Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Полиморфизм генов глутатион-S-трансфераз М1 и Т1 у детей с атопическим дерматитом

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НОВОСИБИРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ

АКАДЕМИЯ

На правахрукописи

ЛЯПУНОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ГЛУТАТИОН S-ТРАНСФЕРАЗ M1 И Т1 У ДЕТЕЙ С АТОПИЧЕСКИМ ДЕРМАТИТОМ

14.00.09 - педиатрия 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

НОВОСИБИРСК- 2004

Работа выполнена в Новосибирской государственной медицинской академии МЗ РФ и ГУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор

Казначеева Лариса Федоровна

Доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Вавилин

Валентин Андреевич

Кондюрина Елена Геннадьевна

Доктор медицинских наук профессор

Поляков

Лев Михайлович

Ведущее учреждение: Сибирский государственный медицинский университет МЗ РФ, г. Томск

Защита диссертации состоится «_»_2004 г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д 208.062.04 при Новосибирской государственной медицинской академии МЗ РФ (630091, Новосибирск-91, Красный проспект, 52).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирской государственной медицинской академии МЗ РФ.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Зубахин А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: По данным эпидемиологических исследований, проведенных в рамках программы ISAAC (International study of astma and allergy in childhood), удельный вес атопического дерматита в общей структуре детской заболеваемости составляет от 3% до 18,5% (Хаитов P.M. и соавт. 1998; Кондюрина Е.Г. и соавт., 2003; Vichyanond Р., 1998; Montefort S., 2002; Di Domenicantonio R. et al., 2003). Острота проблемы обусловлена не только высокой распространенностью атопического дерматита, но и ранним началом заболевания, частым формированием сочетанных, торпидных и инвалидизирующих форм (Торопова Н.П., Синявская О.А. 1993.1997; Балаболкин И.И. 1998, 1999; Казначеева Л.Ф. и соавт., 2000; Ревякина В А., 2000,2001).

В настоящее время не вызывает сомнений ведущая роль генетической предрасположенности в развитии атопического дерматита: подчеркивается роль семейной отягощенности по аллергическим заболеваниям, определен ряд «генов-кандидатов», предрасполагающих к развитию атопии (Горланов И.А., 1999; Фрейдин М.Б. и соавт. 2000; Cookson W.O.S.M., 1996; Tanaka К. et al., 1999; Takabayashi A. et al., 2000; Sandford A.J., 2000; Wollenberg A., 2000). В то же время, высокая значимость генетических признаков еще не составляет фенотипа заболевания, реализация которого требует сочетания наследственной предрасположенности с воздействием факторов внешней среды (Студеникин М.Я., 1998; Gilliland F.D. et al., 2002). К числу таких факторов помимо аллергенной нагрузки относят социально-гигиенические, социально-экономические, климато-гео графические, психоэмоциональные, инфекционные экологические (Балаболкин И.И., 1991, 1999; Огородова Л.М., Козина О.В., 2002; Helms P.J., 2001; Wuthrich В., 2001).

Многие авторы подчеркивают значимость экологического фактора в формировании хронической патологии органов и систем ребенка, среди которых первое ранговое место занимают аллергические заболевания (Ефимова А.А. 1995; Студеникин МЛ. и соавт., 1998; Вельтищев Ю.Е., 2000). Увеличение заболеваемости атопическим дерматитом за последние десятилетия связывают в первую очередь с нарастающим загрязнением окружающей среды, так как величина носительства генетического «груза», предрасполагающего к развитию атопии, не могла кардинально измениться за столь короткий промежуток времени (Ревякина В.А., 2000; Beylot С. et al., 1998; Ring J.et al., 1999). Авторы в своих работах указывают, что заболеваемость атопическим дерматитом среди детей, проживающих в городах с высоким уровнем загрязненности, в среднем в 3 раза выше, чем в относительно «чистых» районах (Балаболкин И.И., 1999; Нечаева Н.И., 1999; Leung D.Y.et al., 2001; Nicolai Т., 2002; Stipic-Markovic A., 2003).

Ксенобиотики оказывают прямое и опосредованное токсическое действие на органы и системы ребенка. К ряду ксенобиотиков у детей формируется специфическая сенсибилизация (Скепьян Н.А., 2000). В процессе эволюции организм выработал определенные механизмы адаптации к воздействию токсичных экзогенных и эндогенных веществ, суть которых сводится к процессам биотрансформации, осуществляемым ферментами биотрансформации ксенобиотиков, и элиминации (Гуляева Л.Ф. и соавт., 2000; Ляхович В.В. и соавт., 2000). В реализации аллергенных свойств ксенобиотиков существенное значение имеют ферменты 2-ой фазы биотрансформации - татион оторые и р у ю т

конъюгацию глутатиона с множест

что облегчает

выведение молекул ксенобиотика и таким образом уменьшается количество потенциально аллергенных молекул (Arita М., 1998; Lutz W., 2001; Gilliland F.D.et al., 2002). Субстратами GST являются широко распространение загрязнители окружающей среды: продукты сгорания бензина, органические растворители, побочные продукты синтеза пластиков. Глутатион S-трансферазы участвуют не только в метаболизме ксенобиотиков, но и широкого ряда эндогенных веществ, играющих важную роль в воспалительных и аллергических реакциях (лейкотриен А4, простагландин А2, J2, гидроперикиси жирных кислот, перекись водорода) (Fryer A. Et al., 2000; Hayes J.D., 2000; Kerb R. et al., 1997; Sheehan I, 2001).

В последнее десятилетие проведены исследования посвященные изучению роли глутатион S-трансфераз в развитии генетически детерминированных, но в большой степени зависящих от факторов внешней среды заболеваний, в первую очередь онкологических (Ляхович В.В., 1997; Вавилин В.А., 2000; Макарова СИ., 2000; Arruda V.R. et al., 2001; Rebbeck T.R.,1997; Katoh T. et al., 1998; Strange R.C. et al., 2001). Изучена роль GST в развитии атопической бронхиальной астмы - заболевания сходного с атопическим дерматитом1 во многих звеньях патогенеза (Гавалов СМ. и соавт., О.А. 2000; Вавилин В.А., 2000; Иващенко Т.Э. и соавт.,2001; Фрейлин М.Б. и соавт., 2002; Желенина Л.А. 2003;. Kabesch M., 2000).

Однако, несмотря на высокую распространенность атопического дерматита среди детского населения, явную связь заболевания с макро- и микро-экологическими факторами, до настоящего времени остается не изученной роль глутатион S-трансфераз в предрасположенности к атопическому дерматиту и формировании клинических особенностей заболевания у детей.

Необходимость изучения механизмов формирования предрасположенности к атопическому дерматиту, факторов, поддерживающих течение заболевания, уточнения прогностических признаков, имеющих значение для формирования групп риска и разработки индивидуальных программ оптимизации терапии и профилактики неблагоприятного течения АД определила актуальность данной работы.

Цель исследования: Изучить ассоциацию полиморфизма генов глутатион S-трансфераз классов Ml и Т1 с риском развития атопического дерматита и особенностями клинического течения заболевания. Задачи исследования:

1. Изучить встречаемость генотипов глутатион S-трансфераз Ml и Т1 у детей больных атопическим дерматитом и здоровых детей без признаков атопии.

2. Исследовать роль генотипов GSTM1 и GSTT1 в формировании риска развития атопического дерматита и выявить их связь с клиническими особенностями течения заболевания.

3. Исследовать влияние пассивного курения на предрасположенность к атопическому дерматиту и его течение у детей с разными генотипами GSTM1 и GSTTL

4. Оценить эффективность терапии у детей с атопическим дерматитом с учетом генотипов глутатион-S- трансфераз Ml и Т1.

