Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Закономерности продукции иммуноцитокинов в зависимости от биологических свойств возбудителя псевдотуберкулеза (Клинико-экспериментальное исследование)

На правах рукописи

ВОРОПАЕВ Артем Валерьевич > 3

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОДУКЦИИ ИММУНОЦИТОКИНОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА (Клинико-экспериментальное исследование)

14.00.16 - патопогическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иркутск, 2002

Работа выполнена на кафедре инфекционных болезней ¡Иркутского государственного медицинского университета Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор И.В. Малов Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Е.Г. Кирдей Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор И.Ж. Семинский кандидат биологических наук, с. н. с. В.И. Дубровина

Ведущая организация: Сибирский государственный медицинский университет Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « V » Д^С^-А 2002 г. на заседании диссертационного совета Д 001.054.01 в ГУ "ВосточноСибирский научный центр Сибирского отделения РАМН" (664003, Иркутск, ул. Тимирязева, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ "Восточно-Сибирский научный центр Сибирского отделения РАМН" по адресу: (664003, Иркутск, ул. Тимирязева, 16)

Автореферат разослан «_» _2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских на Л. Ф. Шолохов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Псевдотуберкулез привлекает в последние годы все большее внимание исследователей из-за широкой распространенности, роста заболеваемости и наличия у возбудителя большого числа факторов патогенно-сти. В настоящее время основные механизмы патогенности Yersinia pseudotuberculosis, такие как способность к внеклеточному размножению и ингибиция фагоцитоза, связывают с плазмидой вирулентности pYV (45-48 MD), детерминирующей контакт-зависимую секрецию эффекторных белков внешней мембраны иерсиний (Yop белков).

Особенный интерес для изучения представляет плазми-да pVM82 с молекулярной массой 82 MD. На территории Иркутской области сформировалось два очага псевдотуберкулеза: на юге области циркулирует двухплазмидный штамм Y. pseudotuberculosis, несущий плазмиды pYV и pVM82, а на северо-западе области Y. pseudotuberculosis только с одной плазмидой pYV.

Клинические наблюдения указывают на зависимость между степенью тяжести, выраженностью клинической симптоматики и наличием плазмиды pVM82 у возбудителя [Климов В.Т. с соавт., 1999; Малов И.В., 1995]. Существует предположение об иммуносупрессивном действии плазмиды pVM82 Y. pseudotuberculosis [Шурыгина И.А., 1994], но природа и механизм этого явления еще не установлены.

На настоящем этапе развития наук стало возможным перейти от описательных методов к исследованию механизмов биологических процессов. Примером такого рода служит изучение уровней медиаторов йммунного ответа или имму-ноцитокинов, отражающих процессы клеточной кооперации при развитии иммунного ответа. Продукция цитокинов под действием антигенов и самого возбудителя псевдотуберкулеза практически не изучена.

На основании вышеизложенного, основной целью работы явилось исследование закономерностей продукции им-муноцитокинов в зависимости от свойств плазмид pYV, pVM82 и факторов патогенности возбудителя псевдотуберкулеза.

Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. Установить действие штаммов Y. pseudotuberculosis с различным плазмидным спектром на продукцию иммуноцитокинов в культуре клеток крови доноров;

2. Определить уровень иммуноцитокинов в сыворотке крови у больных псевдотуберкулезом в зависимости от плаз-мидного спектра Y. pseudotuberculosis;

3. Исследовать воздействие суперантигена Y. pseudotuberculosis на выработку иммуноцитокинов в культуре клеток крови доноров;

4. Выяснить влияние липополисахарида (ЛПС) Y. pseudotuberculosis на продукцию ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а и ИЛ-2 в культуре клеток крови доноров;

5. Определить концентрацию ЛПС Y. pseudotuberculosis, максимально стимулирующую фагоцитоз макрофагов.

