерии Количество, шт. Фуразолин (35 мкг\мл) Фурадонин ( 125 мкг\мл)

1 Ps. aeruginosa 57 + +

2 Pr. mirabilis 10 . + +

3 Ps.putida 10 + -

4 Pr. vulgaris 21 - -

5 St. aureus 8 - -

6 Citrobacter 12 - -

7 E. coli 9 - -

3 Listeria mono-s 7 - -

9 M. morganii 5 - -

10 St. pyogenes 7 - -

11 ¡St. albi 5 - -

+ рост штамое; - рост отсутствует .

Результаты указывают, что • Pseudomoiias aeruginosa и seudomonas putida устойчивы к действию фуразолина и фурадонина указанных выше дозах, а рост ассоциантов ингибировался. Таким бразом, проведенные исследования позволили заключить, что элек-ивный агент должен состоять из фуразолина 35 мкг/мл и фурадони-а 125 мкг/мл.

2.2.2.2. Конструирование питательной основы элективной среды и испытание сненифичностн

Конструирование элективной среды для Pseudomonas сводилась к решению задач по выбору и опробированию элективного агента в известных средах для культивирования микроорганизмов и разработке собственной питательной основы для элективной среды, которая бы была дешёвой и доступной. Было сконструировано четыре образца элективных сред следующего состава ( г/л ): образец № 1 - пептон 0,5 г, глюкоза 2,5 г; образец № 2 - пептон 1,0 г, глюкоза 5,0 г; образец № 3 - пептон 1,5 г, глюкоза 7,5 г; образец № 4 - пептон 2,0 г: глюкоза 10,0 г. На них культивировали штаммы Pseudomonas aeruginosa при 37°С 24 часа. Производили подсчёт КОЕ. Результаты: образец ЛЬ 1 - 41 КОЕ; образец № 2 - 49 КОЕ; образец № 3 - 67 КОЕ; образец Jfe 4 - 90 КОЕ (величины КОЕ имеют среднее значение). Результаты свидетельствуют, что образец №-4 имеет лучшие показатели по КОЕ. Таким образом, сочли, что образец А'» 4 является оптимальной питательной основой для Pseudomonas aeruginosa. Это позволило нам перейти к опытам по определению специфичности прототипа элективной среды. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2

Специфичность элективной среды

м Вид бактерии Количество, Рост на конт- Рост на элек-

шт. рольной среде тивной среде

1 Ps. aeruginosa 57 4- +

2 Ps. putida 10 +

3 Pr.mirabiiis 10 +

4 St, aureus 8 т -

5 Citrobacter 4 + -

6 E. coli 9 + -

7 Listeria mono-s 7 4 -

8 M.morganii 11 + -

9 St. pyogenes 7 +

10 St.albi 5 + -

11 Kl. pneumoinae 4 +

12 S. paratyphi 6 + -

+ Рост штамма. - Рост штамма отсутствует.

Полученные данные позволяют заметить, что элективная сред обладает специфичностью, что позволяет проводить элекцию бакте рий до видов Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas putida.

2.2.2.3. Конструирование элективной минеральной среды . для Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa может расти, используя в качестве источников роста - азот из минеральной формы и углерод из органических соединений! Анализ питательных, дифференциально-диагностических "сред показал, что наиболее оптимален в качестве питательной основы: ацетатный агар. При конструировании, мы испытали четыре образца среды. Состав образцов: элективный агент вещества:; фурадонин-125 мкг/мл и фуразолина-35 мкг/мл на питательная основа в- составе: образец № 1 аммоний фосфорнокислый 0,25г/л, натрий уксуснокислый 0,5г/л; образец № 2 аммоний фосфор-нокислый;.0,5г/л^натрий уксуснокислый 1,0 г/л; образец № 3 аммоний фосфорнокислый 0,75г/л, натрий уксуснокислый 1,5г/л; образец Ш 4 аммоний; фосфорнокислый 1,0 г/л, натрий уксуснокислый 2,0г/л. Культивировали ripfFI37°C 24 часа. Результаты культивирования на образцах приведены таблице 3.

