Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Влияние экспрессии изоформ ядерного рецептора HNF4a на свойства клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека

ФГБУ «РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИМ. Н.Н. БЛОХИНА» РАМН

на правах рукописи

04201458735

ЧЕСНОКОВ МИХАИЛ СЕРГЕЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ИЗОФОРМ ЯДЕРНОГО РЕЦЕПТОРА НОТ4а НА СВОЙСТВА КЛЕТОК ПРОТОКОВОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

ЧЕЛОВЕКА

Специальность 14.01.12 - Онкология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: профессор,

доктор биологических наук Н.Л. Лазаревич

МОСКВА 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................................................................................................................6

1.1. Актуальность темы..........................................................................................................................................................................................................6

1.2. Цели и задачи исследования..........................................................................................................................................................................8

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы..............................................................................9

1.4. Основные положения, выносимые на защиту..............................................................................................................10

1.5. Апробация работы..............................................................................................................................................................................................................11

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................................................................................................................11

2.1. Канцерогенез и опухолевая прогрессия....................................................................................................................................11

2.1.1. Особенности опухолевой клетки................................................................................................................................................11

2.1.2. Эпителиально-мезенхимальный переход......................................................................................................................13

2.2. Поджелудочная железа.........................................................................................................15

2.2.1. Поджелудочная железа: строение и функции......................................................................................................15

2.2.2. Эмбриональное развитие поджелудочной железы......................................................................................18

2.2.3. Патологии поджелудочной железы........................................................................................................................................20

2.3. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (ПАКПЖ)..........................................22

2.3.1. Патогенез и этапы развития ПАКПЖ................................................................................................................................22

2.3.2. Биомаркеры ПАКПЖ......................................................................................................................................................................................24

2.4. Основные регуляторы дифференцировки клеток поджелудочной железы .... 26

2.4.1. РЭХ1............................................................................................................................................................................................................................................27

2.4.2. РТР 1а..........................................................................................................................................................................................................................................29

2.4.3. Гепатоцитарные ядерные факторы..........................................................................................................................................30

2.5. Транскрипционный фактор НОТ4а................................................................................................................................................37

2.5.1. Строение гена НЫР4А и его изоформы............................................................................................................................37

2.5.2. Транскрипционная активность ЬЮТ4а............................................................................................................................39

2.5.3. НЫР4а в развитии и функционировании эпителиальных органов и тканей .. 40

2.5.4. Другие представители семейства Н№4..........................................................................................................................43

2.5.5. Механизмы регуляции экспрессии Н№4а ..............................................................................................................44

2.6. Роль Н№4а в канцерогенезе........................................................................................................................................................................46

2.6.1. НЫР4а в развитии гепатоцеллюлярной карциномы..................................................................................46

2.6.2. НЫР4а в опухолях других органов..........................................................................................................................................48

2.7. Заключение обзора литературы..............................................................................................................................................................50

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................................................................................................................................................51

3.1. Растворы, среды и реактивы........................................................................................................................................................................51

3.2. Олигонуклеотидные праймеры................................................................................................................................................................53

3.3. Ферменты............................................................................................................................................................................................................................................55

3.4. Плазмидные векторы..................................................................................................................................................................................................55

3.5. Клеточные линии................................................................................................................................................................................................................56

3.6. Клинические образцы ткани..........................................................................................................................................................................56

3.7. Наращивание и выделение плазмид..............................................................................................................................................57

3.8. Лентивирусная инфекция клеток линий ПАКПЖ............................................................................................57

3.9. Выделение суммарной клеточной РНК....................................................................................................................................58

3.10. Обратная транскрипция....................................................................................................................................................................................59

3.11. Полимеразная цепная реакция..............................................................................................................................................................59

3.12. Количественная полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени............................................................................................................................................................................................................................................60

3.13. Белковый ДСН-электрофорез в ПААГ....................................................................................................................................61

3.14 Электроперенос белков из ПААГ на PVDF-мембрану................................................................................62

3.15. Иммуноблоттинг................................................................................................................................................................................................................62

3.16. Фиксация клеток..............................................................................................................................................................................................................63

3.17. Иммунофлюоресцентная окраска клеток на HNF4aTOT и Е-кадхерин................63

3.18. Определение интенсивности синтеза ДНК......................................................................................................................64

3.19. Клоногенный тест..........................................................................................................................................................................................................64

3.20. Измерение кинетики роста клеточных культур in vitro........................................................................65

3.21. Миграционный тест....................................................................................................................................................................................................65

3.22. Статистическая обработка данных..............................................................................................................................................66

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ......................................................................................................................................................................67

