Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Новые методические подходы к анализу анксиолитического и седативного действия бензодиазепиновых транквилизаторов

РГ6 од

/ ¡1 N¿¿5

На правах рукописи

МАУЛА МОНА ЛССАД

НОВЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К АНАЛИЗУ АНКСИОЛИТИЧЕСКОГО И СЕДАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ БЕНЗОДИАЗЕПИНОВЫХ ТРАНКВИЛИЗАТОРОВ.

14.00.25 - Фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в лаборатории фармакологической генетики НИИ фармакологи) РАМН (директор - член-корр. РАМН, профессор С.Б.Середенин)

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских каук Ю.А.Бледнов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук

О.Н.Чиченкон Т.Л.Гаркбова

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится июня 1996 года в часов на заседании Специализированного ' Ученого, Совета Д.001.25.01 НИИ фармакологии РАМБ (125315, Москва, ул-Балгайская, д.8)

С диссертацией можно ознакомить« в научной части Института Автореферат разослан "В" мая 1996 года

Ученый секретарь специализированного совета: кандидат медицинских наук

ЕАВальдман

1. ВВЕДЕНИЕ.

Акту'-чьетт/гь. Несмотря па значительные достижения, лоспелних десятилетий созяашш нсаых транквилизаторов (Martin, Haefely, 1995) и изучении молекуляр-i-ллх механизмов ю. действия. (Mihic et ai., 1995; Brownie, Shaw, 1991) проблема глизатией коррекпкч страхатем не менее продолжает привлекать повышенное вни--чипе как фармакологов, так и клиницистов. Это обстоятельство связано прежде всего с тем. что няпбпте^ nvrwro псясдхгу&Аыс ь клмиичесюя* практике препарата ••«ч'отея^еяшгсЕМ'О (БД) ряда характеризуются развитием большого числа разнообразных, в ряде случаев нежелательных эффектов, таких как седация, миорелакса-ция, снотворное действие, толерантность, зависимость, амнезия, синдром отмены и др. (Lader, 1995). На экспериментальном уровне было показано, что проявление эффектов БД зависит от генетически контролируемого типа эмоционально-стрессовой реакции (ЭСР) у мышей различных инбредкых линий (Seredenin et al., 1987). При этом, если одна к та же доза феназепама может оказывать либо транквилизирующий, либо седативнай эффекты в зависимости от линии экспериментальных жи-»стных (С.Б.Середенкн, А.А.Ведеркикоз, 1Р79), то для гидазепама удается выявить диапазон дозировок, оказывающих более селективное анксиолнтическое действие (Seredenin, Blcdnov, 1954). Разнонгправленностй транквилизирующего влияния БД позволяет ьысхазать сомнения в унифицированном механизме их действия, опосредуемым классически;-/« бензодиазепиновым рецептором (БДР), о чем свидетельствует сравнение экспериментальных и клнническихданных, полученных для новых селективных транквилизаторов - бретазенила и аберканила"(?ас1ат et al., 1992; Lader, 1995). Крометого, недамю было показано, \гго альпразапам и оригинальный отечественный транквилизатор - гидазепам потенцируют ГАМК-стнмулированный транспорт ионов СГ двумя различными механизмами, лишь од;ш из которых оказался чр!стьительнын к блокирующему действию антагониста БДР - R015-Î7S3 (Biednov et 1994).

Первые данные о генетической зависимости эффектов БД и возможности диссоциации анксколитического и гипноседатизного действия были получены с использованием метода "открытое поле" (ОП)(С.Б.Середеник, АА-Ведерников, 1979).

ч,

В настоящее время для изучения эффектов БД и других психотропных средств широко применяется методика "приподнятого крестообразного лабиринта" (T1KJI), позво-

ляющая бол ееточно дифференцировать поведение животных в эмоционально-стрессовой обстановке (File, 1995).

Поэтому основной целью настоящей работы является проведение эксперимен-тально-фармакогенсшческого анализа эффекта ряда бензодиазепиновыхтранквилн-заторов на основе метода ПКЛ Для выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: 1) изучить поведение инбредных мышей Baib/c к С57В1/6 в тесте ПКЛ; 2) изучить дозовую зависимость развитая психофармакологи-чесхихэффекговпронзводныхбензодиазетшновогорэда: альпразолама, фгназеяама, циназепама, гидазешма и соединения БД-1158 у мышей Balb/c и С57В1/6 ; 3) ис-• следовать влияние R015-1788 (антагониста-БДР центрального типа), бихухуллкна (антагониста ГАМКд-рецепгора) и гшкротоксина (блокатора хлорного канала) на развитие различных фармакологических эффектов БД; 4) провести сравнительную оценку эффектов типичных психостимуляторов и отобранных селективных анксио-литиков в тесте ПКЛ.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение спектра психофармакологической активности 4-х отечественных транквилизаторов в тесте приподнятого крестообразного лабиринта. Показано, наличие транквило-акгивирую-щего и транквило-седативного типов их действия. Установлено, что селективность транквило-акхивирукяцего действия определяется, как химической структурой, так и действующей дозой. Показано, что диазепам-связывающий тип БДР участвует в реализации прежде всего ингибирующих (транквило-седативного и седативнош) эффектов бензодиазепинов, тогда как ГАМК-рецепторная субъединица и хлорный канал опосредуют все типы зарегистрированных типов фармакологического действия.

Научно-практическая ценность. Применение фармакогснетического варианта теста "приподнятого крестообразного лабиринта" позволило расширить возможности доклинической предикции спектра действия БД в аспекте поиска новых селективных анксиолитиков. Впервые был изучена психофармакологическая активность нового оригинального отечественного соединения - БД-1158, со свойствами селективного анксиолшика транквило-актнвярующего типа действия. На изученное соединение представлена заявка на патент РФ, регистрационный номер 95112132с приоритетом от 12 июля 1995 года.

