Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Клинико-иммунологические аспекты цитокинотерапии хронических рецидивирующих инфекций.

005003058 ^

На правах рукописи

ЖЕЛТОВА ОЛЬГА ИГОРЕВНА

Клиннко-нммунологические аспекты цитокинотерашш хронических рецидивирующих инфекций

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

- 1 Ш 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 2011

005003058

Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинический иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Останин Александр Анатольевич Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Климов Владимир Васильевич

кандидат медицинских наук Круглеева Ольга Леонидовна

Ведущая организация: Учреждение РАН Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук (г. Екатеринбург)

Защита состоится «¡/Хя £¿¿'-¿'¿ ¿/¡,.1$ 2011 г. в /2- '' часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН

у? '-/ •

Автореферат разослан «/,£/» <) 2011 г.

И.о. ученого секретаря диссертационного совета,

доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на успехи, достигнутые в лечении и профилактике инфекционных заболеваний, вызванных бактериальной, вирусной или грибковой микрофлорой, увеличивается число тяжелых форм, а также форм с торпидным течением воспалительного процесса, частыми рецидивами и малой эффективностью от адекватной этиотропной и патогенетической терапии [Титов, 2009; Нестерова, 2000; Malkin, 2004; Хаитов, 2001]. Длительная иерсистенция патогенов находится в тесной причинно-следственной взаимосвязи с развитием вторичного иммунодефицита (ВИД), который проявляется снижением механизмов иммунной защиты [Жукова, 2003; Смирнова, 2000; Калинина, 2003; Ahmed, 1996], что клинически манифестирует в виде хронических упорно-рецидивирующих бактериальных или возвратных вирусных инфекций, резистентных к традиционным методам лечения [Нестерова, 2000].

Наиболее типичным представителем рецидивирующих вирусных инфекций является герпетическая инфекция. По данным глобального обзора герпесвирусных исследований, инфицированность/заболеваемость герпесом из года в год нарастает, опережая скорость прироста населения Земли. Многообразие клинических проявлений, особенности возбудителей, возможность их распространения практически всеми известными путями передачи позволили Европейскому региональному бюро ВОЗ отнести герпесвирусные инфекции в группу болезней, которые определяют будущее инфекционной патологии в текущем столетии [Шульженко, 2004; Железникова, 2005; Arduino, 2006; Walther, 2005]. Важно отметить, что по данным современных эпидемиологических исследований регистрируется не только увеличение количества пациентов с хронической герпетической инфекцией, но также - более тяжелых форм течения заболевания [Латышева, 2001; Самгин, 2002; Ball, 2001; Corey, 2002, Hjalmarsson, 2007,2009].

Среди бактериальных инфекций наиболее распространены инфекции кожи и подкожно-жировой клетчатки (пиодермия и фурункулез). В экономически развитых странах инфекции кожи и мягких тканей составляют до 1/3 всех инфекционных заболеваний [Новоселов, 2004], а удельный вес пиодермии среди дерматологической патологии варьирует от 17 до 60 % [Масюкова, 2004; Белькова, 2005]. При этом также отмечается неуклонный рост хронических, часто рецидивирующих форм пиодермии, обусловленных различными нарушениями в системе врожденного и адаптивного иммунитета [Сетдикова, 2005].

Принято считать, что в случаях хронизации инфекционно-воспалительного процесса для индукции эффективного противоинфекционного иммунитета и элиминации патогена необходимо проводить иммуностимулирующую терапию. Однако дефект специфического иммунного ответа может быть следствием активации регуляторных Т-клеток (T-reg), и в этом случае иммуностимуляция может потенцировать их супрессорную активность [Mills, 2004; Mittrücker, 2004; Воробьев, 2006; Maurus de la Rosa, 2004]. Такую вероятность нельзя исключать, поскольку иммунные нарушения при рецидивирующих инфекционных заболеваниях не всегда удается четко верифицировать традиционными методами оценки иммунного статуса [Латышева, 2004; Масюкова, 1994].