. Таблица 3

Показатели КОЕ на образцах питательных основ

Образец питательной основы Среднее арифметическое(КОЕ)

Образец № 1 23

-Образец № 2 41

Образец № 3 52

Образец № 4 98

■ ' - ■..'!? '.rMi.ü "?'-' ' " ' '

Результаты свидетельствуют, что, образец питательной основы . № 4 имеет( лучшие, результаты по количеству КОЕ. Прослеживается трямая связь" между повышением содержания аммония и солей уксусной кислоты и повышением показателей КОЕ на образцах №1-4. Результаты опытов свидетельствуют, что целесообразным является использовать образец №4 в качестве питательной основы элективной минеральной среды; Опираясь на полученные данные было проведено испытание, специфичности элективной минеральной среды. Производили да сев. указанных ниже штаммов бактерий на испытуемую :реду, паралельно контроль на МПА. Результаты приведены в таблице 4, I".

На элективиойг минеральной среде растут Pseudomonas lerugmosa.ii .Pseudomonas putida. Возможные ассоцианты, использованные в нашем опыте, не культивировались.

Таблица 4

Специфичность элективной минеральной среды

■ Вид бактерии Количество, шт. Рост на контрольной среде Рост на элективной среде

1 Ps. aeruginosa 57 + +

п Ps.putida 10 + +

3 P. mirabilis 10 + -

4 St. aureus 8 -г -

5 Citrobacter 4 . + -

6 E. coli 9 - . • -

7 Listeria mono-s 7 + -

8 M. morganii 11 + ' -

9 St. pyogenes 7 + -

10 St.albi 5 + -

11 K1 pneumoinae 4 -г -

12 S. paratyphi 6 + -

+ рост штамма; - рост штамма отсутствует.

Таким образом, элективная минеральная среда проводит элективный отбор бактерий до видов Pseudomonas aeruginosa i Pseudomonas putida.

2.2.2.4. Определение чувствительности элективной и элективной минеральной сред

Следующей задачей исследований было определение чувстви тельности элективной и элективно-минеральной сред (УГСХА-Ps.al: и yrCXA-Ps:a23). В результате опытов были получены данные, кото рые представлены в таблице 5.

Таблица 5

Показатели чувствительность элективных сред

! 1.10'6 1:10"7 S

Вид бактерии УГСХА-Ps.ala Контроль (ср. КОЕ) УГСХА-Рк.а2э Контроль (ср. КОЕ)

Ps. aeruginosa 97,1 105,8 10,6 10,4 1

Установлено, что чувствительность элективной и элективно! минеральной сред позволяет выявлять Pseudomonas aeruginosa npi концентрации от 20 микробных тел в см3.

2.2.2.4. Конструирование накопительной среды для Pseudomonas aeruginosa

За основу среды накопления, взяли среду Хью-Лейвсона и в ка-?естве элективного агента нитрофурановый состав (фурадонин 125 «кг/мл и фуразолина 35 мкг/мл). Поэтому состав среды накопления зля бактерии Pseudomonas aeruginosa включает следующие компоненты: 1) элективный агент - 160 мкг/мл (фурадонин 125 мкг/мл и {¡уразолина 35мкг/мл); 2) пептон - 2,0 г/л; 3) глюкоза - 10,0 г,л; 4) ¿алий фосфорнокислый двузамещённый - 0,05 г; 5) натрий хлорис-гый - 5,0 г; 6) бромтимоловый голубой - 3,0 г; 7) агар-агар - 3 г/л; 8) шетиллированная вода до 1000,0 мл. Среду в данном составе испы-гывали на специфичность и чувствительность.