Апнсбатщя работы. Материалы диссертации доложены и сбсужцсны на меиа-йириорной конференции НИИ фармакологии РАМН (Мосгва, 8 мая Ю96 г.), 2-ой Меггдунатзодпой хонфергнцин "Выживание человека: Резервные возможности и »^традиционная медицина" (Москва, 24-25 августа 1994 г.), конференции "Ас-"'"ггькк". гспросы экспериментальной и клинической фармакологии" (Смодяюк, '¿•>-22 отбря 1994т.),т5-ом Международном СпмпозиумеЕвропейского общества Поведенческой Фармакологии (Германия, Берлин, 11-15 секгябоя 1994 г.), на 1-пм ЕгргпеПиййй Ионгосси; фармаколог«* (Итяпчя; Мюкмт, июля 1995 г.).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ;

В работе были использованы мыши - самцы линий Ва1Ъ/с (С) и С57В1/6 (В6) массой 20-22 г (питомник "Столбовая"). Животных содержали в условиях лабораторного вивария в клетках по 10 особей, в течение не менее двух недель до начала эксперимента, на стандартной диете, при свободном доступе к воде, при 12-тт: та-соьом нормальном световом режиме. Все эксперимента проводили в период времени с 9.00 до 13.00. Все использозанные БД вводили внугрибрюшкнно в виде водной суояенз:.шпош1епредвгфюеяйноготщатслыю^

ьш каплями Ту/ееп-80 за 30 мин до начала "жеп ери мента из расчета 0,1 мл раствора ¡га 10 г веса животного.

Изучение влиянии отобранных препаратов на поведение животных в тесте ОП проводили по метод', описанному П.М.Бородиным и соавт.(1976). Статистическую обработку полученных результатов проводили иепшпзуя 1-критерий Стьюдента.

,\11г;с;:0л:г777чсс;/л1сзктивн0стькзут1а;1квтестепкл. Выасатснныпнз плох сиг,таза лабиринт имеет форму креста с двумя открытыми (длина - 22 см, ширина - 5 см), двумя закрытыми (длина - 22 см, ширина - 5 см, высота сгслок -15 см) рукавами и нейтральной ютошаягой (5x5 см). Кроме того лабиринт приподнят на высоту 25 см. Пол 'л стенки застьяодс рукавов били покрашены черным цветом, тогда как пол открытых рутявов и центральная площадка были оставлены прозрачными. Через 30 шшут после введения препаратов -хивотное выдерживали в темноте в течение I минуты и затем помещали на центральную площадку в направлении ж одному из за-

ч

крытых рукавов. В течение 5 минут фиксировали отдельно время пребывания животного в открытых рукавах и центральной площадке, а также количество заходов в

открытые и закрытые рукава. Эксперимент проводили при комнатном освещении • Результаты обрабатывали статистически, оценивая на первом этапе влияние различных доз испытуемого соединения на поведение животных методом однофакторногс дисперсионного анализа с последующим межгрупповым сравнением по методу Нью-мена-Кьюлса с помошью статистического пакета "Pharmacologic Calculation System".

Феназепам, щшазепам, гидазепам и соединение БД-115В были синтезированы в Физико-химическом институте им. АВ.Богатского (г. Одесса, Украина), альпразо-лам (RBI, США). R015-1788 (HofTman-LaRoshe, Швейцария) вводили в/бр в виде водной суспензии с Tvveen-80 за 20 мин до начала эксперимента, водный раствор пикротоксина (Sigma, США) вводили в/бр, а бикукуллин (Sigma, США), предварительно растворенный в 0,01 М НС1, - подкожно за 15 мин до проведения опыта.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ. 3.1. Фармакологические эффекты в тесте "открытое поле".

Как было указано ранее, первые данные о генетической зависимости фармакологических эффектов БД (феназепама, гидазепама и циназепама) были получены при использовании теста ОП (С.Б.Середенин, А_А.Ведерников, 1979; Seredenin, Blednov, 1994). В настоящем разделе, было изучено поведение животных тех же линий в тесте ОП при введения альпразолама и нового соединения БД-1158, отобранного в результате скрининга, проводившегося в лаборатории фармакологичес-. кой генетики НИИ фармакологии РАМН.

Показано, что в очень широком диапазоне доз от 1,0 мг/кг до 25,0 мг/кг соединение БД-1158-.повышало общую двигательную активность мышей линии С. Только в дозе 30,0 мг/кг значения двигательной активности у опытных животных не отличались от контрольных показателей. При введении БД-1158 в дозах 2,5 и 5,0 мг/кг наблюдали статистически достоверное увеличение уровня центральной двигательной активности. В тоже время у мышей Вб статистически значимое снижение общей двигательной активности наблюдали лишь начинав с дозы 20,0 мг/хг и выше.. В тех же дозах было зафиксировано заметное падение уровня центральной и вертикальной актавноста животных данной линии. . ,

Препарат сравнения - альпразолам (Ксанакс) заметно активировал поведение мышей С в диапазоне доз от 0,05 мг/кг до 1,0 мг/кг, тогда как в дозе 2,0 мг/кг

джг.или&е. активность была ниже контрольных похггугяей. Пр:г зтш, ее« ¿о ,Г1. ¿¡-эдп^енс ¡■¡■.и-лгшалсч »(вен ь оС'чей и ч:гой

д: чк-тивпости, то в дозах от 0.35 иг/кг до. 1,5 мгЛт идблюдаяи

'¡|г.-;'» - о,: увеличите. показателей пеитр.-ин.чой льига«.и»ей Г'.ктш-ности.

><С' г. ; •'йи/.л:,-:,.'";.:!!)« якблСи:^;!' угх начинал г лозы О.И

. а "р« йгедиши эльпразолама в дозе 0,5 мг/кг злмгпга падали и показатели ■

".2. ьныи анализ поведения мышей Ва!Ь/е к С57В1/6 в тесте

' "приподнятого крестообразного лабиринта".

На начальном этапе работы с тестом "ПЮГ проведен сравнительный анализ попгдекия инбредных линий мышей С я Вб. Как ввдно из результатов, представленных в Табл.1, указанные линии животных практически не различались по большинству оценивэемых в данном тесте показателей поведения. Только время задешйки ?.:"ттггс Л1<);;:|. ~ г. -г1г, б'^чо 'ллтаот;;чсс;ж досшвгрне выше аналогич-

но > о Г0:;:,3::т< • , рИ,1С1р1!руС.МОГ0 У 'ХИВОТНЫХ чянни Б6.

