Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Системная эндотоксинемия в физиологии и патологии человека

РГ6 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВ МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ

СИСТЕМНАЯ ЭНДОТОКСИНЕМИЯ В ФИЗИОЛОГИИ И ПАТОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

14.00.15 патологическая анатомия 14.00.16 патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук в виде научного доклада

Москва - 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте морфологии человека Российской Академии медицинских наук

Научные консультанты:

Лауреат государственной премии, заслуженный деятель науки Роса академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Н.К.Пермяков

Лауреат государственной премии, член-корреспондент РАМН, док' медицинских наук профессор А.А.Кубатиев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б.Б.Фукс

доктор медицинских наук, профессор Ю.Л.Перов

доктор медицинских наук, профессор Г.В.Порядин

Ведущее учреждение - НИИ хирургии им. А.В.Вишневского РАМН

Защита состоится 27 января 1994 г. в 14 часов на заседании специализированного совета Д 0010401

Автореферат разослан 27 декабря 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета к. м. н. И. Н. Емельяненко

4/4

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ АБРИВИАТУРЫ:

AM - альвеолярные макрофаги

БАЛ - бронхоальвеолярное ложе

БОС - бронхообструктивный синдром

БТ - бактериальное тело

ВЗГ - воспалительное заболевание гинеталий

ГФШ - генерализованный феномен Шварцмана

ЛВС - диссеминированное внутрисосудисстое свертывание

КС - коронарный спазм

ЛВП - липопротеины высокой плотности

ЛПС - липополисахариды

ОПН - острая почечная недостаточность

ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

ОРДС - острый респираторный дистресс-синдром

ОРЗ - острое респираторное заболевание

ОТ - остаточные тельца

ПТБ - поздний токсикоз беременности

ПЯЛ - полиморфноядерный лейкоцит

СМЛ - системный маргинальный лейкостаз

СИН - супрессоры индексации нагрузки

СЭЕ - системная эндотоксинемия

ТИА - тонкослойный иммунный анализ

ТКС - транзиторный коронароспазм

ЭКГ - электрокардиограмма

ЭСА - эндотоксинсвязывающая активность

ЭФ - эозинофилы

ЭШ - эндотоксиновый шок

TNF - туморнекротизирующий фактор

[ ] - Порядковый номер статьи списка печатных работ по теме диссертации

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.Актуальность проблемы.

Вторая половина XX столетия ознаменовалась не только бурным f витием науки и техники, но и постоянно нарастающим ухудшением услс обитания человека на Земле. Неблагоприятная экологическая cuTyat. обусловленная в значительной мере техногенными и социальными факте ми, в принципе, не может не сказываться отрицательно на состоянии ; ровья населения. С большой долей вероятности можно допустить, hi основе нарастания частоты ряда хронических заболеваний, таких как е росклероз, аутоиммунные, аллергические и онкологические заболевай лежат не только чисто геронтологические причины, но и постепенно у> шающиеся экологические факторы. В этом плане привлекает интерес называемая нормальная микрофлора кишечника, особенно грамотрицатель бактерии и их эндотоксин - липополисахарид (ЛПС) внешней мембраны к точной стенки этих бактерий. ЛПС посвящено поистине огромное количе во публикаций, обобщенных в недавно изданном четырехтомном руководс (Handbook of Endotoxin, Series Editor R.A.Proctor, Elsevier, Amster - New-York - Oxford). Эндотоксин может взаимодействовать с различь клетками макроорганизма, в зависимости от дозы, вызывать их поврея ния или стимулировать синтез ряда физиологически активных медиатор таких как туморнекротизирующий фактор альфа (TNF), интерлейкин-1 и Грозными последствиями действия ЛПС являются диссеминированное внут сосудистое свертывание (ЛВС) и эндотоксиновый шок (ЭШ), весьма чг заканчивающийся летальным исходом. Такие события, как правило, мс иметь место при так называемом грамотрицательном сепсисе, коте всегда сопровождается интенсивной системной эндотоксинемией (СЭЕ). нако, человек и в физиологических условиях постоянно контактирует грамотрицательными бактериями и их эндотоксином. Огромным резервуг этих бактерий и эндотоксина являются, в частности, дистальные otz кишечника. Как принято считать, в норме в кровоток из кишечника прс кает относительно небольшое количество ЛПС, который может связыват клетками Купфера, макрофагами, гранулоцитами, тромбоцитами, эритроцк ми. антителами, липопротеинами высокой удельной плотности(ЛВП) и не торыми другими белками плазмы крови. Связывая эндотоксин, эти факт предупреждают возможность его токсического действия. Можно предпе жить, что при различных стрессовых ситуациях, а также при дейст различных физических и химических факторов не только увеличивае проницаемость кишечной стенки, но и подавляются функции эндотоксине зывающих систем. В подобных ситуациях избыточный выход ЛПС в систем кровоток способен, по-видимому, вызывать серьезные повреждения раз/ ных клеток и тканей. Несмотря на очевидную значимость этого механик до последнего времени истинная роль ЛПС, как и связывающих ее сис физиологии и патологии человека, оставалась не ясной.Существен сдвиг в понимании фундаментальной природы участие ЛПС в жизнедеяте ности организма наметился в середине 80-ых годов, когда была сформ^ рована принципиально новая концепция о регуляторной роли ЛПС не тол в патологических, но и в защитно-приспособительных реакциях. Указан

цепция опиралась на данные о присутствии ЛПС в портальном кровотоке 90% практически здоровых людей (A.Jacob et.al.,1977), способности ¡ток Купфера элиминировать эндотоксин из портального кровото-D.Knook et.al,1981) и данных о той, что в норме до 6% портальной iBii сбрасывается минуя печень через портокавальные и печеночные шун-в системный кровоток(J.Wolter et.al..1978). Следовательно было >лне логично предположить, что часть ЛПС может проникать в системный iBOTOK и участвовать в физиологических процессах, а при массивных ¡туплениях выступать как общепатологический фактор, индуцирующий ¡витие самых разнообразных синдромов.

Необходимо при этом подчеркнуть, что изучение роли ЛПС и антиэн-^оксиновых факторов тормозилось в значительной мере в связи с от-'ствием общедоступных методов их обнаружения и оценки активности.

1.2. Цель и задачи работы.

Целью работы явилось изучение роли эндотоксина в физиологии патологии человека.

Для достижения указанной цели необходимо было решить нижеследую; задачи:

1. Разработать общедоступные методы выявления эндотоксина в жид-< средах и диагностики системной эндотоксинемии.

2. Разработать методы оценки эндотоксин-связывающих систем.

3. Показать реальную клинико-диагностическую значимость количест-шой оценки содержания эндотоксина и уровня антиэндотоксиновой защи-в системном кровотоке и секционном материале.

4. Осуществить поиск новых химических соединений модулирующих ан-зндотоксиновую активность.

1.3. Научная новизна результатов.

Установлено, что при помощи иммуноэнзимной реакции с антителами к 1колипиду Re-хемотипа в мазках крови можно выявлять лейкоциты, свя-зшие эндотоксин в организме обследуемого посредством- Fc-зависимого (анизма. Некоторые гранулоциты сохраняют способность связывать эндо-íchh in vitro при обработке мазков препаратами ЛПС. Содержание лей-дотов, способных связывать ЛПС in vivo и in vitro, зависит от нали-1 на лейкоцитах Fc-рецепторов, антиэндотоксиновых IgG антител, свя--тых с Fc-рецептором, и от уровня эндотоксинемии.

Основная масса клеток крови, связывающих эндотоксин, представлена пиморфноядерными лейкоцитами (ПЯЛ). Супераффинной к эндотоксину эткой крови является эозинофил.

При помощи иммуноэнзимной реакции с ПЯЛ и разработанной микромо-£икации ЛАЛ-теста установлено, что эндотоксины в низких концентраци-обнаруживаются в крови всех практически здоровых людей, начиная с гского возраста, т.е. выявлена так называемая физиологическая сис->шая эндотоксинемия.

Показано, что состояние клеточного и гуморального иммунитета к эн-гоксину четко отражает общее состояние резистентности макроорганиз-

ма,наличие различных патологических процессов.Низкие показатели an эндотоксинового иммунитета и повышенного содержания эндотоксина в и ви и тканях наблюдаются при гестозах.при патологии верхних дыхатель путей и легких,при некоторых видах сердечно-сосудистой патологии, заболеваниях мочевыводящих путей (мочекаменной болезни,аденомы прос ты, раке мочевого пузыря), при аппендиците и разлитом перитоните, основании этих материалов сделано заключение о том.что эндотоксин ляется общепатологическим фактором, индуцирующим развитие целого р патологических процессов в различных органах и тканях.Важную ро/ развитие органопатологии играют лейкоциты, гиперактивированные и регруженные ЛПС.

Выявлено наличие антиэндотоксин-шоковой активности у некотс производных альфа-имидазолилалкилсульфоновой кислоты, которая комбу руется с антикоагулянтной активностью.

1.4. Практическая ценность полученных результатов.

Разработаны новые методы диагностики эндотоксинемии и оценки тиэндотоксинового иммунитета:

а) микромодификация ЛАЛ-теста для определения эндотоксина в ¡t ких средах (микро-ЛАЛ-тест);

б) способ обнаружения эндотоксина грамотрицательных бактерии их взаимодействию с лейкоцитами и выявлению ЛПС-позитивных лейковд при помощи флюоресцирующих антител (ЛПС-тест) - авторское свидетель BO N 1749758 (1992 г.);

в) способ выявления антиэндотоксиновых антител при помощи тот лойного иммунного анализа (ТИА-антиэндотокс);

г) способ оценки иммунитета к эндотоксинам грамотрицательных С терий по содержанию ЛПС-позитивных лейкоцитов, связавших эндотокси! vivo и in vitro и выявляемых при помощи иммуноферментной реа> (ЛПС-тест-ИФА)-заявка на получение патента с приоритетом от 13 фев£ 1993 г;

д) способ оценки резистентности организма по показателям тш антител к гликолипиду хемотипа Re и антител к ЛПС с общим антигс энтеробактерий (иммуноферментая диагностическая тест-система СОИС-1

Все эти методы нашли применение в научно-исследовательской ра( и диагностической практике.

ЛПС-тест-ИФА дает возможность оценить состояние иммунитета и с тояние здоровья у человека и животных, перенесших проникающую радиа! Иммуноферментная тест-система СОИС-ИФА дает возможность ocyuiecTBJ раннюю диагностику бессимптомно протекающих заболеваний, в том 41 определять группы риска по онкологическим заболеваниям. На ее oci создана технология интенсивного диспансерного наблюдения, которая г воляет оценивать общее состояние и стоимость страхового полиса. пл< ровать целенаправленные профилактические мероприятия и ocyuiecTBJ своевременное лечение. Использование системы СОИС-ИФА на Шевченков( заводе пластмасс в 1991 году позволило на 15-20% уменьшить време}

нетрудоспособность работников и дало экономический эффект в несколько миллионов рублей. Кроме того, система СОИС-ИФА используется для оценки эффективности лечения и отбора плазмы крови доноров с повышенным содержанием антиэндотоксиновых антител, применение которой в клинике неотложной хирургии значительно снижает частоту осложнений и леталь-

гюсть.

Разработаны, по сути дела основы секционной диагностики системной эндотоксинемии и эндотоксинового шока, которая включают данные анамнеза. клиники и лабораторных исследований, в том числе данные тестов С0-■1С-ИФА, ЛПС-тест-ИФА. микро-ЛАЛ-тест(в том числе трупной крови), идентификацию ЛПС-позитивных структур в срезах и отпечатках органов при томощи ЛПС-тест-ИФА.выявление маргинального лейкостаза в микрососудах.

Отобраны также вновь синтезированные химические соединения, облагающие комплексом биологических активностей, в том числе противошоко-зой, а также анти- и дезагрегационной активностями, что открывает 1ерспективу их применения для снижения токсического действия бактери-шьных ЛПС (авторские свидетельства N 1644475 от 22 декабря 1990 года i N 1665676 от 22 марта 1991 года).

Результаты исследований используются в лекционных курсах, диагностической и лекционной практике кафедры патологической анатомии ФУВ псковской Медицинской академии, кафедр патологической физиологии Российской медицинской академии последипломного образования и здорового образа жизни, кафедр патологической анатомии, акушерств и гинекологии, татофизиологии, инфекционных Полезней и детских инфекций Казанского едицинского института.

1.5. Основные положения, вынесенные на защггу.

1) Эндотоксин нормальной микрофлоры кишечника, проникающий в ¡истемный кровоток в низких концентрациях, обеспечивают состояние филологической системной эндотоксинемии и принимают участие в осущест-шении адаптивных реакций, в том числе в формировании пула "активиро-¡анных" гранулоцитов.

2) Эндтоксин грамотрицательных бактерий является общепатологи-[еским фактором,вызывающим и/или участвующим в развитии различных па-'ологических процессов и заболеваний инфекционного и неинфекционного ■енеза.

3) Одним из механизмов развития индуцированной эндотоксином ор-•анопатологии является повреждающее действие гиперактивированных, перегруженных эндотоксином гранулоцитов.

4) Функциональное состояние клеточного и гуморального антиэндо-■оксинового иммунитета является интегральным показателем общего состояния здоровья человека.

1.6. Апробация работы.

Основные положения работы были доложены и обсуждены на VII Плену-;е Правления Всесоюзного Общества патологоанатомов (Казань. 1987), На-чно-практической конференции Отдела патанатомии НИИ скорой помощи м.Н. В.Склифасовского (Москва, 1988). VIII Всесоюзном съезде патолого-

анатомов (Тбилисси, 1989), II Всесоюзной конференции "Бактериал1 токсины" (Латвия, Юрмала, 1989), I Всесоюзной конференции "Патанатс экстремальных состояний" (Москва. 1991), I Международном Симпо; ме-семинаре "Фундаментальные науки и биотехнология - страховой мед1 не" (Крым, Меллас, 1992), Международном семинаре "Фирма MSD и СК Ш - страховой медицине Татарстана" (Казань, 1993). II Международном с позиуме-семинаре "Фундаментальная наука и биотехнология - страхс медицине" (Москва-Рязань, 1993) и Ученом Совете Института морфолс РАМН.

По теме диссертации выполнено 39 печатных научных работ, полу1 3 авторских свидетельства на изобретения, 1 решение о выдаче патент 1 заявка на выдачу патента принята к рассмотрению.

1.7. Благодарности.

Многие результаты, обобщенные в данном докладе, получены в с местных исследованиях с рядом сотрудников НИИ морфологии челоЕ РАМН. НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Гамалеи РАМН. Казанск медицинского института. Казанского ГВДУВа. Хабаровского медицине» института. ИОФХ Казанского филиала РАН, Республиканского центра э тренной медицинской помощи Минздрава Татарстана, Научно-производстЕ ного центра "Гидробиос" Минздрава РФ, медицинского стоматологическ института им.Семашко, Центральной республиканской клинической боль цы Минздрава РФ, Международного медицинского консорциума "Мечнико Перечень соавторов, участвовавших в проведении отдельных разделов боты, приведен ■ в списке публикаций. Всем им автор выражает глубо благодарность.

Особую благодарность автор выражает научным консультантам ака мику РАМН профессору Н.К.Пермякову и члену-корреспонденту РАМН проф сору А.А.Кубатиеву, а также профессору В.Н.Таланкину, профессору В Бондаренко и профессору В.Г.Лиходеду за радость совместной работы творческого обсуждения результатов. Автор также искренне благода своих коллег и помощников А.Н.Крупника. Р.А.Уразаева, В.А.Анохи Н.О.Крюкова и других сотрудников, соискателей и докторантов лабора рии патанатомии экстремальных состояний НИИ морфологии человека РАМ Международного медицинского консорциума "Мечников".

Автор планировал этапы проведения исследований, руководил в работой, принимал непосредственное участие в проведении и оценке зультатов исследований.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы традиционные клинические, клинико-бораторные, морфологические (в том числе секционные), биохимическ иммунохимические, иммуноферментные, микробиологические и статистич кие методы исследований; а также различные методы работы с эксперим тальными животными.

В различных иммунологических исследованиях были использованы п параты гликолипида Re-хемотипа. полученные из бактерий штамма Sal

lella minnesota Re-595 путем экстракции смесью хлороформа с метанолом ¡ конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином, препараты ЛПС 014 ; общим антиг ном энтеробактерий, полученные из бактерий Escherichia olí 014, кинъюгаты антител к гликолипиду Re-хемотипа с флюоресцеином ли пероксидазой хрена, а также коммерческие препараты протеина А и ыворотки против иммуноглобулинов IgG, IgM и Гав-фрагментов иммуногло-улинов человека. В ряде исследований для выявления антител к Re-гли-олипиду были использованы эритроциты, сенсибилизированные Re-гликоли-идам (получены от A.B. Аполлонина). Использованы также электрофорети-еский анализ различных препаратов ЛПС no Laemmly (1970) и иммунобло-инг по Нго и Ленхофф (1988). Эндотоксинсвязывающую активность липоп-отеинов высокой удельной плотности определяли по способу, описанному .Г.Лиходедом и соавторами (1990). Содержание туморнекротизирующего актора THF оценивали по методу Deist и соавторов (1988).

Некоторые другие методы исследований приведены в следующих разде-

ах.

Краткая характеристика материалов и методов исследования представ-ена в таблице 1.

