Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка иммуноферментных тест-систем для количественного определения IgG-, IgG4-антител и их выявления при аллергической патологии человека

РГП од

^ МАР 13:'Ь

На правах рукописи

АГАФОНОВ Виктор Евгеньевич

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ^4 - АНТИТЕЛ И ИХ

ВЫЯВЛЕНИЕ ПРИ АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ >

ПАТОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА 14.00.36. - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 1996 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и

сывороток им.И.И.Мечникова РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - доктор медицинских наук, профессор

В. Б.ГЕРВАЗИЕВА.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ - доктор медицинских наук, профессор

И.И.Балаболкин, доктор медицинских наук л.н.падюков.

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ - Институт Иммунологии Минздравмедпрома РФ.

Зашита состоится • /Я ! • _jO _ 1996 г. на заседании

специализированного совета (Д 001.38.01) при НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН по адресу: 103064, г.Москва, пер.Мечникова, д.5а.

Автореферат разослан • ^ ! • ^ -^1996 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

H.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

актуальность проблемы. Бурное развитие промышленности в последние десятилетия привело к значительному увеличению числа аллергических заболеваний. По данным ВОЗ, аллергические заболевания вышли на 3 место в структуре общей заболеваемости. Около 40% населения развитых стран имеют скрытую или явно выраженную аллергию (Палеев Н.Р., Царькова Л.Н., Борохов А.И. 1989).

Иммунологическим критерием эффективности гипосенсибилизиру-ющей терапии многие авторы считают нарастание блокирующих igG- и IgG4—антител (Djurup R. , 1990). Отмечается очевидная корреляция между увеличением уровня IgG-, IgG4-антител и эффективностью лечения (Gervazieva V.B., Mokronosova M.A., Agafonov V.E., 1993). Антитела IgG класса привлекают большое внимание в связи с поисками у них анафилактических свойств. (Yunginger J.W., Pauli D.R., Jones R.T., 1987) Установлено, хотя и косвенно, что IgG4—антитела , часто встречающиеся в сыворотках больных аллергией, могут обладать как функцией блокирующих антител, так и реагиновой активностью (Stanworth D.R., 1986). В то же время, ряд авторов считают, что ^С4-антитела играют незначительную роль в патогенезе аллергии ( Poulsen L.K., Stahl Skov P., 1988) Отдельные авторы полагают, что выработка специфических IgG4—антител к различным аллергенам (пищевые, инсектные, бытовые и др.) отражает состояние нормального иммунного ответа человека. Продукция этих антител позволяет быстро очистить организм от инородных белков, абсорбированных в крови (Lee D. , Edwards R.G., Dewdney Janet M. , 1991). Все вышеизложенное свидетельствует, что значение этих антител в патогенезе атопической аллергии изучено еще недостаточно. Это в значительной степени объясняется отсутствием доступных, высокочувствительных методов, позволяющих количественно определять содержание IgG- IgG4—антител (IgG-AT, IgG4-AT) как при однократных исследованиях сывороток, так и в динамике иммунотерапии.

В этой связи ЦЕЛЬЮ настоящего исследования является: разработка иммуноферментной (ИФА) тест-системы для количественного оп-

- г -

ределения аллергенспецифических IgG- и IgG4-AT и изучение роли igG- и IgG4-AT при аллергической патологии человека.

Для достижения этой цели требовалось решить следующие ЗАДАЧИ:

а) получить референс-реагенты и коньюгаты, позволяющие количественно определять содержание аллергенспецифических IgG- и IgG4-AT;

б) отработать параметры тест-систем для количественного определения аллергенспецифических IgG- и IgG4-AT;

в) изучить диагностическое значение IgG- и IgG4-AT при аллергических заболеваниях, вызванных аллергенами из коровьего молока, куриного яйца, D.pteronyssinus и D.farinae;

г) изучить динамику изменений уровней аллергенспецифических IgG- и IgG4-AT в процессе специфической гипосенсибилизирующей терапии аллергенами из клещей D.pteronyssinus и D.farinae.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. В результате проведенных исследований получены следующие новые данные:

1. Разработаны референс-реагенты (контрольные образцы с известным содержанием IgG и IgG4) на основе иммуноглобулиновой фракции сыворотки человека и показана их адекватность для количественного определения в ИФА содержания аллергенспецифических IgG- И IgG4-AT.

2. Разработана модульная тест-система ИФА, позволяющая определять в исследуемых образцах сывороток количественное содержание IgG- и IgG4-AT к широкому спектру аллергенов.

3. Проведено количественное исследование содержания специфичных к аллергенам из коровьего молока, куриного яйца, D.pteronyssinus, D.farinae IgG- и lgG4-AT у различных групп аллергических больных и здоровых людей с применением разработанных нами им-муноферментных тест-систем. Выявлена и подтверждена связь между повышением содержания этих антител и гиперчувствительностью к вышеуказанным аллергенам, установленной клинически и подтвержденной наличием IgE-AT. При этом, повышенное содержание аллергенспецифи-

ческих ^0- и ^04-АТ выявлено даже у тех больных, у которых при наличии соответствующей клинической картины аллергенспецифические ^Е-АТ не обнаружены.

4. Впервые установлены показатели содержания в сыворотке крови здоровых людей аллергенспецифических и ^04-АТ к аллергенам нз коровьего молока, куриного яйца. Выявлено, что эти показатели различны для каждого аллергена. Показано, что наличие

и ^04-АТ в пределах вышеуказанных норм отражает состояние нормального иммунного ответа человека на введение в организм продуктов, содержащих данные белки.