Специфичность, среды накопления определяли в два этапа. По-;ев на среду накопления и на контроль исходной суспензии. Культи-шрование при 37°С 24 часа. Затем производили посев на контроль ;реды накопления.Культивирование при 37°С 24 часа. Результаты триведены'в таблице 6.

Таблица б

. Специфичность накопительной среды

N¡2 Вид бактерии 1 этап 2 этап

Коли- Рост Контроль Контроль

чество на среде исходной среды

штаммов накопления суспензии накопления

1 Ps. aeruginosa 57 -4- 4" +

■у Ps. putida 10 4- 4- 4-

3 Pr.mirabilis 10 - 4- -

4 St. aureus 8- - ' 4- - "

5 Citrobacter 13 - + - '

б E. coli 9 - 4- -

7 Listeria mono-s 7 - 4- -

8 M. morganii 11 - 4- -

9 St. pyogenes 7 - 4- -

10 St.albi 5 .i. -

11 Kl. pneumoinae 4 - 4- -

12 S. paratyphi 6 ■ - + -

+ рост штамма: - рост отсутствует.

Полученные данные свидетельствуют: на среде накопления проводит накопление бактериальной массы Pseudomonas aeruginosa и 'seudomonas putida. Рост ассоциантов не установлен.

Было проведено исследование накопительной среды с целые установить оптимальное время культивирования Pseudomonas aeruginosa на среде нахоплениягРезультаты подсчёта КОЕ в периода времени приведены йй?Дй#ра|мЙе.;

Полученные рез^льтат^грсрщетельствуют, что наибольшее количество ми кр о он ых^слето^ достигается через 48 часов. Резкое увеличение количества тКечР-наблюдаегся от 18 до 24 часов. Поэгош Iidßiim.4. t >

оптимальное время культивирования составляет 24-48 часов.

аиэлиалс' 5- i

а*ч öto üi^iain гвпоиюЬнагЯ

—-- 72 ч

2.2.2.5. Определение чувствительности накопительной

среды

Накопительная среэ&чДолжна давать возможность для развитие бактерий РзеЫотопадсает^шодгиз сравнительно малого количеств; микробных клеток. БьЯЮ_лро5ведено испытание чуствительности на копительной среды. В;треау.цьтат^ проведённых испытаний были по лучены следующие результаты которые приведи в таблице 7.

Si^oYl

Таблица 7

Результаты определения чувствительности среды накопления

Вид бактерий —.—q stапо Дим-:--- Чувствительно<;ть среды накопления (ср. зн. КОЕ)

^I^JßlÜÜ ао-7 1-Ю'8 МО"9

Ps. aeruginosa 53,56 13,52 . -

патт&цыти

Установлено, ^хо^^^сре^а^ накопления способна выявит Pseudomonas aeruginosa в Концентрации 10 микробных тел в см3.

2.2.2.6. Разработка бактериологического метода выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa для обследования санитарного состояния объектов внешней среды

Бактерия Pseudomonas aeruginosa является одним из маркеров :остояиия объектов внешней среды и имеет важное санитарно-игиеническое значение, чем и объясняется значимость своевремен-!ого выделения синегнойной палочки.

Разработку данного бактериологического метода производили, [спользуя результаты предыдущих исследований по созданию нако-штельной среды ( УГСХА-Рз.аЗн), элективной среды ( УГСХА-Ps. ib) и ( УГСХА-Ps. а2э), а так же результаты опытов с использовани-:м питательного агара с хлоридом бария, ацетамидного агара, тер-{офильной пробы на МПА при 42°С, цитохромоксидазной пробы. По результатам проведенных экспериментов выявлена наиболее опти-1альная схема выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa, •аботу проводили следующим способом. Приготовили микробную успензию Pseudomonas aeruginosa в пробирках на физическом рас-воре, в качестве контроля использовали бактерии видов: 'seudomonas putida; Proteus mirabilis; Staphylococus aureus; Citrobacter; Listeria monocytogenes; Proteus vulgaris в коцентрации 00 микробных клеток в см3. Произвели посев пастеровской пипет-:ой в объёме 0Л мл (10 микробных клеток) в 0,4 мл среды накопле-[ия. Культивировали 48 часов при 37°С (температурный режим и ремя культивирования на среде накопления описаны выше). Со сре-;ы накопления осуществили посев с помощью пастеровской пипетки объёме 0,1 мл на мясо-пептонный агар в чашках Петри (для кон-роля ). Культивируем при 37°С 24 часа. Результаты КОЕ приведены таблице 8. .-.<■■■■ .■-■