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МАТЕРИАЛА И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Таблица 1

NN аздела 1 Вид млекопитающего, нозология. 1 объект исслед. .кол-во(п), (п] @ Методики

1 1 2 1 3

. 1 1. 1 человек, практически здоровый, 1 плазма крови, (п >200). [32] микро-ЛАЛ-тест

1 2. 1 человек,пр.здор.. кролик интакт. 1мазки крови(ПЯЛ).(п >200), [3,8, 16, 10. И, 13.14. 15] светооптич. иммуноморфология (флюоресцентная), ЛПС-тест с верификаций азур-эозином

1 3. 1 человек,пр.здор.(100), больные ¡менингитом [32]. мазки крови. 1(П >300), [36] светооптич. иммуноморфология (ферментная), ЛПС-тест-МФА

1 .4. 1человек.пр.здор.(21), ребенок 1б-ной ОРВИ (7),новорожденный(13) 1 плазма крови, (п >500) [32] тонкосд.иммуноанализ:ТИА-ан-гиэндотокс: РПГА: Антиэндо-токс-1; дот-блот;иммуноблот.

1 5. (человек,пр. здор.(>1000),плазма 1 крови (п > 1000) [39] 1 иммуноферментный анализ: Ан-тиэндот'ч^-ИФА. Клин.методы определен.иммунного статуса

человек,пр.здор. ( 5000), больные разд.хрон.заб-ниями(293), плазма крови, (п >5000) [34]

иммуноферментный анализ: СОИС-ИФА. Проф.осмотр, спе: диагностические мет.исслед

человек,беремен, пр.здор.(12), с гестозом(59),новорож. (51). родиль -ца(40).плазма кр.(п =103),[6} мазки крови(ПЯЛ) (п >118) [32]

ЛПС-тест СОИС-ИФА

ТИА-антиэндотокс

человек,б-ной прост.аппедицитом (7), деструкт.аппен. с перитони-том(2б), разлит.перит.(21),плазма крови (п=141).[22] мазки крови (Г!ЯЛ) (п=78) [25] отпеч. аппендикса (п >100) [20,37,38]

ЛПС-тест Антиэндотокс-1 Антиэндотокс-ИФА ЛПС-тест-ИФА Т№-тест(по Deist)

человек.дети пр.здор. (20). дета б-ные ОРВИ с глад.теч.,осложнен. БОС или пневмонией(319),плазма крови (п>1ООО),[24] мазки крови (ПЯЛ)(п>1000)[35]сек.набл.(3)[31

ЛПС-тест Антиэндотокс-ИФА ЛПС-тест-ИФА микро-ЛАЛ-тест

человек,больные мочекаменной 6-ю (8), хр. пиелонефр. (8), онкол. моч. пузыря(9),ОПН при перитоните(5), мазки крови(п>100), [10]гист.пре-пар.почки(п=60)[17]секц.набл. (7)

ЛПС-тест ЛПС-тест-ИФА рут.гистология

человек.пр.здоровый.больные раз. заб.. мазки крови (п>2000), [7] ПЯЛ секц.наблюд.(7); [11]

кролик(п>150)при ГФШ и ЭШ:легкие ПЯЛ. AM [12-16,18,23.24,27.31]

ЛПС-тест, ЛПС-тест-ИФА. фагоцитарные тесты, электронная микроскопия, рутинь гистология

кролик, интакт., при ГФШ и ТКС (п>200),внутренние органы, миокард; гист. срезы (П>10000).[1] моделир. ТКС и ИМ(п=57) [3.19,26]

рутинная гистология и гист химия, гистоэнзимология, г ляризационная:

электрокардиография

мыши(п>2000) при ЭШ,срезы внутренних органов: (п>5000) [5,21, 28.29, 30]

рутинная гистология, специальные метод, иссм

- и -

3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Разработка новых способов диагностики эндотоксинемии и оценки активности антиэндотоксинового иммунитета.

Изучение возможной роли эндотоксина грамотрицательных бактерий в физиологии и патологии человека невозможно без разработки новых общедоступных методов выявления ЛПС в организме здоровых и больных людей, \ также экспериментальных животных. Необходима разработка удобных методов оценки активности антиэндотоксиновых систем. Решению этих задач тосвящена первая часть экспериментальных и клинических исследований.

3.1.1. Выявление эндотоксина при помощи микромодификации теста с лизатом амебоцитов краба рода Ити1из (микро-ЛАЛ-тест).

Наиболее распространенным способом определения ЛПС в жидких срезах, в т.ч. в циркулирующей крови, в настоящее время является лиму-пюс-тест (ЛАЛ -тест), основанный на способности ЛПС вызывать коагуляю-дию белковых фракций лизата амебоцитов краба ЫшиШв ро1ур1тепи5. Этот гест характеризуется высокой чувствительностью (выявляет до 0.1 пг ЛПС з 1 мл). К недостаткам метода относятся отсутствие строгой специфич-юсти. необходимость применять строго апирогенные растворы и высокая стоимость (10-15 $ в среднем на один анализ). Последнее обстоятельство добудило нас разработать менее дорогую и не менее чувствительную мик-зомодиФикацию этого теста.

Исходным моментом в этой разработке послужило предположение, что три помощи светового микроскопа можно оценить степень кристаллизации Эелков лизата амебоцитов, которая зависит от концентрации эндотоксина. Это предположение подтвердилось при изучении взаимодействия лизата шебоцитов с растворами, содержащими различные концентрации ЛПС.

Как видно на рис.1, дисперсность кристаллической сетки зависит от шнцентращш ЛПС. При этом степень кристаллизации можно оценить в срестах (от ± при 2,5 пг/мл эндотоксина до ++++ при концентрации 20.0 дг/мл эндотоксина).

Процедура постановки теста заключается в следующем: кровь забирает в лабораторную посуду, прогретую 3 часа при 300°С в алюминиевой фольге. Кожу перед взятием крови обрабатывают спиртом и апирогенной зодой. В кровь добавляют гепарин (10-15 ед/мл), охлаждают до 4°С и {ентрифугируют 10 мин. при 1000 х g. Перед постановкой теста плазму срови разводят апирогенной водой, прогревают 10 мин при 80°С, охлажда-)т, добавляют равный объем разведенного апирогенной водой лизата амебоцитов и полученную смесь инкубируют 45 мин при 37°С. Степень кристаллизации затем оценивают в мазках под микроскопом и концентрацию ЛПС шределяют путем сравнения со стандартными образцами, микрофото кото-)ых приведено на рис.1.

Микро-ЛАЛ-тест является полуколичественным и более экономичным, дам обычный ЛАЛ-тест, так как при его постановке на 1 анализ расходуется в 10 раз меньше реактивов. Чувствительность теста - 2,5 пг/ЛПС в

1 мл сыворотки, разведенной 1:10.

Рис.1. МИКРОЛ-ЛАЛ-ТЕСТ. Дисперсность кристаллической сетки в за висимости от концентрации ЛПС в среде: А - 0 пг/мл; Б - 2.5 пг/мл; В 5.0 пг/мл; Г - 10,0 пг/мл; Д - 15.0 пг/мл; Е - 20.0 пг/мл. На участ Е - аморфная масса геля в виде темных пятен; в правом нижнем углу деструкция сетки и свободные от белка зоны.

3.1.2. Обнаружение эндотоксинов при взаимодействии ЛПС с гранул цитами крови (ЛПС-тест).

В основу этого метода положена известная способность ЛПС взаим действовать и связываться с ПЯЛ. Мы полагали(и это нашло подтвержден в экспериментах), что при смешивании пробы, содержащей эндотокси ПЯЛ, связавшие ЛПС, могут быть выявлены в тонких мазках крови при о работке мазков флюоресцирующими антителами к Ие-гликолипиду, котор способны распознавать ЛПС различных грамотрицательных бактерий.

Тест осуществляют следующим образом. Пробу, содержащую эндото син. смешивают с кровью, выдерживают 30 мин при 37°С, готовят тонк мазок, фиксируют метанолом или этанолом, отмывают солевым растворо наносят на мазок неконъюгированную сыворотку или плазму крови неимм

низированного животного для подавления неспецифического связывания флюоресцирующих антител), отмывают, наносят флюоресцирующую сыворотку, содержащую антитела Ие-к гликолипиду, выдерживают 30 мин. отмывают и микроскопируют в микроскопе Люмам И1 при увеличении х 350 с иммерсией. При наличии в исследуемой пробе эндотоксина на мазке видны ярко светящиеся участки, в которых расположены лейкоциты (рис.2). Интенсивность люминесценции условно может быть выражена в крестах.

Рис.2. Ярко светящаяся клетка слева и верификация in situ супераффинных к ЛПС (ЛПС-ТЕСТ) клеток периферической крови с помощью азур-эозина. Интенсивность люминесценции ++++. х 1200.

Если мазок предварительно обработать неконъюгированными антителами к Re-гликплипиду. а затем Флюоресцирующими антителами к гликолипиду. то светящиеся участки отсутствуют, что указывает на специфичность реакции флюоресцирующих анти- Re антител. Чувствительность метода -около 1 пг ЛПС в 1 мл исследуемой пробы. К недостаткам метода следует отнести необходимость работа с УФ микроскопом и микроскопирование мазка сразу после обработки флюоресцирующими антителами, так как интенсивность свечения со временем заметно снижается.

3.1.3. Способ оценки эндотоксинемии и антиэндотоксинового иммунитета по эндотоксиносвязывающей активности лейкоцитов крови

Недостатки ЛПС-тест с флюоресцирующими антителами побудили нас видоизменить тест, использовать вместо флюоресцирующих антител антитела к Re-гликолипиду. конъюгированные с пероксидазой хрена. Так была разработана иммуноферментная модификация теста - ЛПС-тест-ИФА.

В первых же экспериментах по отработке этого теста была выявлена очень интересная закономерность - в мазках крови здоровых животных и людей без смешивания их крови с пробой, содержащей эндотоксин, обнаруживались ПЯЛ. несущие на своей поверхности ЛПС. который выявляется при помощи конъюгированных с ферментом антител к Re-гликолипиду. Поэтому в дальнейшем мы использовали этот метод для выявления эндотоксина в крови обследуемых.

Кроме того, было установлено, что, если перед обработкой конъюги-рованными антителами на мазки нанести раствор ЛПС, а уж затем конъюги-рованные антитела, то количество клеток, несущих ЛПС, увеличивается.В

такой модификации метод позволяет определить содержание клеток, cbs завших эндотоксин in vivo, в организме обследуемого, и содержание кл( ток. способных дополнительно связывать ЛПС in vitro при обработ> мазка раствором ЛПС. Иными словами, метод позволяет оценивать так нг зываемые резервы связывания эндотоксина.

В кратком изложении способ осуществляют следующим образом. У oót ледуемого берут кровь, готовят два тонких мазка, подсушивают и фика руют метанолом или этанолом. Для инактивации эндогенной пероксидазы i мазки наносят смесь этанола с 3% перекиси водорода. После отмываж для выявления клеток, способных связывать эндотоксин in vitro, на од: из мазков наносят на 30 мин. 1 мл раствора Re-гликолипида в концентр; ции 40 мкг/мл. Вслед за отмыванием оба мазка в течение 30 мин. обраб; тывают конъюгатом антител к Re-гликолипиду с пероксидазой, отмывают на 30 мин.. наносят субстрат фермента с красителем, затем снова otmi вают и для выявления ядер клеток мазок окрашивают толуидиновым chhi или другим красителем, можно, например, азур-эозином, для верификац: клеток, связавших эндотоксин. При микроскопировании в мазках xopoi видны клетки, несущие на своей поверхности эндотоксин и связави« конъюгат антител с пероксидазой (рис.3).

Рис.3. ЛПС-позитивный гранулоцит с дискретно расположенной на поверхности ферментной меткой(справа). Лейкоцит без ферментной метки(слева). ЛПС-ТЕСТ-ИФА. X 2000

Эти клетки окрашены в желтоватый цвет. В клетках видны также я, ра, окрашенные в синий цвет. При этом в мазке N 1 определяются толь ПЯЛ, связавшие эндотоксин in vivo, а в мазке N 2, кроме них еще мог быть выявлены ГШЛ, связавшие эндотоксин in vitro при обработке маз раствором Re-гликолипида.

Для определения показателей нормы обследовали 35 здоровых лиц возрасте 25-50 лет. В среднем было обнаружено 3.510,4% лейкоцито связавших эндотоксин in vivo, и 8,4+0,6% лейкоцитов, несущих ЛПС пос обработки мазков эндотоксином in vitro. При этом предварительная оор ботка мазков антителами к Re-гликолипиду. не конъюгированными с фе ментом, снижала количество ЛПС-позитивных ПЯЛ, выявленных при помо способа ЛПС-тест-ИФА. После сорбции антител к Re-гликолипиду из коныогированной сыворотки она утрачивала способность снижать количес во ЛПС-позитивных лейкоцитов, следовательно. ЛПС-тест-ИФА специфичес выявляет лейкоциты, несущие эндотоксин.

Таким образом, было установлено, что здоровые люди характеризую ся наличием умеренной, по-видимому, физиологической СЭЕ(3,5±0, ЛЛСпозитивных ПЯЛ). Кроме. того. 4.9% (8.4-3,5%) лейкоцитов способ связывать ЛПС дополнительно т.е. при обработке мазков in vitro.

Мы полагали,что значительно большее количество ЛПС-позитивных П

можно выявить при инфекционных заболеваниях, вызванных грамотрицатель-ными бактериями, например,у больных бактериальными менингитами в начале заболевания,когда в циркулирующей крови при помощи ЛАЛ-теста всегда обнаруживается эндотоксин.К нашему удивлению при изучении 45 больных менингитом были получены противоположные результаты: при поступлении в клинику содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов, связавших эндотоксин in vivo и in vitro было крайне низким(0,1+0,03% и 0.1±0, 04% соответственно). При выписке содержание таких лейкоцитов увеличивалось до 6,8+0,9% и 8,1+0,5% соответственно.Эти данные позволили предположить,что содержание ЛПС-позитивных гранулоцитов может отражать не только наличие эндотоксинемии, но и состояние антиэндотоксинового иммунитета.

Приведенные материалы обусловили необходимость изучения механизмов связывания эндотоксина in vivo и in vitro. В связи с этим мазки от здоровых людей обрабатывали сначала сыворотками против Ig G, IgM и Fab Фрагментов иммуноглобулинов человека, а затем по способу ЛПС-тест-ИФА. Все эти сыворотки предварительно сорбировали, чтобы удалить антитела к Re-гликолипиду. Полученные результаты показали, что сыворотки против IgM не влияли на количество ЛПС-позитивных ПЯЛ, связывающих эндотоксин и in vivo и in vitro, в то же время сыворотки против IgG и особенно сыворотки против Fab фрагментов иммуноглобулинов значимо снижали количество гранулоцитов, связавших ЛПС in vivo и количество лейкоцитов, связывающих эндотоксин in vitro. Установлено также, что сыворотка к Re-гликолипиду, не конъюгированная с ферментом, резко снижала количество ПЯЛ, связавших ЛПС in vivo, однако, если такой мазок перед добавлением анти-Ие-конъюгата обрабатывалась Re-гликолипидом, то количество ЛПС-позитивных лейкоцитов восстанавливалось до нормы.

Эти данные показали,что лейкоциты in vivo и in vitro связыва'ют эндотоксин при помощи Fc-опосредованного механизма,за счет антител класса IgG, фиксированных на поверхностных Fc-рецепторах лейкоцитов. В связи с этим можно полагать,что содержание лейкоцитов,связавших ЛПС in vivo, и и лейкоцитов,способных связать эндотоксин in vitro, зависит от степени эндотоксинемии, от наличия на лейкоцитах Fc-рецепторов и связанных с ними антизндотоксиновнх антител класса IgG, т.е. от степени армированности лейкоцитов IgG-антителами. Все это позволяет сделать заключение о защитном характере Fc-завиеимого связывания эндотоксина лейкоцитами.

Для удобства описания состояний, выявляемых при помощи ЛПС-тес-та-ИФА, мы применяли следующие условные обозначения:

-+- нормальное содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов в циркулирующем кровотоке;

4 повышенное содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов в организме обследуемого;

i сниженное содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов в организме обследуемого;

+ наличие лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин при нагрузке гликолипидом in vitro;

- отсутствие лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин при нагрузке гликолипидом in vitro.

Обследование больших групп экспериментальных животных и людей г казало, что по состоянию антизндотоксинового иммунитета, оцениваемс при помощи способа ЛПС-тест-ИФА, они могут быть разделены на 6 групп

Группа I (-м-) - характеризуется нормальным содержанием ЛЕ позитивных лейкоцитов In vivo и наличием лейкоцитов, способных свяг вать эндотоксин in vitro;

Группа II (4+)- повышенное содержание ЛПС-позитивных лейкоцит in vivo и наличие лейкоцитов, способных связывать эндотоксин in vit (группа характеризуется активацией антизндотоксинового иммунитета фоне компенсированной эндотоксинемии);

Группа III (t-) - повышенное содержание ЛПС-позитивных лейкоцит in vivo и отсутствие клеток, способных связывать эндотоксин in vit (активация антизндотоксинового иммунитета на фоне декомпенсировань эндотоксинемии; вследствие того, что антиэндотоксиновый иммунитет не состоянии полностью компенсировать эндотоксинемию, начинается истой ние антиэндотоксинового иммунитета);

Группа IV (-»--) - содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов in vi находится в пределах нормы, однако резервы дополнительного связываь эндотоксина истощены, т.е. имеет место выраженное истощение антиэщ токсинового иммунитета;

Группа V ({•-) - низкое содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов vivo и отсутствие резервов для дополнительного связывания эндоток«' in vitro (резкое угнетение антиэндотоксинового иммунитета);

Группа VI (++) - сниженное содержание ЛПС-позитивных лейкоцит in vivo, однако имеются лейкоциты, способные связывать эндотоксин vitro(восстановление угнетенного ранее антиэндотоксинового иммунитет

Схематически эти состояния можно представить следующим образом: активация илшунитета активация иммунитета на фоне компенсир.СЭЕ на фоне деко/тенсир. СЭЕ

норма I ■*-+ i_

+ - I—i

H-14

I истощение

J

1 f + i-1 +

восстановление глубокое угнетение иммунитет иммунитета

Рис.4. Динамика изменения показателей СЭЕ и антиэндотоксинового иммунитета по результатам ЛПС-ТЕСТ-ИФА.