.'О. ь.ччяния Ое-гзояиззаш-нои на поведение '*н»релныу мышей г. тесте

ЯР. крестообразного лгбпринта".

Счзтнсткпсслугй чнализ полученных данных смдстетьстзует о выраженном кли-яннгг аиьпразояэнч :;я ?с» измеряемые показатели поведения мышей С: время пребывания ;йивсм!ЫХ ? открытых рукавах - Р(5;85)=7,73 (Р<0,01); время задержки в центре*лабиринта - Р(5;85)=57,91 (Р<0,01); общее число заходов в пук?»а - Р(5:?5> -15,36 (?<0,01) и процентсйхолон в открытыерууаьэ - Р(5:25) —8,89 (Р<0,01). Вцл--;то а ог 0,01 ¡¿т/а: до 0,25 мг/'кг альпразолам статистически достоверно увеличивал время пребывания экспериментальныхживотныхв открытых рукавзх лабиринта (Р;;с.1А) и общее число заходов в рукава лабиринта (Рис. I С), з т,.:~;е про-' ¡к-чг я откр'гше рукава {р дочах 0,1 и 0,25 мг/кг)(Рис.1 Б). Однако, в диа-

пазоне доз ст С,25 мг/хг до 1,0 мг/кг наблюдалось дезоззвиетмоеувеличение времени чацер:чки квотных на центральной площадке лабиринта (РисЛВ) при одновременном стгтксшчески значимом снижении (ниже контрольного уровня) в дозе 1,0 мг/кг, как обшего числа.заходов (Рис.1 С), так и процента заходов в открытые рукава (Рис.Ш).

Табл.1. Сравнительный анализ поведения инбредных мышей Ва!Ь/с и С57В1/6 в тесте "приподнятого крестообразного лабиринта (М ± тх).

С57В1/6 п=20 Ва!Ь/с п=20

Время в открытых рукавах (сек) 7,00 ± 2,40 Ч 10,30 ±3,94

Время в центре лабиринта (сек) 22,05 ±3,17 65,15 ±8,87 а!

Общее число заходов в рукава 6,50 ±0,83 5,85 ± 0,64

% Заходов в открытые рукава 9,82 ± 3,24 6,61 ± 2,14

% Времени в открытых рукавах 2,33 ± 0,80 3,37 ± 1,32

Число заходов в 'закрытые рукава" 5,70 ± 0,67 5,30 ± 0,53

Примечание: п - число животных; а1 - статистически достоверные межлинейные различия (Р<0,01; ^критерий Стьюдента).

Сходный статистически достоверный характер изменения всех параметров поведения после введения альпразолама был продемонстрирован и для мышей Вб: время пребывания животных в открытых рукавах - Р(4;55)=8,25 (Р<0,01); время задержки в центре лабиринта - Р(4;55)=8,4б (Р<0,01); общее число заходов в рукава - Р(4;55)= 14,37 (Р<0,01) и проденг заходов в открытые рукава - Р(4;55)=8,94 (Р<0,01). Уже в дозе ОД мг/кг наблюдали статистически значимое снижение общего числа заходов в рукава лабиринта (Ряс.1С). После введения альпразолама в дозах 0,25 мг/кг и 0,5 мг/кг снижалось нетолько общее число заходов в рукава (Рис, 1С), но также и время пребывания в открытых рукавах (Рис.1 А) и процент заходов в открытые рукава

(гис.Ш) при одновременном резко выраженном увеличении времени задержи? в ".снтре лябиринта (Рис.13).

6 4 Б» В*

еогсг (то/ю)

ол ал сл I л

Риса. Влияние альпразолама на поведение имбпелячх ».шшсй в тесте "приподнятый

крестообразный лабиринт" (М + тг^). 1;с. о;ц сргд;;аг А - Время в открытых рукавах (сек); В - время задержки в центре лабиринта (сек); С - общее число заходов в рукава; Б - % заходов в открытые рукава. По оси абсцисс: дозы препарата (мг/кг). *,** - статистически достоверные '.тглчгл от контролл (°<0,05; Р<0,01 соответственно, НыоманчСьюлс тест).

--Еа!Ь/с;-------С57В1/6.

Проведенный дисперсионный анализ эффектов феназепама на поведение ин-

V

бредных мышей подтверждает выраженный характер фармакологического действия препарата: время пребывания животных линии С в открытых рукавах - Р(5;89)=9,б7

(Р<0,01); время задержки в центре лабиринта - Р(5;89)=12,24 (Р<0,01); общее число заходов в рукава - Р{5;89)=4,81 (Р<0,01) и процент заходов в открытые рукава -Р(5;89)=7,23 (Р<0,01). П дозах от 0,1 мг/кг до 0,5 мг/кг феназепам' статистически достоверно повышал как время пребывания животных в открытых рукавах (Рнс.2А), так и процент заходов в открытые рукава лабиринта (Рис.2В). Повышение данных параметров при введении препарата в дозах 0,25 мг/кг и 0,5 мг/кг сопровождалось статистически значимым снижением общего числа заходов в рукава (Рис.2С) и резким увеличением времени задержки в центральной площадке лабиринта (Рис.2В), Следует отметить, что последний параметр характеризовался выраженной тенденцией в сторону увеличения и при использовании более низких доз феназепама, однако измеряемые показатсяинедости тали статистически значимого уровня. Таже закономерность была характерна для времени пребывания в открытых рукавах и процента захода в открытые рукава лабиринта.

У мышей Вб феназепам изменял поведение, описываемое временем пребывания в открытых рукавах - Р(4,49)=3,15 (Р<0,05), однако значения этого параметра, полученные после введения различных доз препарата, не достигали статистически значимых отличий от контрольного уровня (рис.2А). Феназепам также изменял поведение, описываемое временем задержки в центре лабиринта • - Р(4,49)=3,83 (Р<0,01) и общим числом заходов в рукава - Р(4,49)=17,34 (Р<0,01) при статистически значимом увеличении времени задержки в центре в дозе 0,1 мг/кг (Рис.2В) и дозозависимом падении общего числа заходов в рукава после введения в дозах от ОД мг/кг до 0,5 мг/кг (Рис.2С). В тоже время во всем использованном диапазоне доз препарат не оказывал заметного влияния на относительное число заходов в открытые рукава лабиринта - Р(4,49)=1,0 (Р>0,05)(Рис.20).