Таблица 8

Контроль среды накопления

P.aeru-sa P.pu-da P.mir-ilis 1 S.aureus Citr-ter L.mo-nes P. vul-ris

29 11 1 - - •'

Примечание: "-"- отсутствие колоний.

Одновременно из среды накопления сделали посев пастеров-кой пипеткой в объёме ОД мл на чашки Петри с элективной средой УГСХА-Рз. а2э). Культивировали при 37°С 24 часа. Результаты под-чёта КОЕ на элективной среде приведены в таблице 9.

Таблица 9

Количество КОЕ на элективной среде

P.aer-sa P.pu-aaj P.mir-ilis S.aureus! C-ter L.mo-nes P.vul-ris

52 10 1 i i - - -

Примечание: "-" - отсутствие колоний.

Микробные колонии с элективной среды ( УГСХА-Рб. а2з) пересеяли на ацетатамидный агар и питательный агар с хлоридом бария, культивировали при 37°С 24 часа, а также на скошенный мясо-ггеггтонный агар для изучения термофильных свойств при 42°С на 24 часа, выросшие колонии на МПА проверяют на цитохромоксидазу. Полученные результаты приведены в таблице 10.

Таблица 10

Результаты исследования

Teer Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida

Питательный агар с хлоридом бария - -

Ацетамидный агар + ■ -

Цитохромоксидаза +

Мясо-пептонный агар (42°С) + ■ :

Примечание: "+ " - рост колоний; - рост отсутствует.

На накопительной среде УГСХА-Рз.аЗн произошло накопление биологической массы бактерий Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, накопление возможных ассоциантов не установлено. На элективной среде УГСХА-Рэ.а2э был установлен рост Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida. Рост ассоциантов на элективной среде УГСХА-Ps. а2э отсутствовал. На питательном агаре с хлоридом бария Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida us культивировались. На анетамидном агаре был отмечен рост Pseudomonas aeruginosa. При 42°С отмечен рост у Pseudomonas aeruginosa. Опираясь на вышеизложенные,этапы исследования, предлагаем схем} выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектог внешней среды.

Рис. 1. Схема исследования материала.

Доказано, что представленная схема позволяет использовать её для проведения санитарной оценки объектов окружающей среды на наличие Pseudomonas aeruginosa.

2.2.2.7. Бактериологический метод выделения и иден тификаяии Pseudomonas aeruginosa из патологического материала

Конструирование данного бактериологического метода проводили, используя свойства элективных сред УГСХА-Рй.аХэ, УГСХА-Ps.а2э и УГСХА-Ps.аЗн. Результаты предыдущих опытов указывали, тто на элективной минеральной среде( УГСХА-Ps. а2э) происходила »лекция возможных ассоциантов Pseudomonas aeruginosa. На элек-гивной среде УГСХА-Ps.а2э обнаруживали рост Pseudomonas leruginosa и Pseudomonas putida. На питательном агаре с хлоридом эария рост Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas putida не обнару-кивали. На ацетамидном агаре культивировалась только Pseudomonas leruginosa. Рост при 42°С был обнаружен только у Pseudomonas leruginosa. На основе приведенных исследований были предложены :ледуюшие этапы выделения Pseudomonas aeruginosa из патологиче-гкого материала.

1- . Подготовка материала

3.