5. Показано, что иммунологической основой клинической эффективности специфической иммунотерапии больных аллергенами из 0.р1егопуБз1пи5 и О.Гагд-пае является достоверное увеличение содержания в сыворотке крови противоклещевых и 1§а4-АТ.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

В результате исследований разработана технология получения иммуноферментных тест-систем для количественного определения аллергенспецифических и 1дС4-антител к широкому спектру аллергенов. Инструкция по изготовлению и контролю утверждена Ученым Советом НИИВС им И.И.Мечникова РАМН "31" октября 1991 года.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Использование иммуноглобулиновой фракции сыворотки человека в качестве референс-реагента с известным содержанием и 1£04 адекватно при создании ИФ тест-систем на основе МкАТ к этим иммуноглобулинам для количественного определения специфических

и ^04-АТ к широкому спектру аллергенов.

2. Определение аллергенспецифических и ^04-антител может иметь диагностическое значение при выявлении гиперчувствительности к аллергенам из коровьего молока, куриного яйца, Р.р1е-гопуБЭЛ-пиз, О.Гаг1пае.

3. Определение динамики изменений аллергенспецифических

и ^04-антител при специфической иммунотерапии позволяет

оценить ее эффективность, а также корректность выбора аллергена для проведения специфической гипосенсибилизации.

Отдельные фрагменты диссертационной работы были доложены на 2-ом международном микологическом симпозиуме "Микозы и иммунодефицита " (Ленинград, 1991); Всесоюзной конференции молодых ученых "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической иммунологии" (Москва, 1990); 2-ом международном семинаре по биотехнологии на Кубе (Гаванна, 1989); 1-ом съезде иммунологов России (Новосибирск,, ,1992) ; научных конференциях лаборатории аллергодиагностики НИИВС им.И.И.Мечникова РАМН (Москва, 1989-1993).

диссертация апробирована на научной конференции отдела неинфекционной иммунологии и аллергологии НИИ вакцин и сывороток им.и.и.Мечникова рамн.

Объем и структура диссертации, диссертация включает введение, две главы обзора литературы, описание материалов и методов, три главы собственных исследований, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Работа содержит 104 страницы машинописного текста, 14 таблиц и 14 рисунков. Список литературы включает 131 наименование работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве источника моноклональных антител анти—IgG4 и ан-ти-lgG (пан G) были использованы асцитические жидкости мышей, содержащие моноклональные антитела анти—lgG4 (клон 20g/5C7) и ан-ти-lgG (пан G) (клоны 2lg/5A9 и 2lg/4D6), полученные в ЦНИ рент-генорадиологическом институте МЗМП РФ (г.С-Петербург). При разработке референс-реагентов использовали очищенные для структурного анализа igG (No А26Ю7) и lgG4 (No А26114) человека производства фирмы "Serva", плазму крови больного с аллергией к пыльце амброзии после проведенного курса специфической иммунотерапии данным

аллергеном, приведшего к стойкой клинической ремиссии заболевания, а так же суммарную сывороточную иммуноглобулиновую фракцию, выделенную из плазмы крови здорового донора. Для получения аффин-ноочишенных анти-IgG- и анти—IgG4—антител применяли препарат протеин А, выделенный из Staphylococcus aureus Cowan 1, производства фирмы "LKB-Pharmacia" Швеция, при получении конъюгатов применяли препарат пероксидазы из корня хрена, производства фирмы "Sigma" (США) с RZ=3,0 (Р6782). Иммуноферментную реакцию проводили на разборных полистироловых планшетах (стрипах) F8 фирмы "Nunc" (Дания). Коммерческие препараты аллергенов из коровьего молока, куриного яйца, клещей домашней пыли D.preronyssinus и D.farinae были получены на предприятии "Биомед" им.И.И.Мечникова (Петрово-дальнее, Россия).

Для работ, связанных с хроматографией, был использован стандартный набор хроматографического оборудования фирмы "Pharma-cia-LKB" (Швеция). Содержание белка в препаратах и фракциях оценивали с помощью спектрофотометра СФ-26 "ЛОМО" (С-Петербург, Россия). Результаты иммуноферментной реакции учитывали на спектрофотометре "Dynatech MR-5000" фирмы "Dynatech" (ФРГ).

Белок в растворах аффинноочищенных анти-IgG- и ан-ти—IgG4—антител определяли методом Лоури (Lowry О.Н., 1951) Имму-ноглобулиновые фракции из сывороток получали высаливанием насыщенным раствором сульфата аммония (Valovirta Е. , Vinder М. , Koi-vikko А. , 1986) . для аффинного выделения анти-IgG- и ан-TH-IgG4-aHTHTeA из асцитической жидкости применили методику Lo-wenstain Н. , Week А. ( 1983 г.). В качестве сорбента использовали CN-Вг-активированную сефарозу 4В фирмы "LKB-Pharmacia", на которую лигировали протеин A ("LKB-Pharmacia" Швеция). Выделение IgG из биологических жидкостей осуществляли с использованием ионообменного диска "ZetaPrep 15" фирмы "Pharmacia-LKB" (Швеция) по стандартной методике фирмы. Получение конъюгатов проводили методом перйодатного окисления по Nakane.

При статистической обработке применяли методы сравнения

средних при помощи показателя достоверности разницы t по Стъюден-ту и оценки достоверности разности долей (Каминский Л.е., 1959; Плохинский H.A., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При разработке тест-систем для определения igG- и lgG4-AT использовали твердофазный "сендвич"-метод, который по чувствительности не уступает радиоимиунному анализу. Более того, он не требует очищенных антигенов, что особенно вахно при работе с аллергенами (Ngo Т.Т., Lenhoff Н.М., 1985).

За основу нами была принята тест-система для опрелеления аллергенспецифических igE-AT, разработанная нами ранее в лаборатории аллергодиагностики НИИВС им.И.И.Мечникова РАМН. Модульный принцип компановки тест-системы, включающей референс-систему и отдельные стрипы (твердая фаза), сенсибилизированные различными аллергенами, позволяет определять аллергенспецифические AT к широкому спектру аллергенов. При необходимости, в зависимости от нужд исследования, возможна взаимозамемость твердой фазы.