4.1. Выбор модельной системы для исследования роли изменения экспрессии HNF4a в клетках ПАКПЖ..............................................................................................................................................................................67

4.2. Выбор исследуемых тканеспецифических генов, связанных с уровнем дифференцировки и функциями поджелудочной железы................................................................70

4.3. Характеристика экспрессии генов в культурах клеток ПАКПЖ с различным уровнем дифференцировки..............................................................................................................................72

4.4. Исследование влияния экзогенной экспрессии HNF4a на злокачественный

потенциал культур низкодифференцированных клеток ПАКПЖ Panel и

MiaPaCa..............................................................................................................................................................................................................................................74

4.4.1. Получение клеточных культур Panel и MiaPaCa2, экзогенно экспрессирующих изоформы HNF4al и HNF4a7........................................... 74

4.4.2. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4a в клетках Рапс 1 -HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a...................................................... 74

4.4.3. Определение уровней синтеза белка HNF4a в клетках Pancl-HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a................................................................................................ 77

4.4.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в

клетках Рапс 1 -HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a...................................................... 78

4.4.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках

Pancl-HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a.................................................................... 83

4.4.6. Влияние экзогенной экспрессии HNF4a на биологические характеристики

клеток Panel и MiaPaCa2................................................................................... 86

4.4.6.1. Определение скорости роста клеточных культур Panel-HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a.................................................................................... 87

4.4.6.2. Исследование интенсивности синтеза ДНК в клетках Panel-HNF4a

и MiaPaCa2-HNF4a................................................................................. 89

4.4.6.3. Снижение колониеобразующей способности клеток Panel и MiaPaCa2 при экзогенной экспрессии HNF4a.................................... 91

4.4.6.4. Усиление способности клеток Pancl-HNF4a и MiaPaCa2-HNF4a к

направленной миграции......................................................................... 94

4.5. Исследование влияния подавления синтеза HNF4a на злокачественный потенциал культуры высокодифференцированных клеток ПАКПЖ СаРап2. 99

4.5.1. Получение клеточных культур СаРап2 с подавленным синтезом HNF4a..... 99

4.5.2. Определение уровней синтеза белка HNF4a в клетках CaPan2-shHNF4a...... 100

4.5.3. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4a в клетках CaPan2-shHNF4a.................................................................................. 101

4.5.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в

клетках CaPan2-shHNF4a.................................................................................. 102

4.5.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках

CaPan2-shHNF4a................................................................................................. 106

4.5.6. Влияние подавления синтеза HNF4a на биологические характеристики клеток CaPan2-shHNF4a.................................................................................... 108

4.5.6.1. Повышение скорости роста клеточных культур CaPan2-shHNF4a..... 109

4.5.6.2. Усиление интенсивности синтеза ДНК в клетках CaPan2-shHNF4a .. 110

4.5.6.3. Увеличение колониеобразующего потенциала клеток СаРап2 при подавлении синтеза HNF4a................................................................... Ill

4.5.6.4. Повышение способности клеток CaPan2-shHNF4a к направленной

миграции.................................................................................................. 112

4.6. Исследование влияния подавления синтеза HNF4a на злокачественнй потенциал культуры умереннодифференцированных клеток ПАКПЖ AsPCl........................................................................................................................... 116

4.6.1. Получение клеточных культур AsPCl с подавленным синтезом HNF4a...... 116

4.6.2. Определение уровней синтеза белка HNF4a в клетках AsPCl-shHNF4a....... 117

4.6.3. Определение уровней экспрессии изоформ и групп изоформ HNF4a в клетках AsPC 1 -shHNF4a.................................................................................... 118

4.6.4. Изменения экспрессии тканеспецифических транскрипционных факторов в

клетках AsPCl-shHNF4a.................................................................................... 120

4.6.5. Изменения экспрессии функциональных панкреатических генов в клетках

AsPC 1 -shHNF4a.................................................................................................. 123

4.6.6. Влияние подавления синтеза HNF4a на биологические характеристики клеток AsPCl...................................................................................................... 126

4.6.6.1. Замедление роста культур AsPCl-shHNF4a in vitro............................. 126

4.6.6.2. Ослабление ДНК-синтетической активности клеток AsPCl при подавлении синтеза HNF4a................................................................... 127

4.6.6.3. Снижение колониеобразующего потенциала клеток AsPCl-shHNF4a.................................................................................................. 128

4.6.6.4. Усиление способности клеток AsPCl к направленной миграции при

подавлении синтеза HNF4a................................................................... 129

4.7. Исследование уровней экспрессии HNF4a и других тканеспецифических генов в клинических образцах ткани ПАКПЖ человека................................................ 132