Научная новизна. Проведенные исследования расширили представление о факторах патогенности Y. pseudotuberculosis и закономерностях формирования иммунного ответа под влиянием различных штаммов возбудителя псевдотуберкулеза. Впервые обнаружен механизм влияния криптической плазмиды pVM82 на течение инфекционного процесса при псевдотуберкулезе, заключающийся в угнетении продукции интерферона альфа (ИФН-а), интерлейкина-1 (ИЛ-1), интер-лейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухолей альфа (ФНО-а), интерлейкина-2 (ИЛ-2), что является проявлением иммунологической недостаточности макроорганизма. Приоритетными являются данные о продукции цитокинов клетками цельной крови доноров in vitro под влиянием суперантигена, живых культур Y. pseudotuberculosis с различным плазмидным спектром и у больных псевдотуберкулезом. Новыми являются данные о том, что суперантиген YPMa и плазмиды pYV и pVM82, действуя через изменение продукции ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а и ИЛ-2, являются существенными факторами патогенности Y. pseudotuberculosis. Разработан "Способ определения цитокинопродуцирующей способности штамма возбудителя" (заявка на изобретение № 2001119710 от 16 июня 2001 г. Воропаев А.В. с соавт.). Способ позволяет оценивать иммуногенность возбудителя инфекционного заболевания.

Теоретическая и практическая значимость работы

состоит в установлении механизма влияния криптической плазмиды pVM82 на течение инфекционного процесса при псевдотуберкулезе. Показана возможность прогнозирования клинического течения заболевания в зависимости от плаз-мидного спектра Y. pseudotuberculosis, что особенно актуально в условиях вспышечной заболеваемости псевдотуберкулезом. Полученные данные указывают на патогенетически обоснованную необходимость определения уровня цитокинов и коррекции цитокинового статуса у больных псевдотуберкулезом.

Основные положения, вытекающие из проведенных исследований, используются в учебном процессе на кафедрах патологической физиологии, инфекционных болезней и иммунологии ИГМУ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Высокое патогенное действие плазмиды pVM82 обусловлено ее способностью вызывать иммунологическую недостаточность макроорганизма, проявляющуюся угнетением продукции иммуноцитокинов, что приводит к более тяжелой клинической картине псевдотуберкулеза, обусловленного двухплазмидным штаммом возбудителя в сравнении с одноплазмидным.

2. Механизм действия суперантигена Y. pseudotuberculosis связан с его способностью усиленно стимулировать ци-токинопродукцию в сравнении с липополисахаридом и штаммами возбудителя.

3. Липополисахарид Y. pseudotuberculosis в малых дозах стимулирует, а больших угнетает фагоцитарную активность макрофагов.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены на II международном Российско-Монгольском симпозиуме, Иркутск, 2001 г.; на заседании областной Ассоциации врачей инфекционистов Иркутской области, Иркутск, 2002 г.; на расширенном кафедральном заседании кафедры инфекционный болезней совместно с кафедрой патологической физиологии и медицинской биологии ИГМУ, Иркутск, 2002 г.

Структура диссертации:

Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, изложения материала и методов исследования, четырех глав собственных наблюдений, обсуждения и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 15 рисунками. Список источников литературы включает 168 работ отечественных и зарубежных айторов.

По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Методы исследования

Концентрацию ЛПС Y. pseudotuberculosis, оказывающую стимулирующее влияние на фагоцитоз, исследовали в культуре клеток моноцитов-макрофагов селезенки крыс с помощью НСТ и латекс-тестов по описанному нами ранее методу [Воропаев А.В., 1999; 2000].

В экспериментальной части работы были использованы следующие штаммы, полученные из музея живых культур ГУ "Иркутский ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока": штамм Y. pseudotuberculosis I серовара № 8, содержащий плазмиды pYV и pVM82; штамм Y. pseudotuberculosis I серовара № 890, содержащий плазмиду pYV; штамм Y. enterocolitica III серовара № 15, содержащий плазмиду pYV. Все штаммы выделены от больных на территории Иркутской области. Мы использовали также дериват штамма №890 - штамм Y. pseudotuberculosis I серовара № 890-Д, не содержащий плазмид.