Сходство задач при разработке референс-систем для определения специфических IgG- и IgG4—антител дало нам возможность отработать схему создания данных референс-систем на примере одной из них - для определения аллергенспецифических IgG-антител.

Основным компонентом разрабатываемых референс-систем являются референс-реагенты. В процессе работы нами было получено два варианта референс-реагентов, позволяющих количественно определять специфичные к различным аллергенам igG-AT: один на основе проти-воамброзийных IgG-AT, второй - из суммарного IgG сыворотки крови.

Референ-реагент на основе аллергенспецифических противоамб-розийных IgG-антител был получен по следующей схеме. Методом осаждения сульфатом аммония выделили иммуноглобулиновую фракцию из плазмы крови больного с аллергией к пыльце амброзии после проведенного курса специфической иммунотерапии данным аллергеном,

приведшего к стойкой клинической ремиссии заболевания. Из суммарной фракции иммуноглобулинов с помощью ионообменного диска DEAE 'ZetaPrep" ("Pharmacia") выделили иммуноглобулин G, который далее подвергали очистке методом афинной хроматографии с использованием иммуносорбента с лигированным на нем аллергеном из пыльцы амброзии. Далее была проведена дополнительная очистка противоамброзий-ных IgG-AT на иммуносорбенте (CN-Вг-активированная сефароза 4В) с лигированными на нем моноклональными мышиными анти-IgG-AT (клон 21g/4D6). Специфическую активность и чистоту полученных противо-амброзийных аффинноочищенных IgG-AT проверяли в реакции ИФА. Полученные данные свидетельствовали о том, что выделенные антитела специфичны к аллергену из пыльцы амброзии и очищены от примесей других иммуноглобулинов, в частности IgE, специфичных к данному аллергену.

Второй вариант референс-реагента был получен на основе суммарной сывороточной иммуноглобулиновой фракции, которую мы выделили из плазмы крови здорового донора методом сульфатаммонийного осаждения. Полученный раствор иммуноглобулиновой фракции плазмы крови здорового донора с определенным содержанием IgG, использовали в качестве референс-реагента для определения количественного содержания в исследуемых сыворотках аллергенспецифических IgG-AT.

В обоих полученных референс-реагентах количество IgG определяли по калибровочной кривой в реакции ИФА с использованием препарата IgO ("Serva") с содержанием IgG равным 200 мкг/мл. По результатам реакции ИФА определяли концентрацию IgG в обоих референс-реагентах и доводили ее методом разведения до 200 мкг/мл. после этого двукратным титрованием получали 8 двукратных разведений референс-реагентов.

два варианта полученных референс-реагентов использовали в реакции ИФА для определения количественного содержания противоам-брозийных IgG-AT в сыворотках больных поллинозом. Реакцию проводили в одинаковых условиях для референс-реагентов и исследуемых образцов с применением коиъюгата на основе анти-lgG-MKAT. Рефе-

ренс-реагент на основе противоамброзийных IgG-AT раститровывали на твердой фазе сенсибилизированной аллергеном из пыльцы амброзии (40 мкг/мл). Раститровку референс-ревгента на основе иммуноглобу-линовой фракции проводили на твердой фазе сенсибилизированной ан-ти-lgG-MKAT (15 мкг/мл, клон 2lg/4D6). Концентрации аллергенспе-цифическнх противоамброзийных IgG-AT в исследуемых сыворотках определяли по калибровочным кривым, полученным с использованием обоих референс-реагентов. Количественные значения концентрации аллергенспецифических IgG-AT в исследуемых сыворотках были одинаковыми при их определении по обеим калибровочным кривым.

Полученные данные свидетельствовали о том, что калибровочные кривые, полученные при использовании обоих видов референс-реагентов (на основе противоамброзийных igG и на основе суммарной иммуноглобулиновой фракции плазмы здорового донора) идентичны. (Рис. 1, 2).

Вышеизложенное позволяет говорить о возможности использования обоих видов референс-реагентов в разрабатываемых рефе-ренс-системах. Однако процедура получения референс-реагентов на основе противоамброзийных IgG-AT требует большего числа этапов и, как следствие этого, менее эффективна из-за больших потерь. В связи с этим, в дальнейшей работе мы использовали референс-реа-генты полученные из иммуноглобулиновой фракции плазмы здорового донора.

Референс-реагенты для количественного определения в образцах сывороток аллергенспецифических IgG4—антител мы получали также из иммуноглобулиновой фракции плазмы здорового донора аналогичным способом.

Параметры ИФА тест-систем отрабатывали с учетом применения разработанных ранее референс-реагентов. Постановку реакции для определения аллергенспецифических IgG- и IgG4-AT осуществляли в объеме 200 мкл.

Мы провели сравнительную оценку фоновых значений (конъюгат-ный и субстратный контроля) реакции ИФА с использованием приципи-

1.563 3.125 6.25 12.5 25 50 100 200 концентрацияIgG мкг/мл

Рисунок 1. Калибровочная кривая содержания IgG, получен-

ная при разведении образца иммуноглобулиновой фракции плазмы крови здорового донора.

0П 490 НМ

концентрацияIgG мкг/мл

Рисунок 2. Калибровочная кривая содержания IgG, получен-

ная при разведении образца иммуноглобулиновой фракции плазмы крови больного с чувствительностью к аллергену из пыльцы амброзии.

татов асцитических жидкостей мышей, полученных методом осаждения раствором сульфата аммония, и аффинноочищенных анти-IgG- и ан-TH-lgG4-MKAT. Данное исследование имело целью изучить возможность использования неочищенных мышиных асцитов, содержащих монокло-нальные антитела против igG и lgG4, для получения конъюгатов и сенсибилизации твердой фазы.

