Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение особенностей поликлонального иммуноглобулина Е человека и ассоциированных с ним молекул для повышения эффективности диагностики аллергии in vitro

НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ЦЕНТР "ЛЕКБИОТЕХ"

На правах рукописи

СЕРГЕЕВА Анна Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ПОЛИКЛОНАЛЬНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА Е ЧЕЛОВЕКА И АССОЦИИРОВАННЫХ С НИМ МОЛЕКУЛ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДИАГНОСТИКИ АЛЛЕРГИИ in vitro.

14.00.36 - Аллергология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Раиф Гаянович Василов

Москва 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Поликлональные IgE и аутоанти- IgE антитела человека. Роль в патогенезесе и диагностике аллергических заболеваний..........................................................................12

1.1. IgE - зависимые механизмы возникновения и развития аллергических реакций.....................................................12

1.2. Т-клетки и цитокины в регуляции синтеза IgE. Поиски генов аллергии...............................................................................16

1.3. Особенности структуры молекулы IgE....................................22

1.4.Прогностическое значение неонатального определения IgE. Исследования влияния различных факторов на уровень IgE в пуповинной крови..............................................................24

1.5. Роль аутоанти IgE антител в регуляции и определении IgE

при атопических заболеваниях................................................31

1.5.1. Литературные данные о трехмерной структуре комплекса идеотип-анти-идеотип..........................................................31

1.5.2. Изучение роли аутоанти IgE антител in vitro ....................35

1.5.3. Значение анти-IgE аутоантитела при атопических заболеваниях................................................................36

1.5.4. Корреляция между уровнями общего IgE , анти-IgE и IgE в комплексе с аутоантителами по данным различных групп исследователей. Влияние анти-IgE аутоантител на

диагностическое определение IgE...........................................39

1.5.5. Возможное влияние других факторов на диагностическое определение IgE..............................................................41

1.6. Специфическая иммунотерапия и перспективы ее использования......45

1.7. Роль анти-IgE аутоантител при СИТ......................................47

1.8. Моноклональная анти - IgE -плазмоиммуносорбция в комплексном лечении больных атопической бронхиальной астмой.........48

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы......................................................................51

2.2. Методы..........................................................................53

2.2.1. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости..................................................................53

2.2.2. Измерение концентрации белка в препаратах...................53

2.2.2.1. Определение белка по Брэдфорду...........................53

2.2.2.2. Определение белка по оптической плотности

при 280 нм.............................................................54

2.2.2.3. Определение концентрации белка по Лоури...............54

2.2.3. Приготовление конъюгатов моноклональных антител

к ^Е с пероксидазой хрена..................... ................54

2.2.4. Аффинная хроматография иммуноглобулина Е................55

2.2.4.1. Приготовление аффинного сорбента с моноклональными анти- антителами..............................................55

2.2.4.2. Аффинная очистка белка........................................56

2.2.4.3. Экстракорпоральная анти- ^Е - специфическая плазмоиммуносорбция..............................................56

2.2.4.4. Выделение элюатов после плазмоиммуносорбции.........56

2.2.5. Электрофорез образцов элюатов в ПААГ..........................57

2.2.6. Иммуноблоттинг образцов элюатов..................................57

2.2.7. Иммуноферментный анализ для определения концентрации ^Е (общая схема).........................................................58

2.2.8. Иммуноферментное определение комплексов 1£Е-1§0..........59

2.2.8.1. Иммуноферментный анализ на нитроцеллюлозе............59

2.2.8.2.Иммуноферментный анализ на микротитрационных планшетах............................................................59

2.2.9. Иммуноферментный анализ для определения специфического иммуноглобулина Е ..................................60

2.2.9.1. Нанесение аллергенов на нитроцеллюлозную

основу.................................................................60

2.2.9.2. Приготовление стрипов.......................................61

2.2.9.3. Проведение иммуноферментной реакции................61

2.2.9.4. Приготовление проявляющих растворов..................61

2.2.9.5. Оценка результатов.............................................61

2.2.10. Определение специфического IgE с помощью набора Иммунодот..................................................................62