Накопительная среда

питательный агар с BaCh

■чцетамндиый агар

42 °С

Рис. 2. Схема выделения

Предлагаемая схема позволяет выделить и идентифидироват Pseudomonas aeruginosa из патологического материала. Отличитель ные особенности данного метода от прототипов: применение элек тивных сред УГСХА-Р5.а1э и УГСХА-Рк.а2э; применение контрол. элективных качеств среды; сокращение сроков исследований.

1. Разработана элективная нитрофурановах среда УГСХА Р5.а1э: элективный агент - 160,0 мг (фурадонина 125.0 мг и фуразо лина 35,0 мг); пептон - 2,0 г; глюкоза - 10,0 г; агар-агар - 30,0 г; ка лий фосфорнокислый двузамещённый 0,05 г; магний сернокнслы! 0,1 г; бромтимоловый голубой - 0,03 г; дистиллированная вода Д' 1000,0 см3. Чувствительность элективной среды способна выявит Pseudomonas aeruginosa из разведения от 20 микробных клеток в см3 Среда позволяет проводить элекцию бактерий до Pseudomona aeruginosa и Pseudomonas putida.

2. Разработана элективная минеральная нитрофурановая сред yrCXA-Ps.a23: элективный агент - 160,0 мг (фурадонина 125,0 мг ; фуразолина 35,0 мг); аммоний фосфорнокислый однозамещённый 1,0 г; натрий уксуснокислый - 2,0 г; натрий фосфорнокислый двуза мещённый - 1,0; натрий хлористый - 5,0; магний сернокислый - 0,4 бромтимоловый синий - 0,06г; агар-агар - 20г. Дистиллированная во да до 1000,0 см3. Чувствительность разработанной элективной мине ральной среды способна выделить Pseudomonas aeruginosa or 2 микробных клеток в см3.

3. ВЫВОДЫ

3. Разработана накопительная нитрофурановая среда УГСХА-s-аЗн: элективный агент - 160,0 мг (фурадонина 125,0 мг и фуразо-ина 35,0 мг); пептон - 2,0 г; глюкоза - 10,0 г; калий фосфорнокис-ый двузамещйнный - 0,05 г; натрий хлористый - 5,0 г; бромтимоло-ый голубой - 0,03 г; агар-агар - 3,0 г; дистиллированная вода до 000,0 см3. В среде накопления происходит накопление бактериаяь-ой массы Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas putida. Рост ассонантов не установлен. Среда накопления способна выявить seudomonas aeruginosa в концентрации 10 микробных тел в см3, птимальное время культивирования 24-48 часов.*

4. Разработаный метод менее трудоемкий и более точный, чем чествующий и позволяет выделить и идентифицировать seudomonas aeruginosa из обектов внешней среды за 96 часов.

5. Разработаный метод менее трудоемкий и более точный, чем чцествующие и позволяет выделить и идентифицировать seudomonas aeruginosa из патологического материала за 72 часа.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработаны и предложены элективная среда YrCXA-Ps.al3 и ективная минеральная среда УГСХА-Рз.а2э для выделения и иден-[фикации Pseudomonas aeruginosa,

2. Разработанную накопительную среду УГСХА-Рэ.аЗн необхо-[ио применять для выделения и идентификации Pseudomonas ruginosa.

3. Выделение и идентификацию Pseudomonas aeruginosa из объ-тов внешней среды необходимо проводить согласно методическим азаниям утвержденым ректором УГСХА №_.

4. Выделение и идентификацию Pseudomonas aeruginosa из па-логического материала необходимо проводить согласно методиче-им указаниям утвержденым ректором УГСХА №_.

5. Культуры микроорганизмов, выделенные и идентифициро-нные, используются в ВНИИЗЖ при производстве вакцины.

6. Материалы диссертации используются для при чтении лекций микробиологии на факультете ветеринарной медицины Ульянов-

эй государственной сельскохозяйственной академии. Культуры кроорганизмов, выделенные и идентифицированные, используются лабораторно-практических занятиях по, микробиологии на факуль-ге ветеринарной медицины УГСХА.

5. СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ДАННОЙ ТЕМЕ

1. Русалеев B.C., Васильев Д.À., Афонин Э.А. и другие. Разра ботка питательной среды для культивирования сальмонелл, псевдс монад и пастерелл. Научно-практическая конференция "Профилак тика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка крупнс рогатого скота и свиней." Новосибирск. 1996.

2. Васильев Д А.,. Карсунцев А.Ф., Золотухин С.Н., Афони Э.А., Малов A.A., Северов О.П., Молофеева Н.И., Волгушова Н.Г П.ульчеровская Л.П., Мерчина C.B. Антимикробное действие химис препарата 1,8,3,6 диэндометил-1-3-6-8-тетрадилодекана ( А-24). T« зисы докладов 9-ой Межгосударственной межвузовской научнс практической конференции. Санкт Питербург. 1997г.

3. Русалеев B.C., Васильев Д.А., Афонин Э.А. и другие. Разр! ботка питательной среды для культивирования сальмонелл, псевдс монад и пастерелл. Научно-практическая конференци "Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями моло; няка крупно-рогатого скота и свиней." Новосибирск. 1996.

4. Васильев Д.А., Юдина В.М., Афонин Э.А. Селективные сред по выделению Pseudomonas aeruginosa. Сборник научных труде "Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарнс экспертизы." Ульяновск. 1998 г.

5. Золотухин С.Н., Афонин Э.А., Северов О.П., Васильев Д.^ Сборник научных трудов. Диагностика, лечение и профилактика з болеваний животных. Ульяновск. 1999 г.

Бактерия Pseudomonas aeruginosa всё чаще выделяются в воде открытых водоёмов и объектах внешней среды и интерес к Pseudomonas aeruginosa огромен (J. Vincent 1995; G. Gillardi 1991; N. Palleroni 1984; A. Darzins 1997; H. Hahn 1997; W. Bitter, M. Koster, M. Latijnhouwers et. el. 1998; P. Pllesiant, J. Aires, C. Godard et. el. 1997; D. Hart 1994; Von Graevenitz 1985; P. Meadow 1975; J. Liston et. el. 1963; R. Freedman et. el. 1973; Мильченко Б. П. 1975; Захарова И. Я. 1984; Киприанова Е. А. и соавторы 1980; Кудлай Д. Г. и соавторы 1966). Классификации псевдомонад и элементам воздействия Pseudomonas aeruginosa на макроорганизм посвещено большое количество литературы (J. Stock et. el. 1989; D. Frank et. el. 1991; M. Hobbs, E. Collie, P. Free et. el. 1993; W. Fugua et. el. 1994; E. Pesci et. el. 1997; T. Yahr, L. Mende-Mueler, M. Friese et. el. 1997; J. Kadurugamuwa et. el. 1997). Псевдомонадные инфекции стали занимать ведущее место среди нозокоминальных заболеваний (Ильюхин В.И., 1985; Н. Neu, 1985). Pseudomonas aeruginosa вызывает внутри-больничную инфекцию и фибринозную пузырчатку лёгких у человека, особенности клинической картины инфекций, вызываемых Pseudomonas aeruginosa описаны у следующих авторов (D. Talon, В. Mulin, С. Rouget et. el. 1998; J. Fagon, J. Chastre, Y. Domart et. el 1996; M. Falagas, L. Barefoot, J. Griffith et. el. 1996; A. Fluit, M. Jones, F. Schmitz et. el. 1998; A. Baltch, P. Griffin 1977; G. Bodey et. el. 1985; M. McKendrick et. el. 1981; A. Lechi, E. Arosio, P. Pancera et. el. 1984; P. Gallaghar, C. Watanakunakorn 1989; M. Hilf, V. Yu, J. Zuravleff et. el. 1989; J. Mallolas, J. Gatelli, J. Miro et. el 1991; F. Vidal, J. Mensa, M. Almela et. el. 1996; T. Laughlin, D. Armstrong, J. Caporusso et. el 1997; H. Pedersen, J. Rosborg 1997). В санитарно-гигиеническом аспекте Pseudomonas aeruginosa считают наиболее мощным источником контаминации поверхностных вод, в которой человек является мишенью, а жидкости промежуточным звеном передачи. В литературе описаны случаи, когда Pseudomonas aeruginosa была этологической причиной заболеваний человека, где фактором передачи была водная среда. Трудности этиотропной терапии, вызванной Pseudomonas aeruginosa, отмечаются многими авторами, такими как С. Fernandes, R. Pritchard, A. Morris et. el. (1998), V. Andriole (1979), R. Weinstein, L. Young, W. Hewitt (1975), R. Khakoo, et. al (1979), A. Baltch, R. Smith (1985), G. Bodey et. el. (1976), C. Solberg, H. Sjursen, (1995), C. Brun-Buisson, J. Sollet, H. Schweich et. el. (1998), J. Garau, J. Blanquer, L. Cobo et. el. (1997), S. Byrne, J. Maddison, P. Connor et. el. (1995), Y. Siegman-Igra, R. Ravona, H. Primerman et. el. (1998), L. Leibovici, M. Paul, O. Polznanski et. el. (1997), J. Denhollander, A. Horrevorts, M. Vangoor et. el. (1998), при чём на ярко выраженную резистентность Pseudomonas aeruginosa во время терапии указывали N. Troillet, et. el. (1997), D. Pierard et. el.(1998), G. Bonfiglio, Y. Laksai, N. Franceschini et. el. (1998), J. Laconis, D. Pitrin, W. Sheikh, H. Nadler (1977). У животных и птиц, Pseudomonas aeruginosa вызывает эпиоозотическое заболевание псевдомоноз.