На Рис.3 представлены данные по влиянию циназепама на поведение инбред-ных мышей в условиях избранной модели. Статистический анализ полученных данных свидетельствует о выраженном влиянии препарата на такие показатели поведения мышей С, как время пребывания животных в открытых рукавах - Р(5;113)=17,9 (Р<0,01), общее число заходов в рукава - Р(5;113)=18,18 (Р<0,01) и процент заходов в открытые рукава - Р(5;113)=18,81 (Р<0,01). Напротив, поведение, описываемое временем задержки в ценгре лабиринта оказалось нечувствительным к действию данного препарата - К{5;113)=1,15 (Р>0,05). В тоже время необходимо отметить

ОЭ 0.4 <Х5

0СЗ£Э (шоЛв)

ел в • 0.3 о *

с.

•Л <« ви 0.« &$

(твЛй1

0.

и. .....л.........

0 1 03 С * ЕМ 0-5 005ЕЗ (тз/кд)

Рис.2. Влияние феназспаиа на поведение инбредных мышей втестг "приподнятый крестообразный лабиринт" (М + тх). См. описание к Рпс.1

некотсруо тенденцию к увеличению утого показаться после введения различных доз циназенама, но без статистически достозерных изменений по отношению к контролю (Рис.3В). Заметное увеличение времени пребывания в открытых рукавах и про-г.ешя заводов в открытые рукава наблюдали после использования препарата в дозах 0.01 л г/кг, 0,05 мг/кг, 0,25 мг/кг и 0,5 мг/кг (Рлс.ЗЛ,0). Повышение данных параметров сопровождалось статистически достоверным увеличением общего числа заходов в рукава при введении циназенама в дозах 0,01.мг/кг и 0,05 мг/кг со значи-' тельным его снижением (ниже контрольного уровня) при использовании дозы 0,5 мг/кг (Рис.ЗС).

- ю

Использование циназепама прй изучении поведения мышей Вб не выявило заметного влияния данного препарата на большинство измеряемых параметров: пребывания животных в открытых рукавах - Р(5;4б)=2,14 (Р>0,05), времени задержки в центре лабиринта - Р(5;4б)=0,б4 (Р>0,05) и процента заходов в открытые рукава -Р(5;46)=2,24 (Р>0,05) (Рис.ЗА,В,Б). Только показатель, описывающий общее число заходов в рукава лабиринта оказался чувствительным к действию циназепама -

Р(5;46)=7,48 (Р<0,01). При этом наблюдали снижение данного показателя по отао-

1 г

шению к контрольному уровню при использовании препарата в дозах 0,25 мг/кг и 0,5 мг/кг (Рис.ЗС).

к

! О.Г 8J О А

DOSES Ug/tg)

D.1 0.2 0-1 OS

DOSES twi/kgl

DOSES fas/kgl DOSES Inj/kgl

Рис.3. Влияние циназепама на поведение инбредных мышей в тесте "приподнятый . крестообразный лабиринт" (М + п\.). См. описание к Рис.1

Данные, представленные на Рие.4, свидетельствуют о выраженном эффекте, гидазепама на поведение животных линии С в тесте "ПКЛ": время пребывания животных в открытых рукавах - F(8;208)=15,11 (Р<0,01); время задержки в центре лабиринта - FC8;208)=Î1,37 (Р<0,01); обшее число заходов в рукава - F(8;2Û8)=17,63 (Р<0,01) и процент заходов в открытые рукава - F(8:208}=9,49 (Р<О,01 ). При оценке эффектов отдельных использованных доз, оказалось, что гидазепам в дозах от 1,0 м г/кг до 9 мг/кг статистически достоверно увеличивал время пребывания ЖИВОТНТчХ в otkdmtmv рукзгсх (Г.:-.4А'(. Аналогичное увеличение процента заходов в открытые рукава наблюдали при использовании препарата в диапазоне доз от 1,0 мг/кг до 11,0 мг/кг (Phc.4D). Резкое увеличение времени задержки в центре лабиринта было зафиксировано при введении гидазепама в максимальной из использованных доз (Рис.4В). Напротив, общее число заходов в рукава лабиринта статистически достоверно увеличивалось при введении гидазепама в дозах от 1,0 мг/кг до 3,0 мг/кг . (Рис.4С). Однако, после введения более высоких доз препарата значения этого параметра не отличались от контрольных показателей.

Мыши лчнии В6 по времени пребывания в открытых рукавах оказались полностью нечувствительными к действию гидазепама - F(4,65)=l ,59 (Р>0,05) (Рис.4А). Р i-оже время этот препарат выражение изменял другие показатели поведения, измеряемые в данной модели: время задержки в центре лабиринта - F(4;65) =4,17 (Р<0,01); общее число заходов в рукава - F(4;65)«4,85 (Р<0,01) и процент заходов в открытые рукава - F(4;65)=4,06 (Р<0,01). При этом действие всех использованных доз гидазепама характеризовалось статистически достоверным снижением всех вышеуказанных показателей в сравнении с контрольным уровнем (Рис.4В,С,Б).