Влияние живых штаммов иерсиний на уровень продукции цитокинов культурой клеток цельной крови доноров определяли с помощью собственного способа определения ци-токинопродуцирующей способности штамма возбудителя (имеется заявка на изобретение). Суть методики заключалась в следующем: в каждой серии использовали культуру клеток цельной крови одного донора, в контроле к 1 мл культуры клеток цельной крови добавляли 10 мкл физиологического раствора, к положительному контролю добавляли 10 мкл суспензии ЛПС Y. pseudotuberculosis в концентрации 5 мкг/мл, в опытные микропробирки - по 10 мкл суспензии одного из исследуемых штаммов живой культуры возбудителя в конечной концентрации 106 м.к./мл или 10 мкл супернатанта,

содержащего суперантиген в количестве, эквивалентном конечной концентрации 10б м.к./мл. Микропробирки инкубировали 24 часа при 37°С, затем отбирали супернатант и определяли уровень иммуноцитокинов методом иммунофермент-ного анализа (на анализаторе Bio-Tek Instrument Inc. ELx-808щ, США) с использованием наборов реагентов РгоСоп (Протеиновый контур, Россия). В качестве суперантигена использовали супернатант двухплазмидного штамма Y. pseudotuberculosis, который получали дезинтегрированием 24 часовой (при 37°С) культуры Y. pseudotuberculosis в концентрации 1011 м.к./мл с последующим центрифугированием при 20000 об./мин. для осаждения дебриса. Ген урт, кодирующий суперантиген YPMa, определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами 5'-CGTTGG-CGACTGATTATGAT-3' и 5'-TGACAAGGAAGATAGTGAC-3'.

Нами обследовано 63 больных во время вспышек заболевания в 2001 г. из двух очагов псевдотуберкулеза. В северо-западном очаге, где циркулирует Y. pseudotuberculosis (pYV+), под наблюдением были 42 пациента, находившихся на лечении в ЦРБ г. Тулуна, средний возраст больных 12,6 лет, из них мужского пола 22. Из южного очага с двухплаз-мидным возбудителем был обследован 21 больной, находившийся на лечении в военном госпитале г. Иркутска, средний возраст больных 18,7 лет, все больные мужского пола.

Верификация диагноза проводилась на основе данных эпидемиологического анамнеза, установления факторов передачи псевдотуберкулеза с использованием метода ПЦР, клинического обследования, индикации возбудителя у больных при помощи бактериологических, серологических исследований и методом ПЦР. Диагноз формулировался в соответствии с классификацией псевдотуберкулеза, разработанной Ющуком Н.Д. (1988).

В качестве контрольной группы обследовано 20 практически здоровых лиц в возрасте 18-22 лет, в среднем 19,4 года, из них восемь мужчин.

Исследование выполнено в Иркутском государственном медицинском университете, а также на базе эпидемиологического отдела (зав. отд. д.м.н., проф. Марамович А.С.) и лаборатории патофизиологического отдела (зав. отд. д.м.н., проф. Голубинский Е.П.) ГУ "Иркутский ордена Трудового

Красного Знамени Научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока" (директор д.м.н., проф. Голубинский Е.П.) и лаборатории иммунологии отдела лабораторной диагностики Научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (зав. лаб. к.м.н. Дмитриева JI.A., директор д.м.н., с.н.с. Шендеров В.А.).

Статистический анализ полученных данных проводили при помощи методов непараметрической статистики для связанных выборок с использованием двустороннего критерия Уилкоксона (метод использован для оценки фагоцитарной активности макрофагов селезенки крыс); методов параметрической статистики для связанных выборок: в эксперименте с культурой клеток цельной крови доноров применяли метод множественных сравнений с использованием критерия Стью-дента с поправкой Бонферони при сопоставлении с контролем и критерия Ньюмена-Кейлса при сравнении групп между собой; при оценке продукции цитокинов у больных в сравнении с донора>ш применяли парный критерий Т [Гланц С., 1999].

Вычисления производили, используя компьютерную программу Biostat.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ЛПС Y. pseudotuberculosis на фагоцитарную активность мононуклеарных фагоцитов селезеники крыс

ЛПС Y. pseudotuberculosis в концентрации 5-10 мкг/мл стимулирует поглотительные функции макрофагов в латекс-тесте, а в концентрации 30 мкг/мл угнетает фагоцитоз (рис.1). На респираторный взрыв макрофагов селезенки крыс ЛПС действует также дозозависимо, стимулируя при низких дозах и угнетая при высоких.