При изучении роли Pseudomonas aeruginosa в патологии человека и животных приходится сталкиваться с тем, что длительное время в таксономии рода преобладали отрицательные признаки. Достаточное число видов не имеет чётких критериев идентификации. Описано 250 видов, относящихся к бактериям данного рода, но из них всего 29 имеют определительные критерии в справочнике Берджи. Осложняют работу бактериологам-практикам отсутствие современных методов выделения Pseudomonas aeruginosa из патологического материала и объектов внешней среды. Это привело к тому, что многие выделенные культуры, имеющие явные родовые признаки Pseudomonas, диагностируются, как вид Pseudomonas aeruginosa, хотя могут не являться таковыми. Более детальная идентификация отдельных видов данного рода стала разрабатываться лишь в последнее время.

Целью настоящей работы являлось усовершенствование методов бактериологической идентификации Pseudomonas aeruginosa. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из патологического материала.

2. Разработать метод выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды.

3. Разработать накопительную среду для выделения Pseudomonas aeruginosa.

4. Разработать элективные среды для выделения Pseudomonas aeruginosa.

Научная новизна работы. Разработаны новые, менее трудоемкие и более точные, методы выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из патологического материала и объектов внешней среды, которые позволяют сократить сроки исследования на 24 часа по сравнению с разработанными методами. Разработаны новые элективные среды, которые по чувствительности не уступают уже имеющимся, но более специфичны по отношению к росту возможных ассоциантов. Разработана накопительная среда для выделения Pseudomonas aeruginosa, которая позволяет накапливать микробную массу из концентрации от 10 микробных тел в см3.

Практическая значимость. Разработанные методы бактериологического выделения Pseudomonas aeruginosa позволяют выделять и идентифицировать микроорганизм данного вида в течении 72-96 часов.

Разработанные элективные среды YrCXA-Ps.al3 и УГСХА-Ps.23 имеют чувствительность, способную выделить Pseudomonas aeruginosa из возможных ассоциантов в концентрации от 20 микробных тел в см3.