Метод ЛПС-тест-ИФА был использован нами в предварительных иса дованиях для оценки состояния антиэндотоксинового иммунитета у Л1 проживающих в районах с повышенным загрязнением радионуклидами. 0( ледовано 100 таких лиц, а также 100 лиц, проживающих в г.Москве, каждую группу были включены лица обоих полов в возрасте 18-45 лет. содержанию ЛПС-позитивных лейкоцитов они были разделены на 6 описан!

+

шее групп (табл.2).

Таблица 2.

СОСТОЯНИЕ АНТИЭНДОТОКСИНОВОГО ИММУНИТЕТА У ЛИЦ В ЗАГРЯЗНЕННЫХ РАДИОНУКЛИДАМИ РАЙОНАХ И В Г.МОСКВЕ

1 1 Группы I ■ г (Состояние 1 Количество 1 лиц 1

I иммуните 1— 1

1 га |В 1 1 загрязненных 1 1 В Москве |

1 1 1 1 | | 1 9 I 66 |

1 2 1 ++ 1 18 I 12 |

1 з 14- 1 37 | 10 I

1 4 J - | 8 1 9 I

1 5 1 » - 1 16 I 2 1

1 6 1 ♦ + 1 ■ | 12 | 1 1 I

¡Общее кол-во лиц| 1 1

|в группах 3.4.5 | 1 | 61 1 1 21 I

1 1 1 Общее кол-во лиц| 1 1

|в группах 1.2.6 | 1 1 39 | 1 79 I 1

Как видно из табл.2. в зоне с повышенным содержанием радионукли-)в большинство обследованных (61%) относится к группам 3.4.5, которые фактеризуются наличием декомпенсированной эндотоксинемии и угнетени-( антиэндотоксинового иммунитета. В то же время в Москве к таким )уппам было отнесено лишь 20% обследованных. При анализе анамнести-;ских данных и дополнительных обследованиях у лиц. отнесенных к груп-ш 3,4.5 в 70% случае обнаружены острые и хронические заболевания ор-шов дыхания, пищеварения, выделительной системы, дисбактериоз. Сле-жательно, иммуноферментная тест-система ЛПС-тест-ИФА может быть ис~ >льзована при диспансеризации и оценке состояния здоровья людей, в ч. облученных.

3.1.4.Определение титров антизндотоксиновых антител при помощи диагностической тест-системы "ТИА-антиэндотокс".

В ряде экспериментов для определения титров антител, связывающих [дотоксины, мы использовали диагностическую тест-систему "Антиэндо-жс-1", разработанную В.Г.Лиходедом и соавторами (1983). Эта система )едставляет собой формалинизированные и таниназированые бараньи эрит-щиты, сенсибилизированные гликолипидом Ие-хемотипа в комплексе с ¡чьим сывороточным альбумином. Система хорошо работает в РПГА, напри-;р. при отборе высокотитражных образцов плазмы крови доноров, однако шменение ее для обследования больных с острой патологией бывает зат-'днительно из-за возможности ложнопозитивных неспецифических реакций I счет белков острой фазы. В связи с этим, мы разработали новую диаг-ютическую тест-систему "ТИА-антиэндотокс", которая основана на опре-¡лении титров антител к Ие-гликолипиду методом тонкослойного иммунно-

го анализа. Для постановки реакции полистироловые чашки Петри сенси' лизировали раствором Re-гликолипида. а затем свободные участки на i листироле насыщали бычьим сывороточным альбумином и заливали 1% ara] Дифко. На поверхность агара наносили образцы исследуемых сывороток через 16-18 часов оценивали зоны преципитации, которые становились : рошо заметными после кратковременного выдерживания чашек над горя1 паром (рис.5).

Титр анти-Re-антител можно при этом оценивать путем нанесения агар различных разведений сыворотки (или плазмы) или путем измере] диаметра зоны преципитата при нанесении цельной сыворотки:

диаметр зоны

0.9 мм до 1,9 мм до 2. 8 мм до 3. 9 мм 4.9 5.9 до 6,9 мм до 7,9 мм

титр сыворотки

до до

мм мм

2 4 8 16 32 64 128 256

При сравнительном обследовании тест-система "ТИА-антиэндотокс" чувствительности в несколько раз превышала РПГА с эритроцитарным лиг ностикумом "Антиэндотокс-1", но на 1-2 порядка уступала чувствител! ности иммуноферментной тест-системы "Антиэндотокс-ИФА".

Рис.5. Зоны специфической конденсации паров при проведении тс кослойного иммуноанализа (ТИА-АНТИЭНДОТОКС). Величина диаметра пр* соответствует титру антител.

3.1.5. Выявление антиэндотоксиновых антител при помощи иммунофе ментной тест-системы "Антиэндотокс-ИФА".

С целью повышения чувствительности способа определения титров а тител к гликолипиду Ие-хемотипа мы разработали иммуноферментную диа ностическую тест-систему "Антиэндотокс-ИФА". Для этого полистиролов планшеты для иммунологических реакций сенсибилизировали раствор Ие-гликолипида, затем в лунки вносили по 250 мкг буфера для разведен и по 16 мкг исследуемой сыворотки или плазмы крови. После инкубиров

нил и промывания в лунки вносили 150 мкг протеина А. конъюгированного с пероксидазой хрена, инкубировали, промывали, добавляли субстрат с красителем и содержание антител определяли по показателю экстинции при длине волны 405 им. При каждом определении в качестве контроля (нормы) использовали пул плазмы крови от 43 здоровых доноров. Способ позволяет выявлять антитела к Reтликолипиду класса IgG. с которыми связывается протеин А.

3.1.6. Оценка антиэндотоксинового иммунитета при помощи диагностической тест-системы "СОИС-ИФА".

Основанием для разработки этой системы послужили отдельные наблюдения о том. что оценка иммунного статуса является более полной при олнпррпменнпм определении титр>о антител к Re-гликолипиду и антигену Л1!с 01 1 г- Щ||ццм антигеном знтерпбактерий В связи с этим мы создали ennnnCi оценки иммунного статуса, основанный на применении иммунофер-ментной тест системы "соис ИМ" 132). Лля этого определяют содержание антител к Re-глике.пипиду при помощи тест-системы "Антиэндотокс-ИФА" и содержание литигел к ЛИС 01I и общему антигену энтрробактерий. Б последнем случае пилистпреловые планшеты для иммунологических исследований сенсибилизируют антигеном, выделенным из клеток Escherichia coll nit (получен пт П.М.Впндаренко). а все последующие операции проводят как при исиапьзог.янии системы "Антиэндотокс-ИФА".

При этим определяют пои 1затель Е1. характеризующий содержание IgG-антител к Re-глико.пипилу. и показатель Е2. характеризующий содержание IgG-антител к антигену 71ПС 014 и общему антигену энтеробактерий. а также показатель Е2

П -- — .

Е1

определяющий отношение показателя Е2 к показателю Е1. В качестве нормы в каждом исследовании определяют показатели El, Е2 и П для пула образцов плазмы от 43 здоровых доноров. Отклонением от нормы считали увеличение или уменьшение показателей не менее чем на 2 сигмы.

С целью апробации метода "СОИС-ИФА" было проведено обследование 293 практически здоровых людей (рабочих и служащих производственного объединения "ТАСМА" в г.Казани) - полученные результата позволили разделить обследованных на 11 групп следующим образом (табл.3).

Для контроля объективности обследования целенаправленно привлекались следующие специалисты: терапевт, кардиолог, пульмонолог, акушер-гинеколог. гастроэнтеролог, окулист, невропатолог. По показаниям проводились ультразвуковое исследование, гастрофиброскопия, ЭКГ. Проведено 227 анализов на раково-эмбриональныи антиген, антиген рака молочной железы, альфа-фетопротеин . углеводный антиген злокачественных опухолей панкреато гепато-дуоденальной области. кислую фосфатазу предстательной железы, бета-2-микроглобулин. ХГЧ. ЛГ. ФСГ. эстрадиол. прогестерон, тестостерон,ТТГ. тироксин, трийодтиронин. кортизол. 23 человека дообследовались в стационарных условиях. Больные с острыми заболеваниями в состав обследованных не входили.Результаты обследования специалистами представлен в табл.3.

Таблица 3

ПОКАЗАТЕЛИ АНТИТЕЛ К Ке-ГЛИКОЛЙПИДУ (Е1). ЛПС С ОБЩИМ АНТИГЕНОМ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ (Е2) И ИХ СООТНОШЕНИЕ (П) У СОТРУДНИКОВ ПО "ТАСМА"

Группы обследован.

1

2

3

4

5

6

7

8 9

10 И

т

Количество обследованных

34 10 20 22

29 63

4 18

30 17 46

Показатели

Е1

; ;

I *

♦

т

Е2

+ ♦ *

1

н и

А

\ *

I +

Всего

293

Обозначения: -»-норма. |ниже нормы. 4ьише нормы

Таблица 4

ЧАСТОТА ВЫЯВЛЕНИЯ ДИСПАНСЕРНЫХ БОЛЬНЫХ В ГРУППАХ "СОИС-ИФА"( В % )

1 1 N 1 I Число г Нозологическая форма

1 11 Т~\ КПП! 1 1 1-чПЛ П

1 группы|оо^ле- 1 1 1 г 1

|дован- Фибро- I Язвен- Учловои|Пиело 1 Хрон. Ревма 1 Кисты |Зло-

|ных миомы ная 30о и I нефрит|пнев- тизм |и по- |кач.

1 16-нь узловая 1 |мония 1 липы |ново-

1 1 масто- 1 1 !разл. | ибра^

1 .1 1 | патия 1 | 1 1 ирг. 1 1

I 1 34 2, 9

1 2 10 10. 0 - - 10.0 - -

1 з 20 15.0 15. 0 • 20.0 - ю.о 30.0 -

1 4 22 4.5 - 9.0 13.6 - 13.6 -

1 5 29 17.2 13. 8 10,3 20.7 3.4 3.-1 6.9 3,4

1 6 63 19.0 3. 2 7.2 15,9 4.8 1.4 11,6 1.4

1 1 4 - - - - - - - -

1 8 18 16.7 И. 1 - 5.6 - 5.6 22,2 5.6

1 9 30 6.7 6.7 - 10,0 3.3 - - -

1 ю 17 35,3 11,8 13.0 11.8 - 5.9 11,8 -

1 11 46 2.2 4.3 4.3 8.7 - - 2, 1 -

1 Всего 1 293

Как видно из табл.4, различные хронические заболевания (диспансерные больные) наиболее часто выявляются в группах 3,5,6,8.10, которые можно отнести к группам риска.

Состояние резистентности организма по результатам обследования при помощи тест-системы "СОИС-ИФА" в группах можно оценить следующим образом: при нормальных значениях Е1.Е2 и П состояние резистентности оценивают как нормальное (1-я группа); при снижении Е1 и Е2 и нормальном значении П - как физиологический вариант нормы (2-я группа); при снижении Е1 и Е2 и снижении или повышении П - как вариант угнетения резистентности (3-я группа); при повышении Е1 и Е2 и нормальном значении П - как вариант физиологической активации резистентности (4-я группа); при повышении Е1 и Е2 и повышении или снижении П - как вариант дисбалансированной активации резистентности (5-я группа); при снижении Е1, повышении Е2 и П - как вариант активации селективно сниженной резистентности (6-я группа); при повышении Е1, снижении Е2 и П -как вариант дисбалансированной активации селективно сниженной резистентности (7-я группа); при нормальном значении Е1. снижении Е2 и П -как вариант декомпенсированного снижения резистентности (8-я группа); при снижении Е2. нормальном значении Е2 и повышении П - как вариант компенсированного снижения резистентности (9-я группа); при повышении Е1, нормальном значении Е2 и снижении П - как вариант декомпенсирован-ной активации сниженной резистентности (10-я группа); при нормальном значении Е1, повышении Е2 и П - как вариант компенсированной активации измененной резистентности (11-я группа). Предлагаемый способ применялся при обследовании более чем 5.ООО рабочих и служащих ВИАМ и завода низковольтной аппаратуры (г.Москва), производственного объединения "Тасма" (г.Казань), Шевченковского завода пластических масс (г.Актау) и ряда других предприятий СНГ. Способ позволил выявить "группы риска", латентно протекающие формы болезни, состояния предболезни. Способ не требует дорогостоящего оборудования, прост в исполнении, позволяет повысить эффективность профилактики и лечения, сократить потери по временной нетрудоспособности.

Вместе с тем необходимо отметить, что для разностороннего теоретического объяснения результатов, получаемых способом "СОИС-ИФА". при сопоставлении частот патологических процессов в выявленных группах резистентности организма с показателями титров антител, необходимы дальнейшие исследования. В частности, следует сопоставить результаты одновременного обследования разных групп населения, здоровых и больных при помощи системы ЛПС-тест-ИФА и "СОИС-ИФА". Эти исследования пока не проведены в связи с более поздней разработкой системы ЛПС-тест-ИФА.

3.2. Зндотоксинемия и антиэндотоксиновый иммунитет у беременных женщин и новорожденных.

В своих исследованиях мы прежде всего попытались оценить возможную роль эндотоксина в период беременности, в частности, роль эндотоксина при поздних токсикозах беременности (ПТБ). Первые данные, свидетельствующие об участии ЛПС в патогенезе поздних гестозов, были нами опубликованы в 1987 году. У 48 из 59 женщин в мазках периферической

крови определялись ПЯЛ, перегруженные ЛПС. Последующие исследовг ния(проведенные в нашей лаборатории Д.В.Добронецкой). осуществлена при помощи микро-ЛАЛ-теста и ТИА-антиэндотокса, показали, что при гес тозах беременность и послеродовый период протекают на фоне повышенно] по сравнению с контролем (беременные без токсикоза) содержания эндс токсина в крови и сниженного содержания антиэндотоксиновых антига Эти данные подтверждают участие СЭЕ патогенезе этой патологии.

Далее было изучено содержание эндотоксина в плазме и титры анп эндотоксиновых антител у матерей и новорожденных спустя 1 сутки после родов. Они были разделены на группы в зависимости от состояния нов( рожденных: здоровые дети (группа 1) и их матери (группа 4). дети с ф1 зиологическими реакциями адаптации (группа 2) и их матери (группа 5; дети с патологическими реакциями адаптации (группа 3) и их мате( (группа 6).

Как видно из таблицы 5, в контрольных (здоровых) группах дет( (группа 1) содержание эндотоксина в плазме крови было значителы меньше, чем у детей с физиологическими (группа 2) и патологически! (группа 3) реакциями адаптации. Патологические реакции адаптации пр< текают на фоне снижения титра антиэндотоксиновых антител (группа 3 Необходимо отметить, что у детей группы 3 с уменьшением патологичесю реакций адаптации снижалось содержание эндотоксина в плазме и к моме! ту выписки домой (14 дней после родов в среднем) нарастали титры ант: тел к {?е-гликолипиду.

Можно полагать, что эндотоксин является одной из возможных пат1 физиологических причин развития реакции адаптации. Кроме того, необх> димо отметить наличие СЭЕ у новорожденных вскоре после рождения, ч' может быть следствием колонизации организма грамотрицательной микро( лорой.

Таблица 5

СОДЕРЖАНИЕ ЭНДОТОКСИНА И АНТИЭНДОТОКСИНОВЫХ АНТИТЕЛ В ПЛАЗМЕ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ И ИХ МАТЕРЕЙ

1 1 Обсле- 1 Труп-| Кол-во Содержание 1 Обратные титры |

дован- па | обсле- ЛПС антител к Ие- |

ные 1 Iдован. 1 . __ (пг/мл) -гликолипиду |

1 1 Дети 1 1 1 26 1,2 + 0,4 22.9 ± 3,1 |

1 2 1 13 *6.0 ± 1.5 * 60,3 ± 10,1 |

1 1 3 1 I 22 *8,2 ± 1.2 10,2 + 2,3 |

1 I Матери 1 4 1 21 2,4 + 0,9 16.4 + 2,6 |

1 5 1 8 ** * 1.3 ± 0,5 **96. 0 + 26, 4 I

1 I 6 1 1 11 6,8 + 1,9 I 47.3 +14,9 I |

* Р<0, 05 по отношению к 1-ой группе;

* * Р<0,05 по отношению к 4-ой группе;

*** Р<0.05 по отношению к 6-ой группе.

Следует отметить, что и в более позднем периоде у детей имеет место СЭЕ, по-видимому, физиологическая, и в плазме крови содержатся антиэндотоксиновые антитела. При изучении здоровых 20 детей в возрасте от 1,5 до 3 лет были определены следующие показатели:

Содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов 4,2 ± 1,15% Содержание эндотоксина в плазме 1,36 ± 0,61 пг/мл

Обратные титры антител к Ке-глнколипиду 16,8 ± 3,39. Эти данные позволяют заключить,что эндотоксин и антиэндотоксино-вый иммунитет играет важную роль в физиологии и патологии беременных женщин и новорожденных.