В связи с этим в данной группе пациентов остается открытым вопрос о проведении патогенетически обоснованной иммунотропной терапии. Для ответа на этот вопрос актуальным является проведение углубленных иммунологических исследований с привлечением современных методов, позволяющих оценивать функциональную активность иммунокомпетентных клеток, характер продукции Thl/npo- и ТЬ2/противовоспалительных цитокинов, а также количество различных субпопуляций Т-

reg. Такой подход позволит получить новые данные об особенностях иммунопатогенеза хронических рецидивирующих инфекций, которые послужат научной основой для разработки более эффективных методов лечения пациентов с хроническими рецидивирующими инфекциями (ХРИ).

На современном фармакологическом рынке постоянно появляются новые иммунотропные препараты. Кроме того, активно идет процесс расширения арсенала методов лабораторной иммунодиагностики и иммуномониторинга, что позволяет клиническим исследователям более точно дифференцировать «точки приложения» не только новых, но и уже хорошо зарекомендовавших себя иммуномодулирующих препаратов. Постоянное обновление наших знаний о механизмах действия иммунотропных препаратов необходимо для последующего целенаправленного их включения в комплексную терапию больных хроническими рецидивирующими инфекциями с целью повышения клинического эффекта от проводимой иммуномодулирующей терапии.

В настоящее время в клинической практике все более широко используются препараты, основой которых являются цитокины. Одним из первых отечественных фармакопейных препаратов, относящихся к этой группе, является Ронколейкин -рекомбинантный интерлейкин-2 (pIL-2) человека. Многолетний опыт применения Ронколейкина при лечении сепсиса, острых гнойно-воспалительных заболеваний, некоторых злокачественных опухолей свидетельствует о его эффективности и безопасности [Брискин, 2000; Останин, 2002; Лобзин, 2001; Молчанов, 2002; Мусалимова, 2007]. Тем не менее, остаются открытыми ряд вопросов. В частности, в отношении пациентов с хроническими рецидивирующими инфекционными заболеваниями не исследована клиническая и иммунокорригирующая эффективность Ронколейкина при его использовании в режиме монотерапии при различных способах введения препарата: в виде подкожных инъекций и виде ингаляций. Кроме того, представляется важным ответить на вопрос: не происходит ли на фоне курсового лечения Ронколейкином экспансии регуляторных супрессорных Т-клеток, что может быть отнесено к побочным, иммунотропным эффектам препарата, поскольку может усилить клинические проявления иммунной недостаточности.

Исходя из вышесказанного, была сформулирована цель работы:

Изучить особенности иммунопатогенеза и оценить эффективность различных вариантов иммунотерапии хронических рецидивирующих инфекций бактериальной и вирусной природы.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку показателей иммунного статуса, пролиферативной активности Т-клеток, уровня продукции Thl/npo- и ТМ/противовоспалительных цитокинов, а также количества различных субпопуляций T-reg в группах здоровых доноров и пациентов с ХРИ.

2. Оценить особенности иммунитета пациентов с ХРИ в зависимости от нозологической формы основного заболевания и природы этиопатогена (бактериальные vs. вирусные инфекции).

3. Разработать протокол клинических испытаний и провести открытое рандомизированное сравнительное исследование по оценке эффективности pIL-2 при подкожном и ингаляционном режимах введения препарата в параллельных группах пациентов с ХРИ.

4. На основе анализа результатов проведенных испытаний оцепить безопасность, клиническую эффективность, и иммунокорригирующее действие цитокинотерапии pIL-2.

5. Разработать протокол клинических испытаний и провести пилотное клиническое исследование по оценке переносимости, безопасности и эффективности иммунотерапии с использованием дендритных клеток и plL-2 в качестве адьюванта у больных рецидивирующей герпетической инфекцией.

Научная новизна.