Разработанная накопительная среда УГСХА-Рв.Зэ позволяет в течении 24-48 часов накапливать Pseudomonas aeruginosa из концентрации от 10 микробных тел в см3, при этом ингибируется рост ассоциантов.

На защиту выносятся следующие положения.

1. Конструирование бактериологических методов выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa из: а) патологического материала; б) объектов внешней среды.

2. Конструирование среды накопления для Pseudomonas aeruginosa.

3. Конструирование элективных сред для Pseudomonas aeruginosa.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Разработана элективная нитрофурановая среда УГСХА-Ps.al3: элективный агент - 160,0 мг (фурадонина 125,0 мг и фуразо-лина 35,0 мг); пептон - 2,0 г; глюкоза - 10,0 г; агар-агар - 30,0 г; калий фосфорнокислый двузамещённый 0,05 г; магний сернокислый 0,1 г; бромтимоловый голубой - 0,03 г; дистиллированная вода до о

1000,0 см . Чувствительность элективной среды способна выявить Pseudomonas aeruginosa из разведения от 20 микробных клеток в см3. Среда позволяет проводить элекцию бактерий до Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas putida.

2. Разработана элективная минеральная нитрофурановая среда УГСХА-Р8.а2э: элективный агент - 160,0 мг (фурадонина 125,0 мг и фуразолина 35,0 мг); аммоний фосфорнокислый однозамещённый -1,0 г; натрий уксуснокислый - 2,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещённый - 1,0; натрий хлористый - 5,0; магний сернокислый - 0,4; бромтимоловый синий - 0,06г; агар-агар - 20г. Дистиллированная вода до 1000,0 см3. Чувствительность разработанной элективной минеральной среды способна выделить Pseudomonas aeruginosa от 20 микробных клеток в см3.

3. Разработана накопительная нитрофурановая среда УГСХА-Ps-аЗн: элективный агент - 160,0 мг (фурадонина 125,0 мг и фуразолина 35,0 мг); пептон - 2,0 г; глюкоза - 10,0 г; калий фосфорнокислый двузамещённый - 0,05 г; натрий хлористый - 5,0 г; бромтимоловый голубой - 0,03 г; агар-агар - 3,0 г; дистиллированная вода до 1000,0 см3. В среде накопления происходит накопление бактериальной массы Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas putida. Рост ассоциантов не установлен. Среда накопления способна выявить Pseudomonas aeruginosa в концентрации 10 микробных тел в см . Оптимальное время культивирования 24-48 часов.

4. Разработанный метод менее трудоемкий и более точный, чем существующий и позволяет выделить и идентифицировать Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды за 96 часов.

5. Разработанный метод менее трудоемкий и более точный, чем существующие методы, позволяет выделить и идентифицировать Pseudomonas aeruginosa из патологического материала за 72 часа.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработаны и предложены элективная среда УГСХА-Рв.аХэ и элективная минеральная среда УГСХА-Р8.а2э для выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa.

2. Разработанную накопительную среду YrCXA-Ps.a3H необходимо применять для выделения и идентификации Pseudomonas aeruginosa.

3. Выделение и идентификацию Pseudomonas aeruginosa из объектов внешней среды необходимо проводить согласно методическим указаниям, утвержденным ректором УГСХА №

4. Выделение и идентификацию Pseudomonas aeruginosa из патологического материала необходимо проводить согласно методическим, указаниям утвержденным ректором УГСХА №

5. Культуры микроорганизмов, выделенные и идентифицированные, используются в ВНИИЗЖ при производстве вакцины.

6. Материалы диссертации используются при чтении лекций по микробиологии на факультете ветеринарной медицины Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Культуры микроорганизмов, выделенные и идентифицированные, используются на лабораторно-практических занятиях по микробиологии на факультете ветеринарной медицины УГСХА.