Полученные данные свидетельствовали о том, что использование в реакции ИФА асцитических жидкостей значительно повышает значения оптических плотностей (ОП) реакции ИФА в конъюгатных контролях (0,57+0,15) по сравнению с субстратными контролями (0,06±0,04). Это, в свою очередь, приводит к снижению чувствительности и специфичности реакции. Данный факт побудил нас к проведению работ по аффинной очистке иммуноглобулиновых фракций асцитических жидкостей мышей. По завершении очистки on в конъюгатных (0,07±0,03) и суюстратных (0,06+0,04) контролях сравнялись. Контрольные реакции ИФА с использованием очищенных препаратов иммуноглобулинов А, М, G(G4), Е фирмы "Kapel" позволили подтвердить высокую специфичность конъюгатов и моноклональных антител для сенсибилизации твердой фазы, полученных из аффинноочищенных иммуноглобулиновых фракций асцитических жидкостей мышей, и содержащих моноклональные антитела анти-IgG, анти—lgG4.

Доза сенсибилизации твердой фазы (микроячеистые модули "Nunc") для аллергенов из коровьего молока и куриного яйца составила 40 мкг/мл, для аллергенов из клещей D.pteronyssinus и D.fa-rinae - 20 мкг/мл. Эти дозы были отработаны нами ранее при создании тест-системы для определения аллерген-специфических igE-AT (Гервазиева В.Б., Овсянникова И.Г., Ершов И.В., 1985, 1987, 1989) и мы приняли их за исходные при отработке других параметров реакции ИФА. Адекватность выбора доз сенсибилизации была подтверждена при определении аллергенспецифических IgG- и lgG4-AT в сыворото-ках больных с установленной гиперчувствительностью к вышеназванным аллергенам.

Линейная зависимость оптической плотности от концентрации

- И -

иммуноглобулинов, охватывающая все разведения референс-реагентов, наиболее четко была выражена при дозе сенсибилизации ан-ти-IgG-MKAT (клон 21g/4D6) 15 мкг/мл, а для анти—IgG4—МкАТ (20g/5С7) - 10 мкг/мл. При этом % отклонения значений оптической плотности для каждого разведения референс-реагентов, полученный в серии повторных опытов, не превышал в среднем 5%. Контрольные исследования показали, что после 3-х месяцев хранения сорбционная емкость микроячеистых модулей снижалась не более, чем на 7%.

Отработанные дозы сенсибилизации и условия постановки реакции ИФА были приняты нами как рабочие параметры.

В качестве твердой фазы мы остановили свой выбор на полистироловых микроячеистых модулях, поскольку они давали возможность компоновать иммуноферментные тест-системы с различными вариантами сорбированной твердой фазы. Были исследованы микроячеистые модули фирм "Nunc" (Дания), "Labsystems" (Финляндия) и "Медполимер" (Москва). При сравнении их связывающей способности в ИФА выяснилось, что в одинаковых условиях сорбции различными антигенами сорбционная "емкость" модулей фирмы "Nunc" была в 1,3-1,7 раза выше, чем у модулей двух других фирм. Модули "Nunc" характеризовались также наименьшей десорбцией аллергенов при хранении. Полученные данные соответствовали данным литературы о том, что эти полистироловые модули являются предпочтительными при работе с ИФА (Perelmutter L., Emanuel I., 1985).

Для того, чтобы убедиться в специфичности разработанной им-муноферментной тест-системы мы применили реакцию ингибиции ИФА. К образцам, содержащим IgG ("Serva") в концентрации 100 мкг/мл добавляли приготовленые кратные разведения моноклональных мышиных анти-lgG- (клон 21/g4D6), анти-lgE-, анти-lgM-, анти-lgA-AT. далее полученные растворы вносили в лунки микроячеистых модулей, сорбированных анти-IgG-МкАТ (клон 21g/4D6). Реакцию ИФА проводили с использованием конъюгата на основе моноклональных анти-IgG-AT. В случае использования анти-IgG-МкАТ был получен эффект "обратной раститровки". При этом, в лунках, в которые был внесен IgG с до-

бавлением анти-IgG-МкAT в концентрации 0,2 мкг/мл и менее, оптические плотности реакции ИФА практически не отличались от таковых в положительном контроле (без добавления к раствору igG монокло-нальных анти-lgG-AT). В случае добавления к раствору IgG ан-ти-lgG-MKAT в больших концентрациях (25 мкг/мл и более) значения оптических плотностей реакции ИФА снижались до 0,2 и ниже, а при концентрации МкАТ - 100 мкг/мл были равны значениям ОП отрицательного конъюгатного контроля. Полученные данные, а также выявленный факт отсутствия эффекта "обратной раститровки" реакции ИФА при добавлении к IgG моноклональных антител против других классов иммуноглобулинов (анти-IgA анти-lgM и анти-lgE) позволили считать установленной высокую специфичность разработанной тест-системы.

Чувствительность разработанной тест-системы определяли по минимальному разведению референс-реагента, при котором оптическая плотность данного разведения в реакции ИФА была отлична от оптической плотности конъюгатного контроля. Данное минимальное разведение референс-реагента соответствовало 1,56 мкг/мл IgG.

Аналогичное исследование проведено нами для доказательства специфичности тест-системы при определения количественного содержания IgG4-AT. В данном случае к пробам иммуноглобулина G4 ("Serva") в концентрации 30 мкг/мл добавляли кратные разведения монок-лональных мышиных анти-lgGi-, анти—IgG2—, aHTH-lgG4- (клон 20g/5С7), анти-lgE-, анти-lgM-, анти-IgA-AT. Далее проводили реакцию ИФА с использованием полученного пероксидазного конъюгата на основе моноклональных анти—IgG4—антител и стрипов сенсибилизированных анти—IgG4—МкАТ (клон 20g/5c7).