Впервые показано, что больные с хроническими рецидивирующими, инфекционными заболеваниями характеризуются количественным . дефицитом активированных CD56+CD16NK-K.ieTOK, повышенным содержанием регуляторных Т-клеток (CD4"CD25hi8h Treg, CD4+FoxP3 Treg), сдвигом Thl/Th2 баланса ? сторону Th2-клеток, секретирующих 1L-4, а также повышенной активностью Т-клеток, секретирующих IL-10. Установлено, что больные с вирусными заболеваниями, в отличие от пациентов с бактериальной , инфекцией, характеризуются более выраженными иммунными нарушениями, при этом дисбаланс Thl/Th2 (INF-f/IL-4) и про-/противовоспалительных (TNF-<x/IL-10) цитокннов регистрируется у пациентов независимо от природы этиопатогена. Полученные результаты впервые аргументируют, что патогенетической основой персистенции и хронизации инфекции являются нарушения механизмов врожденного (дефицит NK-клеток) и приобретенного иммунитета (сдвиг Thl/Th2), которые развиваются на фоне количественной экспансии регуляторных супрессорных Т-клеток.

Впервые показано, что ТЫ-лимфоциты больных с ХРИ сохраняют свой функциональный резерв и способны в ответ на стимуляцию активно продуцировать INF-y, что доказывает принципиальную возможность коррекции баланса Thl/Th2 цитокннов у больных с хроническими рецидивирующими инфекционными заболеваниями

При проведении клинических испытаний впервые установлено, что цитокинотерапия pIL-2 (в курсовой дозе 1,5 мг) сопровождается усилением активности Т1т1-лимфоцитов и снижением уровня продукции IL-10 in vitro, и при этом не приводит к развитию побочных, иммунотропных эффектов, связанных с количественной экспансией регуляторных супрессорных Т-клеток. Напротив, при подкожном режиме введения препарата отмечается значимое снижение относительного и абсолютного числа CD4*CD25Wsl,Treg до \ровня нормы. При ингаляционном пути введения препарата содержание CD4+CD25hl§llTreg и CD8"FoxP3Treg сохраняется стабильно нормальным, а относительное и абсолютное количество CD4+FoxP3Treg снижается до уровня, при котором различия с донорами становятся статистически недостоверными.

Практическая значимость

Полученные в работе данные патогенетически обосновывают целесообразность проведения цитокинотерапии с использованием препарата pIL-2 в лечении хронических рецидивирующих инфекций. Результаты рандомизированных клинических исследований показали, что монотерапия pIL-2 позволяет в 65,6% случаев достичь клинически значимого позитивного ответа, который проявляется уменьшением частоты рецидивов, площади поражения и выраженности клинических проявлений, и 4-кратным увеличением длительности безрецидивного периода. Кроме того, впервые показано, что ингаляционный режим цитокинотерапии не уступает по своей эффективности традиционному, подкожному варианту введения препарата pIL-2 (70 и 60% позитивного ответа, соответственно), и позволяет статистически более значимо увеличить продолжительность ремиссии основного заболевания. Показано также, что pIL-2 может

использоваться в качестве адьювантной цитокинотерапии в сочетании с дендритноклеточными вакцинами, и что применение такого подхода в лечении больных с рецидивирующей герпетической инфекцией позволяет уменьшить число и выраженность рецидивов без применения противовирусных препаратов.

Практическое значение проведенных исследований заключается также в том, что в качестве лабораторного маркера клинического ответа на монотерапию препаратом pIL-2 предложено использовать оценку относительного содержания CD4+CD25hgl,T-reg в периферической крови больных с ХРИ. Показано, что данный тест является высокоинформативным и диагностически значимым (ДК= 6,7, RR= 13,7), и при исходном (до начала лечения) уровне циркулирующих CD4+CD25l"shT-reg более 2,0% позволяет с 84,6% специфичностью и 71,4% чувствительностью прогнозировать неэффективность цитокинотерапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Рецидивирующий характер течения хронических инфекционных заболеваний ассоциируется с количественным дефицитом С056+СШбТЧК-клеток, повышенным содержанием регуляторных Т-клеток, сдвигом цитокинового баланса в сторону ТЪ2-клеток, секретирующих IL-4, а также повышенной активностью Т-клеток, секретирующих IL-10.