Исходя из полученных данных, в экспериментальной части работы по изучению продукции цитокинов в культуре клеток крови под действием штаммов Y. pseudotuberculosis в качестве положительного контроля мы использовали ЛПС в концентрации 5 мкг/мл, так как при такой концентрации ЛПС происходит наибольшее повышение фагоцитарной активности макрофагов (основных продуцентов провоспалительных цитокинов крови) и, соответственно, их активация и максимальная выработка цитокинов.

о со

so 40

О4

е

< 20 1

ю см

<

ю

0 J-

2, 5 10 15 20 30

концентрация Л ПС, мкг/мл

5 10 -is зо концентрация ЛПС, мкг/мл

о

А

Б

Рис. 1. Зависимость активности фагоцитоза (АФ) от концентрации ЛПС в латекс тесте (А) и НСТ-тесте (Б).

Примечание:---уровень контроля, достоверность изменений

по сравнению с контролем обозначена : о- Р>0,05, • - Р<0,05, ■ - Р<0,01.

Закономерности изменений продукции цитокинов под действием живых штаммов возбудителя псевдотуберкулеза

На рисунке 2 отражена продукция ИФН-а (А), ИЛ-1 (Б), ИЛ-6 (С) и ФНО-а (Д) под влиянием живых штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, ЛПС Y. pseudotuberculosis и суперантигена YPMa.

Под действием исследуемых субстанций значимого повышения продукции ИЛ-2 не происходило в связи с недостаточным временем инкубации для индукции выработки ИЛ-2 (24 часа).

В эксперименте с культивацией штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica с цельной культурой клеток крови установлено, что бактерии повышают выработку ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а по сравнению с уровнем их продукции в контроле, но величина этих изменений значительно меньше, чем под действием ЛПС Y. pseudotuberculosis, который отражает антигенные свойства микроорганизма.

Продукция цитокинов, вызываемая живыми штаммами возбудителя не достигает уровня выработки ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а под действием ЛПС, т. е. Y. pseudotuberculosis обладает способностью снижать цитокинопродукцию.

2 о

-и о

Концентрация, пкг/мл

о

о о

ы о

СП

о

со о

м м о

01 сг

ж

0) ъ-

ж-

^ ъ

нч »

Жег

Концентрация, пкг/мл

(Л

к> о

К

•О -О

И

•ъ

-<

ст>

О

ю "и

В)

V

э

ж

В

0) ст

Ж и

X

I

В)

"ДЧст

о; s J

га a. ь x

0 zr

1

о

160 140 120 100 80 60 40 20

а.Ь

b

-х-

ФНО-а

а.Ь а'ь а-ь

Pi P^l Г5!

а,Ь

-г-

pYV+ pYV+ К pVM+ pVM - Y.p. - Y.e.

Д

ЛПС YPMa

Рис 2. Влияние Y. pseudotuberculosis на цитокинопродукцию. Примечание: показана концентрация цитокинов ИФН-а (А), ИЛ-1 (Б), ИЛ-6 (С), ФНО-а (Д) в контроле (К) и под действием двухплазмидного штамма Y. pseudotuberculosis (pYV+pVM+), одноплазмидного штамма (pYV+pVM-), его бесплазмидного деривата (Y.p.-), Y. enterocolitica (Y.e.), ЛПС (ЛПС) и суперантигена (YPMa) Y. pseudotuberculosis, значимость различий в сравнении с Y. pseudotuberculosis (pYV+pVM+) обозначена: а - Р<0,05; относительно ЛПС Y. pseudotuberculosis: b - Р<0,05.