3.3. Эндотоксин и эндотоксинсвязывающие системы при аппендиците и перитонитах.

Первые результаты, свидетельствующие об участии ЛПС в патогенезе аппендицита, были опубликованы нами в 1989. Они были получены с помощью ЛПС-ТЕСТа (реакция считалась положительной при наличии ЛПС-пе-регруженных ПЯЛ с интенсивностью люминесценции +++, ++++). Так. при остром неосложненном аппендиците эндотоксин-перегруженные гранулоциты определялись в 16,6%, а при остром деструктивном - в 87,5% наблюдений. Наличие ЛПС-гиперактивированных ПЯЛ в периферической крови у больных с острым неосложненным аппендицитом при отсутствии четко выраженных морфологических признаков воспаления отростка может свидетельствовать в пользу того, что СЭЕ предшествует лейкоцитарной инфильтрации тканей аппендикса и его деструктивным изменениям. Способность ЛПС-перегружен-ных гранулоцитов проявлять аутоагрессивные свойства (см.3.6.), присутствие ЛПС в кишечнике и наличие разнообразных факторов, способных быть причиной повреждения слизистой аппендикса и развития СЭЕ, позволило нам предположить, что патогенез острого аппендицита аналогичен местному феномену Шварцмана. В пользу этого предложения свидетельствовало наличие в отпечатках аппендикса при флегмонозном воспалении от-зостка гранулоцитов, перегруженных эндотоксином (рис.6).

Л ¿»¿д. Ч

Рис.6. ЛПС-перегруженный гранулоцит в отпечатке аппендикса при флегмонозном воспалении, х 2000 ЛПС-ТЕСТ-ИФА.

Для оценки роли эндотоксина при разлитом перитоните в крови боль-!ых определялось содержание туморнекротизурующего фактора (TNF), который, как известно, является основным медиатором токсического действия ПС. Исследован 21 больной: 15 выздоровевших(1-я гр.) и 6 умерших(2-ая р.).Результаты исследования приведены в таблице 6.

Из таблицы 3 следует, что в первые сутки послеоперационного пери-

ода концентрация THF в группах сравнения была одинаковой. К 5 сутка содержание TMF у выздоровевших больных, в отличие от умерших, снижает ся (Р<0,001), что свидетельствует о важной роли ЛПС в патогенезе забо левания и возможности использования показателей содержания TNF в прог ностических целях. Исследования перитонеального экссудата (В.В.Струсо

Таблица 6.

КОНЦЕНТРАЦИЯ TNF В КРОВИ У БОЛЬНЫХ РАЗЛИТЫ ПЕРИТОНИТОМ.

1 1 Группа 1 1 Концентрация в ед/мл 1 M ± m) I

I Срок исследования (в днях) )

1 1 1 1 1 3 1 1 5 I

1 1-ая 1 (11=15) 1 1 i 1 182. 3 ± 6, 3 |74, 4 ± 5, 1 | * ** | 32,3 ± 4,8 I

I 2-ая 1 (п=6) 1 1 85,6 + 7,7 | 92,0 + 8,3 |

Примечание, n-число обследованных; *-Р<0,001 - к исходному уровню; **-Р<0,001 - к умершим.

и соавт.1993) обнаружившие параллелизм между концентрацией ТИГ в кров и в брюшной полости. Это свидетельствуют о том, что основным продуцен том токсического фактора при разлитом перитоните являются перитонеаль ные макрофаги, подлежащие удалению из брюшной полости.

Прямое определение ЛПС при помощи ЛАЛ-теста показало, что у 7 больных разлитым перитонитом концентрация эндотоксина в крови при пе ритонитах значительно повышена и колеблется в пределах от 7.8 ± 3, ед.опт.пл.до 14,6 ± 4,8 ед.опт.пл. После проведения экстракорпоральнс детоксикации,дающей хороший терапевтический эффект, содержание ЛГ снижалось в разных группах больных до 4,9 ± 0,8 и 6,4 + 1,4 ед.опт.ш

Исходя из важной роли ЛПС в патогенезе разлитого перитонита, бьи изучена возможность лечения больных плазмой крови с высоким содержат: ем антител к Ее-гликолипиду. Результаты представлены в таблицах 7 и £ Больным 1 группы вводили обычную плазму крови доноров, а больным группы - плазму с высоким(титры 1:64-1:256) содержанием антител Бе-гликолипиду(титры определяли в РПГА при помощи эритроцитарного д!-агностикума "Антиэндотокс-1"). Больные перитонитом при поступлении клинику характеризовались резко сниженным гуморальным антиэндотоксинс вым иммунитетом. Титры антиэндотоксиновых антител начинали возраста! через 5-7 суток после операции и при лечении плазмой крови с повышен ным содержанием антител к Ее-гликолипиду титры таких антител во группе к 10-15 суткам после операции возрастали до значений нормь Применение антиэндотоксиновой плазмы крови доноров снижало частоту ос ложнений после операции и уменьшало продолжительность пребывания бот

ых в клинике (табл.7).

Положительная динамика антиэндотоксиновых антител, регистрируемых етодом СОИС-ИФА, наблюдалась также при благоприятном течение перито-ита в связи с гангреной тонкой кишки (рис.8). В то же время у боль-

Таблица 7

ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ АППЕНДИЦИТОМ, ОСЛОЖНЕННЫМ РАСПРОСТРАНЕННЫМ ПЕРИТОНИТОМ

N 1 гр. п=14 2 гр. П=12

1. а) гангренозный 6 4

б) гангренозно-перфоративный 8 8

О Хар-р флоры брюшной полости:

а) кишечная палочка + протей 13 + 1 = 14 10 + 1 = 11

б) синегнойная палочка - 1

в) признаки анаэроб.флоры 4 5

3. Летальность 1 -

4. Послеопер. осложнения:

а) инфильтраты брюш.полости 7 3

б) абсцессы брюшной полости 2 1

в) эвентрации 1 -

г) нагноение раны 6 3

5. Койко-дни (средние показат.) 31. 2 26.7

Таблица 10.

ТИТРЫ АНТИТЕЛ К !?е-ГЛИКОЛИПИДУ У БОЛЬНЫХ ПЕРИТОНИТОМ

Время обследования 1 1 1 1 Обратные титры антител 1 |

1 1 1 группа 2 группа I

1 При поступлении |2,5 1-3 сутки после операции ¡2,7 5-7 сутки после операции |4,1 10-15 сутки после операции|9,0 |+ 1+ 1+ 1+ 0, 1 Р1<0, 01 0.3 Р1<0. 01 0,3 Р1<0. 01 0.9 РК0.05 2.7 2.3 8.8 18, 3 + 0.2 РК0.01 | ± 0.2 РК0.01 | + 0.6 РК0.01 | ±2.2 Р2<0. 05 |

Показатели нормы 1 1 1 19,5 ± 0. 4 1

Примечание: Р1 - значимость различий по сравнению с нормой; Р2 - значимость различий между группами.

ых, умерших от перитонита, показатели титров антител к Ие-гликолипиду ставались на крайне низком уровне.Так.по данным СОИС-ИФА у 11 чело-ек, выздоровевших от перитонита, содержание антител к Ие-гликолипиду ыло повышенным, в то время как у 8 погибших от перитонита содержание аких антител было крайне низким (рис.8). Эти данные достаточно убеди-ельно свидетельствуют о важной протективной роли антиэндотоксиновых нтител при перитонитах.

Рис.7. Динамика показателей содержания IgG-антител против Re-™ колипида (а) и E.coli (б) в плазме крови(в ед. опт.плот.) в остр< периоде гангрены тонкой кишки с перитонитом. Исход болезни вызд! ровление. Столбики: средние показатели у здоровых. СОИС-ИФА,

О.А

X

X О.З

СМ

CD

II LU 0.2

0.1

О.О

0.2 О.З Е=492 нм

0.5

Рис. 8. Величина экстинции к Бе-гликолипиду у выздоровивших (-*-.) и умерших!-»-) больных перитонитом. СОИС-ИФА.

В своем большинстве изученные нами случаи перитонитов развивалт как осложнения аппендицита.

Совокупность полученных нами результатов позволяет сделать закл| чение, что эндотоксин непосредственно вовлекается в патогенез перип

нита и обусловливает в значительной мере тяжесть его клинического течения, в то время как антиэндотоксиновые антитела играют важную защитную роль при этой патологии.

3.4. Эндотоксинемия и антиэндотоксиновый иммунитет при патологии легких.

Анализ материалов литературы, включающей экспериментальные и клинические наблюдения, позволил предположить возможность участия эндотоксина в различных видах патологии легких. В этом плане вызывал интерес бронхообструктивный синдром (БОС) при острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ). в частности у детей. Мы обследовали 44 ребенка в возрасте от 4 месяцев до 10 лет, больных ОРВИ. У 20 детей ОРВИ была осложнена БОС, у остальных наблюдалось гладкое течение ОРВИ. Было изучено содержание антиэндотоксмновых антител методом ТИА-антиэндотокс, содержание эндотоксина в плазме микро-ЛАЛ-тестом и содержание ЛПС-по-зитивных ПЯЛ, выявленных способом ЛПС-тест и ЛПС-тест-ИФА.

Из табл.9 видно, что у больных детей титр антизндотоксиновых антител в начале заболевания несколько снижен. При осложненных формах ОРВИ наблюдается медленное нарастание титров по мере выздоровления. Более информативны данные о содержании плазменного и клеточно-связан-ного ЛПС (табл.10). У всех больных ОРВИ показатели содержания ЛПС-по-зитивных лейкоцитов и содержания эндотоксина в плазме оказались значительно более высокими, чем у здоровых детей. Особенно высокими были показатели содержания ЛПС-позитивных ПЯЛ. Наибольшее содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов у больных ОРВИ, осложненной БОС, было отмечено в первые 5 дней заболевания, в это же время было отмечено наименьшее содержание эндотоксина в плазме крови.

В первые 5 дней заболевания у больных с БОС была наиболее клинически выражена интоксикация и наблюдалась корреляция между тяжестью заболевания с БОС и содержанием ЛПС-позитивных ПЯЛ.

Были обследованы также дети, у которых ОРВИ осложнялась пневмонией. Средние показатели у таких больных по сравнению с группой больных без пневмонии представлены в таблице 11-13.

Таблица 9.

СОДЕРЖАНИЕ АНТИТЕЛ К 1?е-ГЛИК0ЛИПИДУ У ДЕТЕЙ С ОРВИ, ОСЛОЖНЕННОЙ И НЕОСЛОЖНЕННОЙ БОС (П=101)

1 I Дни заболевания 1 1 I1оё2 обратного титра антител к [?е-гликолип. |

I ОРВИ без БОС 1 1 I ОРВИ с БОС I 1 |

1 1-3 1 4-5 I 6-10 1 позднее 10 I 2. 87 ± 0,43 | 3,37 ± 0,47 I 2, 87 ± 0,31 I 3, 14 ± 0,58 1 1 I 2,50 ± 0,66 | | 2,61 ± 0,56 | I 2,87 ± 0,35 | | 3,62 ± 0,58' | I

I Здоровые дети(20) 1 6,55 ± 0,28 I |

Таблица 10.

ПОКАЗАТЕЛИ СЭЕ ПРИ ОРВИ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА (п=101)

1 1 Дни забо- Содержание эндотоксина в 1 Содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ|

1левания плазме (пг/мл) (в %)

1 ОРВИ без БОС |ОРВИ с БОС 1 \ ОРВИ без БОС | ОРВИ 1 с БОС |

11-3 1 8,75 ± 2,05 |2,52 ± 1,61 1 12,90 ± 5,16 |34,42 + 8,42 I

14-5 8,21 ± 1,85 |1,82 ± 0,72 11,50 ± 3,45 125,15 + 6,29 |

I 6 - 10 7,66 ± 1,35 |3.09 ± 1,47 9,26 ± 2,16 |13,94 + 4.39 I

1 позднее 10 10,09 ± 1,61 |5,83 ± 2,38 | 8,00 ± 1,98 113,71 | + 4,72 |

I Здоровые 1, 36 + 0, 61 4,20 ± 1, 15

|дети (20) 1 |

Из табл.11 видно, что титры антиэндотоксиновых антител у больны: ОРВИ особенно у больных с пневмонией были крайне низкими. Содержанш эндотоксина в плазме в первые 5 дней заболевания было более высоким ; больных с пневмонией, а содержание ЛПС-позитивных лейкоцитов у них бы ло более высоким и после 10-го для заболевания (табл.12).

Нужно заметить, что у всех больных показатели плазменной СЭЕ ] содержание ЛПС-позитивных ПЯЛ были более высокими, чем у здоровых детей. Обращает на себя внимание также тот факт, что клинические проявления интоксикации у тяжелых больных ОРВИ с пневмонией коррелируют I концентрацией эндотоксина в плазме крови (табл.13).

Принципиально такие же наблюдения были сделаны при обследовант взрослых с ОРВИ, осложненной пневмонией. У этих больных была выявлен; прямая зависимость между температурой тела и содержанием эндотоксина 1

Таблица 11.

ТИТРЫ АНТИЭНДОТОКСИНОВЫХ АНТИТЕЛ У БОЛЬНЫХ ОРВИ ДЕТЕЙ С ПНЕВМОНИЕЙ И БЕЗ ПНЕВМОНИИ (п=218)

1 1 Дни I заболевания 1 1о^2 обратных титров антител | к Ие-гликолипиду |

ОРВИ без осложнен. 1 1 1ОРВИ с пневмонией | 1 |

11-3 I 4 - 5 I 6 - 10 ¡позднее I 10 2,78 ± 0,28 2,48 ± 0,40 2,99 ± 0,21 3,26 ± 0,41 1 I I 3,20 ± 0.73 | I 2,00 ± 0,43 | I 2,61 ± 0,30 | I 2,11 ± 0,43 1 1 1 1 |

¡Здоровые ( дети 1 3,55 ±0,28 | 1

Таблица 12.

СОДЕРЖАНИЕ ЭНДОТОКСИНА И ЛПС-ПОЗИТИВНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ ОРВИ С ПНЕВМОНИЕЙ (П=218)

;ни Содержание эндотоксина ... . , Содержание ЛПС-позитив- 1

юлезни в плазме, пг/мл НЬ!Х ПЯЛ, %% 1

ОРВИ без i I ОРВИ с 1 1 ОРВИ без I ОРВИ с I

пневмонии 1 пневмонией i пневмонии | пневмонией 1 1 |

1 - 3 6.3 ± 1,34 1 I10,65 ± 2,38 1 1 12.74 ± 3,261 4,48 ± 2,26|

4-5 6,9 ± 1.36 |12,04 ± 2,89 13,91 ± 2,78113,27 ± 3,92I

6-10 7,18 ± 1,00 ] 6,65 ± 2,16 11,43 ± 2, 13116,83 ± 4,851

1озднее 10, 05 ± 1,38 ) 3,76 ± 1.22 6,42 ± 2. 19111, 18 ± 3,07|

10 1 i 1 1 I |

¡доров. 1,36 + 0,61 4, 2 ± 1. 15 I

дети |

изме крови и обратная зависимость между температурой тела и содержа-[ем антител к эндотоксину (рис.9).

Изложенные материалы, на наш взгляд, достаточно убедительно сви-¡тельствуют о роли эндотоксина в развитии интоксикационного синдрома >и заболеваниях дыхательных путей, а также об участии эндотоксина в ¡ханизме развития бронхообструктивного синдрома.

Таблица 13.

СОДЕРЖАНИЕ ПЛАЗМЕННОГО ЭНДОТОКСИНА У ДЕТЕЙ, БОЛЬНЫХ ОРВИ С ПНЕВМОНИЕЙ 11=38

I Наличие интоксикации I

¡Отсутствие I

I Выраженная интоксикация

¡Здоровые дети

Концентрация эндотоксина в плазме крови, пг/мл

4,24 ± 1,22

13,34 ± 2.22

1.36 ± 0,61

Особо необходимо отметить важную роль ЛПС-позитивных ПЯЛ при изу-1емой патологии. В частности, в первые три дня развития пневмонии ко-[чество ЛПС-позитивных ПЯЛ почти в три раза меньше, чем при неослож-;нной ОРВИ. Этот факт может быть объяснен миграцией эндотоксин-акти-[рованных гранулоцитов в легкие, т. к. именно в этот период и происхо-[Т лейкоцитарная инфильтрация органа, - формируется морфологическая 1ртина банального воспаления органа. Именно в этот период развития 1болевания в системном кровотоке обнаруживается большое количество

Температура тепа

Рис.9. Динамика концентрации плазменного ЛПС ( ) и титра анти-

Ее-антител ( ) в зависимости от температуры тела.

МИКРО-ЛАЛ-ТЕСТ, ТИА-АНТИЭНДОТОКС.