2.2.11. Обработка результатов и графическое оформление.........62

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.Разработка иммуноферментного метода определения

уровня неонатального и пуповинного IgE человека......................62

3.1.1.Разработка гиперчувствительной ИФА тест системы на основе моноклональных антител для определения общего

IgE в пуповинной крови и сыворотках новорожденных............62

3.1.2. Выбор пары антител и твердой фазы.............................63

3.1.3. Оптимизация приготовления конъюгата........................64

3.1.4. Выбор условий проведения анализа..............................66

3.1.4.1 Подбор оптимальной продолжительности

стадий анализа...........................................................66

3.1.4.2. Подбор проявляющего субстрата.............................67

3.1.4.3.Подбор оптимальной концентрации нижних антител. ...61

3.1.4.4. Подбор оптимального разведения периферической или пуповинной сыворотки...............................................68

3.1.5. Основные параметры тест-системы................................68

3.1.6. Результаты лабораторных испытаний тест-системы...........70

3.1.7. Определение концентрации IgE в клинических образцах. Анализ сывороток пуповинной крови матерей, инфицированных герпесом........................................................................72

3.1.8.Общие выводы............................................................74

3.2. Биохимический анализ эллюатов с IgE специфических плазмоферезисных колонок.......................................................77

3.2.1. Выбор стратегии иммуносорбции и приготовление

сорбентов........................................................................77

3.2.2. Количественный анализ элюатов....................................78

3.2.3. Качественный биохимический анализ элюатов..................81

3.2.3.1. Электрофорез........................................................81

3.2.3.2. Иммуноблотинг.....................................................81

3.2.3.3. Выделение IgE.......................................................83

3.2.4. Краткое обсуждение....................................................84

3.3. Разработка и применение иммуноферментного диагностикума для определения уровня IgE в составе иммунного комплекса в сыворотке крови человека.........................................................91

3.3.1. Принцип определения комплексов IgE-аутоанти IgE в сыворотке крови человека.....................................................91

3.3.2. Дот-блот система для определения IgE -содержащих комплексов в сыворотке крови человека................................93

3.3.3. ИФА тест-система для определения уровня IgE -аутоанти- IgE комплексов на микротитрационных планшетах........................95

3.3.4. Уровень IgE-аутоанти IgE комплексов у больных, прошедших процедуры моноклональной анти-IgE

иммуносорбции................................................................97

3.3.5. Уровень IgE-аутоанти IgE комплексов у больных, прошедших процедуры специфической иммунотерапии.............................108

3.3.6. Исследование динамики изменения уровней IgE-IgG комплексов в результате СИТ................................................113

3.3.7. Краткое обсуждение....................................................118

3.4. Скрининг некоторых отечественных аллергенов методом ИФА......122

3.4.1. Принцип определения специфического IgE.........................124

3.4.2. Выбор конъюгата..........................................................124

3.4.3. Выбор аллергенов..........................................................126

3.4.4. Нанесение аллергенов на нитроцеллюлозу............................128

3.4.5. Приготовление стрипов...................................................128

3.4.6. Стандартизация анализа...................................................129

3.4.7. Подбор оптимальной продолжительности каждой стадии.......129

3.4.8. Проявляющие реагенты.............................................•.....131

3.4.9.Сравнительная характеристика диагностических аллергенов

в полуколичественных in vitro тестах.......................................132

3.4.11. Результаты скрининга больных атопическим дерматитом......136

3.4.12. Общие выводы............................................................140

ВЫВОДЫ................................................................................144

ЛИТЕРАТУРА..........................................................................147

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ.

За последние несколько лет достигнут значительный прогресс в пониманиии механизмов, лежащих в основе аллергических нарушений. Активация аллергенами Т-хелперов 2 типа (Т112) у генетически предрасположенных индивидуумов приводит к продукции ^Е антител при участии 1Ь-4. Аллерген-специфические антитела, отвечающие за аллергические реакции немедленного типа, при повторном контакте связываются с аллергенами на поверхности базофилов или тучных клеток, приводя к их дегрануляции с высвобождением медиаторов аллергии, таких как гистамин, простагландины и лейкотриены.

