Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение анксиолитических свойств производных 2-меркаптобензимидазола

15 ОД

' 0 ЫдИ

На правах рукописи

ЯРКОВА МИЛАДА АЛЬНОРДОВНА

ИЗУЧЕНИЕ АНКСИОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРОИЗВОДНЫХ О-МЕРКАПТОБЕНЗИМИДАЗОЛА

14.00.25 - фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1996

. Работа выполнена в научно- исследовательском институте фармакологии Российской академии медицинских наук Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор, 4 член-корреспондент РАМН С.Б.Середеиин

Официальные оппоненты: -Доктор медицинских наук, профессор Т.А.Вороника

Доктор медицинских наук, профессор Н-Л.Шимановский

Ведущая организация: ЦХПС-ВНИХФИ им.СОрджоникидзе

Защита состоится " " 1996 года в " "часов на

заседании специализированного Ученого совета Д 001.25.01 в НИИ фармакологии РАМН, по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной части Института

Ученый секретарь, к.м.н.

Е.А.Вальдман

Актуальность

С конца 50-х годов важнейшими средствами фармакотерапии эмоционально-стрессовых расстройств являются бензодиазепиновые транквилизаторы. Однако, способность вызывать гипноседативное, миорелаксирующее действие, отрицательное влияние на память, возникновение зависимости и синдрома отмены ограничивают их применение для профилактики эмоционально-стрессовых реакций особенно в условиях активной деятельности человека. Доказано, что преимущественно транквило-активирующее, либо транквило-седативное влияние бензодиазепинов определяется фенотипом эмоционально - стрессовой реакции (Середенен С.Б. и соавт., 1984; Середенин С.Б., Бледнов Ю.А., 1992). Индивидуальное назначение бензодиазепинов возможно, но требует значительных усилий по определению предикторов эффекта ( Neznamov G.G. et al., 1993 ).

Поэтому, поиск транквилизаторов, сходных по

анксиолитическому действию с бензодиазепинами, но свободных от их нежелательных эффектов является одной из приоритетных фармакологических задач.' ' " ' " '"

В последние годы обозначились разные подходы к поиску селективных анксиолитиков. В их числе попытка проанализировать физиологическую роль разделенных молекулярно-генетическими методами подтипов ГАМК-бензодиазепинового "рецептора ( Facklan М. et al., 1992; Корнеев А.Я., Лидерман Г.Р.,1985), использовать в качестве мишени другие нейрохимические структуры: серотониновый рецептор (Абрамец И.И. и соавт.. 1990:1992; Riblet L.A.,1982), холецистокинииовый В рецептор ( Costal В. et al.,1991; Gaviraghi G. et al.,1995; Corsi M.,1995 ). NMDA рецептор ( Sanger D.J.,1991 ), ионный транспорт Ca** ( Sudilovsky A.,1992 ) и др. В лаборатории фармакогенетики НИИ фармакологии РАМН в 1985 г. выявлен эффект усиления связывающей способности бензодкязепинового участка ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса антиоксидантом мексидолом ( 2-этил-б-метил-З-оксипиридин). Это нейрохимическое изменение было сопряжено с анксиоселективным действием препарата

( Воронина Т.А. и соавт.,1992; Середенин С.Б. и соавт., 1987 ). Имеется единичная публикация о транквилизирующих свойствах препарата бемитил, разработанного BMA им.С.М.Кирова и НИИ Фармакологии РАМН в качестве средства, повышающего работоспособность в экстремальных условиях (Бобков Ю.Г. и соавт., 1984). Бемитил также обладает выраженными антиоксидантными свойствами ( Середенин С.Б..Дурнев А.Д., 1990,1992). Исходя из совокупности этих данных в качестве - основной цели настоящей работы было определено: выявить экспериментальными методами наличие анксиолитических свойств у ряда производных 2-меркаптобензимидазола - бемитила, томерзола и соединения 919 (2-, фенил-тио-6-этил-бензимидазол гидробромид), синтезированного профессором М.О. Лозинским в ИОХ АН Украины. Для ее достижения необходимо решить следующие задачи:

1.С использованием фармакотенетичёсхой методологии оценить анксиолитическве свойства отобранных.препаратов по их влиянию на поведение мышей линий Balb/c и С57В1/6 в тесте "открытое поле".

2. Дифференцировать анхсиолитические __ свойства .от, психостимулирующих методом регистрации изменений спонтанной двигательной активности на приборе "Optovarimex".

3. Доказать наличие анксиолитических свойств препаратов стандартными методами "конфликтной ситуации" и "приподнятого-крестообразного лабиринта.

4. Изучить диапазон концентраций, в которых препараты обладают антиоксидантными свойствами, методом хемилюминисцентного анализа.

5. Изучить влияние препаратов на рецепцию в бензодиазепиновом участке ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса.

-1.2 Научная иовизна-исследования

Впервые установлено, что производные 2-

меркаптобензимидазола: бемитил, томерзол и соединение 919

обладают селективными^ анксиолитическими свойствами, не сопровождающимися гипноседативным действием.