5. Определить генетические маркеры благоприятного и неблагоприятного прогноза атопического дерматита основанные на полиморфизме генов глутатион S-трансфераз Ml и Т1.

Научная новизна: Впервые дана характеристика частоты встречаемости полиморфных аллелей глутатион S-трансфераз Ml и Т1 у детей, больных

атопическим дерматитом. Установлено, что нуль-генотип GSTTJ является фактором риска развития атопического дерматита.

Впервые показана роль мутаций генов глутатион S-трансфераз Ml и Т1 в формировании клинических особенностей атопического дерматита у детей. Выявлена связь полиморфизма GSTM1 с длительным сохранением симптомов заболевания на фоне стандартной терапии АД.

Впервые выявлено, что нуль-генотип GSTM1 является фактором риска развития тяжелого течения атопического дерматита, диффузного поражения кожи и предрасполагает к частым обострениям и раннему появлению пролиферативных изменений на коже.

Определены генетические маркеры благоприятного и неблагоприятного прогноза атопического дерматита, на основании оценки полиморфизма генов глутатион S-трансфераз Ml и Т1.

Практическая значимость: При проведении исследований получены новые данные о генетических факторах предрасположенности к атопическому дерматиту у детей, что имеет значение при формировании группы риска по развитию заболевания.

Определение полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 может рекомендоваться для раннего определения прогноза клинического течения атопического дерматита у детей. Полученные данные позволяют на начальных этапах оценить риск развития тяжелых, форм атопического дерматита, разработать индивидуальную программу профилактики неблагоприятного течения АД.

Внедрение результатов исследования: Результаты исследования внедрены в практику работы Новосибирского областного аллергодерматологического центра (МУЗ МДКБ №1, г. Новосибирск).

Основные положения исследования включены в процесс подготовки студентов, врачей-интернов, клинических ординаторов на кафедре госпитальной педиатрии Новосибирской государственной медицинской академии. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Нуль-полиморфизм глутатион S-трансферазы Т1 в исследуемой популяции ассоциирован с предрасположенностью к атопическому дерматиту.

2. Нуль-генотипы GSTM1 и GSTT1 являются прогностическими факторами неблагоприятного течения атопического дерматита, при этом роль GSTM1-генотипа является доминирующей.

3. Комбинация мутантных генотипов GSTM1 и GSTT1 ассоциирована с риском развития атопического дерматита и является наиболее неблагоприятной для прогноза течения заболевания.

4. Пассивное курение увеличивает риск развития диффузного поражения кожи у детей с генотипами GSTM1- и снижает величину устойчивости к развитию атопического дерматита у детей с комбинацией генотипов GSTM1+/GSTT1+. Апробация- материалов диссертации: Основные положения диссертации

доложены на семинаре Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, 2002); на XII научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» 23-25 апреля (Новосибирск, 2002); на второй межрегиональной научно-практической конференции «Клинические аспекты использования молекулярно-биологической диагностики в медицине» 1-3 октября (Новосибирск, 2003); на III Всероссийском съезде детских аллерологов 9-11 декабря (Москва 2003).

Автором опубликовано 13 научных работ по теме диссертации.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования, главы с результатами собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 237 источников (из них 88 отечественных и 149 зарубежных). Работа иллюстрирована 17 рисунками и 28 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных в настоящем исследовании задач, проведено обследование и генотипирование 301 ребенка в возрасте от 2 до 15 лет. В исследование включены три группы детей. Первую группу составили 109 пациентов (57 мальчиков и 52 девочки), с диагнозом атопический дерматит из числа госпитализированных в Новосибирский областной аллергодерматологический центр (МУЗ МДКБ № 1, г. Новосибирск). Средний возраст 7,8±3,2 лет.

Во вторую группу вошли 92 ребенка (50 мальчиков и 42 девочки) без признаков атопии на момент осмотра и в анамнезе и отсутствием семейной отягощенности по аллергическим заболеваниям из числа госпитализированных травматологическое отделение Муниципальной детской клинической больницы скорой помощи №3 (контрольная группа I). Средний возраст составил 8,1 ±2,4 года.

В' третью группу включены 100 пациентов (53 мальчика и 47 девочек) М>ниципальной детской клинической больницы №1 (г. Новосибирск), аллергологический анамнез при отборе не учитывался (контрольная группа II). Средний возраст составил 6,7±2,3 лет.

План обследования пациентов с атопическим дерматитом включал:

• целенаправленный сбор аллергологического анамнеза с заполнением специально разработанной анкеты, куда включены данные семейного анамнеза (наличие аллергических заболеваний у родственников), сведения о возрасте и причинах манифестации заболевания, течении атопического дерматита, сезонности обострений применявшихся методах терапии. Кроме этого в анкетах была представлена информация о жилищно-бытовых условиях, воздействии табачного дыма, течении беременности и родов, периоде новорожденности, характере вскармливания и введении прикормов, перенесенных инфекционных заболеваниях, сопутствующей патологии.

• клинический осмотр ребенка, общий анализ крови и мочи, биохимический анализ крови, определение уровня общего IgE, аллерген-специфических IgE, иммуноглобулинов классов А, М, G, копроовоцистоскопию, а также иммунограмму с определением функций Т-клеточного, В-клеточного и фагоцитарного звеньев иммунитета, НСТ-тест, бактериологическое исследование кала на дисбактериоз, фиброгастродуоденоскопию, дуоденальное зондирование, электрокардиографию и ультразвуковое исследование внутренних органов по показаниям.

Формулировка основного диагноза проведена согласно классификации и в соответствии с рекомендациями научно-практической программы «Атопический дерматит у детей: диагностика, лечение и профилактика» (2000). Для оценки степени тяжести заболевания использовалась полуколичественная шкала SCORAD (Scorning of Atopic Dermatitis) объединяющая объективные (площадь поражения кожных покровов, интенсивность клинических проявлений) и субъективные (интенсивность

зуда, нарушения сна) симптомы (Europian task force on atopic dermatitis. Severity scorning of atopic dermatitis: the SCORAD index., 1993).

Оценка эффективности терапии проводилась с учетом показателей шкалы SCORAD через две недели, 1 месяц и 2 месяца от начала лечения.

Уровень общего IgE в сыворотке крови оценивали согласно инструкции по применению иммуноферментной тест-системы ИФА-БЕСТ-Стрип (ЗАО «Вектор-Бест» п. Кольцове, Россия). Определение специфических иммуноглобулинов класса Е сыворотке крови проводилось иммуноферментным методом (тест-система IgE-a/т-ИФТС; НПО «Микроген-Аллерген», г. Ставрополь). По общему анализу крови оценивали количество эозинофилов в периферической крови.

Оценка полиморфизма глутатион S-трансфераз Ml и Т1

Выделение ДНК из образцов цельной крови проводилось по методу Kunkel L.M. et al., 1977. Полиморфизм генов GSTM1, GSTT1 определялся с помощью полимеразной цепной реакции по методам Zhong S. et al., 1993 и Pemble S. et al., 1993 соответственно. Метод генотипирования позволял различать гомозиготную делецию гена (нуль-генотип, GSTM1-, GSTT1-) от гетерозиготы и нормальной гомозиготы, объединенных как плюс-генотип (GSTM1+, GSTT1+).