В случае использования анти-IgG4—МкАТ был получен эффект "обратной раститровки". При этом, в лунках, в которые вносили раствор lgG4 и aHTH-IgG4-MKAT с концентрацией менее 0,1 мкг/мл, оптические плотности образцов практически не отличались от оптических плотностей положительного контроля (без добавления к раствору igG4 моноклональных aHTH-IgG4-AT). При внесении в лунки смеси igG4 с aHTH-IgG4-MKAT в концентрациях 12,5 мкг/мл и более, оп-

тические плотности образцов снижались ло 0,25 и ниже, а при концентрации МКАТ - 50 мкг/мл становились равны отрицательному конъ-югатному контролю. В то же время, использование анти-^01-, ан-ти-1§02-, анти-^04-, анти-1вЕ-, анти-^М-, анти-^А-АТ для приготовления смеси с не приводило к эффекту "обратной растит-ровки" реакции ИФА.

Чувствительность тест-системы для определения аллергенспе-цифических АТ была равна минимальному разведению рефе-

ренс-реагента, при котором оптическая плотность данного разведения в реакции ИФА была отлична от оптической плотности конъюгат-ного контроля, данное минимальное разведение референс-реагента соответствовало 0,016 мкг/мл ^С.

Таким образом, разработанные тест-системы удовлетворяли наиболее важным требованиям, предъявляемым к такого рода системам -обладали высокой специфичностью и необходимой чувствительностью.

Разработанный метод ИФА для определения количественного содержания в сыворотке человека аллергенспецифических 1§С- и ^б4-АТ мы использовали при изучении значения этих антител в диагностике аллергии к коровьему молоку, куриному яйцу, О.р1егопуя-вдлиБ и О.Гаго.пае.

С этой целью было обследовано 97 здоровых детей и 242 больных ребенка с различными аллергическими заболеваниями. В процессе исследования содержания аллергенспецифических и ^С4-АТ к

вышеуказанным аллергенам были отобраны контрольные группы здоровых детей.

Уровни аллергенспецифических и ^04-АТ к О.рЬегопувБд.-

пия и О^агл-пае, определенные методом ИФА, у больных достоверно выше, чем у здоровых (Табл. 1).

При определении содержания и ^04-АТ к аллергену из

коровьего молока обнаружено, что в группе больных уровень 1д0-АТ был также выше, чем в группе здоровых (р$0,001), а уровень \gGi-kl практически не отличался от такового в группе здоровых (р>0,05). (Табл. 2)

Содержаниие аллергенспецифических 1во- и ^04-антител к О^егопувв^ив и О.Гаг1пае у больных с бронхиальной астмой и здоровых детей.

Группы обследованных Уровень IgG-г в икг/мл к аллергенг D.pteronyssinus нтител м±т) м из D.farinae Уровень Ig04-в мкг/мл к аллерге! D.pteronyssinus -антител (М+ш) [ам из D.farinae

ЗДОРОВЫЕ БОЛЬНЫЕ с бронхиальной астмой 65,15+9,98 П=19 315,37+93,08 П=20 р<0,01 62,97+16,01 П=19 206,94±77,91 П=20 р<0,05 0,83±0,13 П=19 2,19+0,44 П=20 р<0,01 0,77+0,07 П=19 1,27+0,21 П=20 р<0,01

Таблица 2

Содержание аллергенспецифических и ^04-

антител к коровьему молоку у аллергических больных и у здоровых детей.

Группы обследуемых Уровень (М+ш) в мкг/мл из коровье ^-антител специфичных к аллергену ;го молока Ig04-aнтитeл

. ЗДОРОВЫЕ БОЛЬНЫЕ 45,07+7,48 П=29 128,67+13,98 П=99 р<0,001 1,96+0,48 П=29 4,69+1,32 П=99 р>0,05

Таблица 3

Содержание специфичных к аллергену из коровьего молока и ^04- антител

в зависимости от уровней специфичных к данному аллергену ^Е-антител.

Группы Уровни ^Е-'антител Концентрация (М+ш) в икг/мл спе-

обследуемых (класс реакции ИФА) цифичных к аллергену из коровьего

(П) молока

IgG-антител IgG4-антител

ЗДОРОВЫЕ

• 29 0 45,07+7,48 1,96+0,48

БОЛЬНЫЕ

27 0 94,20+13,55 3,34±1,34

р<0,01 р>0,05

. 22 1 109,05±16,07 4,96+1,80

р<0,001 р>0,05

28 2 166,59+13,63 5,66±1,04

р<0,001 р<0,01

22 3 147,83±12,67 4,80±1,12

р<0,001 р<0,05

Поскольку значение специфических IgE-AT при диагностике аллергии доказанок нам представлялось важным изучить связь между содержанием в исследуемых сыворотках специфичных к аллергену из коровьего молока IgE-, IgG- и IgG4-AT. Для этого больных разделили на группы, учитывая класс реакции ИФА при определении аллер-генспецифических IgE-AT. (Табл. 3)

Во всех группах больных с чувствительностью к коровьему молоку уровни аллергенспецифических IgG-AT были выше, чем в группе здоровых доноров. (Табл. 2). нами было обнаружено, что эта закономерность отмечена и в группе больных, у которых специфичные к аллергену из коровьего молока IgE-AT отсутствовали. В отличие от этого уровень специфических lgG4-AT был повышен только в группах больных с наличием высокого и среднего уровня (2-3 классы) IgE-AT к данному аллергену. (Табл. 3).

Определение содержания специфичных к аллергенам из коровьего молока IgG- и IgG4-AT в группе здоровых детей позволило нам установить "нормальные" значения этих антител в сыворотке. Они составили для IgG - 45,07+7,48, для IgG4 - 1,96+0,48. Основываясь на этих значениях, мы определили процент выявления больных с повышенным (относительно "нормы") содержанием IgG- и lgG4-AT по вышеуказанным группам.