Определено, что дозовые диапазоны проявления анксиолитического действии бемитила на порядок меньше, чем, вызывающие актопротекторный эффект.

Доказано, что стимуляция поведения животных с выраженной реакцией страха обусловлена влиянием на формирование ЭСР и не является психостимулирующим действием.

Показано, что препараты бемитил, томерзол и соединение 919 в широких диапазонах концентраций обладают антирадикальными свойствами. • •

Выявлен характер взаимодействия препаратов с бензодиазепиновым участком- ГАМК-бензодиазепинового

рецепторного комплекса.

Сформулировано научное положение о перспективности поиска селективных анксиолитиков в ряду 2-меркаптобензииидазола.

1.3. Научно-практическая ценность

Выполненные исследования расширяют область применения препарата бемитила и перспективы дальнейшей фармакологической разработки соединения 919.

Доказанная возможность формирования анксиолитического эффекта за счет модуляции мембрано-рецепторного взаимодействия производными меркаптобензимидазола явилась основой для синтеза в НИИ фармакологии РАМН новых оригинальных соединений этого ряда и скринингового изучения их транквилизирующих свойств.

Обнаружено активное соединение и выполнен комплекс работ по созданию нового оригинального анксиолитека СМ-346.

Подана заявка на патент РФ N 940226663 от 10 июня 1994 года, получено положительное решение от 11 мая 1995 года, а также международная заявка № РСТ/ Ри 95/00085, опубликованная 21.12.95 ДУО 95/34304. \

* "ч

Подтверждена " целесообразность использования

зкспериментально-фармакогенетической методологии для поиска селективных анксиолитиков.

Апробация работы

Результаты представленной работы докладывались на второй международной конференции " Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным веществам " ( Москва, 1993 ), на первом съезде Российского общества фармакологов ( Волгоград, 1995).

Обьем в структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 2), описания материалов и методов ^исследования ( глава 3), собственных результатов ( глава 4) и их обсуждения ( глава 5), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 23 рисунка Библиографический указатель включает 124 отечественных и 76 иностранных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали мышей-самцов инбредных линий С57В1/6 (Вб) и Ва1Ь/с (С) в возрасте 3-4 месяца, полученных из питомника " Столбовая " РАМН. Животных содержали в условиях вивария лаборатории фармакологической генетики НИИ фармакологии РАМН по 10 особей в метке, в течение не менее 2-х недель до начала -эксперимента на стандартной диете при 12-ти . часовом световом режиме.

Также были использованы беспородные белые крысы-самцы, массой 200-300 г.

Эмоционально-стрессовое воздействие моделировали в тесте "открытое поле" (ОП) со световой вспышкой в модификации, описанной П.М. Бородиным с соавторами-( 1974 г. ). Наблюдение за животными производили в течение 3 минут, раздельно фиксировали число пересеченных квадратов на периферии, в центральных областях, число стоек и количество дефехаций. Суммарное число

пересеченных квадратов вместе с числом стоек обозначали как общую двигательную активность (ОДА).

Для оценки анксиолитического действия использовали также методику конфликтной ситуации, создаваемую на крысах, в условиях общепринятой для этой цели методики столкновения питьевого и оборонительного рефлексов при действии внезапного болевого раздражителя как экстремального фактора ( Вороника Т.А. и соавт., 1982; Молодавкнн Г.М., 1993).

Исследование влияния препаратов на спонтанную

двигательную активность (СДА) проводили, используя аппарат "Optovarimex" фирмы" Columbus Corp." США, ' с фиксацией передвижения животных с помощью инфракрасных датчиков. За неделю до начала эксперимента животных помещали в прозрачные клетки по 3 особи в каждую. СДА фиксировали в день эксперимента в течение 10 минут. Полученная величина двигательной активности была суммарной для трех испытуемых животных.

Для более подробного анализа анксиолитического эффекта использовался метод' приподнятого крестообразного лабиринта. Лабиринт состоит из 2-х открытых отсеков,- "светлые рукава" и 2-х. закрытых "темные рукава" размером 50x10 см со стенками 40 см. В центре лабиринта имеется квадратная площадка размером 5x5 см. Лабиринт приподнят на высоту 50 см. Опыты проводили при естественном освещении. Мышь помещали на центральную квадратную площадку и в течение 3-х минут регистрировали следующие показатели:

1. Общее число заходов в рукава.

2. Время нахождения в светлом и темном отсеках лабиринта. Анксиолитическое действие оценивали по увеличению времени пребывания животных в светлом отсеке камеры по сравнению с контролем ( Pellow S.E. et ah, 1987).

Процедура определения генерации свободных радикалов кислорода в химических и ферментативных системах была следующей: !. Супероксидный анион-радикал О"2 продуцировался при окислении ксантина ксантиоксидазой. Конечная концентрация ксантина составляла КИМ, ксантиноксидазы- 0,04 мг/мл. В качестве среды

для измерения использовали р-р Хенкса, рН 7,4. Хемияюминисцентным зондом служил люцегинин, взятый в концентрации 5х10\-5М. Реакцию начинали впрыскиванием в измерительную кювету, содержащую перечисленные выше ингредиенты, . ксантина. Возникала короткая вспышка ХЛ, светосумму которой регистрировали в течении 20 сек.