Методы статистического анализа

По результатам исследования была сформирована база данных в виде таблицы в пакете программ MS Excel 2000. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 5.0» для медико-биологических исследований. Произведен расчет среднеарифметических значений (М), средних квадратических отклонений (а). Оценка значимости различий проводилась по одному выделенному признаку: для средних величин с помощью t критерия Стьюдента (t), для качественных признаков по критерию х2 и двустороннему точному критерию Фишера Сравнение содержания общего IgE и количества эозинофилов периферической крови у детей с разными генотипами проводилась с применением непараметрического критерия Манна-Уитни.

Оценка ассоциации генотипов с риском развития АД, и клиническими особенностями течения заболевания проводилась по величине отношения шансов (odds ratio, OR) (Pearse N., 1993). Величина 95% доверительного интервала для значения OR рассчитана по методу Woolf (Реброва О.Ю, 2002). Для количественной оценки влияния генетических признаков на формирование особенностей клинического течения атопического дерматита использовался дисперсионный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Под наблюдением находилось 109 детей (57 мальчиков и 52 девочки) с диагнозом атопический дерматит из числа госпитализированных в Новосибирский областной аллергодерматологический центр. Распределение по возрасту было следующим: в возрасте 2-3 года наблюдалось 14 (12,9%) пациентов, 4-7 лет - 31 (28,4%), 8-12 лет -29 (26,6%) и 13-16 лет-35 (32,1%) больных.

С диагнозом атопический дерматит младенческая форма обследовано 5 (4,6%) пациентов, атопический дерматит детская форма - 63(57,8%), подростковая форма АД зарегистрирована у 41(37,6%) ребенка.

С тяжелым атопическим дерматитом наблюдалось 38 (34,9%) детей, АД средней степени тяжести отмечался у 64 (58,7%) пациентов. Легкая степень тяжести атопического дерматита регистрировалась у 7 (6,4%) больных.

Все больные были обследованы в стадию обострения кожного процесса: фаза выраженных клинических проявлений отмечалась у 68 (72,3%) детей, фаза умеренных клинических проявлений - у 26 (27,6%).

У 74 (67,9%) пациентов кожных процесс носил распространенный характер, у 20 (18,3%) - диффузный, 15 (13,8%) детей наблюдались с ограниченным поражением кожных покровов.

У всех детей кожный процесс носил рецидивирующий характер, для 75,6% детей была характерна сезонность обострений, преимущественно в осенне-весенний, осенне-зимний период.

Течение атопического дерматита осложнялось присоединением вторичной инфекции у 21,1 % пациентов.

Аллергические заболевания органов дыхания встречались у 25,7% детей: бронхиальная астма (11,0%), поллиноз (9,2%), аллергический ринит (5,5%).

1. Ассоциация полиморфизма глутатион S-трансфераз Ml и Т1 с риском развития атопического дерматита у детей

Частоты встречаемости полиморфизма генов 08ТМ1 и 08ТТ1 у детей атопическим дерматитом и в группах контроля представлены в таблице 2.

Таблица 2

Частота встречаемости генотипов 08ТМ1 и 08ТТ1 в исследуемых группах

^^Группы генотиГн>1 Атопический дерматит Контрольная группа I , Контрольная группа II

вБТМ!- 45 (41,3%) 38 (40,1%) 39 (39,0%)

ОБТМ1+ 64 (58,7%) 55 (59,9%) 61 (61,0%)

вБт- 29 (26,6%)* 11 (11,9%) 19(19,0%)

С57Т/+ 80 (73,4%)* 81 (88,1%) 81 (81,0%)

Примечание: * - р=0,01 при сравнении групп «атопический дерматит» и «контрольная группа I», где р - уровень значимости различий по критерию X2

При сравнении частоты встречаемости генотипов глутатион S-трансфераз Ml иТ1 у детей с атопическим дерматитом и в контрольной группе достоверных различий не обнаружено, что, возможно, связано с широкой распространенностью аллергических заболеваний в популяции, так как при составлении контрольной группы II аллергологический анамнез не учитывался. Поэтому была составлена контрольная группа I, являющаяся противоположным клиническим фенотипом основной группы, критерием включения в которую было отсутствие проявлений атопии у ребенка и его ближайших родственников.

Анализ частот генотипов 08ТЫ1, 08ТТ1 у детей основной и контрольной группы I выявил достоверное увеличение нуль-генотипа 08ТТ1 у больных АД (р=0,01), из чего можно предположить, что полиморфизм 08ТТ1 играет роль в предрасположенности к атопическому дерматигу.

При изучении частоты встречаемости сочетаний генотипов 08ТТ1 и 08ТМ1, выявлено, что комбинация 08ТМ1-/08ТТ1- достоверно чаще отмечался у больных атопическим дерматитом по сравнению с контрольной группой I (р=О,ОЗ).

Для оценки ассоциации изучаемых генетических признаков с риском развития атопического дерматита были рассчитаны величины отношения шансов. Расчеты показывают, что полиморфизм 08ТМ1 не связан с риском развития АД. Нуль-генотип 08ТТ1 ассоциирован с предрасположенностью к атопическому дерматиту, а плюс-генотип 08ТТ1 является фактором устойчивости к развитию заболевания (табл. 3).

Таблица 3

Отношение шансов развития атопического дерматита у детей с разными генотипами

08ТМ1 и 08ТТ1

вБТМ1- СБТМ1+ С57Т/- (75777+

(Ж (95% С1)1 1,02 (0,56-1,86) 0,98 (0,54-1,79) 2,67 (1,18-6,13) 0,37 (0,16-0,85)

Р 0,9 0,9 0,01 0,01

Примечание: р - уровень значимости различий по критерию у?

1 - здесь и далее в скобках приведены значения 95% доверительного интервала для величины отношения шансов (95% С1).

При подобном анализе, проведенном для комбинаций генотипов, обнаружено, что комбинация 08ТМ1-108ТТ1- является фактором риска развития атопического дерматита (табл.4).

Таблица 4

Отношение шансов развития атопического дерматита у детей с разными ___комбинациями генотипов 08ТМ1 и 08ТТ1___

"\сенотип СБТМ1+ вБТМ1- СЗТМ1+ СБТМ1-

/<75777+ /65777- /С75777-

(Ж 0,78 0,68 1,95 3,36

(95% С1) (0,43-1,42) (0,36-1,28) (0,78-12,17) (1,03-15,3)

Р 0,4 0,2 0,2 0,03

Примечание: р - уровень значимости различий по критерию

Вероятно биохимический дефект, возникающий при делеции гена 08ТТ1, более значим для реализации предрасположенности к атопическому дерматиту, чем дефект, возникающий при мутации гена 08ТМЬ Однако, комбинация мутантных генотипов 08ТТ1 и 08ТМ1 взаимно усиливает рисковую значимость отдельно взятого нуль-полиморфизма 08ТТ1, так как величина ОЯ для комбинации 08ТМ1-/08ТТ1-(ОЯ=3,36) выше, чем для генотипа 08ТТ1- (ОК=2,67).

2. Связь генотипов 08ТТ1 и 08ТМ1 с особенностями клинического течения атопического дерматита

Была оценена ассоциация полиморфизма 08ТТ1 и 08ТМ1 с таким комплексным признаком как тяжесть течения атопического дерматита.

Величины отношения шансов развития тяжелого течения атопического дерматита показывают, что данный признак ассоциирован как с нуль-полиморфизмом 08ТМ1 (р<0,0001), так и с мутантным генотипом 08ТТ1 (р=О,ОЗ) (табл.5). Плюс-генотипы 08ТМ1 и 08ТТ1 статистически 'достоверно являются благоприятными прогностическими факторами в отношении тяжелого течения заболевания.