На фоне значительного прогресса в области изучения молекулярных и иммунных механизмов развития аллергических реакций парадоксом выглядят неблагоприятные эпидемиологические данные, свидетельствующие о росте распространенности и усилении тяжести аллергических заболеваний, особенно среди подрастающего поколения. Одной из причин сложившейся ситуации является подчиненное, а не главенствующее ( положение превентивной аллергологии в научных исследованиях и в практической медицине.

Иммунный статус организма, заложенный генетически, заканчивает свое формирование в первые недели и месяцы жизни ребенка. Выявление аллергической предрасположенности в неонатальный период позволяет принять превентивные меры, способные отдалить или предотвратить развитие аллергического заболевания. Одним из важных маркеров риска атопии "является уровень иммуноглобулина Е в пуповинной крови. Разработка диагностических систем для определения пуповинного 1§Е актуальна, хотя осложняется чрезвычайно низкими концентрациями этого иммуноглобулина у новорожденных.

Наличие специфического иммуноглобулина Е в сыворотке или плазме крови является результатом сенсибилизации соответствующим аллергеном, поэтому выявление специфического ^Е информативно как

при идентификации аллергенов, провоцирующих аллергические проявления, так и при мониторинге развития атопии, особенно у маленьких детей.

Повышенный уровень IgE ассоциируется с атопией и является результатом нарушения механизмов регуляции синтеза IgE, включающих интерлейкины IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10, интерферон гамма, CD 23 антиген (низкоаффинный IgE-рецептор), анти- IgE аутоантитела и собственно IgE. Определение общего IgE в сыворотках крови детей и взрослых широко используется при выявлении атопической природы заболевания и выборе терапевтических стратегий. Однако, у ряда атопических больных IgE присутствует в скрытом для обычного определения виде - в комплексе с собственными аутоантителами, что зачастую приводит к неправильной трактовке результатов анализов, в частности, неоправданному во многих случаях тяжелой бронхиальной астмы определению ее как "intrinsic"acTMbi, т.е. не связанной с повышением уровня IgE. Развитие иммуноферментных методов анализа с использованием мкАт позволяет получить дополнительную информацию о свойствах иммунных комплексов, включающих IgE.и их участии в механизмах воздействия некоторых видов антиаллергической терапии.

Применение моноклональных антител и иммуноферментных методов анализа открывает большие перспективы в изучении природы аллергических заболеваний и разработке методов их диагностики и мониторинга, доступных для широкого круга аллергологических и иммунологических лабораторий

Цель работы. Исследование особенностей поликлонального IgE и ассоциированных с ним молекул при различных видах аллергопатологии и антиаллергической терапии человека с помощью иммуноферментных методов и моноклональных антител; разработка новых иммуноферментных методов диагностики аллергии in vitro, пригодных для широкого клинического применения При выполнении работы ставились следующие задачи:

1. Анализ биологических материалов, элюированных с колонок в ходе процедур моноклональной IgE-специфической иммуносорбции .методами электрофореза и Western блоттинга

2. Разработка на основе мкАт серии IgE/11 иммуноферментной тест-системы для определения IgE в составе иммунного комплекса IgE/ IgG и исследование динамики изменения уровня комплексов во время процедур специфической иммунотерапии и моноклональной IgE-специфической иммуносорбции.

3. Разработка на основе мкАт серии IgE/11 иммуноферментного диагностикума для определения IgE в концентрации 0.1-10 МЕ/мл, пригодного для измерения IgE в пуповинной крови.

4. Разработка на основе мкАт серии IgE/11 иммунодиагностикумов для качественного определения специфического IgE в сыворотке крови детей и анализ некоторых аллергенов отечественного производства для выявления их пригодности для in vitro диагностики аллергии

Научная новизна.

С помощью электрофоретических, иммунохимических и имму но ферментных методов проанализированы элюаты, полученные с колонок в результате процедур моноклональной IgE - специфической иммуносорбции (ИС) больных бронхиальной астмой. Идентифицированы подклассы иммуноглобулинов, сорбирующихся на аффинных колонках в результате ИС. Определены количественные и качественные характеристики поликлонального IgE, извлеченного из кровотока в результате ИС.