2. Гидроксильные радикалы ОН" продуцировали реакцией Фентона: смесь 0,1М FeSO< и Ю-4 М Н2О2. Средой для измерения служил ЮмМ трис-буфер, рН 7,5 и 10-5М люминола.

3.Синглетный кислород О продуцировали в системе, содержащей гипохлорид Na (NaClO-} и Hj Oí (10"4М). Средой для измерения также служил трис-буфер (рН 7,5) и 10-4М люминол.

4. Липоперекисные радикалы ROO- продуцировали в системе, содержащей 0,01мл лероксидазы хрена (в концентрации 10 мгУмл), 0.04 мл HiOiClO-'M), средой для измерения служил трис-буфер (рН 7,5) и люминол (10-5М) ( Коркина Л.Г., 1987 ).

В измерительную кювету со средой для измерения добавляли активатор реакции (для трех последних систем им служила перекись водорода) и-измеряди контрольный-уровень хемилю1минисценций. Для изучения антирадихальных свойств препараты : бемитил, томерзол и 919 использовались в концентрациях от 10"2 до Ю-12 М. Водонерастворимые препараты готовили в растворе диметилсульфоксида (ДМСО) так, чтобы его конечная концентрация была 0,1% в пробе. Измерение хемилюминисценции производили на люминометре LKB (Швеция) модель 125 при t=37° С при постоянном помешивании. '

Измерение хемилюминисценции перитонеальных макрофагов.

Беспородным белым крысам под эфирным наркозом , внутрибрюшинно вводили 10-15 мл р-ра Хенкса с 5 ед/мл гепарина, подогретого до 37• С. Брюшко массировали 2-3 мин. За сутки животным прекращали ' давать пищу. Животных умерщвляли смещением шейных позвонков, всхрывали брюшную стенку и пастеровской пипеткой отсасывали содержимое перитонеальной полости. Полученный экссудат центрифугировали при 400 gx 10 мин. (Model J-68, фирма Beclcman). Супернатант сливали, а клеточный

осадок ресуспендировали в холодном р-ре Хенкса без гепарина. Процедуру отмывки повторяли два раза. Отмытые клетки окончательно ресуспендировали в среде 199 и хранили в течение всех дальнейших процедур при температуре таяющего льда. Клетки подсчитывали в камере Горяева и доводили их концентрацию до 5x10е мл-1. Жизнеспособность клеточных элементов определяли, окрашивая их 0,1%-ным р-ром трипанового синего. Отношение количества неокрашенных к общему числу просмотренных клеток соответствовало содержанию жизнеспособных элементов, 80-85% которых составляли макрофаги.

Измерение хемилюминисценции производили на люминометре ПХЛ 01(Россия) при 37° С при постоянном помешивании. В измерительную кювету помещали 850 мл люминольной среды, состоящей из 110 шМ NaCI, 10 шМ трис, 5 шМ глюкозы, 0,65 шМ люминола при pH 7,4 и 0,1 мл клеточной взвеси. Далее измеряли спонтанный уровень хемилюминисценции макрофагов в течении 3 минут, затем в содержимое кюветы добавляли 0,02 мл протамина (в концентрации 10 мг/мл) в качестве активатора процесса XJI и регистрировали ответ клеток. Каждый эксперимент повторяли- не менее трех раз. Контрольные измерения XJ1 проводились непосредственно до и после каждого опыта в присутствии растворителя.

Радиолигандкые методы исследования:

У мышей после декапитации немедленно извлекали мозг, отделяли ствол и мозжечок, оставшуюся часть гомогенизировали в 20 мл трисцитратного буфера, рн 7,4 и центрифугировали при 45 000 g в течение 25 мин. на центрифуге 1,5-50 ( фирма Бекман, Австрия). Осадок ресуспендировали повторной гомогенизацией в том же объеме буфера, затем вновь центрифугировали. Процедуру отмывки проводили трижды, полученный остаток ресуспендировали в 15 мл трис-цитратного буфера и использовали по 250 мкл на пробу.

N- метнл-Н3-диазепам (уд. акт. 67,338 Кю/ммоль) добавляли в пробу в конечной концентрации 2нМ. Содержание белка в пробах составляло 150-200 мкг. Неспецнфическое связывание определяли в присутствии ЮмкМ немеченного диазепама. В пробу добавляли

исследуемые соединения в конечных концентрациях от 1(Н до 10~12 М. Инкубацию проводили в течение 30 мин. при температуре таящего льда. Реакцию останавливали добавлением холодного буферного раствора с быстрой фильтрацией через GF/B фильтры ( Whatman, Англия ) с последующей двукратной промывкой холодным буферным раствором общим объемом 8 мл. Радиоактивность измеряли на счетчике LS-100C ( фирмы Beckman, Австрия ). Эффективность счета составляла 45%. Специфическое связывание составляло 90% от общего( Weissman В.А., et al, 1983 ).