Штамм Y. pseudotuberculosis содержащий плазмиды pYV и pVM82 вызывает значимо меньшую продукцию цитокинов, по сравнению с одноплазмидным штаммом (рис. 3). Следовательно, наличие плазмиды pVM82 у Y. pseudotuberculosis придает микроорганизму свойство угнетать выработку цитокинов. Хотя штаммы возбудителя и вызывают повышение продукции как ИФН-а, так и провоспалительных цитокинов, но их выработка не одинаково интенсивная за счет относительной гипопродукции ИФН-а и гиперпродукции ИЛ-6. Цитокины ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а преимущественно вырабатываются моноцитами-макрофагами. При их активации происходит усиленная продукция всех вышеперечисленных цитокинов. В случае отставания в выработке ИФН-а от уровня продукции провоспалительных цитокинов, иммунный ответ неполноценный, так как недостает в необходимом количестве одного из медиаторов иммунной системы.

ИЛ-6 b,c

Q

s

X

® 600 -

Ш (0

О £400-| g

■z о

£ 300 -

X 0) J x

300-

200-

100

ИФН-а a A a a c Pi

I Щ

ИЛ-1

Рис. 3. Влияние Y. pseudotuberculosis (pYV+pVM+) на выработку иммуноцитокинов in vitro.

Примечание: светлые столбики - Y. pseudotuberculosis (pYV+ pVM+), темные - Y. pseudotuberculosis (pYV+), достоверность различий oo сравнению с контролем обозначена: а - Р<0,05, b - Р<0,01 и между штаммами: с - Р<0,05

Закономерности изменений продукции цитокннов под действием суперантигена Y. pseudotuberculosis

Обнаружено, что суперантиген значительно увеличивал продукцию ИФН-а ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а в культуре клеток крови доноров, что соответствует свойствам суперантигенов [Kappler J. et al., 1989]. Суперантиген YPMa вызывал повышенную выработку ИЛ-6 по сравнению с остальными цито-кинами. Продукция ИФН-а отставала от уровня выработки провоспалительных цитокинов (рис. 4).

Так как суперантиген в дозе, эквивалентной 103 м.к./мл, не вызывал значимых изменений в уровне продукции цитокинов по сравнению с контролем, а в дозе, эквивалентной 106 м.к./мл, достоверно увеличивал их выработку, то можно сделать заключение о необходимости минимального уровня бактериемии для представления моноцитам периферической крови необходимого количества суперантигена Y. pseudotuberculosis. В результате иммунокомпетентными клетками вырабатываются ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а.

и

ИФН-а ИЛ-1 ИЛ-6 ФНО-а

Рис. 4. Продукция цитокинов под действием штаммов возбудителя псевдотуберкулеза, ЛПС и суперантигена Y. pseudotuberculosis.

Примечание: различия по сравнению с уровнем контроля (горизонтальная плоскость) и различия между столбиками в каждом ряду значений для одного цитокина значимы.

Механизм действия суперантигена Y. pseudotuberculosis связан с его способностью вызывать гиперпродукцию продукцию провоспалительных цитокинов, вследствие чего происходит гиперактивация иммунной системы, дифференци-ровка и созревание эффекторных цитотоксических лимфоцитов и плазматических клеток, повышается синтез антител, белков острой фазы, происходит повреждение тканей за счет чрезмерной воспалительной реакции. Зсе это приводит к возникновению иммунопатологических осложнений при псевдотуберкулезе [Baba K.et al., 1991; Davenport A. et al., 1987; Saari К. et al., 1986]. Несоразмерно малое повышение ИФН-а на фоне чрезмерной продукции ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а нарушает процесс регуляции цитокинопродукции за счет недостаточного тормозящего влияния ИФН-а на выработку цитокинов, которое он в норме оказывает [Кирдей Е.Г., 2000].

Продукция ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а под влиянием суперантигена Y. pseudotuberculosis (в количестве, эквивалентном дозе Y. pseudotuberculosis 10б м.к./мл) была достоверно больше в сравнении с действием ЛПС (в концентрации

13

5 мкг/мл, эквивалентной дозе возбудителя 107 м.к./мл). Это указывает на способность суперантигена усиливать выработку цитокинов при меньшей концентрации возбудителя в крови. При массивной бактериемии, сопровождающейся гибелью микроорганизмов и высвобождении большого количества эндотоксина (ЛПС), пусковым механизмом гиперпродукции провоспалительных цитокинов является ЛПС [Gardlund В. et al., 1995; Groeneveld В. et al., 2001; Casey L. et al., 1993].