2. Цитокинотерапия с использованием pIL-2 в лечении больных с хроническими рецвдивирующими инфекциями является патогенетически обоснованным подходом, который характеризуется иммунокорригирующим и клинически значимым позитивным эффектом.

Объем и структура диссертации:

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 124 страницах машинописного текста, включающего 21 таблицу и 8 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 225 литературных источников, в том числе, 134 иностранных.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2010), Научно-практической конференции с международным участием «Клиническая иммунология, иммуногенетика - междисциплинарные проблемы» (Ташкент, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Абакан, 2011), на 6-ой отчетной конференции ИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2011).

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Благодарности:

Автор диссертации выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю A.A. Останин}' за поддержку и помощь, оказанную при работе над диссертацией; сотрудникам лаборатории клеточной иммунотерапии под руководством д.м.н., профессора Е.Р. Черных и лаборатории клинической иммунопатологии (руководитель лаборатории д.м.н., профессор B.C. Кожевников) НИИ Клинической иммунологии СО РАМН за практическую помощь в проведении экспериментальной части

исследования; сотрудникам иммунологического отделения клиники иммунопатологии под руководством к.м.н. Н.М. Старостиной за помощь в проведении клинической части исследования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследования.

Оценку безопасности и клинической эффективности иммунотерапии с использованием препарата рекомбинантного IL-2 (pIL-2, Ронколейкина) проводили в в дизайне открытого рандомизированного сравнительного исследования в параллельных группах больных с ХРИ. Отбор пациентов в исследование осуществляли согласно критериям включения/исключения. Одним из условий участия пациента в исследовании являлось отсутствие предлечснности какими-либо иммунотропными препаратами в течение последнего месяца, а также добровольный отказ пациента от приема других препаратов в течение всего срока наблюдения. Согласно протоколу, Ронколейкин использовали в виде монотерапии в двух группах пациентов (по 21 больному в группе), различающихся по способам введения препарата (подкожные инъекции и ингаляции). Пациентов относили к той или иной группе методом случайного распределения.

В качестве основного критерия при оценке клинической эффективности иммунотерапии Ронколейкином использовали продолжительность безрецвдивного периода и частоту обострений у больных со сроком наблюдения 6 и более месяцев по данным катамнеза. У всех больных оценивали динамику показателей иммунного статуса после завершения терапии Ронколейкином. В исследование было включено 42 пациента в возрасте от 18 до 57 лет с бактериальной (хронический необструктивный бронхит, хронический тонзиллит, обусловленный грамиоложительной и грамотрицательной микрофлорой, пиодермия) или вирусной (рецидивирующие респираторные инфекции, рецидивирующая герпетическая инфекция (РГИ) [вирус простого герпеса 1 и/или 2 типа]) инфекцией, с частотой рецидивов основного заболевания > 6 раз/год. Средний возраст пациентов, составил 30,7±1,5 года. Группа обследуемых больных включала 9 мужчин (21,4 %) и 33 женщины (78,6 %). Среди обследованных пациентов у 30 больных выявлялась вирусная инфекция: РГИ (п=21) и рецидивирующие респираторные инфекции (п=9). У 12 человек выявлялись различные варианты бактериальной инфекции: хронический тонзиллит (п=3), хронический бронхит (п=1), рецидивирующий фурункулез/пиодермия (п=8). Продолжительность основного заболевания составляла в среднем по группе - 7,6± 1,0 лет (от 1 года до 23 лет), при этом частота ежегодных обострений варьировала от 6 до 25, составляя в среднем 10,5 ± 0,7 в год. Длительность межрецидивного периода варьировала от 14 дней до 2 месяцев, (в среднем 1,3 ± 0,07 месяца).

Для разных целей из венозной гепаринизированной крови выделяли стандартными методами лейковзвесь и мононуклеарные клетки (МНК).