При изучении концентрационной зависимости вытесняющей способности в инкубационные - пробы добавляли необходимые количества изучаемых соединений. Водонерастворимые соединения готовили в 96% этаноле и все последующие разведения были выполнены с таким расчетом, чтобы конечная концентрация этанола в объеме инкубационной пробы не превышала 1%.

Исследуемые препараты также вводились внутрибрюшинно мышам линии Balb/c за 1ч. до декапитиции. Эмоционально-стрессовое воздействие , моделировали в тесте "открытое поле". После извлечения мозга- процедура проводинась-как описано -выше.- - -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Рабочая гипотеза настоящего исследования возникла на основе клинических наблюдений эффектов бемитила у отдельных пациентов. Соответственно данным Т.В. Серебряковой, бемитил проявлял у ряда больных транквилизирующие эффекты ( Серебрякова Т.В.,. Валуев Л.Н., 1985 ). Одновременно существовали клинически подтвержденные сведения об анксиолитических свойствах антиоксиданта мексидола и

гипотеза о нейрохимическом механизме его действия ( Середенин С.Б. и соавт., 1987 ).

Изучение транквилизирующего действия производных

2-меркаптобензимидазола В наших экспериментах, в условиях эмоционально-стрессового воздействия в тесте ОП бемитил в дозах 0.1; 0.5; 3.0; 5.0 и 7.5 мг/кг достоверно повышал Двигательную активность ( ДА ) мышей линии С. Максимальное увеличение ДА в 2.5 раза выявлено в дозе 5.0 мг/кг. Снижение "двигательной активности наблюдалось в дозе 100.0 мг/кг и достоверно отличалось от контроля. Стимулирующий ДА эффект проявлялся за счет увеличения периферической и центральной активности, вертикальная ДА и количество дефекаций были на уровне контрольных показателей.

У мышей линии С57В1/6 бемитил не влиял на уровень ДА в диапазоне доз от 0.05 до 30.0 мг/кг и только в дозе 50.0 мг/кг достоверно снижал ее в два раза по сравнению с контролем .

Таким образом, .бемитил в- широком диапазоне малых доз обладает активирующим поведение действием у мышей С с "пассивным" типом эмоционально-стрессового ответа и в этих же дозах не подавляет ДА мышей В6 с "активным" типом ответа ( рис. 1 )•

Препарат томерзол в,дозах 0.01; 0.05; 0.07 и 0.1 мг/кг достоверно увеличивает показатели двигательной активности мышей линии С. Периферическая и центральная ДА возрастает в три раза по сравнению с контрольными данными дозах 0.01; 0.07; 0.1; 1.0 и 5.0 мг/кг томерзол не оказывал эффекта на двигательную активность мышей линии В6. *

Соединение 919 в дозах 0.01; 0.05; 0.07 и 0.1 мг/кг активировало периферическую и центральную двигательную активность с достоверным отличием от контроля у мышей линии С. У мышей линии В6 соединение 919 не оказывало влияния на двигательную активность.

Рис. 1. Влияние бемитила на поведение мышей в "открытом поле"

Таким образом, экспериментально-фармакогенетическое исследование производных 2-меркаптобензимидазола показало, что эти соединения обладают в тесте "открытое поле" анксиолитическими свойствами. Причем активация поведения мышей Ва1Ь/с не сопровождается седацией в том же диапазоне доз у мышей С57В1/6, что. свидетельствует об. анксиоселективности всех трех изучаемых соединений.

Принципиально важным является факт подтверждения транквилизирующих свойств бемитила и соединения 919, в близких дозах, в тесте конфликтной ситуации. Несмотря на то, что в этом методе используется электроболевое раздражение, эффективность препаратов оказалось достаточной для получения статистически значимых результатов.

Анксиолитические свойства производных . 2-

меркаптобензимидазола зарегистрированы и методом приподнятого крестообразного лабиринта в дозах, сходны^ с выявленными в тесте "открытое поле". Совокупность этих результатов позволяет сделать однозначное заключение: о наличии у бемитила, томерзола и соединения 919 анхсиолитических свойств.

Таблица I

Влияние соединения 919 на повеление мышей лшти Ва1Ь/с в крестообразном лабиринте

Дозы Время в Время в Двигательная % забегов в

иг/кг открытых рукавах,сек центре, сек активность светлые рукава

контроль 10.0 + 3.3 41.9 ±5.8 6.5 ± 0.5 7.9 ±2.3

п=29

0.1 47.5 ± 20.2 55.0 ±9.8 6.4 ± 0.7 24.9 ±7.2

п=10 р<0.01 . р<0.01

0.5 57.0 ±10.8 54.5 ± 10.4 8.9 ± 0.6 38.4 ±4.6

п=10 р<0.01 р<0.01

1.0 106.0 ±16.8 42.5 ±9.7 10.2 ±0.6 43.7 ±4.6

п=10 р<0.01 р<0.01 р<0.01

5.0 12.0 ±5.4 64.0 ±8.5 11.2 ±0.9 5.5 ±3.1

п=10 р<0.01

F(4.64)=15.22 F(4.64)=1.27 F(4.64)=9.07 Р(4.64)=18.08

. р<0.01 р>0.05 . р<0.01 р<0.01 .