ЛПС-позитивных в том числе (ЛПС-перегруженных) гранулоцитов на фс более чем пятикратного увеличения концентрации плазменного ЛПС. Пр^ значительное снижение свободного эндотоксина на 6-10 день развит пневмонии сопровождается почти четырехкратным увеличением количест ЛПС-позитивных ПЯЛ при исчезновении из системного кровотока эндотс син-перегруженных гранулоцитов. Создается впечатление того, что met гиперактивированные ПЯЛ и ответственны за развитие осложнения OPE Механизм развития воспаления при ОРВИ может быть представлен следуюи образом: повреждение("протрава") вирусом эпителиальных клеток легки) сенсибилизация поврежденной ткани ЛПС (который всегда присутствует вдыхаемом воздухе) - выброс хемаатрактантов - инфильтрация оргг ЛПС-активированными лейкоцитами(в том числе и гиперактивированными аутоагрессивными, см.3.6.) - деструктивные изменения - типичная Mopí логическая картина пневмонии. В связи с этим возникает справедлиЕ вопрос. - Почему при ОРВИ резко возрастает концентрация ЛПС в систе ном кровотоке? По-видимому, это происходит в результате повреждеь вирусом эпителия слизистой кишечника. Возможность развития пневмоь при ОРВИ по предложенному нами механизму находит свое подтверждение секционном материале аспирационной пневмонии (рис.15) новорожденног осложнившейся кровоизлиянием в надпочечники(классическая картина эщ токсипового шока,- синдрома Уотерхаза-Фридрихсена) : наличие свободнс эндотоксина на стенке альвеолы и и инфильтрация ткани ЛПС-позитивнь ПЯЛ. Не менее интересен и другой факт, - несомненного участия ЛПС-г зитивных ПЯЛ в патогенезе бронхообструктивного синдрома при ОРВИ.

Полученные результаты, свидетельствуют о важной (если не ведуще роли СЭЕ и, в частности ЛПС-позитивных ПЯЛ, в патогенезе острого ре пираторного дистресс-синдрома(ОРДС), патогномоничными признаками кот poro являются как БОС, так и альвеолит.

3.5. Эндотоксин и патология мочеполовой системы

Обобщенные O.Westphal [1975] данные литературы свидетельствуют важной роли почек в выведении эндотоксина из системного кровото? Так, при внутривенном введении кролику ЛПС моча приобретает выражеш пирогенную активность. Однако, до настоящего времени неизвестно, кар

ндотоксин выводят почки: плазменный ("свободный") или гранулоцит-свя-анный? Более того, неизвестно какие же структуры мочевыводящей систе-ы ответственны за это? Клубочковый аппарат? Слизистые оболочки лоха-ок, мочеточников, мочевого пузыря? Или те и другие? Также не опреде-ена роль ЛПС в патогенезе острой почечной недостаточности (ОПН) и ругих видах патологии почек у человека.

Хорошо известно, что ОПН является практически облигатным синдро-ом шокового процесса любой этиологии, в т.ч. эндотоксиновой.

Наши немногочисленные секционные исследования почек при эндоток-иновой патологии, осложненной ОПН. (рис.13 а) показали наличие ЛПС в пителии, выстилающем клубочковую капсулу Шумлянского-Боуэна. и эпите-ии проксимальных канальцев. Обнаруженные данные являются прямым сви-етельством участия клуоочкир.пго аппарата в выведении плазменного ЛПС , возможно, участия свободна I эндотоксина в патогенезе деструктивных зменений. лежащих в оониве развития некронефроза. Мы допускаем воз-ожность того, что именно ЛПС является ответственным за развитие поли-рической фазы ОПН. В связи с обнаружением нами эндотоксина в эпителии апсулы клубочкового аппарата весьма интересными представляются ре-ультаты исследований с.МогеП соавт. [1988], изучавших патогенез ПС-индуцированного повреждения почек на изолированном клубочке, кото-ые показали, что ЛПС может быть причиной развития гломерулонефрита. роме того, нефротоксический эффект при остром перитоните с ОПН может существляться ЛПС-позитивными гранулоцитами (рис. 13 б), т.к. эндо-оксин-гиперактивированные ПЯЛ обладают полным спектром необходимых ля этого биологических свойств и способны сами по себе обусловливать азвитие всей гаммы морфологических и клинических нарушений в почках ри _изучаемой патологии. Подтверждением этого может служить наличие ....... . • ' ■ . г-

••.уад?

Рис. 13.

Почки при

геморрагическом инфаркте кишечника с ост-ым перитонитом и ОПН. ЛПС-ТЕСТ-ИФА. х 400: а) наличие ЛПС в эпите-ии капсулы Шумлянского-Боуэна и в некротизированных эпителиальных летках проксимальных канальцев; б) ЛПС-позитивные гранулоциты в ин-ерстиции(слева) и в микрососудах(справа) с явлениями маргинального ейкостаза.

ЛПС-перегруженных гранулоцитов у аналогичных по тяжести течения забс левания больных острым перитонитом с ОПН и при хроническом пиелоне(1^ те в периферической крови на 2-3 день болезни,а также приведенные выи данные о резком угнетении антиэндотоксинового иммунитета при перитом тах.

На участие эндотоксина в ренальной патологии косвенно указывай также имеющиеся у нас данные о значительном угнетении гуморального ai тиэндотоксинового иммунитета при хронической почечной недостаточное™

Об этом же свидетельствуют и факты наличия в периферической крои ЛПС-перегруженных ПЯЛ при различной нефро-урологической патологии:y2í больных хроническим пиелонефритом(в стадии ремиссии),33% больных с of кологическими заболеваниями мочевого пузыря в раннем послеоперационнс периоде и, что наиболее интересно,- 87% больных мочекаменной болезньк

Таким образом, почки принимают участие в выведении эндотоксина у системного кровотока. Естественно предположить, что нарушение этог механизма с фиксацией эндотоксина в различных структурах нефрона ь может не играть существенной роли в патогенезе заболевания почек других органов урологической системы. Особое место в реализации пате генного эффекта эндотоксина, по-видимому, принадлежит ЛПС-перегружеь ным гранулоцитам.

3.6. Эндотоксин и система полиморфноядерных лейкоцитов

Клетки крови различных видов млекопитающих имеют не одинаков^ чувствительность к эндотоксину. Наибольшей аффинностью по отношению ЛПС кроличьи тромбоциты и гранулоциты, а также крысиные мононуклеарнь фагоциты, наименьшей - человеческие тромбоциты и эритроциты.

Реакция человеческих гранулоцитов на ЛПС во многом аналогии! кроличьей. Справедливость этого была подтверждена нами в предварител! ных опытах in vitro на популяции лейкоцитов, которые активно акцепт! ровали бактериальные липополисахариды. Более того, верификация in sil ЛПС-позитивных клеток в 500 мазках периферической крови больных с ра; литым гнойным перитонитом, хроническим пиелонефритом, очаговой и кр; позной пневмонией, травматическим, кардиогенным и ожоговым uioKot поздним токсикозом беременности с нефротическим синдромом, мочекаме? ной болезнью и др. с помощью гематологических окрасок обнаружила вес* ма любопытный факт: у большинства больных в периферической крови обнг руживались ПЯЛ с высокой интенсивностью люминесценции, что, как прав! ло. сопровождалось лихорадкой, изменениями биохимических и гематолоп ческих показателей крови. Определялся сдвиг лейкоцитарной формулы вл( во различной степени выраженности, лейкопения, но чаще лейкоцитоз, большинства больных в мазках периферической крови практически отсутс твовали эозинофилы(ЭФ). У части пациентов отмечалась тромбоцитопения нередко активация тромбоцитарного ростка (появление бластных форь костного мозга и др. При просмотре мазков периферической крови HaL внимание было привлечено к чрезвычайно ярко светящимся клеткам, намне го превосходящим по яркости аффинные к ЛПС ПЯЛ.Клетки встречались дг леко не в каждом мазке. Оказалось, что они обнаруживаются в мазкг крови, в которых присутствовали единичные ЭФ.Верификация этих суперас

шых к ЛПС клеток показала,что ими являются ЭФ (рис.2).По-видимо-ЛПС и является одним из основных факторов, обусловливающих развитие ¡ионопении, так как, с одной стороны, СЭЕ-весьма частое клиническое яв-ше.а с другой - хорошо известна способность ЛПС оказывать лейкопе-[еский эффект с депонированием(секвестрацией)ПЯЛ в микроциркулятор-I русле паренхиматозных органов,и, в первую очередь,-в легких.В свя-с этим весьма интересны клинические исследования(Halgen R. et , показавшие,что в патогенезе повреждения тогенезе повреждения лег: при септическом шоке с развитием острого респираторного диет-:с-синдрома (ОРДС) определенная роль принадлежит ЭФ и, в частности, юбождаемому ими специфическому гранулярному белку - эозинофильному ■ионному протеину. Плазменная концентрация этого белка значительно ¡растает (несмотря на эозинопению), что на наш взгляд, может служить ним диагностическим критерием развивающегося при септическом шоке [С.

Таким образом, полиморфноядерные лейкоциты являются основной эн-■оксин-связывающей популяцией клеток крови, а эозинофил будет еще [ее активной к ЛПС клеткой, может опосредовать патогенный эффект

При исследовании с помощью ЛПС-ТЕСТа и ЛПС-ТЕСТ-ИФА мазков крови [ее чем 1000 практически здоровых и больных людей обратило на себя :мание обязательное присутствие в периферической крови различного мчества слабо ЛПС-позитивных ПЯЛ. Первоначально этот факт тракто-:ся нами как артефакт (или расценивался как фон). Однако проведение ;ых разнообразных контрольных исследований, включая иммуноблотинг и '-блот, мы сочли возможным по-иному подойти к оценки этого факта.

Материалом для исследования послужила кровь практически здоровых .ей и больных с т. н. грамотрицательными флегмонами нижней челюсти, итонитом и ОРДС (выполнено совместно с В.Н.Таланкиным,А.Н.Крупни-,А. М. Токмаковым). Исследования морфо-функциональной активности ПЯЛ ществлялись при помощи методики, разработанной В.Н. Таланкиным с со-.[1987]: в 5 мл гепаринизированной(20 МЕ/мл гепарина) венозной кро-измеряли рН и определяли число ПЯЛ; добавляли в пробирку с кровью териальную взвесь суточной культуры музейного штамма стафилокок-109 микробных тел/мл) с рН, равной рН крови, из расчета 10 микроб-тел на 1 ПЯЛ; кровь, смешанную с бактериями, инкубировали 30 мин в мостате при температуре тела обследуемого, встряхивали через каждые мин.; затем готовили первую серию мазков для изучения поглотитель-способности ПЯЛ на светооптическом уровне; остаток крови инкубиро-и, не встряхивая, еще 120 мин. при тех же условиях. Через 120 мин убации готовили вторую серию мазков для изучения бактерицидной спо-ности ПЯЛ. Далее проводили фиксацию материалов для электронно-мик-копического исследования по методу, описанному Н.Azar и соавт.

Результаты ультраструктурных исследований позволили разделить ПЯЛ три группы - неактивированные, умеренно активированные и гиперакти-ованные(В.Н.Таланкин и соавт..1988). В норме в крови доноров нахо-ся определенное количество ЛПС-позитивных гранулоцитов и сопостави-

Рис.14. Ультраструктура ПЯЛ человека из тест-системы с лейкощ тарно-бактериальной взвесью через 120 мин после добавления бактер> (Staphylococus epedermltls 9198) х 18000. a-умеренно активированнь ПЯЛ: не формирует обширных вакуолей, содержащих окружающий клеть субстрат. Активность соответствует задачам переваривания бактерий -цитоплазме остаточные тельца (ОТ) от переваренных бактерий; б - типе рактивированный ПЯЛ: формирует обширные вакуоли, содержащие хлопьевщ ный материал. Степень активации превышает необходимую для выполнена фагоцитарной функции - бактерии перевариваются хуже, одно из бактери альных тел (БТ) не имеет признаков деструкции.

мое число умеренно активированных ПЯЛ. Неактивированные ПЯЛ имели пра вильную округлую форму без псевдоподий, сохранные первичные и вторич

ie гранулы, не способны -к захвату дозированно добавленных в тест-сис-му бактерий. Умеренно активированные ПЯЖрис.14а) характеризовались юсобностыо образовывать псевдоподии типа лобоподий, формировать обегающие бактериальные тела фагосомы. обладали организованным выбросом держимого гранул в просвет фагосом, хорошим перевариванием бактерий тест-системе в течение 120 минут. Полученные данные свидетельствуют важной роли ЛПС в поддержании системы ПЯЛ в состоянии физиологичес->го тонуса, и, соответственно, - в формировании антибактериального )меостаза в здоровом организме.

Становятся объяснимыми малопонятные с позиций фагоцитарной теории 1нные о наличии в крови здоровых людей активированных ПЯЛ. Причины и шел этой активации находится в полном соответствии с общими законо-:рностями деятельности физиологических систем: воздействие (в данном 1учае проникновение ЛПС из килечника в кровь в обычных условиях) )авновешивается действием транспортно-элиминирующих систем, в том юле системы ПЯЛ, и одновременно поддерживает системы в состоянии фи-юлогического тонуса.

Вместе с тем, при изучаемой патологии, сопровождающейся лихорад-)й, сдвигом леикоформулы влево, гипер- или гипокоагуляцией и увеличе-1ем плазменного эндотоксина в системном кровотоке отмечалось появле-ie ЛПС-перегруженных ПЯЛ. Одновременно с этим, выявлялись гиперакти-фованные ПЯЛ. Ультраструктурно (рис.146) гиперактивированные ПЯЛ ха-жтеризуются образованием нитевидных псевдоподий и обширных непра-1льной формы мешковидных фагосом, иногда с разрушением их мембран, входом содержимого гранул непосредственно в цитоплазму с развитием шгового цитолиза. Появляются вакуоли, не содержащие объект фагоцито-1, которые очевидно лишены функционального значения и являются прояв-знием сверхактивации мембран, возникает значительное количество ли-1дных включений в цитоплазме - как свидетельство деградации гликоли-!дов мембран клетки: ухудшаются процессы переваривания микробов в те-гние 120 минут. Гиперактивация ПЯЛ, связанная с возникновением сверх-зюокой текучести мембран, отражает нарушение внутриклеточных регулярных механизмов фагоцитоза, приводит к неэкономному расходованию зктерицидного потенциала клетки, снижению ее функциональной активнос-(I. и, по нашему мнению, способности обусловливать аутоагрессивность ЯЛ как по отношению к самим себе, так и окружающим их клеткам и тка-ям.

Обнаруженные нами морфо-функциональные изменения ПЯЛ согласуются многочисленными литературными данными(полученными в экспериментах in i tro и in vivo) о способности ЛПС воздействовать на функциональные озможности ПЯЛ и, порой, их извращать.

Многочисленные литературные и собственные данные морфологических сследований экспериментального(эндотоксиновый шок на кроликах) и сек-ионного (перитонит и др.) материала подтверждают выдвинутую нами кон-епцию участия ЛПС-позитивных ПЯЛ в патогенезе эндотоксин-индуцирован-ой патологии.

Исследования легочной ткани кролика обнаружили, что уже спустя 30 инут после инфузии ЛПС количество ПЯЛ в микрососудах значительно уве-

личивается, большинство гранулоцитов, находящихся в маргинальном со тоянии, ЛПС-позитивны. при этом отмечается незначительный отек интер тиция. Выраженность последнего значительно возрастает к 1 часу иссл дования, когда обнаруживаются признаки повреждения эндотелия (набух ние его, десквамация), петехиальные кровоизлияния, периваскулярн отек, что происходит на фоне нарастания явлений маргинального лейко таза и появления ЛПС-позитивных ПЯЛ в интерстиции. К 5 часу наблюден секвестрация ПЯЛ в микрососудах легких достигает своего максимум десквамация эндотелия наиболее выражена, нарастают явления периваск лярного и интерстициального отека, увеличивается количество интерст циальных ПЯЛ. Единичные ЛПС-позитивные ПЯЛ появляются в просвете ал веол и мелких бронхов, выявляются признаки повреждения пневмоцитов явления дистелектазов, носящие очаговый характер. Эти изменения нара тают к 10 часу наблюдения и достигают своего максимума к концу перв суток исследования. Часть маргинальных и интерстициальных ЛПС-позити ных ПЯЛ имеют признаки повреждения. Резкий отек интерстиция, перива кулярных пространств и паренхимы сочетается с петехиальными кровоизл яниями и наличием в альвеолярных пространствах ЛПС-позитивных ПЯЛ альвеолярных макрофагов (АМ). Отмечаются повреждения пневмоцитов прогрессирование дистелектазов. Таким образом, выведение ЛПС из легк (и организма) реализуется системой ПЯЛ, которая играет важную роль и повреждении легочной ткани. В связи с этим приобретает важное значен определение роли АМ в механизме осуществления дренажной функции легк при СЭЕ. тем более, что и ЛПС-активированные макрофаги могут быть ва ным фактором повреждения органа.