Таблица 5

Отношение шансов тяжелого течения атопического дерматита у детей с разными генотипами 08ТМ1 и 08ТТ1

GSTM1- GSTM1+ GSTT1- GSTTI+

OR (95% CI) 4,46 (1,79-11.27) 0,22 (0,09-0,56) 2,50 (1,04-5,14) • 0,40 (0,19-0,95)

Р 0,0001 0,0001 0,03 0,03

Примечание: р - уровень значимости различий по критерию yt

Сочетание двух мутантных генотипов усиливает риск развития тяжелого атопического дерматита в сравнении с наблюдаемым для индивидуальных генотипов (табл. 6). Комбинация генотипов 08ТМ1+/081Т1+ является .фактором устойчивости к развитию тяжелого течения заболевания

Таблица 6

Отношение шансов тяжелого течения атопического дерматита у детей с разными комбинациями генотипов 08ТМ1 и 08ТТ1

GSTM1-/GSTT1- GSTMI+ /GSTT1- GSTM1-/GSTT1+ GSTM1+ /GSTTI+

OR (95% CI) 5,69 (1,47-23,76) 0,88 (0,24-3,13) 2,11 (0,83-5,4) 0,22 (0,08-0,59)

Р 0,007 0,9 0.08 0,001

Примечание: р - уровень значимости различий по критерию

Тяжесть заболевания - комплексный признак, сочетающий в себе оценку интенсивности кожных проявлений и частоты рецидивирования заболевания. Если частота рецидивирования зависит, в первую очередь, от воздействия внешних факторов-триггеров (аллергенных и неаллергенных), то распространенность кожного процесса реализуется за счет влияния эндогенных факторов (дисбаланс иммунной и иейровегетативной регуляции, повышенная продукция биологически активных веществ). Следовательно, ассоциация нуль-полиморфизма GSTM1 и GSTT1 с тяжелым течением АД предполагает не только сопряженный с отсутствием активности фермента сдвиг токсификации/детоксификации чужеродных соединений, но и изменения в метаболизме эндогенных субстратов: продуктов ПОЛ, простагландинов, катехоламинов (van DeltfJ.H. et al., 2001; Hayes J.D., 2000; Fryer A. et al., 2000).

При изучении распространенности кожного процесса обнаружено, что генотип GSTM1- является фактором риска развития диффузного поражения кожи (OR=2,96 (95% CI 1,07-9,76), р=0,033) а плюс-генотип GSTM1 служит благоприятным прогностическим фактором (OR= 0,33, (95% CI 0,12-0,92), р=О,ОЗЗ).

Нуль-генотип GSTM1 является фактором, предрасполагающим к частым обострениям АД: у пациентов с генотипом GSTM1- достоверно чаще встречалось непрерывно-рецидивирующее течение и атопический дерматит с частотой

ю

обострений 6-8 (р=0,0001). У большинства больных с 08ТМ1+ генотипом АД рецидивировал с частотой до 3-х раз в год. Подобная оценка, проведенная для гена 08ТТ1, значимых различий не выявила.

У больных с комбинациями генотипов 08ТМ-Ю8ТТ1- и 08ТМ1-108ТТ1+ частота обострений атопического дерматита достоверно выше, чем у пациентов с комбинациями 08ТМ+/08ТТ1-, 08ТМ+/08ТТ1+ и составляет в среднем 6,1±2,2 (р=О,ОЗ) и 6,3±2,4 (р=0,008) соответственно. У детей с двойным «диким» генотипом АД рецидивировал с частотой 2,9±1,1 раза в год (р=0,001).

Атопический дерматит - хроническое заболевание, характеризующееся возрастной эволюцией клинических проявлений. У большинства детей младшего возраста кожный процесс имеет признаки экссудативного воспаления, которое с возрастом приобретает характер пролиферативного, при этом, раннее появление инфильтрации и лихенизации ухудшает прогноз течения заболевания. При изучении возраста появления признаков пролиферативных изменений на коже (застойная эритема, папулезная сыпь, инфильтрация, лихенизация с характерной локализацией) обнаружено, что у детей с генотипом 08ТМ1- трансформация происходила значительно раньше: в среднем в 3,1± 1,6 года, в то время как у детей с 08ТМ1+ генотипом в 4,6±2,3 года ^=3,0; p=0,005). У пациентов с комбинациями генотипов 08ТМ1-/08ТТ1- и 08ТМ1-/08ТТ1+ появление пролиферативных изменений на коже происходило достоверно раньше по сравнению с другими сочетаниями (табл. 7).

Таблица 7

Возраст появления пролиферативных изменений на коже у детей с разными

комбинациями генотипов 08ТМ1, 08ТТ1

--^^^^генотап^ СБТМ!-Ю5ТТ1- вБТЫ!-/05ГГ1+ СБТМ1 + /05777- С5Ш7 + /С57Т7 +

Средний возраст (в годах) 2,9±1,1* 3,2±1,4+ 5,5±2,9 4,4±2,0

Примечание: *; + - р<0,05 при сравнении с генотипами 08ТМ1+/08ТТ1- и 08ТМ1+/08ТТ1+, где р - уровень значимости различий по ^критерию Стьюдента

В результате исследования было выявлено, что генетический полиморфизм 08ТМ1 и 08ТТ1 принимает участие в формировании клинических особенностей атопического дерматита, поэтому представилось важным изучить силу влияния генетических признаков на характер течения АД у детей. Были рассчитаны доли вклада (в %) полиморфизма 08ТМ1, 08ТТ1 в развитие тяжелого течения АД, диффузного поражения кожи, высокой частоты обострений АД, раннего появления пролиферативных изменений на коже.

Предыдущий анализ показал, что генотип 08ТМ1- является фактором риска развития тяжелого течения атопического дерматита, доля вклада этого генетического признака составляет 12,1% (95%С1 9,0-15,2%, F=9,78, р=0,002). Также велико влияние полиморфизма GSTM1 на формирование диффузного поражения кожных покровов (19,4%; 95%С1 15,8-22,9%, F=7,42, p=0,009), частых обострений АД (22,4%; 95%С1 19,6-25,2%, F=14,2, p=0,0002), раннего появления пролиферативных изменений на коже (21,2%; F=12,79, p=0,01) (рис.1).

Вклад полиморфизма GSTT1 составляет для развития тяжелого течения атопического дерматита 5,4%, (95%С1 2,2-8,6, F=6,02, р=0,01). В отношении диффузного поражения кожи, высокой частоты обострений, ранних

пролиферативных изменений влияние этого фактора имеет еще меньшую величину и не достигает статистической значимости.

тяжелое течение диффузное частые ранние

поражение обострения пролиферативные

изменения

□ полиморфизм СБТМ 1 ■ другие факторы

Рисунок 1. Вклад полиморфизма GSTM1 в формирование клинических особенностей течения атопического дерматита у детей

Далее был проведен анализ связи генотипов GSTM1, GSTT1 и их комбинаций с показателями сенсибилизации. Обнаружено, отсутствие достоверных различий в уровне общего IgE у детей с нуль-генотипами GSTM1 и 77 по сравнению с плюс-генотипами (р=0,3 и р-0,7 соответственно). Однако, при изучении уровня общего IgE у детей с комбинациями генотипов, обнаружено статистически достоверное увеличение количества пациентов с нормальным содержанием IgE в плазме крови у больных с GSTM1+/GSTT1'+ (р=0,04) в то время как в группах с комбинациями GSTM1-IGSTT1-, 08ТМ1-/08ТТ1+, 08ТМ1+/08ТТ1- преобладали пациенты с повышенным уровнем общего IgE.