Для поверхностного маркирования иммунокомттентных клеток использовали моноклональные антитела к CD3, CD4, CD8, CD20, CD16, CD25, HLA-DR, меченные флюоресцеином изотиоцианатом (FITC), фикоэритрином (РЕ), перидинин хлорофилл протеином (РегСР) и аллофикоциашшом (АРС) в количестве, рекомендуемом производителем (Сорбент и МедБиоСпектр, Москва, Россия; BD Biosciences Pharmingen, USA). Процент лимфоцитов определяли с помощью проточного цигометра FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) в программе CellQuest (Becton Dickinson, USA), используя параметры прямого (FSC), бокового (SSC) светорассеяния и канала флюоресценции (FL-2). Процент позитивных клеток, экспрессирующих CD4+CD25+, определяли среди 10000 клеток в лимфоцитарном регионе. При определении субпопуляции CD4+CD25hlgh

учитывали клетки с наибольшей интенсивностью свечения CD25. Для оценки внутриклеточной экспрессии FOXP3 в CD4" и в С08'Т-клетках, МНК обрабатывали FITC-меченными aimi-CD4 или аши-CDX мАТ («Сорбент», Москва). Пермеабшшзацию клеток проводили с использованием 0,2% раствора Твин-20, после чего клетки культивировали 30 мин с РЕ-меченными анти-РОХРЗ антителами (eBioscience, США). Культивирование лимфоцитов. МНК культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% С02. Полная культуральная среда состояла из среды RPMI-1640, дополненной 10% инактивированной сыворотки доноров АВ (IV) группы, 2мМ HEPES-буфера,' 0,3 мг/мл глютамина (все реактивы фирмы Sigma) и гентамицином (100 мкг/мл). Количество МНК, вносимых в лунку, составляло 0,1 х 106 клеток в 0,15 мл культуральной среды. Для стимуляции клеток использовали моноклональные airra-CD3 антитела (ICO-90, «Медбиоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл, и митоген конканавалин А в дозе 15 мкг/мл (Sigma). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению в нуклеопротеидные фракции клеток "Н-тимидина, вносимого за 18 ч до окончания культивирования в дозе 1 мкКю/лунку. Подсчет радиоактивности материала производили в жидкостном сцинциляционном счетчике SL - 30 (Intertechnic, Франция). Результаты представляли в виде среднего счета (имп/мин).

Продукцию цитокинов (TNF-a, INF-y, IL-4, IL-10) в 48-часовых супернататах нестимулировашшх и анти-СОЗ-стимулированных МНК оценивали методом ИФА с использованием соответствующих тест-систем в соответствии с инструкцией фирмы-производителя («Протеиновый контур», Санкт-Петербург, Россия для IL-4 и «Вектор-Бест», Новосибирск, Россия для INF-y, TNF-a и IL-10).

Исследование фагоцитом и продукции перекиси водорода. Функциональную активность фагоцитарных клеток оценивали по показателю активации нейтрофилов, определяемому по продукции перекиси водорода клетками после стимуляции зимозаном. Результат оценивали на многоканальном спектрофотометре (Multiskan MS, Labsystems, Финляндия) по интенсивности окрашивания пробы, которое происходило за счет окисления ортофенилдиамина в процессе катаболизма перекиси водорода. Фагоцитарную активность гранулоцитов и моноцитов оценивали методом проточной цитометрии после инкубации выделенных клеток с латексом, меченным FITS.

Уровень иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови определяли на многоканальном спектрофотометре с использованием соответствующих наборов реагентов («НПО СИНТЭКО», Россия) согласно инструкции фирмы-производителя.

Математическую обработку полученных результатов проводили методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows.

С целью оценки эффективности специфической иммунотерапии у больных рецидивирующей герпетической инфекцией было проведено дополнительное проспективное контролируемое пилотное клиническое исследование. Лечение проводили согласно протоколу, утвержденному решением Ученого Совета и Локального этического комитета, после подписания пациентами информированного согласия. В исследование включали пациентов от 18 до 60 лет в период ремиссии с резистентным течением заболевания при использовании стандартных методов противовирусной терапии.