Взаимодействие ЛПС-позитивных ПЯЛ с альвеолярными макрофага (АМ) изучалось в исследованиях ш уШ'о. АМ выделялись из бронхоальв олярного лаважа с последующей очисткой в смеси фиколл-верографин, ПЯЛ - из цельной стабилизированной крови того же кролика, отстаива шейся при комнатной температур)3 в течение 1 часа. Затем клетки инкуб ровали в растворе Хенкса (рН=7,4), жизнеспособность их оценивалась эксклюзии метиленового зеленого и составляла не менее 90%. Выделенн ПЯЛ в количестве 8 •106 инкубировали с раствором ЛПС(2 мг/мл) в теч ние 1 часа при 37°С (жизнеспособность клеток не снижалась), трижды о мывали путем центрифугирования в растворе Хенкса, а затем инкубирова со взвесью АМ в количестве 4 ■106 1 час при 37°С (1 серия). Три друг серии эксперимента были контрольными: 2)АМ инкубировали с неактивир ванными ЛПС ПЯЛ; 3)АМ инкубировали с раствором Хенкса; 4)АМ инкубир вали 1 час с различными растворами ЛПС (от 0,0005 до 5,0 мг/мл), -целью определения токсичных для АМ доз ЛПС. Соответственно приготавл: вали в каждом случае по три мазка, которые исследовались методом люм: несцирующих антител к Ие-гликолипиду, с последующей верификацией кл> ток по Май - Грюнвальду, а в 4 серии определялась жизнеспособность по эксклюзии метиленового синего. Для блокировки свободных Ес-фрагме: тов клеток перед инкубацией с люминесцирующими антителами использов. лась баранья сыворотка. Для исключения аутолюминесценции отобранш поля предварительно исследовались.

В 1 серии иммуноморфологическое исследование обнаружили налич

Z в 80% AM. тогда как во 2 и 3 сериях он определяется лишь в 5% AM. ППС-позитивных AM 1 серии обнаружена значительная вакуолизация ци-глазмы. точечные просветления в ядре и увеличение ворсинчатости кле-чной мембраны. Часть ЛПС-позитивных ПЯЛ, поглощается видимо AM цели-ч. Последнее представляется весьма важным фактором, поскольку чувс-,ггельность AM к ЛПС значительно выше, чем у ПЯЛ (при инкубации с 0.5 /мл ЛПС жизнеспособны только 50% AM при 0.05 мг/мл - 70% AM), а ги-пь AM может быть фактором повреждения легких. Кроме того, полученные чные свидетельствуют о возможности передачи ЛПС от ПЯЛ к AM и/или гоцитозе AM ПЯЛ.

Определенную роль AM играют в механизмах развития ОРДС. т.к. ^-активированные AM. освобождая супероксидные радикалы и протеолити-зкие ферменты, повреждают близлежащие эпителиальные клетки, неколла--ювые компоненты базальной мембраны (фибронектин) и способствуют от-кению фибрина в альвеолах (Show R. et al.1982). что обнаруживалось и м в экспериментах на кроликах. N.Freudenberg и соавт.(1984) в экс-эиментах на крысах отмечали поразительную взаимосвязь между появле-гм ЛПС-позитивных AM и повреждением легочной ткани. В этой связи здставляются весьма интересными обнаруженные нами факты наличия эн-гоксинпозитивных AM и ПЯЛ в альвеолах, альвеолярных перегородках и онхах умерших (рис.15). Участие AM в выведении ЛПС из организма, их эсобность фагоцитировать ЛПС-положительные ПЯЛ. обнаруженная In vit. могут быть причиной гибели AM и повреждения прилежащих паренхима-зных элементов. В то же время наличие 5-10% ЛПС-положительных AM в онхоальвеолярном лаваже интактных кроликов может быть свидетельством щиты органа от ингалируемого ЛПС и (или) выведения его из организма норме.

Об участии гранулоцитов в патогенезе эндотоксин-индуцированного вреждения легких(в том числе ОРДС) свидетельствуют и многочисленные тературные данные. Доза внутривенно введенных ЛПС прямо пропорцио-льна увеличению выделения ПЯЛ из легких^.Rinaldo.J.Dauber 1985). золютное число ПЯЛ в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) значительно зрастает к 24 и 48 ч после введения ЛПС крысам в кровь. Однако при зтиляции анестетиков или просто интубации, несмотря на то что ПЯЛ цвергаются агрегации в сосудах микроциркуляции легких после введения С. активированные ПЯЛ не мигрируют из капиллярного русла в воздушные эстранства (J.Chang. М.Lesser 1984). Эти данные представляют чрезвы-йно большой интерес, если их сопоставить с результатами исследований Rinaldo и J.Dauber (1985). которые сравнили выживаемость крыс и ин-г!сивность нейтрофильного альвеолита. развивающегося после интрапери-4еального введения ЛПС. при дыхании обычным воздухом, содержащим ки-чную палочку, и 60% кислородной смесью. Оказалось, что дыхание гипе-гссичной смесью уменьшало явления нейтрофильного альвеолита, но повы-по(!) летальность в группе экспериментальных животных.

Рис.15. Легкие ребенка, умершего на 3-й сутки от аспирацион пневмонии, осложнившиеся кровоизлияниями в надпочечни ЛПС-ТЕСТ-ИФА. а участок альвеолы с расположенными на стенке ЛПС-по тивными АИ. хЗОО; б - то же поле зрения. х800; в - участок альвеол ЛПС-позитивными ПЯЛ. прокрашивание стенки бронхиолы. хЗОО: г - ко роль. То же поле зрения, что на рис.15в. хЗОО; д - то же поле зрен что на рис.15в. х500; е - контроль. То же поле зрения, что на рис.1 хЗОО; ж - фрагмент слизистой бронха, специфическое окрашивание эпи лия. хЗОО; з - контроль. То же поле зрения, что на рис.15ж. х400.

Таким образом, допустимо '-делать заключение о том, что выведе ЛПС через легкие из организма сопровождается развитием нейтрофильн альвеолита и тяжелыми структурными повреждениями ткани легких, раз

(ем ОРДС. Приведенные данные позволили нам предположить, что ведущей >анспортной единицей, осуществляющей вывод ЛПС из крови через легкие, ¡ляется ПЯЛ. В связи с этим представляется целесообразным кратко юкрыть возможное участие ПЯЛ в патогенезе ОРДС. Известно, что пред-фительное истощение системы ПЯЛ в эксперименте не снимает легочную [пертензию, но значительно уменьшает повреждение легких, особенно в |3дней фазе повышения сосудистой проницаемости, и имеются морфологи-:ские и биохимические данные, свидетельствующие об участии ПЯЛ в поведении эндотелиальных клеток. В частности. Е. Warble (1980) считает, 'о секвестрация ПЯЛ с их Фрагментацией и высвобождением ферментов условливает повреждение эндотелия капилляров и увеличение их прони-1емости. Обнаружена положительная корреляция между аккумуляцией ЛПС в тких. секвестрацией ПЯЛ и ппд^-мем урнпня кислой фосфатазы в плазме юви (M.Ganu'tt еt al. r.«m Изыч-тп, что при контакте с достаточно 'Льшим количеством ЛИС п:-, ПИЛ ги.т.иПиждаютея такие биологически ак-вные агенты, как щютензн, лизосомалыше ферменты и радикалы кисло-да, которые могут пор,рождать мембрану эндотелиальных клеток и спо-'бствовать повышению проницаемости (Wong G. et, al. 1985).

ПЯЛ могут участвовать в патогенезе ОРДС через кининовую систему, содружественно патогенный эффект комплемента и ЛПС можно представить виде следующей цепочки: ЛПС-обусловленное (с помощью прямого протео-гического распада нативной С5-фракции комплемента) образование пеп-дов - повышение адгезивности ПЯЛ и их маргинации - повреждение эндо-лия микрососудов обусловленное пептидом, содержащимся в С5 и ПЯЛ. этому вполне логично допустить, что эндотоксинобусловленное повреж-ние легких при ОРДС является одновременно ПЯЛ-зависимым.

Таким образом, правомочно заключить, что гранулоциты передают он-токсин альвеолярным макрофагам "с рук на руки" не только ценой своей зни, но и ценой повреждения ткани легких с развитием ОРДС.

Такие же повреждения гиперайтивированные лейкоциты, несущие эндо-ксин. могут вызывать и в других органах.

В настоящее время известны несколько видов взаимодействия ЛПС с Л и макрофагами (Lynn W.A., D. Т. Gollenbook. 1992): а) ЛПС связывает-с рецепторным белком СД18, причем такое связывание не является не-ходимым для активации гранулоцитов; б) ЛПС связывается сначала с лком LBP плазмы, а затем в комплексе с этим белком реагирует с ре-птором СД14. что ведет к активации лейкоцитов; в) неспецифическое аимодействие ЛПС с мембранами клеток. К этому следует добавить также исанное в нашей работе Fc-завиеимое связывание ЛПС клетками.армиро-нными антиэндотоксиновыми антителами. Вклад этих видов связывания в отективную и патогенетическую роли гранулоцитов пока еще не изучен, -видимому, исход взаимодействия ЛПС с лейкоцитами и свойства ПЯЛ, дуцированные ЛПС, зависят от концентрации эндотоксина; при относи-льно низких концентрациях имеет место активация и положительный (Фи-ологический) эффект, при высоких концентрациях - гиперактивация, пе-грузка лейкоцитов и патологический эффект (развитие органопатоло-и).

3.7. Эндотоксин и сердечно-сосудистая патология.

Первые данные о возможности участия эндотоксина в сердечно-со( диетой патологии мы получили еще в 1987 г. С помощью ЛПС-ТЕСТа I кардиогенном шоке в системном кровотоке были впервые обнаружены эш токсин-перегруженные гранулоциты. Объяснили мы этот факт повышен} поступлением кишечного ЛПС и развитием портальной гипертензии [ следствие системной и локальной недостаточности кровообращения. Исх( из этого нам представилось интересным более подробное рассмотре! этой проблемы в эксперименте.

Наиболее приближенной к клинике моделью кардиогенного шока явJ ется генерализованный феномен Шварцмана(ГФШ), который моделировался 140 кроликах породы "шиншилла" путем двукратной(с интервалом в 24 1 са) внутривенной инъекции ЛПС.

3.7.1. Морфологические изменения в органах при генерализованно) феномене Шварцмана

Обнаруженные нами паталогоанатомические изменения во внутреш органах(легкие, печень, почки, селезенка, тимус, надпочечники, киик ник) соответствовали хорошо известной, ставшей уже классической, Кс тине повреждения органов и тканей при генерализованном феномене Шва[ мана. Наряду с многочисленными проявлениями дистрофических и дecмoJ тических процессов(в ранней фазе ГФШ) в паренхиме и строме обращал себя внимание, на наш взгляд, наиболее патогномоничный для СЭЕ симп" системного маргинального лейкостаза (СМЛ) в венулярном отделе внутр( них органов, который во времени предшествовал альтеративным изменеш эндотелиальных клеток. В отличии от билатерального некронефроза' данным Б.А.Саакова и соавт., являющегося облигатным признаком ГФ1! который встречался крайне редко(в 10% наблюдений), СМЛ является ат[ бутом изучаемой патологии. Наиболее интересными (и новыми) пpeдcтaвJ ются результаты исследования м:юкарда.

3.7.2. Эндотоксин-индуцированное повреждение сократительного г парата кардиомиоцитов.

Анализ клинических исследований последних лет позволяют констап ровать наличие сердечной недостаточности уже в ранней фазе клиники и квалифицировать ее как фактор, лимитирующий жизнеспособность пацие та в более поздний период развития патологического процесса. Вместе тем. проведенные нами совместно с Д.Ш.Еналеевой (1979) исследованм эксперименте на кроликах показали, что сердечной недостаточности I ЭШ предшествует мобилизация резервной силы сократимости миокарда.

Морфо-гистохимические исследования миокарда кролика в динамике идентифицировали морфологический субстрат как усиления сократительд функции сердечной мышцы, так и сердечной недостаточности.

Гистоэнзиматически на ранних сроках обнаруживалось значительь повышение активности ферментов энергетического (СДГ.НАД) и пластиче кого обменов (Гл-6-ФДГ, НАДФ, ГДГ) в субэндокардиальном.слое и тод миокарда. Вместе с тем, уже в эти сроки наблюдения появлялись оче внутриклеточного миоцитолизиса. В динамике развития ЭШ количество кд

с этим видом повреждения миофибриллярного аппарата прогрессивно астало (рис.16 а). В случаях тяжелого течения патологического проса (погибшие животные) определялись кардиомиоциты. практически ли-ные миофибрилл (рис.16 б) вплоть до появления очагов колликвацион-о некроза (рис. 16 в). Вместе с тем, уже в первые часы развития ЗШ аллельно с нарастанием мпофибриллолизиса определялись единичные диомиоциты (забитые животные) с морфологическими признаками репара-ного процесса (рис.16 г).

Рис. N 16. Преобладающий вид морфологических изменений в субэндо-диальном отделе левого желудочка сердца в динамике развития ЭШ: а ожественные очаги внутриклеточного миоцитолизиса. Съемка в поляри-анном свете, х 250; б - обширный очаг миофибриллолизиса. "Пустые тки". Окраска гематоксилин и эозином, х 630. в - обширный очаг вы-.ающего некроза. Окраска гематоксилин и эозином, х 84. г - регенера-очагового внутриклеточного миоцитолизиса - появление анизотропной станции, приобретающей поперечную исчерченность. Съемка в поляризо-ном свете, х 630.

Ведущим типом повреждения сократительного аппарата кардиомиоцитов эндокардиального слоя сердечной мышцы являлся очаговый миоцитоли-, начинающийся с перинуклеарной зоны, который развивался на фоне ышенной активности ферментов пластического и энергетического обме-что позволило нам квалифицировать данный процесс как морфологичес-эквивалент относительной пластической недостаточности этого наибо-функционально отягощенного отдела миокарда. При тяжелом течении ЭШ гибшее животное) или на 5-8-е сутки развития патологического проса очаговой миоцитолизис кардиомиоцитов внутреннего слоя миокарда распространяться практически на всю клетку. Однотипный процесс нно в субэндокардиальном отделе сердечной мышцы обнаружен А.М.Витом и соавт. (1986) у внезапно умерших людей.

Коэффициент повреждения субэндокардиального слоя миокарда в зави-ости от тяжести течения ЭШ и представлен в табл. 14.

КОЭФФИЦИЕНТ ПОВРЕЖДЕНИЯ СЕРДЕЧНОЙ МЫШЦЫ ПРИ ГФ1И.

Таблица 14

Серия

опытов

Погибшие животные

наружный слой пн

внутренним слой вп

Забитые животные

наружный слои зн

внутренний слой зв

II

III

IV

54,9 - 1,4

Р1 пн- 1 ЗН <0,001 р

Ргпн- 1 ПН >0, 05 р

ПН - 53Н <0,001 р

пн - 4ПН <0,001

52, 3 - 1,76

Ргпн- 2 зн <0.001 р

Ргпн - 5зн >0, 001 р

Ргпн- 4 п н <0,001 р

19,5 - 0,7

Р4ПН-4 3 н05 Р4пн-5зн<0.001

34, пв-

1 п в - 4 и в

6 - 1,4

5зв<0.001 гпв<0.01

>0,05

28. "2 п в -Зг пв -32пв-

5 - 1.2 гзв<0.02 5зв<0.001 4ПВ>0.02

34, 2-1,6 Р4пв-43о<0. 001 Р4пв-5зв<0.001

20,0 ЗМ - 2 ЗМ

зм-3 зм зм-4 зм Р13М-5 ЗМ

20, 8

Ргзн-з з и Рг зн-4 з н Рг зн -5з н

21,3 -

Р3 ЗН-43 н Р3 зн - 5з н 21,7 -

Р4 з н - 5 з н

- 2,0 >0, 05 >0, 05 >0, 05 <0,001 -0,8 >0.05 >0,05 >0.001 1.57 >0,05 >0,001 1.1 <0,001

0,4 - 0,35 Контроль

24,4 - 0,9 Ргзв- ззв 02

Р2зв-4зв<0.00 Р2зв-5зв<0.00

20.4 - 1,2 Рззв - 4 зв 02

Р3зв-5зв<0.00

17,2 -0,5

Р4зв-5зв<0.00

2,5 - 0.3 Контроль

V

Статистически значимые различия коэффициентов повреждения в] реннего слоя миокарда погибших и забитых животных свидетельству! том, что коэффициент повреждения субэндокардиального слоя серде1 мышцы более 30 является критическим для жизнеспособности организма.

Таким образом, в субэндокардиальном слое миокарда происходит < еобразная поляризация биологических процессов, и, если в группе з; тых животных она идет по пути усиления (адекватного) синтетиче< процессов, то в группе погибших животных - миофибриллолитических, < детельствующих о пластической(а значит и сократительной) недоста' ности сердечной мышцы.

Ведущим, если не единственным, типом повреждения сократителы аппарата субэпикардиального отдела миокарда является контракту; тип,а в целом морфологическая картина практически идентична реперф; онной(различные виды контрактурного повреждения, глыбчатый распад, лаксация миофибрил), что наряду с наличием в этом слое спазмирова( артерий и следов перенесенной аноксии в виде плазматического прога вания стенок, навело нас на мысль об участии транзиторного корона]: пазма (т. к.тромбоз артерий нами не наблюдался ни в одном случае) в тогенезе этого повреждения. В патогенезе транзиторного коронароспг (ТКС) могут принимать участие два фактора: гиперкатехоламинемия (I-венным подтверждением которой является обнаруженное нами значитель

¡ышение активности моноамнооксидазы) и обнаруженная нами неспособ-:ть кардиомиоцитов наружного слоя отвечать на нее повышением актив-:ти ферментов(сохраняется линейная форма отложения формазана) аэроб-по метаболизма. Только в этой ситуации наступает своеобразный "пара-1" метаболического механизма отмены катехоламин-обусловленной вазо-ютрикции. Кроме того, у погибших животных в наружном слое определя-:ь субсегментарные контрактуры, являющиеся патогномоничными для пе-¡есенной фибрилляции желудочков, причиной которой может быть репер-!ия.В этой связи весьма интересными представляются клинические наб-(ения F.Thomas с соавт. (1986), которые обнаружили у больных ЭШ ха-стерные для инфаркта миокарда электро- и эхокардиографические изме-[ия. ТКС в условиях ЭШ может иметь и определенное адаптивное значе-: - перераспределять коронарный кровоток в сторону наиболее функцио-1ьно отягощенных (активных) оубэндокардиальных отделов миокарда в ;рб наружным вплоть до "самоампутации" субэпикарда. Об этом прямо [детельствуют соотношения коэффициентов повреждения наружного и гтреннего слоев миокарда в зависимости от тяжести течения шокового щесса (табл.14). Статистически достоверное снижение коэффициента феждения наружного слоя миокарда погибших животных сопровождается ■личением количества поврежденных клеток внутреннего слоя сердечной щы, тогда как у выживших отмечается обратная тенденция, что подт->ждает наше предположение о том, что явление, называемое нами фено-юм централизации кровообращения в сердечной мышце, является адап-!ным по своему характеру.