Процент больных с повышенным содержанием аллергенспецифических IgG- и IgG4-AT увеличивался параллельно увеличению класса специфичных к аллергену из коровьего молока IgE-AT. В то же время, с уменьшением класса IgE-AT увеличивается процент больных, у которых при наличии соответствующей клиники и специфических IgE-AT уровень специфичных к коровьему молоку IgG- и lgG4-AT находится в пределах нормы. (Рис. з, 4).

При выявлении диагностического значения специфических igG-и IgG4-AT к аллергену из куриного яйца нами было обследовано зо здоровых детей в возрасте от 2 до 16 лет и 103 ребенка с повышенной чувствительностью к аллергенам из куриного яйца разной степени интенсивности.

МАССЫ РЕАКЦИИ И«А (1(Е АНТИТЕЛА) ШЗ— Кшцснтмш" 1{С-АТ 4о 50 шг/н» ШШ Кошюпгаии ДО-АТ мяк 50 н«гЛм

Рисунок 3. Зависимость частоты выявления повышенного содержания ^б-антител к аллергену из коровьего молока от уровня ^Е-антител той же специфичности.

100 90 «0 70 60 50 40 30 20 10 0

X БОЛЬНЫХ

0 12:

КЛАССЫ РЕАКЦИИ ИФА (1|Е-ЯТ)

-КОНЦЕНТРАЦИЯ ДО4-ЯТ ДО 2 МКГ/МЛ -КОНЦЕНТРАЦИЯ ивЧ-ЯТ ВЫШЕ 2 ИКТ/МЛ

Рисунок 4. Зависимость частоты выявления повышенного содержания ^04-антител к аллергену из коровьего молока от уровня ^Е-антител той же специфичности.

Средние значения IgG- и IgG4-AT к аллергену из куриного яйца в группе здоровых детей составили 7,72+1,16 и 1,65+0,47 соответственно, а у больных - 71,4+27,19 и 24,48+11,63. (Табл. 4)

По результатам определения аллергенспецифических IgE-AT больные были распределены по группам, каждая из которых соответствовала определенному классу реакции ИФА. Изучение связи между специфичными к аллергену из куриного яйца IgG-, IgG4- и IgE-AT показало, что повышенный уровень IgG- и IgG4-AT отмечается только при высоких и средних уровнях IgE-AT (2,3,4 классы реакции ИФА). Эта закономерность подтверждена при определении доли больных с повышенным содержанием аллергенспецифических IgG- и IgG4-AT в каждой из вышеуказанных групп. (Рис. 5, 6). При этом "нормальное" значение концентрации специфичных к аллергену из куриного яйца IgG-AT для исследуемой группы детей составило - 7,72+1,16 мкг/мл, а IgG4-AT - 1,69+0,47 МКГ/МЛ.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что определение количественного содержания аллергенспецифических IgG- и lgG4-AT к аллергенам из коровьего молока, куриного яйца, D.ptero-nyssinus и D.farinae имеет диагностическое значение, поскольку выявлена и подтверждена связь между повышением уровня этих антител и гиперчувствительностью к данным аллергенам.

Разработанный метод ИФА для количественного определения аллергенспецифических IgG- и IgG4—AT мы применили при обследовании группы больных детей с аллергическими заболеваниями в динамике специфической иммунотерапии.

детям с гиперчувствительностью к D.farinae (86 человек) была проведена иммунотерапия аллергеном из клещей D.farinae.

Из 158 детей с аллергией к домашней пыли (ДП) и D.pteronys-sinus 37 - получили иммунотерапию аллергеном из домашней пыли, а 121 ребенок - аллергеном из клещей D.pteronyssinus.

У всех больных и группы здоровых доноров определяли специфические IgG- и lgG4-AT к аллергенам из D.pteronyssinus и D.farinae до начала терапии, после 1 курса и по завершении лечения

0 12 3 4

КЛАССЫ РЕАКЦИИ (1|Е-АТ)

УЖ — КОНЦЕНТРАЦИЯ 1|С-АТ АО Ю МКГ/Ш1 Ш — КОНЦЕНТРАЦИЯ 1|С-ЯТ ВЫШЕ 10 ЫХГ/МЛ

Рисунок 3. Зависимость частоты выявления повышенного содержания ^-антител к аллергену из куриного яйца от уровня ^Е-антител той же специфичности.

100 90 80 70 60 50 40 •30 20 10 0

X БОЛЬНЫХ

0 1 2 3 4

КЛАССЫ РЕАКЦИИ ИМ (||Е-АТ)

] — КОНЦЕНТРАЦИЯ ЦС4-АТ 00 2 МКГ/МЛ | — КОНЦЕНТРАЦИЯ 1|С4 -АТ ВЫШЕ 2 ЫКГ/ЫЛ

Рисунок 6. зависимость частоты выявления повышенного содержания

1£С4-антител к аллергену из куриного яйца от уровня 1£Е-антител той же специфичности.

Содержание специфических и ^04-антител

к аллергену из куриного яйца у больных и у здоровых детей.

Группы обследуемых Концентрация (М+ш) в м> лергену из к; 1£0-антител сг/мл специфичных к ал-финого яйца I д04-антител

ЗДОРОВЫЕ БОЛЬНЫЕ 7,72+1,16 п=30 71,40+27,19 П=103 р<0,05 1.65+0,47 П=30 24.48Ц1,63 П=103 р=0,05

Таблица 5

Изменение концентрации специфичных и ^04-

антител к аллергену из клещей й.Гаг1пае в дин-миике специфической иммунотерапии аллергеном из Р.Гаг1пае.