Показано, что измерение уровня IgE в комплексе с аутоантителами методом дот-блот анализа при использовании различных мкАт дает плохо коррелирующие результаты, что связано с различной эпитопной специфичностью мкАт. Таким образом, получено объяснение несоответствию литературных данных о корреляции общего, специфического IgE, аутоанти- IgE антител, и IgE/IgG комплексов.

Разработан вариант ИФА, позволяющий достоверно судить об уровне IgE-содержащих комплексов в биологических жидкостях. Корреляция между уровнем IgE и комплексов IgG/ IgE нами не обнаружена.

Исследования уровней IgE в пуповинной крови и в сыворотках новорожденных матерей, инфицированных герпесом, обнаружило повышенный уровень пуповинного и сывороточного неонатального IgE у новорожденных в данной группе в отличие от контрольной. Повышенный синтез IgE, в данном случае, можно объяснить активизацией иммунной системы новорожденного против чужеродного вируса. Подобное исследование матерей с признаками вируса герпеса во время беременности проводилось впервые.

Показано, что наличие IgE антител, специфических к Candida Albicans ассоциируется с высоким уровнем этих антител, соответствующим, как правило, 3-4 группе PACT, тяжелой формой атопического дерматита и гипер - IgE синдромом.

Практическая значимость. В данной работе впервые в отечественной практике получена ИФА тест-система на основе мкАт для измерения концентрации IgE в пуповинной крови и сыворотках крови детей первого года жизни, предназначенная для выборочного неонатального обследования детей атопиков, которая поможет исключить или снизить некоторые факторы риска развития аллергического заболевания уже в постнатальный период, когда иммунный статус ребенка только формируется. Данная тест-система превосходит зарубежные аналоги по чувствительности (0.1МЕ/мл) и требует значительно меньшего объема анализируемого материала (50-100мкл). Проведены лабораторные испытания тест-системы. Для последующего мониторинга детей, отнесенных к группе риска развития аллергии и обследования детей и взрослых с атопическими проявлениями разработана диагностическая система, позволяющая выявлять характер сенсибилизации по уровню специфических IgE антител в сыворотке крови (Аллтест). Утверждены

медико-технические требования на разработку данного диагностического набора. Показана возможность использования некоторых аллергенов отечественного производства для производства подобных систем. Разработана иммуноферментная тест-система, позволяющая выявлять сенсибилизацию детей 14 аллергенами пыльцы злаков и трав, 7 пищевыми аллергенами и 7 аллергенами, входящими в состав домашней пыли. Проведены лабораторные испытания тест-системы.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Поликлональные IgE и аутоанти IgE антитела человека. Роль в патогенезесе и диагностике

аллергических заболеваний.

1.1. IgE - зависимые механизмы возникновения и развития аллергических реакций.

Присутствие так называемых реагинов в сыворотке больных аллергией было впервые продемонстрировано в 1921 году (реакция Prausnitz&Kustner). Однако, иммунологическая и биохимическая характеризация реагиновых антител потребовала многолетних исследований, в результате которых в 1966-67 годах Ishizaka (Ishizaka, 19 66) и Johansson (Johansson, 1967) успешно идентифицировали новый класс иммуноглобулинов, определенный как Е.

С момента открытия иммуноглобулины класса Е (IgE) прочно ассоциируются с аллергическими реакциями немедленного типа или анафилактическими реакциями. Аллергические реакции немедленного типа ответственны за такие заболевания, как аллергическая астма, сезонный ринит, анафилактический шок и некоторые нарушения пищеварения.

Первоначальная сенсибилизация включает синтез IgE антител, индуцируемый специфически аллергенами, такими как пыльца, грибы, клещи, перхоть животных и др., в предрасположенных индивидуумах. Специфические IgE антитела фиксируются на мембране тучных клеток (мастоцитов) в тканях или базофилов в крови посредством высокоаффин