Полученные данные обусловили необходимость проведения дополни-^ных исследований в части определения возможности развития инфаркта жарда на базе ТКС.

Для этой цели нами была разработана методика, позволяющая модели-¡ать ТКС с достаточной атравматичностью и возможностью постоянного [троля за объемом кровотока в коронарных артериях дистальнее места :люзии.

Опыты проводили на 12 кроликах-самцах породы шиншилла массой >-4 кг., которые составили 3 группы исследования. Все манипуляции на ютных производили под гексеналовым наркозом в условиях искусствен-[ вентиляции легких атмосферным воздухом. В I (контрольную) серию 1TOB было взято 3 животных, которым производили ложную операцию без во II - 3 кролика, трижды перенесших коронароспазм (КС) длитель-:тью 1 мин с интервалами между ними 5 мин., в III - 6 животных, ¡жды перенесших 5-минутный КС с реперфузионным периодом 5 мин. Все ютные на протяжении 2 ч находились под непрерывным электрокардиог-шческим контролем.

В миокарде животных контрольной группы 14-17% кардиомиоцитов наелось в состоянии контрактупных изменений, заключавшихся в повышен: анизотропии,уменьшении и 1ичезновении 1-дисков(рис.17 а). Практики идентичная картина наблюдалась в интактной зоне миокарда кроли-; II и III серий опытов. На электрокардиограмме (ЭКГ) животных I се: отмечалась незначительная тахикардия.

Во II серии эксперимента уже после первого КС регистриров. незначительный подъем сегмента БТ. который к моменту второго КС < жался, но не достигал исходного уровня. Во время второго КС сегмен' поднимался и практически не изменялся в реперфузионном периоде. I больший подъем этого сегмента происходил во время третьего КС, к появлялись и пароксизмы тахикардии; в реперфузионном периоде восстанавливался, сегмент БТ снижался (но не достигал изначаль: уровня), стабилизировался к 20-й минуте реперфузии и оставался н менным до завершения исследования. Для ишемизированной зоны миок, данной серии эксперимента характерны уменьшение 1-дисков в большин кардиомиоцитов, контрактурные изменения миофибрилл, обнаруживавшие

Рис.17. Контрактурные изменения миокарда при транзиторном кор роспазме(съемка в поляризованном свете):а-контроль: повышенная ани ропия А-дисков;уменьшение I-дисков и их отсутствие,х 800;б-интак миокард погибшего животного (111 серия опыта): субсегментарные контра ры(светлые полоски),х700;в - миокард бассейна спазмируемой корона артерии: первично-глыбчатый распад,необратимые контрактурные повре: ния, сохранившиеся кардиомиоциты, х 300.

21-24% сократительных клеток, и единичные клетки с первично-г чатым распадом. Таким образом, даже непродолжительный по времени (модель кратковременного стенокардического приступа) может быть пр ной развития мелкоочагового кардиосклероза, а позже и гипертрофии, варианта структурной (пластической) адаптации к утраченной струк но-функциональной единице.

В III серии опытов наблюдалась несколько иная морфологическ ЭКГ-картина. Нарушения ритма носили прогрессирующий характер, уху лась проводимость, в одном случае животное погибло от фибрилляции лудочков (рис. 17 б). Снижения сегмента ST не наблюдалось ни в о из реперфузионных периодов, а подъем его нарастал от КС к КС. Б того, на протяжении всего 1,5-часового периода реперфузии вплоть

вершения эксперимента высота сегмента практически не снижалась. В не ишемии миокарда в этой серии опытов в большинстве сократительных юток определялись контрактурные изменения, носившие необратимый ха-ктер в 35-50% случаев (рис.17 в). Группы кардиомиоцитов с первич-'-глыбчатым распадом и необратимой контрактурой, для которой характе-н единый анизотропный конгломерат, распределялись по срезу миокарда «имущественно мозаично. Таким образом, данный вариант ТКС может слу-ть моделью для индуцирования мелкоочагового инфаркта миокарда или 'оль часто встречающейся острой коронарной недостаточности.

Обнаруженные контрактурные повреждения миофибриллярного аппарата идетельствуют о нарушении функции кардиомиоцитов. По-видимому, в ге-зе нарушения функции сарколеммы принимают участие метаболиты арахи-новой кислоты и эндоперекиси, поскольку способность ишемии активиро-ть фосфолипазу А2 хорошо известна, а реализация патогенного эффекта ой активации возможна лишь при наличии кислорода, т. е.реперфузии.

Таким образом, в субэпикардиальном слое миокарда при эксперимен-льном ЭШ ведущим типом повреждения является контрактурный. одной из ичин развития которого может являться транзиторный коронароспазм. жащий в основе феномена централизации кровообращения в сердечной :шце. Следовательно, одной из возможных причин развития ишемического вреждения миокарда (и его инфаркта) может быть транзиторный корона-спазм.

Кроме того, определенная роль в патогенезе повреждения миокарда и ЭШ может принадлежать ПЯЛ. К сожалению, до настоящего времени мно-численные факты развития лейкостазов и инфильтрации ПЯЛ стромальных паренхиматозных структур миокарда при различных патологических про-ссах оценивались лишь как реактивный (в ответ на повреждение) про-сс резорбции разрушенных структур или как процесс, направленный на ичтожение и элиминацию чужеродных антигенов бактериального происхож-ния. При ЭШ феномен лейкостаза определялся преимущественно в вену-рном отделе сосудистого ложа сердечной мышцы кроликов, погибших че-з 0.5-1.5 ч после повторного внутривенного введения ЛПС (рис. 18 а), раллельно с этим происходило набухание эндотелиальных клеток и деэн-телизация (рис.18 б), которые, как нам представляется, может быть язано с продукцией активированными эндотоксином ПЯЛ различных токси-ских субстанций. Лейкостаз нарастал в течение 1-х суток следования и прямо коррелировал с прогрессированием деструктивных оцессов в различных структурных компонентах сосудистой стенки, что гласуется с данными C.Dahinden и соавт.(1990), обнаружившими сниже-е миграционной способности активированных эндотоксином ПЯЛ при зна-тельной активации в них метаболических процессов и гиперадгезивнос-

Этот факт особенно интересен в связи с данными о том. что рецеп-рная регуляция выхода ПЯЛ локализована в эндотелиальных клетках сткапиллярных венул. Вполне возможно, что именно поэтому, равно как благодаря нарушению анатомической целостности стенки венул. марги-льные ПЯЛ выходят за пределы сосуда через 1 сутки после введения

Рис 18. Гранулоцит-индуцированное повреждение сосудистой стеш кардиомиоцитов: а - агрегация и пристеночное стояние ПЯЛ в венуле. 800; б - десквамация эндотелиальных клеток, х 800; в - деструктш изменения стенки сосуда и прилежащего к нему миокарда, скопления I х 300. а,б,в, - окраска гематоксилин и эозином.

эндотоксина, т.е. тогда, когда феномен деэндотелизации наиболее В1 жен. И. пожалуй, наиболее интересным представляется нам то, что пр) жащие к деструктивно измененным венулам и зонам лейкодиапедеза кар^ миоциты находятся в состоянии контрактурного повреждения{рис.18 Возможно, мы имеем здесь дело с прямым повреждающим действием акп рованных эндотоксином ПЯЛ на сарколемму кардиомиоцита. К такому вы! мы пришли на основании результатов комбинированного метода исслед! ния: поляризационной микроскопии, позволяющей дифференцировать обр; мые и необратимые виды контрактурного повреждения сократительного парата, и разработанного нами способа идентификации активированных дотоксином ПЯЛ.

По сути поставленная проблема гораздо шире выяснения роли опо! дованного ПЯЛ повреждающего миокард действия эндотоксина при ЭШ, ] кольку эти же механизмы могут иметь значение в патогенезе рецидиви] щего инфаркта миокарда, алкогольной кардиомиопатии и идиопатичес] миокардита.

Таким образом, представляется возможным заключить, что серде1 недостаточность является облигатным компонентом ЭШ. Структурная ос] сердечной недостаточности при ЭШ неспецифична и включает в себя I фибриллолитические и контрактурные повреждения кардиомиоцитов в с тании с диапедезом ПЯЛ в зонах повреждения. Одним из наиболее перс: тивных направлений изучения патогенеза сердечной недостаточности я ется выяснение роли эндотоксин-гиперактивированных гранулоцитов в ханизме повреждения стромальнмх и паренхиматозных структур сердц помощью комбинированного метода поляризационно-иммуноферментной : роскоши.

Эндотоксин оказывал выраженное действие также и на эндотелий. Аль-эативные изменения эндотелиальных клеток и их десквамация наблюдает-уже в первые часы развития экспериментальной СЭЕ. В патогенезе поведения сосудистого эндотелия по-мимо ЛПС-перегруженных ПЯЛ может снимать участие непосредственно сам ЛПС или опосредовано через раз-чные гуморальные факторы (комплемент и др. ) при самых разнообразных :тремальных состояниях, сопровождающихся СЭЕ. Вместе с тем, эта спо-Эность эндотоксина может быть и атерогенным фактором. В частности, ^еэопеп и соавт.(1981) считают повреждение эндотелия главным факто-* развития атеросклероза. В этой связи представляется весьма интемными обнаруженный нами факты пролиферации эндотелиальных клеток(уже третьи сутки развития ЭШ) миокарда кролика и процессы новообразова-д сосудов уже на шестые сутки исследования. Кроме того, ряд авторов лтают, что ЛПС способен стимулировать пролиферацию и гладкомышечных эток.Наши наблюдения находится в соответствии с известной способ-:тью ЛПС активировать протеинкиназу С. которая является ключевым эментом снимающим репрессию с генома, тем самым запускающим пролифе-гивный процесс. Более того, результаты исследований Ие1бу М. и ^игагЬг Б. (1983) обнаружили, что дефекты эндотелиальной выстилки рты кролика размерами в 1-2 клетки способны "закрываться" уже через часов после внутривенной инъекции ЛПС. Способность эндотоксина обус-зливать как повреждения, так и пролиферацию эндотелиальных клеток Яствительно может играть не последнюю роль в патогенезе атеросклеро-

Представления о возможном участии ЛПС в патогенезе атеросклероза, зусловно. требуют пристального внимания и изучения.

3.8. Поиск веществ с антиэндотоксин-модулирующей активностью

В последние годы характеризуются активным поиском веществ с анти-етериальной и противошоковой активностью. Успехи в этом направлении столь уж впечатлительны, поэтому дальнейшие исследования в этой об-зти имеют огромную практическую значимость. В принципе, препараты гиэндотоксинового действия должны отвечать следующим требованиям: мсительная простота синтеза и доступность сырьевой базы, водораст-эимость, термостойкость, достаточно высокая активность в относитель-низких дозах, безвредность. К этому необходимо еще добавить обязанное наличие доступной и адекватной модели для оценки биологическо-действия вещества.

Таблица 15.

ДЕЙСТВИЕ ПРОИЗВОДНЫХ АЛЬФА-ИМИДАЗОЛИЛАЛКИЛСУЛЬФОНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ЭНДОТОКСИНОВОМ ШОКЕ У МЫШЕЙ

1 1 СОЕДИНЕНИЕ МТД МГ/КГ Кол-во введенного в-ва мг/кг Летальность % 1 Эффектов- 1 ность 1

№ - С СН3 0 II \ 1 1

11 И-С-Б—ОН II /II |с-С СН3 0 600 15 41 1-4 кратный! защитный | эффект 1

— С СгН5 0 II \ 1 1

11 N-0-Э-ОН II /II 1С - С С2Н5 0 500 12,5 8 3,5 кратный| защитный | эффект 1

1Преднизолон-базовый 1 объект 30 30 41 1,4 кратный 1 защитный | эффект 1

1 Контроль 1 58 I I

Анализ, проведенный совестно с д.х.н. профессором Б.Е.Иванов! кандидатом химических наук В.Б.Ивановым, позволил предположить, ожидаемая нами биологическая активность может быть у некоторых пр< водных сульфоновой кислоты. Для проверки этого предположения были < тезированы производные альфа-имидазолилалкилсульфоновой кислоты. : из них была изучена биологическая активность на модели эндотоксино! шока у белых мышей при введении ЛПС в дозе Ц)50. При этой дозе на! далась клиническая (кратковременное двигательное возбуждение, сме! мое коматозным состоянием) и морфологическая картина, свойственная бому шоковому процессу.

Для каждого изученного соединения была определена минимал£ токсическая доза (МТД). При изучении антиэндотоксиновой активности щества вводили внутривенно в дозе 1/40 МТД через 30 минут после вв( ния ЛПС в дозе ЬО50. Для сравнения контрольной группе животных вво; преднизолон в дозе 30 мг/кг. Из 12 веществ было отобрано 2. коте давали или более высокий (соединение 111350) или такой же (соедини N1273) эффект как преднизолон (табл.15).

На модели агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ или адрене ном, показано также, что пррпараты обладают более или менее выраже! анти- и дезагрегирующей активностью.

Позднее в исследованиях А. М.Девятаева была показана способнс

[х веществ увеличивать силу скелетных мышц. Поздеев O.K. обнаружил у \ ¡парата N 1273 наличие иммуностимулирующего эффекта. Наиболее полно 1ество N1273 было изучено Н.Н.Камбургом. который показал, что оно гадает выраженным Н-холинолигическим действием, дает центральный ад-юлитический, ГАМК-литический и противовоспалительный эффект, обла-;т антиоксидантной. иммуностимулирующей активностью, ингибирует син-! холестерина, увеличивает скоростную выносливость, увеличивает про-шительность гексеналового сна и. наконец, обладает антиатеросклеро-1еской активностью.

Сочетание антиатеросклеротических и антиэндотоксин-шоковых свойс-препарата N1273 вызывает особый интерес, так как не исключено, что ютоксин может инициировать и способствовать развитию атеросклероза.

4. Заключение

Разработанные новые способы диагностики СЗЕ (МИКРО-ЛАЛ-ТЕСТ. I-TECT,ЛПС-ТЕСТ-ИФА) и оценки состояния антиэндотоксинового иммуни-га(ТИА-АНТИЗНДОТОКС, СОИС-ИФА) позволили получить ряд новых и прин-шально важных данных о роли эндотоксина в физиологии и патологии ювека. Прежде всего, речь идет о том, что в физиологических услови-практически у всех здоровых людей имеет место так называемая физио-"ическая СЭЕ. При этом эндотоксин обнаруживается в плазме и на ложности ПЯЛ. Из этого следует несколько заключений и. прежде всего.

что эндотоксин проникает в системный кровоток значительно чаще, 1 это было принято считать ранее. Проникая в системный кровоток здо-$ых людей, в оптимальном достижении физиологического эффекта кон-[трации, ЛПС участвует, по-видимому, в реакциях иммунной защиты за ?т, как минимум, трех ключевых механизмов: активации ограниченного ia ПЯЛ, индукции синтеза важнейших медиаторов и цитокинов пептидной [роды и умеренной поликолональной активации В-лимфоцитов. Разумеет-

при этом неисключены и другие механизмы участия элиминированных в ;темный кровоток (или адсорбированных на клеточных структурах) ПЯЛ. 1юбом случае не исключено, что присутствие в крови ограниченной порции ПЯЛ "вооруженных" (армированных) антителами для связывания ЛПС 1 помощи Ес-зависимого механизма, приводит в действие те эволюционно терминированные защитные эндотоксинсвязывающие механизмы, отсутствие горых приводит к острым воспалительным и другим заболевниям.

По содержанию ПЯЛ. связавших ЛПС в организме обследуемого, а так-лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин, можно суть о состоянии антиэндотоксинового иммунитета и резистентности оргазма в целом. Информацию об этом дает также наличие антиэндотоксино-i антител к ЛПС 014, несущему общий антиген энтеробактерий. Низкое держание антиэндотоксиновых антител и угнетенная активность Fc-зави-дого связывания характерны для патологических процессов. Из этого здует, что клеточные и гуморальные факторы антиэндотоксинового имму-гета. их активное (полноценное) функционирование весьма необходимы i поддержания гомеостаза. С другой стороны, полученные данные свиде-чьствуют о вовлечении ЛПС в механизмы развития ряда патологических )цессов(как инфекционного, так и неинфекционного генеза). На это

указывают не только результаты, документирующие низкую активность дотоксинсвязывающих систем, но и повышенное содержание ЛПС в пла крови и/или на гранулоцитах в поврежденных органах и тканях. Име ЛПС-перегруженные ПЯЛ играют важную роль в развитии органопатолог Все это позволяет сделать заключение о том. что эндотоксин являе мощным общепатологическим фактором, индуцирующим развитие (и/ участвующим в развитии) целого ряда патологических процессов в разл ных органах и тканях. При этом речь, конечно, идет об эндотоксинах шечной микрофлоры, мощным резервуаром которой является толстая кишк

В современных условиях все чаще возникают различные стрессо ситуации, наблюдается практически повсеместное ухудшение экологичес го макро- и микроокружения, а также усиливается вредное возденет различных Физических и химических факторов, вследствие чего создаю условия для массивного проникновения эндотоксина в системный кровот Повторяющиеся (повторные) эндотоксиновые атаки могут лежать в осн развития иммунодефицитных состояний, иммунопатологии и. по всей ве ятности, атеросклероза или способствовать его развитию.