Примечание: п - количество животных

Кроме того, можно утверждать, что в отличие и от известных транквилизаторов бензодиазепиновой природы , и от атипичного бензодиазепина - гидазепама, и от антиоксиданта мексидола производные меркаптобензимидазола имеют гораздо более широкий диапазон действующих доз, в то время как минимальные эффективные дозы бемитила и соединения 919 соответствуют интервалу между феназепамом и диазепамом.

Известно, что эмоционально-стрессовое воздействие по разному влияет на отдельных лиц. Так, в многочисленных исследованиях выделены, группы людей, стрессовый ответ которых связан с активацией деятельности, повышением ее продуктивности, с другой стороны, существуют лица у которых эмоциональный стресс сопровождается дезорганизующим эффектом ( Вальдман А.В, 1982). Характерно, что описанные группы обладают противоположными

реакциями на бензодиазепины. Если у первых типичные транквилизаторы вызывают в основном седацию, то у второй группы эти препараты в низких дозах облегчают деятельность, оказывая анксиолитический эффект ( Бадыштов Б.А. и соавт., 1995 ). Важно отметить, что данные закономерности характерны для класса млекопитающих в целом, поскольку они отмечены для его разных видов ( Беляев Д.К. и соавт., 1967,1979; Вальдман А.Ъ. и соавт., 1987).

Поэтому, основное значение результатов исследования транквилизирующих свойств отобранных препаратов состоит в выявлении направленности их действия на . "пассивный" фенотип эмоционально-стрессовой реакции.

Описывая актопротекторы, авторы часто сравнивали их с типичными психостимуляторами, акцентируя преимущества бемитила как "стимулятора неистощающего действия" ( Смирнов A.B., 1991 ). В процессе настоящей работы было крайне важно доказать, что активирующее влияние соединений не соответствует имеющемуся у типичных психостимуляторов , таких как амфетамин и сиднокарб.

Ранее было показано, что последние рблэдают. психостимулирующим действием на мышей Вб и С в разных дозах при оценке психостимулирующей способности стандартным методом регистрации спонтанной двигательной активности ( Машковский М.Д.и соавт., 1980 ). ■ ■

Установлено, что ни бемитил, ни томерзол, ни соединение 919 не стимулировали двигательную активность мышей обеих линий при отсутствии эмоционально-стрессовых- стимулов. Эти данные позволяют сделать однозначное заключение, о том что активация поведения мышей С в "открытом поле", наблюдаемая при введении меркаптобензимидазолов, обусловлена их влиянием на параметры эмоционально-стрессовой реакции. Вторым важнейшим результатом опытов ho оценке спонтанной двигательной активности является отсутствие и в этом случае в достаточном диапазоне доз седативного действия, характерного для бензодиазепиновых транквилизаторов в данном тесте (Воронина Т.А., 1992 )( рис.2 ).

Рис. 2. Влияние бемнтила на спонтанную двигательную активность

$ 1100

CJ

. 1600

600

100

опыт

□ ОПЫТ

□ контроль

0,1 1 5 10 100 1 5 30 50 Baib/c С57В1/6

Таким образом, комплексный анализ траквилизирующих свойств бемитила, томерзола и соединения 919, выполненный на основе фармакогенетической методологии и стандартных методов, позволяет сделать заключение о наличии у них селективных анксиолитических свойств.

Поскольку, подобные свойства для производных меркаптобензимидазола в эксперименте ранее не были описаны, полученные данные позволили развернуть работы в НИИ фармакологии РАМН по синтезу и широкому скринингу новых оригинальных селективных анксиолитиков в данном ряду. На основе проведенных исследований отобран ряд оригинальных соединений, по которым получен патент РФ № 94022663 и представлена РСТ заявка, опубликованная 21.12.1995.

Второй отправной точкой рабочей гипотезы явились сведения об антиоксидантных. свойствах некоторых производных меркаптобензимидазола, установленные ранее в лаборатории-фармакогенетики при изучении их антимутагенных свойств ( Середенин С.Б. и соавт., 1992 ). Известно, что образование свободных радикалов является важным звеном в регуляции процессов передачи сигнала через мембрану нервных клеток, состоянии мембранных рецепторов.

принимающих участие в реализации эффектов транквилизаторов ( Бурлакова Е.Б. и соавт., 1982 ). Испытания, проведенные в 'бесклеточных модельных системах, генерирующих гидроксильные и супероксидные радикалы и синглетный кислород, позволили обнаружить отдельные антирадикальные эффекты, что однако не дает возможности вывести каких-либо закономерностей в отношении тропности соединений к тому или иному виду активных форм кислорода ( рис. 3-5).

Рис.3 Вшннс соединении на ХЛ л

реакция Феитоиа Рис. А Уровень хемклюмнннсцеицни в

системе кеанткн^ссинтниоксиджэа

[ « 6«мнтнл -О-томрао--'-«оотротП } —о— Г ........мгт»м.|

Вместе с тем, проведенные нами исследования убедительно показывают, что бемитил и соединение 919 эффективно снижают образование липоперекисных радикалов в системе " гидропероксид водорода + пероксидаза хрена ".'Так, наиболее активным в этом отношении является соединение 919, которое в диапазоне концентраций от 10-8 до 10-4 М снижало образование радикалов на 40 - 50 % ( рис.6).