Суперантиген обладает способностью вызывать большую продукцию ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а, чем штаммы Y. pseudotuberculosis в равном количестве (106 м.к./мл) и при одинаковом времени инкубации. Таким образом, несмотря на способность Y. pseudotuberculosis вырабатывать суперантиген, продукция цитокинов под действием живой культуры возбудителя не достигает уровня выработки ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а, вызванного суперантигеном. Следовательно, Y. pseudotuberculosis подавляет продукцию цитокинов клетками крови.

Таким образом, суперантиген YPMa обладает более выраженной способностью стимулировать выработку ИЛ-1, ИЛ-6, ИФН-а и ФНО-а клетками цельной крови доноров in vitro в сравнении с ЛПС и штаммами Y. pseudotuberculosis.

Под действием живых штаммов иерсиний, ЛПС и суперантигена происходит активация цитокинопродуцирующих клеток крови, которые вырабатывают ИФН-а, ИЛ-6, ИЛ-1 и ФНО-а, но продукция ИФН-а не достигает уровня выработки провоспалительных цитокинов. Это указывает на негативный характер активации макрофагов (основных продуцентов ИЛ-1, ИЛ-6, ИФН-а и ФНО-а).

Закономерности изменений продукции цитокинов у больных псевдотуберкулезом

Наши клинические наблюдения указывают, что заболевание, обусловленное двухплазмидным штаммом, протекает более тяжело, чем вызванное одноплазмидным возбудителем псевдотуберкулеза.

У больных псевдотуберкулезом, обусловленным Y. pseudotuberculosis с плазмидами pYV и pVM82, наблюдалась более выраженная и длительная температурная реакция (температура > 38°С у 61,9% по сравнению с 7,1% больных псевдотуберкулезом, вызванным Y. pseudotuberculosis (pYV+),

Р<0,002), чаще отмечались артралгии (соответственно 42,8% и 4,8%, Р<0,002) и вовлечение в патологический процесс печени и селезенки (соответственно 57,1% и 7,1%, Р<0,003). Это обусловлено гипореактивностью иммунной системы вследствие проявления патогенных свойств плазмиды pVM82 Y. pseudotuberculosis.

Так, у больных псевдотуберкулезом на первой неделе заболевания на фоне повышения ИЛ-6, уровни ИЛ-1 и ФНО-а недостоверно повышены, а продукция ИФН-а и ИЛ-2 снижена по сравнению с контрольной группой. Таким образом, продукция цитокинов у больных в разгаре болезни увеличивается незначительно, что является проявлением иммунологической недостаточности (рис. 5).

170 -

Q) X

m со

Г150 -

о о

130

=г со о.

ИЛ-6

ИЛ-1

if

°110

90 -

ИНФ-а

ФНО-а

ИЛ-2

70

Рис. 5. Продукция цитокинов у больных псевдотуберкулезом на первой неделе болезни.

Примечание: — уровни цитокинов у доноров, больных одно-плазмидным (белые столбики) и двухплазмидным штаммами (серые столбики) Y. pseudotuberculosis на первой неделе заболевания, значимость различий по сравнению с группой доноров: а - Р<0,05.

и

Достоверных различий в уровнях ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-а и ИФН-а между двухплазмидным и одноплазмидны-ми штаммами Y. pseudotuberculosis выявить не удалось, по-видимому, из-за сильного индивидуального разброса в уровнях цитокинов у больных псевдотуберкулезом.

*

Рис. 6. Соотношение в величине продукции ИФН-а и про-воспалительных цитокинов у доноров и больных в разгаре заболевания.

Примечание: значимость различий: * - Р <0,05

Отставание выработки ИФН-а от провоспалительных цитокинов проявляется в достоверном увеличении соотношений ИЛ-1,* ИЛ-6 и ФНО-а к ИФН-а на первой неделе заболевания по сравнению с соотношениями в продукции этих цитокинов в контрольной группе (рис. 6). Экспериментальные данные о недостаточной продукции ИФН-а в сравнении с провоспалительными цитокинами под действием как Y. pseudotuberculosis (pYV+pVM+) и Y. pseudotuberculosis (pYV+), так и ЛПС и суперантигена Y. pseudotuberculosis согласуются с отставанием выработки ИФН-а у больных.