Ксенобиотики могут обладать как непосредственным сенсибилизирующим действием, так и увеличивать иммуногенность других «натуральных аллергенов», например пыльцевых (Балаболкин И.И., 1999; Скепьян Н.А., 2000, Fennessy M, 2000). Было предположено, что различия в ферментативной активности у носителей разных генотипов GSTM1, GSTTJ могут обусловливать и разницу в чувствительности к некоторым группам аллергенов. Анализ показал, что сенсибилизация к пищевым, пыльцевым, эпидермальным и бытовым аллергенам у детей с нуль-генотипами GSTM1 и GSTT1 существенно не отличалась от таковой у пациентов с плюс-генотипами (р=0,1).

Изучение уровня эозинофилов периферической крови обнаружило более высокое содержание эозинофилов у детей с нуль-генотипом GSTM1 по сравнению с пациентами с плюс-генотипом (р=0,01) и у пациентов с генотипом GSTM1-/GSTT1 + при сравнении с другими комбинациями (р=0,02)

В целом проведенные исследования показали, что нуль-генотип GSTM1 ассоциирован с тяжелым течением атопического дерматита, диффузным поражением кожных покровов, частыми обострениями, ранним появлением пролиферативных изменений на коже. Наряду с клиническими признаками, генотип GSTM1- связан с более высоким содержанием эозинофилов в периферической крови. Наиболее

неблагоприятной для прогноза течения атопического дерматита является комбинация двух мутантных генотипов GSTM1-/GSTT1-.

3 Влияние пассивного курения на предрасположенность и особенности клинического течения атопического дерматита у детей

Клинико-эпидемиологические исследования показывают, что пассивное курение является фактором, способствующим формированию и поддерживающим течение бронхиальной астмы у детей (Гавалов СМ. и соавт. 2000; Strachan D.P., 1998; Gilliand F.D. et al., 2002). Табачный дым содержит более 4000 соединений, среди которых много субстратов глутатион S-трансфераз Ml и Т1 (Ляхович В.В. и совт. 2000; Hayes J.D., 2000; Sheehan D.A. et al., 2001). Дети с атопическим дерматитом, родственники которых курили в квартире, составили группу пассивных курильщиков (п=60). Пациенты, не подвергавшиеся такому воздействию, были квалифицированы как «некурящие» («не ПК») (п=49).

Изучение риска развития атопического дерматита у детей с разными генотипами GSTM1 и GSTT1, в зависимости от фактора пассивного курения, выявило что, воздействие табачного дыма изменяет величину устойчивости к развитию заболевания у носителей «благополучной» комбинации генотипов GSTM1+IGSTT1+. В группе «некурящих» детей сочетание «диких» генотипов является фактором устойчивости к развитию АД (0R=0,3; 95%CI 0,11-0,98; р=0,03)в отличие от группы пассивных курильщиков (0R=1,02; 95%CI 0,47-2,19; р=0,9).

Выявлено, что генотип GSTM1- является фактором риска развития тяжелого течения атопического дерматита как для пассивных курильщиков, так и для больных, не имеющих контакта с табачным дымом (р=0,04 и р=0,03 соответственно) (табл.8). Диффузное поражение кожных покровов возникает достоверно чаще у носителей нуль-генотипа GSTM1 в группе пассивных курильщиков (р=0,04). Нуль-полиморфизм GSTT1 является более значимым для тяжелого течения АД (р=0,03) у «некурящих» детей. Тяжелое течение АД достоверно реже встречается у носителей комбинации генотипов GSTM1+/GSTT1+ в обеих группах (0R-0,24; 95%CI 0,06-0,9; р=0,03 для пассивных курильщиков и 0R=0,18; 95%CI 0,01-0,78; р=0,02 для «нек>рящих»).

Таблица 8

Ассоциация полиморфизма 08ТЫ1 и 08ТТ1 с клиническими особенностями _атопического дермагита в зависимости от _ фактора курения_

^-Кдан. показатели генотип Тяжелое течение Диффузное поражение кожных покровов

ПК «не ПК« ПК «не ПК»

GSTM1- 3,3* (1.04-16,5) 3,74* (1,14-28,5) 4,8* (1,08-93,4) 1,75 (0,35-8,99)

GSTT1- 2,69 (0,76-9,66) 5,25+ (1,28-38,8) 0,43 (0,07-2,61) 3,67 (0,62-22,16)

Примечание: *; - р<0,05 при сравнении с плюс-генотипами, где р - уровень значимости различий по критерию ^

3. Эффективность терапии атонического дерматита у детей с различными

генотипами 08ТМ1 и 08ТТ1

Изучение динамики клинических проявлений на фоне лечения, выявило, что у части больных атопическим дерматитом проведение стандартной терапии, соответствующей форме и степени тяжести заболевания, не давало выраженного положительного эффекта. Было высказано предположение, что степень выраженности ответа на проводимое лечение может зависеть от полиморфизма глутатион S-трансфераз Ml и Т1, которые принимают участие в метаболизме медиаторов аллергического воспаления и лекарственных средств.

Под наблюдением находились 56 детей в возрасте от 3 до 14 лет (28 девочек и 28 мальчиков). Детская форма атопического дерматита была диагностирована у 31 ребенка, подростковая - у 25 пациентов. У 11 детей отмечалось диффузное поражение кожи, у 45- распространенное. Тяжелое течение атопического дерматита встречалось у 21 ребенка, среднетяжелое - у 35 детей. Нуль-генотип 08ТМ1 встречался у 22 больных, плюс-генотип - у 34 пациентов. Распределение генотипов 08ТТ1 было следующим: 19 детей с 08ТТ1-, и 37 с 08ТТ1+.

Все дет получали комплексную терапию по стандарту, рекомендованному научно-практической программой «Атонический дерматит у детей: диагностика, лечение и профилактика» (2000).

У всех больных на фоне лечения отмечалось снижение индекса тяжести атопического дерматита. Однако, у пациентов с нуль-генотипом 08ТМ1 величина SCORAD на 14-й день уменьшилась в среднем на 29,8% от исходной и составила 37,2±11,4 баллов, те же показатели у больных с 08ТМ1+ составили 37,5% и 30,4±8,2 баллов ^=2Д, p=0,04). Анализ величины индекса SCORAD через 1 и 2 месяца о начала терапии выявил, что более выраженная положительная динамика отмечалась у больных с плюс-генотипом 08ТМ1 (;=2,5, p=0,02 и t=2,6, p=0,01 соответственно) (рис 2). Достоверных различий в распространенности процесса (в%) на фоне терапии у носителей 08ТМ1- и 08ТМ1+ не обнаружено. Положительная динамика интенсивности поражения кожи (выраженность эритемы, отека/папул, корок/мокнутня, лихенифнации, сухости кожи в баллах) более выражена у носителей генотипа С5ГМ/ + (1=2,1, р=0,04). У пациентов с 08ТМ1+ достоверно ниже показатели, отражающие субъективные симптомы (выраженность зуда и нарушений сна в баллах) через 2 недели ^=2,46, p=0,02), 1 и 2 месяца от начала лечения (;=21, р=0,04 и ;=2,9, р=0,008 соответственно).

При анализе динамики индекса SCORAD у детей с тяжелым и среднетяжелым течением атопического дерматита выявлено, что более медленный регресс симптомов заболевания отмечается у больных с нуль-генотипом 08ТМ1: ;=2,3, р=0,03 для тяжелого течения и ;=2,1, р=0,04 - для среднетяжелого.

Подобный анализ детей с различными генотипами 08ТТ1 достоверных отличий в выраженности ответа на проводимое лечение не выявил.