Методом клеточной хемилюминисценции удалось доказать, что все три . изученных соединения, снижая индуцированную хемилюминисценцию перитонеальных макрофагов крыс, обладают антирадикальными свойствами. Наиболее активным в диапазоне концентраций Ю-9 - !0-6 М опят:- оказалось соединение 919. Учитывая характерный для антиоксидантов переход с изменением концентрации в прооксидантное состояние, наличие такой широты антиоксидантного диапазона ( 10"5 - 10"'° М) ( рис.7 ) является положительным прогностическим признаком, поскольку позволяет варьировать дозы назначения препаратов в зависимости от индивидуальной чувствительности к их эффектам без опасения вызвать прооксидантное действие даже при достаточно большой физиологической широте различий в соотношениях эндогенных про- и антиоксидантных систем ( Меерсон Ф.З. и соавт., 1980; Середенин С.Б. и соавт., 1992; Kahl R.,1984 ). По этим характеристикам изучаемые препараты обладают значительным преимуществом перед производным триоксипиридина - мексидолом ( Середенин С.Б. и соавт., 1987 ).

Сопоставляя дозовы'е ' " зависимости селективного

анксиолитического действия изученных соединений с их концентрационными диапазонами антирадикальной активности можно считать, что полученные данные не противоречат предположению о роли этого механизма в формировании фармакологических эффектов. Кривые дозовой зависимости носят отчетливый куполообразный характер, что специфично для мембранотропных соединений ( Enenel G. et al., 1993). По выраженности анксиолитического и антирадикального эффектов имеется некоторые соответствия по активности 919> бемитил> томерзол. Концентрации, в которых проявляется антиоксидантные эффекты соответствуют обнаруженным в организме фарм'акокинентическими методами ( Бойко С.С., Игнатова М.А., 1989).

Рис. 7 Влияние соединений на ХЛ перитонеальных макрофагов крыс

4а ел

--контроль —□—бемитил —6—томермл —О—919

Хотя, в настоящей работе не изучали влияние бемитила, томерзола и соединения 919 на перекисное окисление липидов, существует большой объем литературных данных, свидетельствующих о взаимообусловленности процесса образования активных форм кислорода и ПОЛ, что позволяет сделать заключение об антиоксидантных свойствах изученных меркаптобензимидазолов ( Айрапетянц М.Г., 1990; БеЬег 5.,1987 ).

И, наконец, серия экспериментов, посвященных анализу влияния бемитила и родственных ему соединений на бензодиазепиновую рецепцию, позволяет высказать некоторые соображения о нейрохимических механизмах установленного анксиолитического действия.

В серии работ, выполненных в НИЛ фармакогенетики, была установлена возможность непрямого. влияния на рецепторную активность ГАМК - бензодиазепинового рецепторного комплекса. Среди выявленных модуляторов было производное Зоксипирндина (Середенин С.Б., Бледнов Ю.А., 1990), бензодиазепиновые .производные гидазепам и БД-556 (Бегедешп 5'.В.,В1ес1поу Уи.А., 1993 Д 994). Установлено также, что эндогенкные пептидные соединения способны увеличивать или уменьшать бензодиазепиновую рецепцию, при этом характеристики подобных воздействий

специфичны для фенотипа эмоционально - стрессовой реакции (Федосеев Ю.Л., 1990). Эти данные указывают на возможность тонкой и многосторонней регуляции эмоционально - стрессовой реакции ДНК-зависимыми механизмами, что позволяет объяснить, каким образом реализуется программа генетического контроля эмоционольно - стрессовой реакции.

Одним из важных результатов исследований, выполненных ранее в лаборатории фармакологической генетики с использованием в качестве модели инбредных линии мышей В6 и С было выявление межлинейных различий в . связывании Н3 диазепама после эмоционаьно-стрессового • воздействия, а также в стимулирующих эффектах ГАМК и ИаС! ( Середенин С.Б.,1992; Бледнов Ю.А., 1990).

Для анализа механизма действия изучаемых соединений было необходимо убедиться прежде всего в воспроизводимости этих результатов.

На рис.8 представлены данные, отражающие уровень бензодиазепиновой рецепции у интактных мышей, мышей подвергшихся ЭС воздействию, в ОП, мышей после контрольной йнъехции' и ' мышей, подвергшихся эмоциональному стрессу в "открытом поле" на фоне контрольной инъекции

Установлено, что эмоционально-стрессовое воздействие в "открытом поле" снижает бензодиазепиновое связывание на 28%. Контрольная инъекция не вела к его достоверным изменениям, а при наличии обоих воздействий связывание Н3диазелама снижалось на 22%.