Таким образом, у больных псевдотуберкулезом в период разгара болезни не происходит ожидаемого подъема уровня цитокинов, выработка ИФН-а отстает от продукции ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а. Все это характеризует состояние иммунологической недостаточности при псевдотуберкулезе.

К третьей неделе заболевания разнонаправленность ци-токинопродукции нивелируется за счет достоверного повышения выработки ИФН-а и снижения ИЛ-6. Соотношение в продукции иммуноцитокинов нормализуется (рис. 7).

Имеющаяся разнонаправленность в выработке цитокинов замедляет процесс клеточной кооперации в развитии иммунного ответа при псевдотуберкулезе. Этим можно объяснить наблюдаемое медленное нарастание уровней цитокинов у больных, особенно ИЛ-2 и ИФН-а.

Q

5

О О о О

* i

m и

if

m ° W сГ

е- о

X 0) 3" х о ьй

180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70

ИЛ-6,

Г-

ИЛ-1

- О ФНО-а доноры

ИЛ-2 ©- *

ИФН-а QT ' 1 неделя

3 неделя

Рис. 7. Продукция иммуноцитокинов у больных псевдотуберкулезом, вызванном двухплазмидным штаммом Y. pseudotuberculosis на первой и третьей неделе болезни. Примечание: указана значимость изменений по сравнению с донорами: о- Р>0,05, • - Р<0,05 и у больных в динамике заболевания: * - Р<0,05.

Механизм влияния плазмиды pVM82 на течение инфекционного процесса при псевдотуберкулезе

Установлен механизм влияния криптической плазмиды pVM82 на течение инфекционного процесса при псевдотуберкулезе, заключающийся в выраженной способности возбудителя с плазмидами pYV и pVM82 вызывать угнетение продукции иммуноцитокинов по сравнению с одноплазмид-ным штаммом Y. pseudotuberculosis. В процессе взаимодействия с клетками крови происходит экспрессия факторов вирулентности микроорганизма, кодируемых плазмидой pVM82, и возбудитель проявляет витальные иммуносупрес-сивные свойства, заключающиеся в снижении выработки ци-токинов. Основными продуцентами в крови ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а и ИФН-а являются мононуклеарные фагоциты, при позитивной активации которых происходит усиленная выработка всех вышеперечисленных цитокинов [Кетлинский С. А. и др., 1995; Кирдей Е. Г., 2000; Ковальчук Л. В. и др., 1999].

В случае с возбудителем псевдотуберкулеза, увеличи-

вается уровень ИЛ-6, который стимулирует как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ, а продукция остальных иммуноцитокинов значительно не изменяется. Происходит незначительное повышение продукции ИЛ-1, который стимуг лирует Th-1 и продукцию белков острой фазы; усиливается выработка ФНО-а, который обладает тканеповреждающим действием. Продукция ИФН-а остается на исходном уровне контроля. Тогда как ожидается, что при позитивной активации фагоцитов увеличивается выработка всех цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИФН-а и ФНО-а).

Таким образом, активация фагоцитов при псевдотуберкулезе носит негативный характер, происходит угнетение иммунного ответа за счет недостаточной выработки иммуноцитокинов. Это приводит к состоянию иммунологической недостаточности, которое проявляется преобладанием генерализованных форм псевдотуберкулеза и более тяжелой клинической картиной заболевания.

Основные представления о механизмах, определяющих патогенность плазмид pYV, pVM82 и суперантигена Y. pseudotuberculosis отражены на рисунке 8.

Рис. 8. Гипотетическая схема механизмов, определяющих па-тогенность плазмид рУУ, рУМ82 и суперантигена УРМа

Выводы

1. Живые культуры Y. pseudotuberculosis обладают свойством вызывать значительно меньшее повышение продукции ИФН-а, ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а клетками цельной крови доноров in vitro по сравнению с ЛПС и суперантигеном Y. pseudotuberculosis.