Статистический анализ полученныхданных свидетельствует 6 выраженном влиянии соединения БД-1158 на все измеряемые показатели поведения мышей С в тесте "ПКЛ": время пребывания животных в открытых рукавах - F(9;I35)=9,31 (Р<0,01); время задержки з пентре лабиринта - F(9;135)=14,65 (Р<0,01); общее число заходов в рукава - F(9;135)=ll,3 (Р<0,01) и процент загодов в открытые рукава - F(9;135)= 6,68 (Р<0,01). В дозах от 1,0 мг/кг до 15,0 мг/кг испытанное соединение статистически достоверно повышало время нахождения животных в открытых рукавах (Рис.5А). В диапазоне доз 2,0 мг/кг - 30,0 мг/кг БД-1158 достоверно увеличивал процент заходов в открытые рукава лабиринта (Phc.5D). Заметное увеличение време-

DOSES Imj/kj) 00S6S (mj/kjl

Рис.4. Влияние гидазепама на поведение инбредных мышей в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" (М + m*). См. описание к Рис.1

ни задержки животных на центральной площадке лабиринта наблюдалось только при введении БД-1158 в максимальных из использованных доз (20,0 мг/кг и ЗО.Омг/кг) (Рис.5В). В тоже время для поведения, индуцированного введением данного соединения, было характерно статистически достоверное увеличение общего числа заходов в рукава лабиринта в широком диапазоне использованных доз (0,6

г

г мг/кг - 15,0 мг/кг), без снижения данного показателя ниже уровня контроля при введении БД-1158 в дозах 20,0 мг/кг и 30,0 мг/кг (Рис.5С).

Проведенный дисперсионный анализ эффектов подтверждает выраженный характер фармакологического действия соединения БД-1158 на поведение мышей Вб

UQ 4 -5t-îî-T

H

4Û -20

4..Î-

DOSES (mj/Vj)

A.

DOSES (mtfkel

10 15 , 20

DOSES Imj/kgl

B.

«Г 90 •

А во-

2

э ТО-

Z

£ «0 •

50 ■

-с

V- -

о

ь- 30 ■

ш го ■

а.

О 10 •

о ■

D.

**

-.. -й--*-

doses imj/Xj)

Рис.5. Влияние с-оелинения БД-1158 на поведение инбредных мышей в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" (М + См. описание к Рис.1

в использованной экспердментальноймодеяй: время пребывания животныхв открытых рукавах - F(5;52)~5,78 (Р<0,01); время задержки в центре лабиринта - F(5;52)= 4,08 (Р<0,01); общее число заходов в рукава - F(5;52) =9,40 (Р<0,01) и процент заходов в открытые рукава - F(5;52)=4,89 (Р<0,01). При этом, использованное в дозах 5,0 мг/кг, 10,0 мг/кг и 15,0 мг/кг, соединение БД-1158 статистически значимо уменьшало время пребывания животных данной линии в открытых рукавах (Рис.5А) и общее число заходоз в рукава (Рис.эС). Максимальные из использованных доз (10,0 мг/кг и 15,0 мг/кг) вызывали, кроме того, и заметное снижение процента заходов в открытые рукава (Рис.5Б). В тоже время ни одна из избранных дозировок

заметно не изменяла времени задержки животных в центре лабиринта (Рис.5В) при обшей чувствительности данного показателя к фармакологическому воздействию данного соединения, очемсввдетельствуютпредсгавленныеданныедисперсионного анализа.

3.4. Изучение влияния психостимуляторов на поведение инбредных мышей в тесте

"приподнятого крестообразного лабиринта".

Для анализа, выявленного ранее активирующего компонента в действии некоторых БД производных, выражающегося в увеличении уровня двигательной активности, в данной серии экспериментов было изучено влияние двух известных психо-. стимуляторов -• амфетамина и сиднокарба нз поведение мышей двух инбредных линий в тесте "ПКЛ".

Проведенный дисперсионный анализ показал, что амфетам.ин достоверно влия-

ч

ет на поведение, описываемое временем пребывания мышей линии С в открытых рукавах - Р(6,87)=20,91 (Р<0,01) и процентом заходов в открытые рукава - Р{6,86) =14,54 (Р<0,01). В тоже время выраженного влияния этого препарата на время задержки животных в центре лабиринта - Р(6,87)=1,6 (Р>0,05) и общее число заходов в рукава - Р(б,87)=1,5б (Р>0,05) выявлено не было. Только относительно высокие дозы амфетамина (1,5 мг/кг, 6,0 мг/кг и 12,0 мг/кг) приводили к статистически •■• значимому повышению как времени пребывания в открытых, рухавах лабиринта, так и процента заходов в открытые рукава.

У мышей линии В6 амфетамин статистически достоверно изменял поведение, описываемое: временем пребывания в открытых рукавах - Р(4,53)=4,23 (Р<0,01), временем задержки жиеотных в центре лабиринта - Р(4,53)=4,06 (Р<0,01) и общим, числом заходов в рукава - Р(4,53)=11,97 (Р<0,01), тогда как по относительному числу заходов в открытые рукава мыши оказались нечувствительными к действию данного препарата - Р(б,8б)=14,54 (Р<0,01). В дозе 6,0 мг/кг наблюдали статистически достоверное увеличение времени пребывания животных в открытых рукавах и общего числа заходов в рукава. Снижение времени задержки на центральной площадке было выявлено при использовании амфетамина в дозах 1,0 мг/кг и 3,0 мг/кг.

Заметный эффект в действии сиднокарба у мышей линии С наблюдали только для изменений во времени пребывания животных в открытых рукавах - Р(5,72)=2,68 (Р<0,01) и времени задержки в центре лабиринта - Р(5,72)=4,83 (Р<0,01), тогда как

параметры общего числа заходов в рукава - Р(5,72)=0,86 (Р>0,05) и относительного числа заходов в открытые рукава - Р(5,72)=2,23 (Р>0,05) оказались нечувствительными кдействиюданного препарата. Только в максимальной из использованных доз (30,0 мг/кг) сиднокарб статистически значимо повышал как время пребывания в открытых рукавах, так и относительное ч!'сло заходов в открытые рукава. В тоже время при выявленной общей чувствительности времени задержки в центре лабиринта к действию препарата, величины, получаемые при введении его различных лот не достигают статяспкесхщ достоверных отгачпй от контрольного уровня.

Полученные данныесвидетельствуютовыраженном эффекте сиднокарба на поведение животных линии В 6 в тесте "ПКЛ", описываемое только параметрами времени задержки в центре лабиринта - Р(5;57)=5,01 (Р<0,01) и общего числа заходов в рукава - Р(5;57)=4,54 (Р<0,01), в то время как процент заходов в открытые рукава -Р(5;57)=0,84 (Р>0,05) и время пребывания животных в открытых рукавах -Р(5;57)= 1,5 (Р>0,05) не зависели от использования данного препарата. Только в дозе 10,0 мг/кг сиднокарб статистически достоверно повышал общее число заходов в рукава лабиринта. Однако, при наблюдаемой общей чувствительности параметра, описываемого временем задержки в центре лабиринта, к действию препарата, величины, получаемые при введении его различных доз не достигают статистически достоверных отличий от контрольного уровня.