В присутствии ГАМК в концентрации 200мкМ связывание Н3 диазепама у всех групп стрессированных в ОП животных падало по сравнению с показателем у интактных животных на 20-27%. Такая же тенденция отмечалась и при исследовании связывания в присутствии 150мМ ИаС1. Показатели рецепции уменьшались в среднем на 30%.

Таким образом, полностью подтверждены данные, полученные ранее, об ннгибирующем бензодиазепиновую рецепцию влиянии эмоционально-стрессового воздействия у мышей С. У этих же животных нарушается ионная регуляция бензодиазепиновой рецепции, что проявляется как в снижении., эффективности, так и в уменьшении

максимальной стимуляции КаС1 рецепции бензодиазепинового лиганда, особенно в случае комбинированного стрессового воздействия ( контрольная инъекция + ОП ).

Таким образом, обнаружены хорошо воспроизводимые, специфические для фенотипа эмоционально-стрессовой реакции нейрохимические изменения, которые можно рассматривать как базовые данные для последующей оценки эффектов изучаемых препаратов.

Рис. 8 Влияние эмоционально-стрессового воздействия на связывание меченого диазепама

40000

5В ГАМК НаС!

□ К1 РК2 а КЗ ВК4

Примечание: К1 - интактные мыши; К2 - ОП;

КЗ - контрольная инъекция; К4 - КЗ + ОП

На следующем этапе исследования оценивали зависимость, наблюдаемых после эмоционального стресса изменений в бензодиазепиновой рецепции от введения изучаемых производных 2-меркаптобензимидазола.

Препарат бемиткл вводили мышам линии Ва!Ь/с в дозе 5 мг/ кг, вызывающей анксиолитический эффект в поведенческих тестах, за час до декапитации.

Бемитил не оказывал влияния на уровень базального н ГАМК и №С1 стимулированного связывания по сравнению с животными, получившими контрольную инъекцию.

В мембранах мозга мышей линии С. испытавших эмоциональный стресс в ОП. при введении бемнтила наблюдали статистически достоверное увеличение базального связывания по отношению к животным, получившим контрольную инъекцию и эмоциональный стресс в "открытом поле". При этом происходило и восстановление до контрольного уровня ГАМК и ЫаС1 стимулированного связывания Н3 диазепама ( рис. 9 ). 1

В данной серии опытов также Изучено соединение СМ-346 ( 2-[ 2-(морфштно)этил]тио-5-этил-бензимидазол дипщрохлорид), отоб-ранное в качестве наиболее перспективного селективного анксиолитика по результатам скрининговых исследований НИИ фармакологии, выполненных в развитие настоящей работы.

Соединение СМ-346 вводилось мышам линии Ва1Ь/с в дозе 1.0 мг/кг . вызывающей селективное анксиолитическое действие, за 30 мин. до декапитации.

СМ-346 не изменял уровень базального связывания у мышей С по сравнению с контрольной инъекцией. Также не произошло изменений и в связывании з присутствии ГАМК и №С1.

У мышей С после эксперимента в "открытом поле" СМ-346 достоверно увеличивал уровень базального связывания ( с 22397 срт/мг белка до 29324 ерш/ мг белка ) и восстанавливал стимулирующее рецепцию действие ГАМК и №С1 (рис.

10)...... '

Препарат томерзол вводили животным в дозе 0,1 мг/кг, как показано выше в этой дозе наблюдался ансиолитичесхий эффект у мышей линии С в "открытом поле". У мышей декапитированных после эксперимента в "открытом поле" томерзол практически не вызывал изменений связывания как в присутствии ГАМК и №С1 так и в параметрах базальной рецепции. '

Соединение 919 вводили мышам в дозе 0,1 . мг/кг, вызывающей анксиолитическое действие в "открытом поле", за час до декапитации. В сравнении с контрольной инъекцией соединение не оказывало влияния на базальное связывание меченого диазепама, но в этом случае ГАМК стимулировала связывание на 27%, а КаС! на 25% по сравнению с соответствующем контролем, однако эти данные не были статистически достоверны.

У мышей линии С после эмоционально-стрессового воздействия в "открытом поле" введение 919 достоверно увеличивало уровень базального связывания ( с 22397 ерм/ мг белка до 26902 ерм/мг белка ). Рецепция, стимулированная ГАМК, возрастала на 28% в сравнении с аналогичным параметром в контроле, а

стимулированная NaCP увеличивалась на 27%. Все" полученные результаты были статистически достоверны (рис. 11).

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что введение бемитила, 919 и СМ 346 предотвращает изменения в ГАМК-бензодиазепиновом рецепторном комплексе в мембранах мышей С, вызванные эмоционально-стрессовым воздействием. Вероятнее всего, что это влияние является модулирующим, поскольку в опытах in vitro не обнаружено концентрационной зависимости эффектов бемитила, томерзола, и соединения 919 на рецепцию меченого диазепама при ее снижении по сравнению с контролем. Последний факт требует дополнительных исследований для объяснения.

'^Отсутствие достоверных эффектов томерзола соответствует его меньшей активности в других экспериментах.