2. Способность двухплазмидного штамма Y. pseudotuberculosis повышать выработку цитокинов клетками цельной крови доноров in vitro выражена слабее в сравнении с Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica с одной плазмидой pYV.

3. Плазмида pVM82 придает возбудителю свойство угнетать продукцию цитокинов.

4. Суперантиген YPMa обладает более выраженной способностью стимулировать выработку ИЛ-1, ИЛ-6, ИФН-а и ФНО-а клетками цельной крови доноров in vitro в сравнении с ЛПС Y. pseudotuberculosis.

5. У больных псевдотуберкулезом на первой неделе заболевания продуцируется недостаточное количество цитокинов, особенно ИФН-а. В период реконвалесценции выработка иммуноцитокинов нормализуется.

6. Штаммы Y. pseudotuberculosis, ЛПС и суперантиген Y. pseudotuberculosis вызывают недостаточное повышение ИФН-а по сравнению с провоспалительными цитокина-ми.

7. ЛПС Y. pseudotuberculosis в концентрации 5-10 мкг/мл стимулирует, а в концентрации 30 мкг/мл угнетает фагоцитоз (поглощение и респираторный взрыв) мононукле-арных фагоцитов.

Опубликованные работы по теме диссертации

1. Влияние аденозина на фагоцитарную активность моноцитов-макрофагов селезенки крыс в эксперименте// Сибирский медицинский журнал. - 1999. - № 3. - С. 38-41.

2. Влияние аденозина на фагоцитоз макрофагов селезенки крыс в эксперименте// Актуальные проблемы современной клиники: Тез. докл. - Красноярск. - 2000. - С. 27-29.

3. Стимуляция суперантигеном Yersinia pseudotuberculosis продукции иммуноцитокинов in vitro// Тихоокеанский медицинский журнал. - 2001. - №2(7). - С. 16-17. (Соавт. Щурыгина И. А., Климов В. Т., Малов И.В., Кирдей Е.Г.)

4. Влияние ЛПС Y. pseudotuberculosis на фагоцитарную активность культуры мононуклеарных фагоцитов селезенки крыс в эксперименте// Журнал инфекционной патологии. - 2001. - т.8, №1 .- С. 18-22. (Соавт. Шурыгина И. А., Малов И.В., Кирдей Е.Г.)

5. Влияние ЛПС и супернатанта суперантиген-продуцирующего штамма Yersinia pseudotuberculosis на продукцию имуноцитокинов in vitro// Журнал инфекционной патологии. - 2001. - т.8, №1. - С. 14-18 (Соавт. Шурыгина И. А., Климов В. Т., Малов И.В., Кирдей Е.Г.)

6. Продукция цитокинов при псевдотуберкулезе// Сибирский медицинский журнал. - 2002. - № 2. - С. 22-23. (Соавт. Шурыгина И. А., Климов В. Т., Чеснокова М.В., Ма-рамович А.С., Малов И.В., Кирдей Е.Г.)

7. Влияние Yersinia pseudotuberculosis на продукцию цитокинов клетками цельной крови доноров in vitro// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2002. - В печати.

Список условных сокращений

АФ - активность фагоцитоза ИЛ-1 - интерлейкин-1 ИЛ-2 - интерлейкин-2 ИЛ-6 - интерлейкин-6 ИФН-а - интерферон-альфа ЛПС - липополисахарид

м.к./мл - количество микробных клеток в 1 мл НСТ-тест - тест фагоцитоза частиц нитросинего тетразолия ПЦР - полимеразная цепная реакция ФНО-а - фактор некроза опухолей-альфа MD - мегадальтон

pYV - плазмида вирулентности иерсиний (plasmid of Yersinia

virulence), с молекулярной массой 45-48 MD pVM82 - плазмида с молекулярной массой 82 MD YPMa - суперантиген Y. pseudotuberculosis (Y. pseudotuberculosis derived mitogen, Y. pseudotuberculosis производный митоген)

Yop- белки - белки внешней мембраны иерсиний (Yersinia

outer membrane proteins) Ysc - секреторный аппарат иерсиний, составляющий III

тип бактериальной секреции (Yersinia secretion system)