3.4. Анализ фармакологических эффектов БД с помощью антагонистов различных

субъединиц ГАМК-БДР-СГ-ионоФор рецегггорного комплекса.

Результаты, представленные в предыдущем разделе, свидетельствуют о том, что в зависимости отиспользованных доз весь спектр фармакологических эффектов изученных БД можно условно разделить натри группы: 1) анксиолитическое действие, сопровождающееся развитием активации поведения, которое проявляется в низких дозах; 2) анксиолитическое действие без сопутствующего активирующего эффекта, развивающееся при использовании промежуточных доз; 3) седативное действие, развивающееся при использовании высоких дозировок БД. Соотношение и выраженность всех типов эффектов зависит от конкретного препарата. В связи с тем, что наибольшая степень селективности проявления различных фармакологических эффектов была продемонстрирована для гидазепама, именно этот препарат был избран для последующего анализа с помощью антагонистов различных субъединиц БДРК -

К015-1788, бикукуллина и пикротоксина. В качестве препарата сравнения было выбраносоединениеБД-1158,снаиболее выраженным 1-ым типом фармакологического действия. Для анализа выбирались дозы, вызывающие наиболее полярные эф- • фекты, относящиеся к 1-ой и 3-ей группам.

<

Г 100

S

О » 1 ♦ М S ♦ DOSES (mg/Kcl

Р<0.05

« ¡ > » 5 « DOSES (mg/kg)

РС0.05

W 2 . H 1 *

DOSES Img/kgl

D.

10 2 ■ ♦ . IB E 4

DOSES (me/ka!

Рис.6. Зависимость эффектов гидазепама на поведение мышей линии С в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" от антагониста БДР - 11015-1788 (М ± го,). Оси координат - см. описание к Рис.1;

Р<0,05 - статистически достоверные отличия ((-критерий Стьюдента). ' □- коотроль;Е- К015-1788;И- гидазепам;К- гидазепам + 1Ш15-1788 .

На Рис.6 представлены данные, описывающие влияние ROI 5-1788 на развитие эффектов гидазепама у мышей линии С в тесте "ПКЛ". Видно, что сам антагонист ' БДР заметно повышает как время пребывания животных в открытых рукавах

а п.7»-.»- /»'ГС.71'4. "О';-*""", ili " г ч:;м.

• -; ;о" п:лг.--,сг:';:- эт-i ''V; -ir'/.'n, nii з л^и^и«; рукаьах

ГРиг-АЛЧ -----77-,-— j _-..v. :: пу.- '•:<i:4>l.Z' I U5HC.0'~1. Ojli,.. . J1 - ,.

>; ' .л.• ■ центра -.Л'-). J юхх .;.::■! ajiTJ: u.'iiicr ^¿лисаыо блокирует повышение времени пребывания животных в открытых ттсягау п«»»»^'"»—

ilUiw lU'lTW'ii'l <•; 0 ¡P.IC.iA), .¡С шмиии

при этом других параметров поведения (Рис.бВ,С,D). Наконец максимальная из использованных доз гидазепама (10,0 мг/кг) заметно повышала время задержки в центре лабиринта, которое полностью блокировалось одновременным введением R015-1788 (Рис.бВ). Напротив, другие показатели поведения, зарегистрированные после использования данной дозы гидазепама и не отличающиеся от контрольного уровня, статистически достоверно повыведись при совместном кспсльзсгзтпти антагониста БДР (Рис.бВ,С,D).

При использовании соединения БД-1158 было выявлено, что изменения всех видов поведения, развивавшиеся у мышей линии С после введения препарата в лозг 5,0мг/кг, оказалисьнечувствшгльныкдейстаиюК015-1738 (Pnc.7A,B,C,D). Напротив, антагонист БДР частично или полностью блокировал, повышенный после введения БД-1158 в дозе 20,0 мг/кг, уровень показателей времени пребывания в открытых рукавах, времени задержки а центре лабиринта и процента заходов в открытые рукава (Рис.7А,ВЛ>). В тоже время общее число заходов в рукава в присутствии R015-I788 несколько повышалось и становилось неотличимым от контрольного уровня (Рис.7С).

Пикротоксян в дозе 2,0 мг/кг значительно повышал время задержки мышей линии С в центре лабиринта (Pnc.SB) ir снижал процент заходов животных в открытые рукава (Phc.SD). Введенный совместно с гидазепамом (2,0 мг/кг) блокатор СГ-ионофора частично Препятствовал повышению времени нахождения животных в открытых рукавах (Рис.8А), числа заходов в рукава (Рис.8С) и процента заходов животных в открытые рукава^ лабиринта (Phc.8D), наблюдавшимся при введении одного гидазепама. Однако, использование той же дозы пикротоксина при сочетанием применении с гидазепамом в более высокой дозе (10,0 мг/кг) блокировало толь-

Q 10 5 ♦ »0 2ff *■ 0 10 5 + 10 20

DOSES fiSJ/ltïl. ■ • DOSES (raî/kel

о îo g * » » » о to s + io го ♦

DOSES (mi/ksl . .. DOSES tmg/kj)_

Рис.7. Зависимость эффектов соединения БД-1158 на поведение мышей линии С в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" от антагониста БДР -R015-1788 (M ± m,). Оси координат - см. описание к Рис.1;

Р<0,05 - статистически достоверные отличия (t-критерий Стьюдента). □ - контроль;®-К015-1788;й- БД-1152;Ш- БД-1158 + R015-1788

ко уровень общих перемещений животных, не-влияя на показатели времени пребывания в открытых рукаьах и процента заходов в открытые рукава (Phc.8A,C,D). Увеличение дозы пикротоксина до 3,0 мг/кг полностью блокировало уровень тех же трех показателей, характерный для использования гидазепама в дозе 10,0 мг/кг (Рис. 8A,C,D).