Примечание р - уровень значимости различий по Меритерию Стьюдента между ОБТМ1- и ОБТМ1+

Рис.2 Динамика объективных и субъективных симптомов на фоне терапии у детей с разными генотипами 08ТМ1

У 37 больных стандартный протокол лечения атопического дерматита был усилен введением кетотифена, рекомендованного научно-практической программой «Атопический дерматит у детей: диагностика, лечение и профилактика» (2000), в качестве дополнительного средства системной фармакотерапии.

Анализ динамики клинических проявлений атопического дерматита через 1 и 2 месяца от начала терапии показал, что достоверных отличий в величине индекса SCORAD (р=0,3), выраженности субъективных симптомов (р=0,5) распространенности (р=0,4) и интенсивности поражений кожи (р=0,8) у больных принимающих и не принимающих кетотифен не обнаружено.

.При подобном анализе у детей с различными генотипами 08ТМ1 и 08ТТ1 положительного эффекта от назначения кетотифена также не наблюдалось.

Таким образом, мутация гена 08ТМ1, приводящая к утрате его функции (нуль-полиморфизм), является одним из факторов, определяющих медленный регресс клинических проявлений атопического дерматита на фоне проводимой терапии. Длительное сохранение поражений кожи может способствовать вторичному инфицированию, что приводит к усилению тяжести заболевания и снижению

качества жизни. Назначение кетотифена в составе комплексной терапии атопического дерматита не увеличивает ее эффективности.

ВЫВОДЫ

1. Нуль-генотип глутатион S-трансферазы Т1 является фактором риска развития атопического дерматита у детей (ОЯ=2,67, р=0,01). Сочетание нуль-генотипов 08ТМ1 и 08ТТ1 увеличивает риск развития заболевания (ОЯ=3,36, р=0,03). Генотип 08ТТ1- служит фактором риска развития атопического дерматита преимущественно для мальчиков (ОЯ=3,74, р=0,043)

2. Нуль-генотипы 08ТМ1 и 08ТТ1 являются факторами риска развития тяжелого течения атопического дерматита (ОЯ=4,46, р<0,0001 и ОИ=2,5, р=0,03 соответственно). Для больных с нуль-генотипом 08ТМ1 характерно диффузное поражение кожи (р=О,ОЗ), непрерывно-рецидивирующе течение и частота обострений 6-8 раз в год (р=0,0001), раннее появление пролиферативных изменений (р=0,005). Генотип 08ТМ1- служит фактором риска развития тяжелого течения атопического дерматита и диффузным поражением кожи, преимущественно у девочек (0Я=7,0, р=0,004 и 0Я=20,08, р=0,001 соответственно).

3. Воздействие табачного дыма снижает величину устойчивости к развитию атопического дерматита у детей с комбинацией генотипов 08ТМ1+/08ТТ1 + и повышает риск развития диффузного поражения кожи у детей с генотипом 08ТМ1- (ОЯ=4,8, р=0,04)

4. Для больных с 08ТМ1- характерно длительное сохранение симптомов атопического дерматита на фоне стандартной терапии (р=0,01). Назначение кетотифена в составе комплексной терапии не увеличивает эффективность лечения.

5. Двойной мутантный генотип 08ТМ1-/08ТТ1- является прогностическим фактором тяжелого течения атопического дерматита у детей (ОЯ=Л5,69, р=0,007), а комбинация 08ТМ1+/08ТТ1 + прогностическим признаком благоприятного течения заболевания (0Я=0,22, р=0,001).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

У детей раннего возраста с наследственной отягощенностью по аллергическим заболеваниям необходимо определять полиморфизм гена 08ТТ1 с целью формирования группы риска развития атопического дерматита.

У больных атопическим дерматитом необходимо определение полиморфизма генов 08ТМ1 и 08ТТ1 для оценки риска развития тяжелых, форм заболевания и разработки индивидуальной программы профилактики неблагоприятного течения атопического дерматита.

Больные с комбинацией генотипов 08ТМ1-/08ТТ1- составляют группу риска по развитию тяжелого течения атопического дерматита, поэтому наблюдение за этими детьми должно осуществляться по схеме диспансеризации группы риска по развитию инвалидизирующих форм заболевания.

Нецелесообразно дополнительное введение кетотифена в комплексную терапию атопического дерматита, так как его назначение не увеличивает эффективности терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вавилин В.А., Сафронова О.Г., Ляпунова А.А., Ляхович В.В., Мананкин Н.А., Казначеева Л.Ф., Гавалов СМ. Полиморфизм цитоплазматических глутатион S-трансфераз Ml, Т1 и PI у больных бронхиальной астмой и атопическим дерматитом. // Тез. науч. докл. 3-го съезда биохимического общества. - Санкт-Петербург, 2002 г. - С. 141-142

2. Казначеева Л.Ф., Вавилин В.А., Ляпунова А.А., Сафронова О.Г. Мананкин Н.А. Полиморфизм ферментов биотрансформации ксенобиотиков у детей с атопическим дерматитом. // Аллергология. - 2002. - № 4. - С. 15-17

3. Ляпунова А.А., Казначеева Л.Ф., Сафронова О.Г. Полиморфизм гена глутатион S-трансферазы Ml у детей с атопическим дерматитом. // Тез. докл. 12 научн.-пр. конф. врачей «Актуальные вопросы современной медицины» -Новосибирск, 2002. - С. 94

4. Ляпунова А.А., Сафронова О.Г., Вавилин В.А., Казначеева Л.Ф., Мананкин Н.А. Ассоциация полиморфизма глутатион S-трансферазы Ml с предрасположенностью к атопическому дерматиту. // Тез. Докл. ГУ-го съезда Российской ассоциации ахчергологов и клинических иммунологов. Москва, 2002. - С.234

5. Ляпунова А.А., Сафронова О.Г., Казначеева Л.Ф., Вавилин В.А., Мананкин Н.А. Полиморфизм гена глутатион S-трансферазы М1 у детей с атопическим дерматитом. // Тез. докл. IX Росс. Национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2002. - С. 561

6. Мананкин Н.А., Ляпунова А.А., Вавилин ВЛ., Щепотина Е.Г. Активность цитохрома Р4503А у детей с медикаментозными отравлениями. // Тез. докл. 12 научн.-пр. конф. врачей «Актуальные вопросы современной медицины». -Новосибирск, 2002.- С. 93

7. Мананкин Н.А., Ляпунова А.А., Вавилин В.А., Щепотина Е.Г. Активность цитохрома Р4503А у детей с медикаментозными отраапениями. // Тез. докл. IX Росс. Национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2002. - С. 74

8. Вавилин ВЛ., Макарова СИ., Сафронова О.Г., Ляпунова А.А., Ляхович В.В., Батычко О.А., Казначеева Л.Ф., Гавалов СМ. Полиморфизм ферментов биотрансформации ксенобиотиков и предрасположенность к атопическим заболеваниям у детей. // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. - Новосибирск, 2003. - С 98-106.

9. Вавилин В.А., Сафронова О.Г., Ляпунова А.А., Ляхович В.В., Казначеева Л.Ф., Мананкин Н.А., Молокова А.В. Эффекты взаимодействия генотипов GSTM1, GSTT1 и GSTP1 в детерминации предрасположенности к атопическому дерматиту. // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. - 2003. -Т. 136, № 10. - С. 438-441

Ю.Ляпунова А. А., Казначеева Л.Ф., Сафронова О.Г., Вавилин В Л., Мананкин

H.А. Полиморфизм гена глутатион S-трансферазы М1 у детей с атопическим дерматитом. // Сборник трудов конференции, посвященной 90-летию академика РАМН Бисяриной В.П. - Омск, 2002 . - С 247-248

11. Молокова А.В., Казначеева Л.Ф., Сафронова О.Г., Ляпунова А.А., Вавилин В.А. Особенности течения атопического дерматита и сочетанных форм аллергии у детей в зависимости от генотипов глутатион S-трансфераз М1 и Р1. // Вестник НГУ (серия: биология, клиническая медицина). - 2003. - Т.1, выпуск

I.-С 22-31.