Больные с диагнозом Содержа»» IgG-i ДО лечения (е в мкг/мл нтител После 3 курса иммунотерапии Содержа! IgG' до лечения <ие в мкг/мл -антител После 3 курса иммунотерапии

Предастма п=46 Бронхиальная астма п=40 24,23+7,34 80,44+14,51 97,25+17,8 р<07001 299,69+60,97 р<0,001 0,47+0,12 0,64±0,13 <> » 99^0 , 1 9 р<0,001 11,19+0,33 р<0,001

Таблица 6

Изменение содержания специфичных к аллергену из клещей О.р1егопу583.пи8 ^-антител в процессе специфической иммунотерапии аллергенами из О.р1егопу58л.пи5 и домашней пыли

ГРУППЫ больных с диагнозом Соде! ДО лечения )жание мкг/мл Ige клещей D.р После 1 курса иммунотерапии D.pteronyssinus ¡-антител к алле] .егопу551пиз После з курса иммунотерапии О. р1егопу881пиз згену из После 3 курса иммунотерапии домашней пылью

Предастма Бронхиальная астма Атопический дерматит п=50 46,34+9,80 П=90 68,47+4,08 П=18 118,12+50,9 п=40 85,67+20, 10 р>0,05 П=63 79,89+12,37 р>0,05 П=18 87,76+8,46 р>0,05 п=40 118,76+35,27 р<0Т05 П=63 198,51+18,31 р<07001 П=18 184,63+35,15 р>0,05 п=10 68,79+12,37 р>0,05 П=27 56,60+5,75 р>0,05

(после 3 курса).

Полученные результаты свидетельствуют о значительном, достоверном (р$0,001), по сравнению с исходным, увеличении содержания как IgG—, так и IgG4-AT после 3 курса иммунотерапии аллергеном из D.farinae. (Табл. 5)

Аналогичные результаты получены в группе больных предастмой и бронхиальной астмой, леченных аллергеном из D.pteronyssinus. Так, после 3 курса специфической иммунотерапии у больных с предастмой, бронхиальной астмой и атопиическим дерматитом содержание как IgG-, так и IgG4-AT существенно превышало исходные, в отличие от уровня lgG-АТ, уровень IgG4-AT достоверно (p^o.ooi) повышался уже после 1 курса иммунотерапии. (Табл. 6, 7) У всех больных, леченных аллергеном из клещей D.pteronyssinus, отмечалось наличие стойкой клинической ремиссии, т.е. положительный клинический эффект сопровождался достоверным увеличением содержания аллергенс-пецифических IgG и, особенно, IgG4-AT.

Лечение аллергеном из домашней пыли не приводило к клини-ческоц ремиссии заболевания. Данный факт можно объяснить недостаточной для терапевтического эффекта концентрацией антигенов D.pteronyssinus; который являлся причиной заболевания, в аллергене из домашней пыли. Доказательством этого является отсутствие увеличения содержания IgG- и IgG4-AT к аллергену из D.pteronyssinus- даже после 3 курса иммунотерапии. (Табл. 6, 7).

Представленные материалы свидетельствуют в первую очередь о том, что разработанный метод ИФА позволяет оценивать количественные изменения аллергенспецифических IgG- и IgG4-AT в динамике специфической гипосенсибилизации. В свою очередь, увеличение уровня исследуемых антител говорит об эффективности проводимой иммунотерапии и адекватности выбранного для этой цели аллергена.

Изменение содержания специфичных к аллергену из клещей О^егопуввишв ^04-антител в процессе специфической иммунотерапии аллергенами из О.р£егопузз1пиз и домашней пыли

Содержание мкг/мл IgG4—антител к аллергену из

ГРУППЫ клещей D.pteronyssinus

больных с ДО После 1 курса после 3 курса После 3 курса

диагнозом. лечения иммунотерапии иммунотерапии иммунотерапии

D.pteronyssinus D.pteronyssinus домашней пылью

Предастма п=50 П=40 П=40 п=10

2,61+0,4,1 5,12+0,56 9,36+0,66 2,71+0,20

р<07001 р<0.001 р>0705

Бронхиальная П=90 П=63 П=63 П=27

астма 3,55+0,14 8,95+0,41 11,56+0,80 3,86+0,32

Р<07001 р<07001 р>0,05

Атопический П=18 П=18 п=18

дерматит 4,54+0,30 8,78+0,52 12,83+2,15 -

Р<07001 р<0,001

выводы

1. Разработаны новые референс-реагенты на основе иммуногло-булиновой фракции сыворотки человека, позволяющие количественно оценивать уровни аллергенспецифических IgG- и IgG4—антител. Показана адекватность применения данных референс-реагентов при создании иммуноферментных тест-систем, позволяющих количественно определять IgG- и IgG4—антитела специфичные к широкому спектру аллергенов.

2. на основе твердофазного метола ИФА разработана технология получения тест-систем для количественного определения аллергенспецифических IgG- и IgG4—антител к аллергенам из коровьего молока, куриного яйца, D.pteronyssinus и D.farinae с использованием:

- унифицированных референс-реагентов для количественной оценки уровней аллергенспецифических IgG- и lgG4-aHTHTeA;

- конъюгатов против IgG и lgG4 с пероксидазой хрена на основе моноклональных мышиных антител;

- модульного принципа комплектации твердой фазы в тест-системах .

3. 'при исследовании различных групп аллергических больных и здоровых людей с использованием разработанных тест-систем, выявлена и подтверждена связь между повышением уровней аллергенспецифических igG- и IgG4—антител и гиперчувствительностью к аллергенам из коровьего молока (р$0,05 и р§0,05), куриного яйца (р$0,05 и р^о,Ol), D.farinae (р§0,05 и р$0,01) и D.pteronyssinus (p^o.oi и р$0,01), установленной по наличию соответствующей клинической картины и lgE-антител той же специфичности.