В цепом сходный эффект пикротоксина наблюдали при его использовании

P<O.OF>

р<0.0-5

250

о « 200

ОС

UJ ь- 150

z

Ui

о

100

з

UJ

2 50

0

2 2«- Z « 3 10

DOSES (тдЛд)

Р<0.05

z г * г ю* з to ♦ DOSES (mgrtg)

Р<0.05 D.

2 2+ г 1С «■

coees (mg/kg) DOSES (rng/kg!

Рис.S. Зависимость эффехтов гидазепама на поведение мышей линии С в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" от пикротоксина (M + mj. Оси координат - см. описание к Рис.1; . Р<0,05 - статистически достоверные отличия (t-критерий Стыодента). □- контроль;"]- пикрохоксин;0- гидазепам;ЕЗ- гидазепам + пикротоксин

вместе с соединением БД-1158 (Рис.9). Блокатор хлорного канала, введенный мышам линии С в доза 2,0 мг/кг, частично или полностью блокировал, значительно повышенные при использовании одного БД-1158 (5,0 мг/кг и 10,0 мг/кг), показатели времени нахождения в открытых рукавах (Рис.9А), общего количества перемещений животных (Рис.ЭС) и относительного числа заходов в открытые рукава (Рис.9Б). Увеличение дозы пикротоксина до 3,0 мг/кг приводило к полной блокаде показателей анксиолитического действия (Рис.9А,Б), характерных для введения

БД-1158 в максимальной из использованных доз, а общее число перемещений снижалось даже ниже контрольного уровня (Рис.9С).

о 2

PC0.G5

DOSES hg/kg)

DOSES 1 mg/kg)

Р<0.05

te tcô •

2

tu . О

se* г го » DOSES lmj/kî)

о îs» г го » lia» DOSES (mg/kgi

Рис.9. Зависимость эффектов соединения БД-1158 на поведение мышей линии С в тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" от пикротоксина (М + т,). Оси координат - см. описание к Рис.1;

Р<0,05 - статистически достоверные отличия ^-критерий Стьюдента). □- контроль;ЕЗ -пикротоксин;й- БД-1153;®- БД-1158 + пикротоксин

Антагонист ГАМКА-рецептора - бккукуллин, использованный б дозе 1,0 мг/кг, значительно снижал время пребывания животных линии С в отхрышх рукавах (Рис.ЮА) и общее число перемещений (Рис.ЮС), при резком увеличении времени задержки на центральной площадке (Рис.ЮВ). Сочетанное использование бикукул-

р<';.05

Р<0.0:-

сс

у- -г.. ]

I I

! л

1/Л V*

г.

V/.

12» 1 10 » 00563 («.с|

Р<0.05

2 гоо Н

® 150 ^

1

I Г

X »I

ьзI-

ХМ I г/Аъея

В. •

п

Г. I

; !

г!

т *

Й 3

щ 1.тщ щй

1 г * г ю » г 1С +

00?£3 !тз/>с1

005Е5 (тв/к5)

Р<0.05

* 1 :о + ООгЕЭ (то/кд)

1 10 +

Рис.10. Зависимость эффектов гидазепама на поведение мышей линии С в тесте "приподнятый крестообразный лпбнринт" от бикукуялина (М + пг^). Оси координат - см. описание к Рис.1;

Р<0,05 - статистически достоверные отличия ^-критерий Стьгодента). □- контроль; 3 - бикукуллин; И- гадазепам; &3- гидазепам + бикукуллин

лина с гидазепамом (2,0 мг/кг) приводило к частичному снижению времени пребывания в открытых рукавах (Рис. 10А) и общего числа заходов в рукава (Рис.ЮС), которые заметно превышали аналогичные контрольные показатели при введении одного гидазепама. При увеличении дозы шдазепама до 10,0 мг/кг, бикукуллин также частично блокировал, повышенные при использовании одного гидазепама, показатель времени нахождения в открытых рукавах (РисЛОА) и полностью блокировал

процент заходов в открытые рукава лабиринта (Рпс.КЮ). Увеличение дозы бикукул-лина до 2,0 мг/хг приводило к дальнейшему усилению-эффектов, наблюдавшихся при его использовании в более низкой, дозе. При сочетанием применении данной дозы бикукуллина сгидазепамом (10,0 мг/кг) наблюдали выраженное снижение времени пребывания в открытых рукавах (РясЛОА) п процента заходов животных в открытые рукава лабиринта (РнсЛОВ), которые заметно превышали соответствующие контрольные показатели при введении одного гидазепама.

2 1СО

Р<0.05

Р<0.05

DOSES (isc)

DOSES Imff/koi

Р<0.05

m «оо о

DUSES Ims/Vj]

DOSES (mg/tg!

Рис.11 Зависимость эффектов соединения БД-1158 на поведение мышей линии С е тесте "приподнятый крестообразный лабиринт" от бикукуллина (М±тх). Оси координат - см. описание к Еис.1;

Р<0,05 - статистически достоверные отличия ^-критерий Стьюдента). .□- контроль;В- бикукуллин;£Э- БД-1158;Е- БД-1158 + бикухудлин

Û отя!1ЧИ!1 отшдазепама, гочгтгниое введениесоеаимеиняБД-il i3 (3,0 мг/кги 20,0 >:!/'.,г) й нч испояьгоглнвыхгочбикукуялкт (» ,0 мг/кг) ужз вшмвало

.ic.ii.'.", ::нп1бкро'.?нис ассзакцеЗ погедсичя, описываемых временен нахо тиснил г. руклвтх (l'ire.! 1 A.J, временем задержеи на центрапмкт площадке

il/si ;; jTj:;jx в открытые ругава (t'H"îiD), а;v

дс-roEupai) пр .'лишала ко'лро-ьчяЯ уровень при пы.дапи одного 5Д-11*8. Я то ввемя. обшее число пеоемешений. повышенное при использовании БД-1158 в дозе

с п ^.«-..лп-».« ; ппл к ,.npiipimnm | кнг

тогда как неизмененный в сравнении с контролем, тот же показатель, зарегистрированный при использовании БД-1158 в дозе 20,0 мг/кг, оказался нечувствителен к действию бикукуллина (Рис.ИС).