Рис. 9 Влияние бемитила, томерзола, 919 и СМ-346 на базальное связывание мышей линии С

■ контроль Ибамитил НСМ-346 , Птомерзол Ш919

Таким образом, все элементы рабочей гипотезы настоящего исследования получили экспериментальные подтверждения. Обобщая полученные данные представляется возможным предположить, что мембранные изменения, первично возникающие при воздействии стрессового стимула у мышей С приводят к конформационной перестройке ГАМК - бензодиазепинового рецепторного комплекса, нарушающей его нормальное взаимодействие с лигандами

бнзодиазепинового участка и с эндогенными регуляторами. Эти изменения ослабляют ГАМК - эргическую передачу, что ведет к развитию реакции страха типа freezing.

Рис. 10 Влияние бемитила, Гомерзола, 919 и СМ-346 на №С1-стимулированную рецепцию

□ контроль Ибемитип ПСМ-346 Птомерзоп ИЭ19

Рис.11 Влияние бемитила, томерзола, 919 и СМ-346 на ГАМК-стимулированную рецепцию

ю . м

□ контроль Вбемитил ¡3 СМ-346 □томерэол 3913

Беметил, соединение 919 и СМ-346 , по-видимому, предотвращают развитие рецепторных сдвигов при стрессе за счет первичного влияния

на мембрану, что возможно при наличии у них антиоксидантных свойств, в результате чего формируется их анксивлитическое действие. Отсутствие же такого эффекта 4 у мышей В6 вполне соответствует ранее обнаруженным фактам, показавшим, что эмоционально - стрессовое воздействие в тесте " открытое поле" не вызывает у животных этой линии рецепторных перестроек, наблюдаемых у мышей С ( Seredenin S.B. et al., 1993).

В совокупности, полученные результаты и сделанные на их основе заключения позволяют констатировать наличие у препарата бемитил и соединения 919 анксиолитических свойств селективных для "пассивного" фенотипа эмоционально - стрессовой реакции. v

На основании результатов проведенного исследования можно сделать следующие выводы:

ВЫВОДЫ

1. Препараты бемитил в диапазонах доз 0.1-7.5 мг/кг, томерзол 0.01-0.1 мг/кг и соединение 919 0.01-0.1 мг/кг при однократном введении обладают анксиолитическими свойствами, не сопровождающимися седативным эффектом .

2. Установлено, что препараты бемитил, томерзол и соединение 919 в дозах, вызывающих анксиолитическое действие, не обладают психостимулирующим

" эффектом.

3. Методом клеточной хемилюминисценции установлены антирадакальные свойства бемитияа в концентрациях 10"* - 10-' М, томерзола 10-5 - 10* М и соединения 919 10"3 - 10-'° М. Наибольшей активностью обладает соединение 919.

4. Установлено, что у мышей линии Balb/c эмоционально-стрессовое воздействие - вызывает снижение связывающей способности бензодиазепинового учалка ГАМК-бензодиазепиноваго рецепторного комплекса и уменьшает стимулирующее связывание Н3-диазепама действие эндогенных регуляторов - ГАМК и NaCl.

5. Установлено, что бемитил, соединение 919 и СМ-346, введенные однократно мышам линии Ва1Ъ/с в анксиолитических дозах, предотвращают падение бензодиазепиновой рецепции и нарушения в эффектах эндогенных регуляторов -ГАМК и NaCl, вызванные эмоционально-стрессовым воздействием в тесте "открытое поле".

6. В опытах in vitro установлено отсутствие концентрационной зависимости взаимодействия с бензодиазепиновым участком ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса препаратов бемитил, томерзол и соединения 919.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ СОИСКАТЕЛЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Yarkova М.А., Blednov Yu.A., Seredenin S.B. И The study of anxiolytic properties of bemytyl - the mercaptobenzoimidazole derivative / Sec. international conf. Biological Basis of individual senssitivity to psychotropic drugs 22-26 may 1993, Moscow , 1993, p. 151

2. Яркова M.A., Бледнов Ю.А., Середенин С.Б. // Изучение анксиолитических свойств бемитила и его производных / Актуальные вопросы экспериментальной и клинической фармакологии, Смоленск, 1994, стр. 139-140

3. Яркова МА., Бледное Ю.А., Середенин С.Б. // Изучение антиоксидантной активности производных меркаптобензнмидазола / Актуальные вопросы экспериментальной и клинической фармакологии, Смоленск, 1994, стр. 140-141 -

4. Середенин С.Б., Яркова М.А. и соавт.// Производные 2-меркаптобеюимцдазола, обладающие селективной ашсснолитической активностью / Заявка на выдачу патента РФ № 94022663 от 10.06.1994, приоритет от 11.05.1995

5. Середенин С.Б. Яркова М.А. и соавт. Международная заявка № PCT/PU95/00085 опубликована 21.12.1995 W095/34304

6. Яркова МА, Рагимов Х.С., Бледнов Ю.А. , // Изучение анксиолитической активности знтиоксидантов / Фундаментальные исследования как основа создания

• лекарственных-средств-. Сб.-тезисов 1-го съезда Российского научного общества фармакологов 9-13 октября 1995 Волгоград, Москва, 1995, стр. 501