В исследование было включено 7 женщин в возрасте от 22 до 48 (средний возраст -29,7±3,5лет) с орофациальной локализацией РГИ. Длительность заболевания составила в среднем 18,3±1,3 года (от 15 до 25 лет), а количество обострений от 8 до 15 в год, за полгода до начала лечения - 6±0,5 рецидивов.

На предварительном этапе проводили генерацию IFN-альфа-индуцированных дендритных клеток (IFN-ДК) in фракции прилипающих к пластику МНК в течение 3 сут в среде RPMI-1640 (Sigma, США) в присутствии GM-CSF (Sigma, США) 40 нг/мл и INF-a 1000 ЕД/мл (Роферон-А, Roche, Швейцария) с последующим дозреванием в течение 24 ч в присутствии полиоксидония в дозе 2 нг/мл («ПетроваксФарм», Москва). ДК нагружали специфическим рекомбинантым антигеном HSVlgD («Диагностические системы», Нижний Новгород) в дозе 5 мкг/мл и криоконсервировали для последующего использования. Лечение проводили в два курса. Первый - включал 4-6 подкожных инъекций IFN-ДК (5х106 клеток) с 2-недельным интерватом. Второй (через 3 мое после завершения первого) - 3-6 вакцинаций с кратностью 1 раз в месяц. В качестве адъюванта использовали Ронколейкин (п/к в дозе 0,25 мг). Оценку лечения проводили после первого и второго курсов, а таюкс через 6 мес после завершения терапии. Основным критерием эффективности являлось увеличение продолжительности межрецидивного периода. Интенсивность специфического ответа оценивали по пролиферации МНК больных в ответ на стимуляцию HSVlgD антигеном (5 мг/мл) в отсутствие и присутствие Ронколейкина (100 Ед/мл). Неспецифический ответ оценивали по пролиферации МНК в ответ на стимуляцию конканавалином А. Интенсивность пролиферации оценивали на 3 сутки.

Результаты и обсуждение.

Особенности иммунопатогенеза ХРИ. На первом этапе был проведен анализ иммунного статуса больных с хронической рецидивирующей бактериальной и вирусной инфекцией до начала курса иммунотерапии.

Табл. J. Показатели иммунного статуса в группах здоровых доноров и пациентов с ХРИ