4.7.1. Анализ уровней экспрессии HNF4a и групп его изоформ в панели клинических образцов ПАКПЖ........................................................................ 132

4.7.2. Исследование корреляции между экспрессией изоформ HNF4a и панкреа-

специфических генов в клинических образцах ПАКПЖ............................... 136

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................................... 140

6. ВЫВОДЫ............................................................................................................................... 143

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................................ 144

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................. 147

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (ПАКПЖ) является наиболее распространенной формой опухолевых заболеваний поджелудочной железы (ПЖ). Она отличается чрезвычайно высокой агрессивностью, высокой скоростью прогрессии, бессимптомным течением ранних стадий заболевания. Из-за этих особенностей ПАКПЖ, как правило, диагностируется на поздних стадиях развития и плохо поддается лечению с использованием большинства современных терапевтических подходов. На сегодняшний день молекулярные механизмы развития этого типа опухолей остаются плохо исследованными, достаточно эффективных диагностических и предиктивных биомаркеров этого типа опухолей также не описано. Ввиду перечисленных фактов исследование механизмов возникновения и прогрессии ПАКПЖ является одной из наиболее актуальных проблем современной фундаментальной онкологии.

Закладка и формирование ПЖ в ходе эмбрионального развития регулируется сложным каскадом транскрипционных факторов, среди которых важную роль играет группа гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ). Эта группа включает 5 неродственных семейств транскрипционных факторов (Н№1, БОХА, НИР4, ОЫЕСиТ, С/ЕВР), экспрессирующихся в различных сочетаниях в клетках печени, ПЖ, кишечника, желудка, почки и ряда других эпителиальных органов. Факторы этих пяти семейств образуют в клетках комплексную регуляторную сеть, контролирующую различные этапы развития тканей и их функции. Ряд исследований показал, что в гепатоцитах центральную роль в регуляции этой сети играет фактор НЫР4а. Транскрипция гена НЫР4А происходит с двух альтернативных промоторов (Р1 и Р2), в результате чего образуется две группы изоформ, Н№4аР 1 и НЫР4аР2, отличающихся транс-активирующей способностью, что позволяет им регулировать различные наборы генов. Соотношение уровней экспрессии изоформ групп НЫР4аР1 и НИР4аР2 имеет определяющее значение для дифференцировки гепатоцитов и может влиять на дифференцировку других клеток; для разных органов характерны специфические спектры экспрессии изоформ НИР4а.

Нарушения экспрессии изоформ РЮТ4а тесно связаны с возникновением и прогрессией гепатоцеллюлярной карциномы — самой распространенной формы первичных опухолей печени. НЫР4а в гепатоцитах выполняет роль опухолевого супрессора, восстановление утраченной экспрессии Н№4аР1 в дедифференцированных клетках гепатоцеллюлярной карциномы приводит к частичной реверсии злокачественного фенотипа этих клеток. Противоопухолевая

функция НЫР4а описана также в клетках кишечного эпителия, почки, эмбриональной карциномы, инсулиномы. Роль Н№4а в возникновении и прогрессии ПАКПЖ на сегодняшний день остается практически не исследованной.

Данная работа посвящена исследованию возможного влияния изменений экспрессии изоформ НЫРЧа в ПАКПЖ на уровень дифференцировки и биологические свойства клеток, отвечающие за развитие их злокачественного фенотипа. В качестве модельной системы для исследования функций НЫР4а в клетках ПАКПЖ мы использовали панель из четырех клеточных линий ПАКПЖ человека, отличающихся друг от друга уровнями дифференцировки и спектрами экспрессии изоформ НЫР4а. В зависимости от исходных уровней экспрессии НЫР4а в исследуемых клеточных культурах, в них либо экзогенно экспрессировали изоформы НМР4а1 или НЫР4а7, либо подавляли эндогенную экспрессию ЬЮТ4а с помощью малых шпилечных РНК (мшРНК). Анализ изменений спектров экспрессии панкреа-специфических генов и биологических параметров клеток при изменениях в них уровней синтеза изоформ НМР4а позволил установить основные закономерности влияния НЫР4а на дифференцировочный статус и злокачественный потенциал клеток ПАКПЖ. Обнаруженные изменения активности тканеспецифических генов, вызванные изменениями экспрессии НЫР4а, были верифицированы на панели клинических образцов ткани ПАКПЖ, полученных при проведении гастропанкреатодуоденальных резекций в отделении опухолей печени и поджелудочной железы ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН.

1.2. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы является анализ роли изменений экспрессии изоформ фактора РПМР4а в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы и исследование влияния этого фактора на экспрессию генов и основные биологические характеристики опухолевых клеток, определяющие выраженност