12.Сафронова О.Г., Вавилин В.А, Ляпунова А.А, Макарова СИ., Ляхович В.В., Казначеева Л.Ф., Мананкин НА., Батычко О.А., Гавалов СМ. Изучение связи полиморфизма глутатион S-трансферазы Р1 с бронхиальной астмой и атопическим дерматитом // Бюлл. Экспер. Биол. Мед. - 2003. -Т.136, №7. - С. 84-87

13.Vavilin V.A., Safronova O.G., Lyapunova A.A., Lyakhovich V.V., Kaznacheeva L.F., Manankin N.A., Molocova A.V. Interaction of GSTM1, GSTT1, and GSTP1 Genotypes in Determination of Predisposition to Atopic Dermatitis. // Bui. Exper. Biol. Med. - 2003. - №4. - P. 388-3

АД - атопический дерматит ГЩР - полимеразная цепная реакция ПОЛ — перекисное окисление липидов «ПК» - пассивные курильщики

«не ПК» - дети не подвергавшиеся воздействию табачного дыма

ФБК - ферменты биотрансформации ксенобиотиков

GST - глутатион-8трансферазы (ферменты)

GST- гены глутатион S-трансфераз

GSTM1 - глутатион S-трансфераза Ml (фермент)

GSTT1 - глутатион S-трансфераза Т1 (фермент)

GSTM1 - ген глутатион S-трансферазы Ml

GSTT1 - ген глутатион S-трансферазы Т1

IgE - иммуноглобулины класса Е

OR - (odds ratio) - отношение шансов

SCORAD - (Scorning ofAtopic Dermatitis) - индекс степени тяжести АД

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Соискатель

Ляпунова А.А.

m 11027

Актуальность проблемы: Атопический дерматит (АД) - актуальная проблема педиатрии. В общей структуре детской заболеваемости удельный вес данной патологии составляет от 3% до 18,5% [42; 67; 72; 105; 119; 166].

Острота проблемы обусловлена не только высокой распространенностью атопического дерматита, но и ранним началом заболевания, частым формированием сочетанных, торпидных и инвалидизирующих форм [60; 67; 76].

В настоящее время не вызывает сомнений значительная роль генетических факторов в развитии атопического дерматита: подчеркивается роль семейной отягощенности по аллергическим заболеваниям, определен ряд «генов-кандидатов», предрасполагающих к развитию атопии [27; 62; 74; 96; 120].

В то же время, высокая значимость генетической предрасположенности не означает однозначного развития заболевания, реализация которого достигается при сочетании аддитивного воздействия генов и средовых факторов риска. К числу таких факторов помимо аллергенной нагрузки относят социально-гигиенические, социально-экономические, климато-географические, психоэмоциональные, экологические [67; 75; 142; 172; 230].Постоянное загрязнение окружающей среды не может не сказываться отрицательно на состоянии здоровья населения, в первую очередь, детей. Это объясняется повышенной проницаемостью биологических барьеров, свойственной детскому возрасту, напряженностью основного обмена, незрелостью ферментных систем детоксикации, высокой интенсивностью процессов роста и дифференцировки, недостаточностью защитных механизмов системного и местного иммунитета, ограниченностью функциональных возможностей печени и почек, направленных на элиминацию ксенобиотиков [18; 19; 38; 79; 87; 92] Многие авторы подчеркивают значимость экологического фактора в формировании хронической патологии органов и систем ребенка, среди которой первое ранговое место занимают аллергические заболевания, в первую очередь, атопический дерматит [10; 20; 33; 36; 88].

Исследования, проведенные в последние десятилетия, показали, что заболеваемость атопическим дерматитом среди детей, проживающих в городах с высоким уровнем загрязненности, в среднем в 3 раза выше, чем в относительно «чистых» районах [53; 70; 152; 155; 157; 189; 222; 226].

В процессе эволюции организм выработал определенные механизмы адаптации к воздействию токсичных экзогенных и эндогенных веществ, суть которых сводится к процессам биотрансформации, осуществляемым ферментами биотрансформации ксенобиотиков, и элиминации. Механизмы клеточной детоксикации очень важны для защиты организма от воздействия ксенобиотиков. Кроме этого, они также необходимы для защиты клеток от веществ, образующихся в результате нормально протекающих метаболических процессов, продуктов перекисного окисления липидов, активных форм кислорода, биологически активных веществ [108; 132; 136; 203]. Эта функция ФБК эволюционно сложилась раньше, чем активность в отношении экзогенных веществ [200]. Все ферменты биотрансформации характеризуются перекрывающейся субстратной специфичностью, индуцибельностыо и генетическим полиморфизмом. Эти свойства ФБК предопределяют различную индивидуальную чувствительность к воздействию ксенобиотиков за счет изменений баланса их токсификации/детоксификации, а также эндогенных веществ, создавая условия для протекания воспалительных и аллергических реакций разной степени выраженности у разных индивидов в ответ на один и тот же раздражитель [85; 161; 206; 220].

Реакции биотрансформации проходят в две стадии, каждая из которых может иметь самостоятельное значение. Первая фаза осуществляется главным образом цитохром Р450-зависимой системой, а вторая представлена реакциями конъюгации посредством глутатиоп-, N-ацетил-, сульфо-, УДФ-глюкуронозил -трансферазами [29; 139; 203; 219]. Среди ферментов II фазы наиболее широкими функциями обладают глутатион S-трансферазы (GST), катализирующие реакции конъюгации глутатиона с различными электрофильными ксенобиотиками, участвующие в метаболизме эндогенных медиаторов воспаления и являющиеся важным компонентом антиоксидантной, антиперекисной, антирадикалыюй защиты клетки [25; 90; 108; 118; 138; 148; 187].

В последнее десятилетие опубликовано большое число работ, касающихся изучения роли глутатион S-трансфераз в развитии генетически детерминированных, но в большой степени зависящих от факторов внешней среды заболеваний, в первую очередь, онкологических [14; 30; 91; 117; 147; 164; 177; 188; 234].

Метаболические механизмы участия глутатион S-трансфераз в воспалительных и аллергических реакциях остаются малоизученными, а имеющиеся в литературе сведения носят неоднозначный характер и касаются бронхиальной астмы. Исследования, проведенные В.А. Вавилиным и соавт. [15; 16; 23], выявили, что нуль-полиморфизм глутатион S-трансфераз М1 и Т1 являются факторами риска развития бронхиальной астмы у детей, а также предрасполагают к неблагоприятному течению заболевания. Т.Э. Иващенко [143], JI.A. Желенина [34] также показали, что нуль-генотипы GSTM1 и GSTT1 являются фактором риска для развития атопической бронхиальной астмы. С другой стороны, М.Б. Фрейдин [124], М. Kabesch [146] подобной взаимосвязи не выявили.

Однако, несмотря на высокую распространенность атопического дерматита среди детского населения, связь заболевания с макро- и микроэкологическими факторами, до настоящего времени не исследована роль глутатион S-трансфераз в развитии АД у детей. Остается неизвестной частота встречаемости полиморфных аллелей генов глутатион S-трансфераз у детей с АД и их роль в предрасположенности к заболеванию. До сих пор не определена связь разных генотипов GST с клиническими особенностями АД. Не изучена возможность прогноза течения атопического дерматита на основании полиморфной экспрессии генов GST.