ПОКАЗАТЕЛЬ Доноры,п=30 М ± SE (LQ - UQ) Больные, п=42 М ± SE

Абс. лимфоцитоз (х 109/L) 1,87 ±0,14 (1,45-2,23) 2.21 ±0.1 *

CD3+ Т-лимфоциты (%) 76,1 ± 1,48 (74,0-80,0) 78,8 + 1.02

CD4+ Т-лимфоциты (%) 45,32 ±0,93 (42,0-50,0) 48.17 ± 1.25

CD8+ Т-лимфоциты (%) 29,94+ 1.24 (25,0-34.0) 31,52 ± 1.2

CD3* Т-лимфоциты (х 109/L) 1,15 ±0,07 (0,94- 1,27) 1,74 ± 0.08

CD4+ Т-лимфоциты (х 109/Ь) 0,81 + 0,06 (0,61 -0,93) 1,05 ± 0.047 *

CD8T Т-лимфоциты (х lO'/L) 0,61 ±0,05 (0,46-0,67) 0,69 ± 0,04

CD20+ В-клетки (%) 9,58 ±0,86 (7,0- 12,0) 9,67 ±0,88

CDI6T NK-клетки (%) 14,17 ±1,67 (8,5-19,5) 12,17 ±0.78

CD16+CD56* NK-клетки (%) 8,69 + 0,5 (7,0- 11,0) 5,83 ±0,46 *

CD16+CD56+ NK-кл (x 10y/L) 0,18 + 0,017 (0,14 - 0,22) 0.13 + 0.013 *

HLA-DR моноциты (%) 62,8 ± 4,3 (52.0 - 76,0) 66.9 ± 1,6

ПАН (усл. ед.) 4.24 + 0.29 (2,9-5.3) 4.93 + 0.39

Фагоцитоз моноцитов (%) 57, 9 ± 1,05 (53,0-62.0) 54.9+1.25

Фагоцитоз гранулоцигов (%) 65,1 + 1,3 (56.0-73.5) 66,07 + 1.27

Пролиферация (имп/мин) Спонтанная 234 ±32.6 (130-270) 333 ±72

Аити-СОЗ-индуцированная 23760 ± 2799 (14 520 - 33500) 23067+ 1583

HBcD3-mAT 139,8 ±20,7 (104,4- 176,7) 129,4 ± 16,2

Примечание: здесь и далее п - количество наблюдений; данные представлены в виде М ± ЭЕ - средняя ± стандартная ошибка. ЬС> - 1К2 - нижнее и верхнее квартальное (25%) отклонение. * - ри < 0,05 достоверность различий между группами

В целом по группе обследованных больных регистрировалось статистически достоверное увеличение общего лимфоцитоза и абсолютного количества CD4T-лимфоцитов. Других изменений в Т-клеточном, В-клеточном, моноцитарно-макрофагальном звеньях иммунитета выявлено не было (табл. 1). Тем не менее, у пациентов регистрировалось достоверное снижение относительного и абсолютного содержания активированных CD16~CD56"NK-K.ieTOK. Следует отметить, что у 30 из 42 обследованных больных (т.е. более чем в 70% случаев) отмечался наиболее выраженный дефицит активированных CD16*CD56^NK-icneTOK, при котором индивидуальные значения выходили за нижнюю границу квартального диапазона здоровых доноров (<7%). Кроме того, у 10 из 42 обследованных больных реактивность Т-клеток в ответ на стимуляцию через СОЗ-Т-клеточный рецепторный комплекс была снижена более чем в 2 раза (10800 ± 740 против 23760 ± 2799 имп/мин у здоровых доноров), что свидетельствует о низкой функциональной активности циркулирующих Т-лимфоцитов.

Выявленные иммунные нарушения могли быть взаимосвязаны с изменениями в компартменте регуляторных супрессорных Т-клеток (T-reg), поскольку регистрировались на фоне увеличения абсолютного количества С04Т-лимфоцитов. Поэтому дополнительно исследовали абсолютное и относительное содержание в крови основных субпопуляций Т-reg - CD4+CD25Т-клеток (в том числе высоко экспрессирующих CD25 антигены -CD4"CD25'"gh), а также CD44 и СШ+Т-лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией FoxP3 - фактора транскрипции специфичного для T-reg. Из данных, представленных на рисунке 1 видно, что в целом по группе пациентов с ХРИ было выявлено достоверное увеличение относительного и абсолютного содержания CD4TT-reg, высоко экспрессирующих CD25 антиген, а также CD4TFoxP3Treg. При этом больные не отличались от здоровых доноров по количеству CD8"FoxP3Treg. Тем не менее, корреляционный анализ выявил наличие статистически значимой обратной корреляционной взаимосвязи между содержанием CD^FoxPSTreg и уровнем пролиферативного ответа Т-клеток в анти-СШ-стимулированных культ} pax (rs= -0,54; р=0,02), что свидетельствует о возможном участии не только С D4 , но и СП8^Т-регуляторных клеток в нарушении параметров Т-клеточного иммунитета у пациентов с ХРИ.