4.0БСУЖЦЕНИЕ.

Одним нз основных итогов выполненной работы является подтверждение факта генетической зависимости индивидуальных эффектов БД. Однако. использование метода "ПКЛ", позволило более точно дифференцировать поведение животных ь эмоционально-стрессовой сСстзпогке. Исходя из общепринятой интерпретации показателей, характеризующих поеедение животных в данном тесте (l'ellow et al., ' РХ5), весь спе ктр психофармакологических эффектов изученных БД, выявленных у мышей линии С и развивающихся в зависимости от действующей дезь:, можно условно раз-делитьна четыре группы: 1) активирующее действие, 2) анксиолитическое действие, сопровождающееся активацией исследовательского поведения, 5) анксиолиткческое /и"стане без сопутствующей актпвацпи (развивающееся на фспе пйлглягашейся cs-дацнп), 4) седативное действие. Выявленное активирующее действие БД не является результатом их возможного психостимулирующего эффекта, что подтверждаетсядан-ными, полученными при изучении психофармакологического действия амфетамина

Г ч

и сиднокарба.

Суммируя результаты, полученные при изучении роли различных субъединиц БДРК в механизме опосредования различных типов анксиолитического эффекта БД можно сделать два основных вывода. Во-первых, развитие анксиолитического действия с седативным компонентом зависит от функционирования всех трех основных субъединиц БДРК; БДР, ГАМКА-рецептора и хлорного канала. Во-вторых, анксио-литический эффект с активирующим компонентом развивается в результате взаи-

модействия БД прежде всего с ГАМКл-рецептором и хлорным каналом, но не с классическим БДР. Однако, следует отметить, что БДР является фактически лишь местом связывания БД на ГАМКА-рецепторе. Поэтому, учитывая доказанную нами зависимость транквило-активируюшего типа действия от ГАМКА-рецептора и хлорного канала, нельзя исключить возможность взаимодействия низких доз БД нового поколения, таких какгидазепамисоединениеБД-1158,сдругими нетрадиционными видами этого рецепторного комплекса, которые в принципе описаны в литературе ' (Sieghart, 1995). С другой стороны, нельзя забывать о возможном участии других нейромедиаторных систем, участвующих в развитии чувства тревоги, страха. Что касается транквило-акгивирующего типа действия, среди возможных кандидатов ' можно отметить ВАК- (Xie, Commissaris, 1992) и норадренергическке (Lerner et al., • 1986) системы мозга, а также холецистокининовую (Crawley, Corwin, 1994) и тироли-бериновую (Feuer, 1969) системы. :

ВЫВОДЫ.

1 .Анализ психофармакологического влияния бензодиазепиновых транквилизаторов на мышей Balb/c и С57В1/6 с различной эмоционально-стрессовой реакцией с ис- ■ пользовгниеммегода'приподнятого крестообразного лабиринта" подтверди наследственную зависимость эффектов бекзодиазепинов от фенотипа ЭСР. • 2. Установлены дополнительные различия в поведенческих параметрах мышей С57В1/6 и Balb/c при эмоционально-стрессовом воздействии. В тесте ПКЛ мыши Balb/c характеризуются значительно большим временем задержки в центрелабирин-та по сравнению с животными С57В1/6.

3. Показано, что тест ПКЛ с использованием, фармакогенегической методологии позволяет более дифференцировано регистрировать эффекты бензодказепиаов с выделением активирующего, транквило-актвкрутешего к транквило-ссдатавного типов действия.

4. Показано, что диазепам-связывающий тип БДР опосредует прежде всего кнгиби-рующие (транквЕЛо-седатиЕньшиседативнын) эффекты бензодиазепинов,тогда как ГАМК-рецепторная субъединица и хлорный канал участвует в формировании всех

. типов их фармакологического действия. ... -

5. Доказано, что психофармакологическое влияние, описываемо е как активирующее , действие бензодиазепинов, отлично от эффектов типичных психостимуляторов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ. 1. Yu.A ßiednov, M M. KozJovskaya, M. Mau¡a, S.B. Seredenin Is the. anxiolytic effect of benzodiazepine tranquillizers mediated through benzodiazepine iccep'or?, Behav.Pharmacology, 1994, vol. 5, Suppl.l, p.70. Abstr. of the 5-t'n Meeting of the Eur. Behav. Pharmacol. Soc., Berlin, Germany, 11-15 September, 1994. 1 YaASlednov, M.M.Kozlovsbya, M.Maria, H.Rnrimov, RAHarri?, S.B.Seredenin Benzodiazepine receptor mediates only part of pharmacological eiTects of gidazepam and alprazolam, Pharmacol. Research, 1995, vol.31, Suppl., p.275, Abstr. of the First European Congress of Pharmacology, Milan, Italy, June 16-19, 1995

3. ЮАБледнов, М.М.Козловская, М.Маула, АКрасовский, С.Б.Середенин Фармакогенетический подход к индивидуальной профилактике эмоционального стресса, Тезисы докл. на 2-ой Международной конференции: "Выживание человека: резервные возможности и нетрадиционная медицина", Москва, 24-25 августа, 1994, с.61

4. ЮАБледнов, М.М.Козловская, М.Маула, АКрасовский, Х-Рагимов, С.Б.Сереяе-

нин

Изучение спектра психофармакологической активности бензодиазепинов в условиях эмоционального стресса у животных с "пассивным" типом эмоционально -стрессовой реакции, в im.: Актуальные вопросы экспериментальной и клинической фармакологии" (ред.В.Е.Новиков), Смоленск, 1994, с.13-15

5. ЮАБледнов, М.М.Козловская, М.Маула, И.В.Косая

Изучение спектра психофармакологической активности производных 1,4-бензодиа-зепина у животных с "пассивным" типом эмоционально-стрессовой реакции, в сб.: Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств, ВИНИТИ, Москва, 1995, с. 49, Тезисы дом. 1-ого Съезда Российского научного общества фармакологов, 9-13 октября 1995, Волгоград