В заключение, следует подчеркнуть, что изучение роли эндотокс в физиологии и патологии человека заслуживает, на наш взгляд, серь ного внимания специалистов различного профиля, представителей фун, ментальной медицинской науки и практического здравоохранения.

Выводи

1.Обнаружен феномен физиологической системной эндотоксинемии: практически здоровых людей разных возрастов(начиная с раннего перш новорожденности) в плазме крови в низких концентрациях определяе-свободный эндотоксин (в концентрации 1,36±0.10 пг/мл у новорожденны; 1,9 ±0,25 пг/мл у взрослых) и 3.5±0.4% полиморфноядерных лейкоциг крови несут на своей поверхности эндотоксин, связанный при пом( Fc-зависимого механизма.

2.Основной эндотоксин-связывающей клеточной популяцией крови 1 ловека является полиморфноядерный лейкоцит. В физиологических конце! рациях ЛПС активирует адгезивную и фагоцитарную функции гранулоцитс Наиболее выраженной способностью акцептировать эндотоксин обладает ; зинофил.

3.Около 4.9% полиморфноядерных лейкоцитов практически здорои людей обладает способностью к Fc-зависимому связыванию эндотоксина vitro при обработке мазков крови раствором, содержащим эндотока т.е. практически здоровые люди характеризуются наличием резерва се зывания эндотоксина лейкоцитами крови.

4. По содержанию лейкоцитов, связывающих эндотоксин в оргашш обследуемого и в условиях In vlt.ro, можно выделить 6 фаз состояния е тиэндтоксинового иммунитета: 1-нормальное состояние, характерное i

ювых людей; 2-состояние активации иммунитета на фоне компенсиро-юй системной эндотоксинемии; 3-состояние активации иммунитета на ! декомпенсированной системной эндотоксинемии; 4-состояние истоще-иммунитета; 5-состояние резкого угнетения иммунитета; 6-состояние тановления иммунитета.

5. По показателям содержания антиэндотоксиновых ^-антител (антик гликолипиду Ее) и антител к липополисахариду 014, содержащему

й антиген энтеробактерий, а также по соотношению между этими пока-лями, можно выделить 11 групп людей.

6.Состояние клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммуни-. коррелируют с общим состоянием здоровья обследуемых: 3,4,5 фазы ■очного иммунитета и 3.5.6,8 и 1 о группы гуморального иммунитета ктерны для лиц с различными острыми и хроническими заболеваниями, -чая онкологически!"' заоп.т'кчния

7.1'естози, различные заболевания верхних дыхательных путей и лег-сердечно-соеудистая патология, заболевания мочеполовой системы, ндициты и перитониты характеризуются снижением антиэндотоксинового нитета, повышенным содержанием эндотоксина в плазме крови и нали-ЛПС-перегруженных гранулоцитов.

8. Липополисахарид грамотрнцательных бактерий является общепатоло-ским фактором, индуцирующим развитие(или по меньшей мере участвую-

в механизме развития) различных патологических процессов, в том е неинфекционного генеза. Патологическое действие эндотоксина, ловливающее развитие различных видов органопатологии, реализуется ачительной мере через перегруженные( гиперактивированные) эндоток-м гранулоциты. ЛПС-перегруженные полиморфноядерные лейкоциты приют непосредственное участие в патогенезе острого респираторного ресссиндрома. острого пиелонефрита, апппендицита, являются одной ричин эндотоксин-индуцированного повреждения эндотелиальных клеток дистый системы. Кроме того, гиперактивированные гранулоциты, идимому, могут быть одной из причин контрактурного повреждения ломиоцитов.

9.В механизмах удаления эндотоксина из системного кровотока и ор-зма принимают участие легкие и почки. При экстремальной патологии з больших количествах обнаруживается в эпителии проксимального от-

нефрона и может участвовать в патогенезе некронефроза. При зкс-альных ситуациях вероятным представляется участие гранулоцитов в тазме выведения эндотоксина через почки, о чем свидетельствует на-э ЛПС-позитивных лейкоцитов в строме. Важная роль в удалении эндо-ша через легкие принадлежит гранулоцитам. В механизме выведения юзитивных лейкоцитов принимают участие альвеолярные макрофаги, зужена принципиальная возможность фагоцитоза жизнеспособных позитивных гранулоцитов альвеолярными макрофагами. Последние в еще ней степени чем лейкоциты подвержены токсическому воздействию эн-

дотоксина. Фагоцитоз альвеолярными макрофагами ЛПС-перегруженных г нулоцитов может быть одной из причин повреждения органа.

Ю.Транзиторной коронароспазм является одной из причин повреж ния миокарда при экспериментальном эндотоксиновом шоке(генерализов ный феномен Шварцмана на кроликах). Обнаружена принципиальная возм ность развития инфаркта миокарда в результате транзиторного коронар пазма.

11. Разработаны новые иммунологические методы диагностики сист ной эндотоксинемии и оценки антиэндотоксинового иммунитета, необхо, мые для диагностики системной эндотоксинемии и изучения роли эндот сина в патогенезе важнейших заболеваний человека (инфекционного и инфекционного генеза):

а)микромодификация теста с лизатом амебоцитов краба рода Ыти (МИКРО-ЛАЛ-ТЕСТ);

б)иммуноферментный и иммунофлюоресцентный методы выявле ЛПС-позитивных(эндотоксин-активированных) гранулоцитов(ЛПС-ТЕСТ);

в)способ определения титров антиэндотоксиновых антител с помо тонкослойного иммуного анализа(ТИА-АНТИЭНДОТОКС);

г)иммуноферментный способ оценки резистентности организма ( ИС-ИФА) по показателям титров ^-антител к гликолипиду Ие-хемотипа ЛПС 014 с общим антигеном энтеробактерий (СОИС-ИФА):

д)иммуноферментный способ оценки антиэндотоксинового иммунит по наличию ЛПС-активированных лейкоцитов и резервного пула эндотокс чувствительных лейкоцитов.

12. Создана наиболее необходимая методическая база для созда основ патологоанатомической диагностики системной эндотоксинемии. дотоксинового шока(методы прижизненной диагностики СЭЕ и идентифика ЛПС в органах и тканях) и изучения роли эндотоксина в патоморфоген различной органопатологии на секционном материале. Установлено, облигатным признаком СЭЕ является системный маргинальный лейк таз(преимущественно венулярного отдела) сосудистого русла. Патогно ничным признаком ЭШ является наличие ЛПС в некротизированном эпите проксимального отдела нефрона и эндотоксин-позитивных(в том числе регруженных) гранулоцитов с явлениями нейтрофильного альвеолита и проявлениями острого респираторного дистресс-синдрома.

13.Установлено, что вновь синтезированные производные альфа-и дазолилалкилсульфоновой кислоты обладают антиэндотоксинвошоковой, тиагрегационной, а также антиатеросклеротической и другими видами тивности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Метаболическая гетерогенность миокарда и феномен централиза кровообращения в сердечной мышце при экспериментальном шоке// Матер

IX Всемирного конгресса кардиологов.-Москва.1981.-С.25-31.-Ю.Яковлев.

2. Метаболическая гетерогенность миокарда и феномен централизации овообращения в сердечной мышце при эндотоксиновом шоке// Вестник АМН СР.-1981.-N 5.-С.26-30. - М.Ю.Яковлев.

3.Cardiac coronary vessels in endotoxic shock// J.Mollee, and llul. Cardiol.1983.-Vol.15.-Suppl. 1. -P.49. - M.Yakovlev. A.Kubatiev.

4.Морфология миокарда при эндотоксиновом шоке// Арх.пат.-1985.-N -С.34-41. - М.Ю.Яковлев.

5.Experimental endotoxic shock and its pharmacological correcti-// 1-st Vienna Shock Forum. 1-3 Mai 1986, Abstracts. - A.Kubatiev. Grachev, L.Smirnov. M.Yakovlev et al..

6.ИммуноморФологичоская диагностика эндотоксинемии в акушерскоги-кологической практике// Сборник научных трудов НИИЗМ им.Н.Ф.Гамалеи H СССР,1987.-С.128-131. В Н.Серов. Е.В.Бондаренко, М.Ю.Яковлев и

7.Эндотоксиновый шок// Казанский мед.ж.-1987.-N 3.-С.207-211. Ю. Яковлев.

8.Диагностическая информативность иммуноморфологической идентифи-ции эндотоксин-положительных гранулоцитов в клинике и эксперимен-//Актуальные вопросы теоретической и прикладной инфекционной иммуно-гии: Тез.докл. П Всесоз.конф.-Москва, 1987.-С. 127-128. - М.Ю.Яковлев.

H. Круник, Е. В. Бондаренко, М. Ф. и др..

9.Моделирование транзиторного коронароспазма в условиях острого ыта// Бюлл.экспер.биол.мед.-1987.-N 8.-С.247-248. - А.Н.Крупник. Ю.Яковлев.

Ю.Ятрогения в урологии// Арх.пат.-1988.-N 5.-С.31-34,- Э.Н.Сит-ков, А. Н. Крупник. М. Э. Ситдыкова, М. Ю. Яковлев.

11.Роль кишечной микрофлоры и недостаточности барьерной функции чени в развитии эндотоксинемии и воспаления// Казанский мед. ж.-38.-N 5.-С.353-358. - М.Ю.Яковлев.

12.Острый респираторный дистресс-синдром при эндотоксиновом шо-// Арх.пат.-1988.- N 11.-С.81-89 - В.Н.Галанкин,А.И.Ипатов.М. Ю.Яков-3 и др.

13.Взаимодействие эндотоксин-позитивных полиморфноядерных лейко-гов с альвеолярными макрофагами ин витро// Тез.докл.-IX Всесоз. съ-ца патфизиологов,1989.-С.1236. 7 М.Ю.Яковлев. А.Н.Крупник.Л.Д.Зубаи-за, А. А. Кубатиев.

14.Эндотоксин и система полиморфноядерного лейкоцита// Арх.пат. Э89. -N 5. -С.3-11. - Н.К.Пермяков, М.Ю.Яковлев. В.Н.Галанкин.

15.Эндотоксин-индуцированное повреждение легких// Тез.докл.- УШ эсоюз.съезда патологоанатомов, 1989.-С.108-110. - М.Ю.Яковлев, \. Крупник, Н.О. Крюков, Л.Д.Зубаирова.

16.Эозинофил - суперафинная клетка крови к эндотоксину// Бюлл. шер.биол.мед.-1989.- N 6.-С.765-766. - М.Ю.Яковлев, А.А.Кубатиев.

I. Крупник. В. М. Бондаренко, Е. В. Суджан.

17.Острая почечная недостаточность(участие эндотоксина в патоге-зе)// Пат.физ.экспер.тер.- 1989.-N 6.-С.77-80. - Н.К.Пермяков.

М. Ю. Яковлев, В. В.Шляпников.

18. Значение взаимодействия эндотоксина грамотрицательных бакте] и полиморфноядерных лейкоцитов для диагностики системной эндотоксш мии// Тез.докл. - 2 Всесоюз.конф. "Бактериальные токсины".- Dpi да,1989.-С.5. - А.В.Аполлонин, М.Ю.Яковлев. А.Н.Крупник и др.

19. Транзиторный коронароспазм в генезе инфаркта миокард; Бюлл. экспер. биол.мед.-1989.- И 7.-С.121-123. - Н.К.Пермяков, М.Ю. Яю лев, А. Н. Крупник, А. А. Кубатиев.

20. Эндотоксин кишечной микрофлоры в патологии печени// Арх. ш -1989.- N 9.-С. 3-9. - Н. К. Пермяков, М.Ю. Яковлев, А. А. Миронюк.

21. Диагностика и терапия эндотоксинового шока// Хирургия,3i пресс-информация Н1Ю"Союзмединформ".-1989. -Выпуск 3.-С.14-27. - В Серов,Н. В.Аныкина, М.Ю.Яковлев и др..

22.Патология органов пищеварения и системная эндотоксинемш Арх.пат.-1989,- N 12.-С.74-79. - Н.К.Пермяков. М.Ю.Яковлев.

23. Липополисахарид микрофлоры кишечника в физиологии и патоло] системы полиморфноядерного лейкоцита// Сборник научных трудов НИИ м( фологии человека АМН СССР.-М.,1989.-С.74-77. - М.Ю.Яковлев. В.Н.Галг кин, А.Н.Крупник, А.Н.Токмаков.

24. Системная эндотоксинемия и бронхообструктивный синдром г острой респираторной вирусной инфекции у детей// Там же.-С.8-11. М.Ю.Яковлев, В.А.Анохин.Г.Р.Булатова и др.

25. Системная эндотоксинемия при различных формах острого аппещ цита//Там же,- С.17-19. - М.Ю.Яковлев, А.А.Рудик. С.С.Федотов и др.

26.Сердце при эндотоксиновом шоке// Пат.физ.и экспер.тер. - 19i - N 2, С.45-48. - Н.К.Пермяков, М.Ю.Яковлев.

27. Эндотоксинсвязывающие системы крови// Журн.микробиол.-1990. N И.-С.100-106. - А.В.Аполлонин,М.Ю.Яковлев. А.А.Рудик,В.Г.Лиходед.

28. "2-Имидазолил... - сульфокислота. обладающий иммуностимулир^ щей, антиагрегационной. дезагрегационной активностью и усиливаюи сократительную активность скелетных мышц"// Авторское свидетельство 1644475 от 22 декабря 1990 г., ДСП экз. N 000132. - В.Б.Ие нов,М. Ю.Яковлев. 0. К. Поздеев и др.

29. "Производные альфа-... сульфоновой кислоты, обладающие прот вошоковой , антиагрегационной и дезагригационной активностью, усилие ющие сократительную активность скелетных мышц и способ их получения' Авторское свидетельство N 1665676 от 22 марта 1991 г.. ДСП экз. 000147. - М.Ю.Яковлев, В.Б.Иванов, O.K.Поздеев и др.

30."Basic mechanisms of the DlC-syndrome development in cases system endotoxemia and endotoxic shock" // Abstracts of t constituent Congvess of the International Society for pathophysiolo^ Moscow. 1991, p.125. - A.Kubatiev, S.Grachev. L.Smirnov. M.Yakovlev al.

31. Альвеолярные макрофаги в физиологии и патологии легких. Арх.пат. - 1991. -N 4. -С.3-8. - М.Ю.Яковлев, Л.Д.Зубаирова,А.Н.Kpi ник.Н. К. Пермяков.

33. Эндотоксинемия в раннем периоде адаптации новорожденных и матерей// Казанский мед.ж,- 1992.-N 2.- С. 114-118. - Р.А.Уразае

Крупник. М.Ю.Яковлев.

33. "Способ обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий"// рское свидетельство М 1719758 от 22 марта 1992 г.- М.Ю.Яковлев. Крупник. В.Г.Лиходед. В.М.Бондаренко и др.

34."Способ оценки резистентности организма по B-звену гуморально-нтиэндотоксинового иммунитета" // Заявка на патент. Приоритетная вка N 5050728, положительное решение от 29 сентября 1992. Уразаев, М.Ю.Яковлев, А.И. 1ниховская и др.

35.Эндотоксинемия и синдром бронхиальной обструкции при респира-ых вирусных инфекций у детей.-Казанский мед.ж.-1993.-1.-С.21-- М.Ю.Яковлев. Г.Р.Хасанова, В.А.Анохин. Р.А. Уразаев.

36. "Способ оценки иммунитета к эндотоксинам грамотрицательных ерий("ЛПС-ТЕСТ-ИФА")". Заявка па патент. Приоритетная справка N 9852 от 04'августа 1993 г. - А.В.Аполлонии. В.Г.Лиходед, Н. Д.Ющук. Яковлев и др.

37. Содержание TNF в крови у больных с разлитым перитонитом при едении интракорпоральной детоксикации.// Сборник трудов НИИ морфо-и человека РАМН.-1993. - В печати. - В. В. Струсов, Ш. С. Кара-11. Н.Лустина, М.Ю.Яковлев. '

38. Экстракорпоральная терапия эндотоксикоза при разлитом перито-.//Тамже. - Ш.С.Каратай.Н.Н.Лустина.В. В.Струсов. М.Ю.Яковлев.

39.Антиэндотоксиновыи иммунитет при воспалительных заболеваниях вых органов.// Там же, - М.Ю.Яковлев. В. Н.Серов, Л.Н. Ильенко, С.Н. Сив Р. А. Уразаев.

М.Яковлев

Зак.13-21

Диссертант.

Тир. 150

Издательство Международного Медицинского Консорциума "МЕЧНИКОВ"