4. Установлены верхние максимальные нормы содержания в сыворотке крови здоровых людей аллергенспецифических IgG- и IgG4—антител к аллергенам из коровьего молока (50 мкг/мл и 2 мкг/мл, соответственно) и куриного яйца (10 мкг/мл и 2 мкг/мл соответственно). Выявлено, что нормы IgG- и IgG4—антител различны для каждого аллергена. Показано, что наличие в сыворотке аллергенспецифических IgG- и IgG4—антител в пределах норм отражает состояние нормального иммунного ответа человека на введение в организм вышеуказанных аллергенов.

5. У всех больных, прошедших курс специфической иммунотерапии аллергенами из D.farinae и D.pteronyssinus, имела место стойкая клиническая ремиссия аллергического заболевания, сопровождающаяся достоверным увеличением содержания аллергенспецифических IgG- (Р$0,01 и р$0,05, соответственно) и, особенно, IgG4—антител (p^o.oi и p^o.ooi).

6. Показано, что лечение больных с бытовой аллергией, в том числе с гиперчувствительностью к D.pteronyssinus, аллергеном из домашней пыли не приводит к клиническому улучшению и соответствующему увеличению противоклещевых IgG- (р>0,05) и IgG4—антител (р>0,05). По всей видимости, это связано с недостаточным количеством антигенов клеща D.pteronyssinus в составе аллергена из домашней пыли.

7. Разработанные ИФ тест-системы найдут широкое применение в практическом здравоохранении для диагностики аллергии и оценки эффективности специфической иммунотерапии аллергических больных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. "Создание иммуноферментных тест-систеи для диагностики аллергии". Гервазиева В.Б., Овсянникова И.Г., Агафонов В.Е. Актуальные проблемы прикладной иммунологии и биотехнологии. Тезисы доклада научной конференции пермского НИИВС, Пермь, 1988,с.161-163.

2. "Перспективы совершенствования методов нммуноферментного анализа для лабораторной диагностики аллергии". Гервазиева В.Б., Овсянникова И.Г., Ершов И.В., Агафонов В.Е. Проблемы развития работ по лабораторно-диагностической технике. Тезисы доклада симпозиума с международным участием, Смоленск, 1988, стр. 44-46.

3. "ELIZA system for the determination of allergen-specific IgE and IgGantibodies". ного анализа для лабораторной диагностики аллергии". Гервазиева В.Б., Овсянникова И. Г. , Ершов И.В., Агафонов В.Е. , Полетаев А.О. 3-rd Cuban and international seminar on interferon, 2-rd Cuban and international seminar on biotechnology. 1-st iberoamerican congress on biotechnology. Гаванна, Куба, 1989, S05-040.

4. "Применение твердофазного иммуноферментного анализа для выявления сенсибилизации к коровьему молоку и куриному яйцу". Агафонов В.Е., Стасий Е.Д., Полетаев А.О. Всесоюзная конференция молодых ученых "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической иммунологии". В сб. "Молекулярные и клеточные аспекты клинической иммунологии", Москва, 2 МОЛГМИ, 1989, стр.183-187.

5. "Современные методы диагностики аллергии на основе иммуноферментного анализа". Гервазиева В.Б., Ершов И.В., Агафонов В.Е., Полетаев А.О. 2-й национальный конгресс по алергологии. В сб. "Резюмета", София, Болгария, 1989, стр.24-25.

6. "Методы специфической диагностики аллергии на основе иммуноферментного анализа". Овсянникова И.Г., Гликман М.В., Даргее-ва Т.А., Агафонов В.Е., Илюшина Н.В., Полетаев А.О. В сб. "Имму-ноферментный анализ в диагностике заболеваний", Москва, 1989, стр.139-147.

7. ""Выявление IgE и IgG-антител при грибковой сенсибилизации". Агафонов В.Е., Хафизова А.О., Гервазиева В:Б. ТезисЫ доклада на II международном микологическом симпозиуме "Микозы и иммунодефицита " , Ленинград, 1991, стр.6-7.

8. "IgE и анти—IgE—антитела при атопическом дерматите". Гервазиева В.Б., Агафонов В.Е., Годун О.В. В сб. I съезда иммунологов России, Новосибирск, 1992, стр.104.

9. "igG и I gG4—антитела у больных с сенсибилизацией к пи-роглифидным клещам". Гервазиева В.Б, Желтикова Т.М., Мокроносова М.А., Агафонов В.Е., Петрова Т.Н., Годун О.В. Тезисы доклада на Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии, Алма-Ата, 1992, стр.57.

10. "Correlation bitween IgG of anti-IgE specifity in structure of immune complexes and serum IgE levels in patients with atopic dermatitis". Гервазиева В.Б., Агафонов В.Е., Годун О.В. В сб. "Abstract of 6-th International Congress of Pediatric Dermatology", Торонто, Канада, 1992, стр. 171-172.

11. "IgG- and IgG4-antibodies in patients with hypersensitivity to D.pteronyssinus". Гервазиева в.Б., мокроносова м.А., Агафонов В.Е. В сб. "Abstract of 8-nd International Congress of Immunology", Будапешт, Венгрия, 1992, стр.57.

12. "IgG and IgG4 antibodies in patients sensitized to py-roglyphid mites". Гервазиева В.Б., Желтикова Т.М., Голышева М.А., Агафонов В.Е., Годун О.В. J. of Allergy and clinical immunology., Vol.9 i, No.1, Part 2., 1993, p.357..

13. "Диагностика аллергических заболеваний у детей в городе Перми"., М.И.Репецкая, В.Б.Гервазиева, л.А.Головская, В.Е.АгафонОв. , Тезисы 2-ой научной конференции "Актуальные, вопросы клинической педиатрии, акушерства и гинекологии"..Киров,1993,с.136-137.

14. "Эффективность специфической иммунотерапии у детей с заболеваниями респираторного тракта, обусловленными клещевой сенсибилизации". , В.Б.Гервазиева, Т.И.Петрова, В.Е.Агафонов., Пульмонология, 1994, с.26-31.