Следовательно, изучение генетического полиморфизма глутатион Б-трансфераз М1 и Т1 (СгБТМ!, б^ТТ/) у детей с атопическим дерматитом и его влияния на течение и прогноз заболевания является обоснованным и целесообразным.

Цель исследования: Изучить ассоциацию полиморфизма генов глутатион Б-трансфераз классов М1 и Т1 с риском развития атопического дерматита и особенностями клинического течения заболевания. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить встречаемость генотипов глутатион Б-трансфераз М1 и Т1 у детей больных атопическим дерматитом и здоровых детей без признаков атопии.

2. Исследовать роль генотипов (7£ТМ/ и (75777 в формировании риска развития атопического дерматита и выявить их взаимосвязь с клиническими особенностями течения заболевания.

3. Исследовать влияние пассивного курения, на предрасположенность к атопическому дерматиту и его течение у детей с разными генотипами <757М/, (75777.

4. Оценить эффективность терапии у детей с атопическим дерматитом с учетом генотипов глутатион-8- трансфераз М1 и Т1.

5. Определить генетические маркеры благоприятного и неблагоприятного прогноза течения атопического дерматита основанные на полиморфизме генов глутатион 8-трансфераз М1 и Т1.

Научная новизна: Впервые дана характеристика частоты встречаемости полиморфных аллелей глутатион 8-трансфераз М1 и Т1 у детей, больных атопическим дерматитом. Установлено, что нуль-генотип (75777 является фактором риска развития атопического дерматита.

Впервые показана роль мутаций генов глутатион 8-трансфераз М1 и Т1 в формировании особенностей клинического течения атопического дерматита у детей. Выявлена связь полиморфизма (757Ж/ с длительным сохранением симптомов заболевания на фоне стандартной терапии АД.

Впервые выявлено, что нуль-генотип (75ТМ/ является фактором риска развития тяжелого течения атопического дерматита, диффузного поражения кожи и предрасполагает к частым обострениям и раннему появлению признаков хронического воспаления на коже.

Определены генетические маркеры благоприятного и неблагоприятного прогноза течения атопического дерматита, на основании оценки полиморфизма генов глутатион Б-трансфераз М1 и Т1.

Практическая значимость: При проведении исследований получены новые данные о генетических факторах предрасположенности к атопическому дерматиту у детей. Эти результаты имеют значение при формировании группы риска по развитию заболевания.

Определение полиморфизма генов С5ТМ/ и С5ТТ1 может рекомендоваться для раннего определения прогноза клинического течения атопического дерматита у детей. Полученные данные позволяют на начальных этапах оценить риск развития тяжелых форм атопического дерматита, разработать индивидуальную программу профилактики неблагоприятного течения АД.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Нуль-генотип глутатион Б-трансферазы Т1 в исследуемой популяции ассоциирован с риском развития атопического дерматита.

2. Нуль-генотипы ОБТМ! и (75777 являются прогностическими факторами неблагоприятного течения атопического дерматита.

3. Комбинация мутантных генотипов (75ГЛ/У и ОБТЛ ассоциирована с риском развития атопического дерматита и является наиболее неблагоприятной для прогноза течения заболевания.

4. Пассивное курение увеличивает риск развития диффузного поражения кожи у детей с генотипами С8ТМ1- и снижает величину устойчивости к развитию атопического дерматита у детей с комбинацией генотипов С5'7М7+/С57Т/+.

Внедрение в практику: Результаты исследования внедрены в практику работы Новосибирского областного аллергодерматологического центра (МУЗ МДКБ №1, г.Новосибирск).

Основные положения исследования включены в процесс ^дготовки студентов, врачей-интернов, клинических ординаторов на кафедре госпитальной педиатрии Новосибирской государственной медицинской академии.

Апробация материалов диссертации: Основные положения диссертации доложены на семинаре Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, 2002); на XII научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» 23-25 апреля (Новосибирск, 2002); на второй межрегиональной научно-практической конференции «Клинические аспекты использования молекулярно-биологической диагностики в медицине» 1-3 октября (Новосибирск, 2003); II Конгрессе детских аллергологов, 9-11 декабря (Москва, 2003); на семинаре Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, 2004).

Личный вклад автора: Целенаправленный сбор аллергологического анамнеза, наблюдение и клинические осмотры, оценка эффективности терапии у детей с атопическим дерматитом; забор крови, подготовка ее для амплификации ДНК; совместно со старшим научным сотрудником лаборатории метаболизма лекарств и фармакокинентики НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, к.б.н. Сафроновой О.Г. проводилась постановка полимеразной цепной реакции, электрофорез продуктов амплификации и оценка генотипов глутатион Б-трансфераз М1 иТ1.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 5 в центральной печати.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования и описанием клинической характеристики обследованных больных, главы с результатами собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы включает 235 источников (из них 88 отечественных и 147 зарубежных). Работа иллюстрирована 17 рисунками и 28 таблицами.

ВЫВОДЫ

1. Нуль-генотип глутатион 8-трансферазы Т1 является фактором риска развития атопического дерматита у детей (011=2,67, р=0,01). Сочетание нуль-генотипов (757М7 и (75777 увеличивает риск развития заболевания (011=3,36, р=0,03). Генотип (75777- служит фактором риска развития атопического дерматита преимущественно для мальчиков (ОЯ=3,74, р=0,04)

2. Нуль-генотипы СБТМ! и (75777 являются факторами риска развития тяжелого течения атопического дерматита (ОЯ=4,46, р<0,0001 и ОЯ=2,5, р=0,03 соответственно). Для больных с нуль-генотипом ОБТМ1 характерно диффузное поражение кожи (р=0,03), непрерывно-рецидивирующе течение и частота обострений 6-8 раз в год (р=0,0001), раннее появление пролиферативных изменений (р=0,005). Генотип СБТМ!- служит фактором риска развития тяжелого течения атопического дерматита и диффузным поражением кожи, преимущественно у девочек (011=7,0, р=0,004 и 011=20,08, р=0,001 соответственно).

3. Воздействие табачного дыма снижает величину устойчивости к развитию атопического дерматита у детей с комбинацией генотипов С57М/+/(75777 + и повышает риск развития диффузного поражения кожи у детей с генотипом СБТМ!- (ОЯ=4,8, р=0,04)

4. Для больных с (757М/- характерно длительное сохранение симптомов атопического дерматита на фоне стандартной терапии (р=0,01). Назначение кетотифена в составе комплексной терапии не увеличивает эффективность лечения.

5. Двойной мутантный генотип С57М/-/(75777- является прогностическим фактором тяжелого течения атопического дерматита у детей (ОЯ=5,69, р=0,007), а комбинация С5ГЛ/7+А757Т7+ прогностическим признаком благоприятного течения заболевания (011=0,22, р=0,001).

ПРАКТИЧЕКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

У детей раннего возраста с наследственной отягощенностью по аллергическим заболеваниям необходимо определять полиморфизм гена ОБТП с целью формирования группы риска развития атопического дерматита.

У больных атопическим дерматитом необходимо определение полиморфизма генов СБТМ! и (75Т7У для оценки риска развития тяжелых, форм заболевания и разработки индивидуальной программы профилактики неблагоприятного течения атопического дерматита.

Больные с комбинацией генотипов С8ТМ1-Ю8ТТ1- составляют группу риска по развитию тяжелого течения атопического дерматита, поэтому наблюдение за этими детьми должно осуществляться по схеме диспансеризации группы риска по развитию инвалидизирующих форм заболевания.

Нецелесообразно дополнительное введение кетотифена в комплексную терапию атопического дерматита, так как его назначение не увеличивает эффективности терапии.