0,14 в | 0,10 1 0,08 1 % 0,06 Е | 0,04 5 0.02 ЭОан ¡•anai rdE, r± nfl T — 0 7 1 6 5 1 3 i о 2 if ацпент пЗг| —1- pEi !i 1 ж

Я § £ о ¡S | s g s I "fa? H H J- Я S 1

Рис. 1 Сравнительная оценка абсолютного и относительного количества различных субпопуляций T-reg в группах здоровых доноров и пациентов с ХРИ Примечания: * - рц < 0,05 достоверность различий между группами

Учитывая выявленные изменения в компартменте регуляторных супрессорных Т-клеток, представлялось важным оценить цитокин-секреторную активность Т-лимфоцитов больных с хронической, рецидивирующей инфекцией. Для этого, был проведен сравнительный анализ интенсивности спонтанной и анти-СИЗ-стимулированной

10

продукции ТЫ- (1Ш-у) и ТЬ2- (11^-4), а также про- (ТЫР-а) и противовоспалительных цитокинов (1Ь-10) в 48-часовых супернатантах МНК здоровых доноров и пациентов с ХРИ. В отсутствие какой-либо стимуляции Т-клетки больных активно продуцируют 1Ь-4, что приводит к смещению ТЫ/ТЬ2 баланса на фоне нормального уровня продукции 1Ш-у (табл. 2). В анти-СТО-стимулированных культурах интенсивность продукции 11.-4 значимо не меняется, что указывает на то, что у пациентов с ХРИ ТЬ2-клетки находятся в активированном состоянии и не отвечают на дополнительные стимулы.

Табл. 2 Спонтанная и апти-СЭЗ-стимущюванная продукция цитокинов в группах

здоровых доноров и пациентов с ХРИ

Цитокины Спонтанная Анти-СОЗ-стимулированная

(пкг/мл) Доноры Больные Доноры Больные

(п=18) Гп=.М <п=18\

27.1 +22.2 24.6 ± 16.5 2135 + 951 3921,95 + 314

1Ь-4 12,5 + 6.2 102.6 ± 16,6* 107 ± 15 118,93+ 15.5

1Р!\'-у/1Ь-4 6.3 + 4,9 0.224 + 0.11 * 17.1 + 6.2 45 + 7.5 *

ТЫР-а 192 + 61.6 206.4 + 65,3 1120 + 98 1208,7 + 33

1Ь-10 7.4 + 0.7 25.9+ 4.9 * 93,6+46.7 255 + 39.1 *

ТЖ-аЛИО 29.4+ 12.2 12.2 + 3.5 * 25,2 ± 9.5 6.9+1.2 *

Примечание: представлены также значения (расч.ед.) индексов соотношения 1РЫ-уЛЬ-4 и ТОР-аЯНО, отражающих баланс продукции ТЫПЫ, а также про- и противовоспалительных цитокинов, соответственно.

Тем не менее, продукция ШГЧ-у в ответ на митогенную стимуляцию V больных возрастает даже в большей степени, чем у здоровых доноров (до 3921,95 ±314 против 2135 + 951 пкг/мл). В результате индекс соотношения 1Ш-7/1Ь-4, отражающий баланс продукции ТЫ/Т112 цитокинов, в среднем по группе пациентов с ХРИ достоверно выше, чем у здоровых доноров (45 + 7,5 против 17,1 ± 6,2 расч.ед., ръ-<0,05). Эти данные свидетельствуют о том, что ТЪ1-лимфоциты больных с ХРИ сохраняют свой функциональный резерв и способны в ответ на стимуляцию активно продуцировать Н-ТЧ-у, тогда как Т112-лимфоциты остаются рефрактерными к митогенным стимулам. Т-клетки пациентов с ХРИ отличались также высоким уровнем спонтанной и анти-СИЗ-стимулированой продукции 1И0, тогда как продукция ТЫР-а была сопоставима с нормативными значениями здоровых доноров. Как следствие у больных регистрировалось 3-4-кратное снижение индекса соотношения ЮТ-аЛИО как в спонтанных, так и в анти-СОЗ-стимулированных культурах (до 12,2 ± 3,5 и 6,9 ± 1,2 против 29,4 ± 12,2 и 25,2 ± 9,5 расч.сд. у здоровых доноров, р1)<0,05). В этой связи следует отметить, что поскольку продукция 1Ь-10 характерна для популяции индуцибельных Т-ге§, то выявленное усиление синтеза данного цитокина в культурах МНК больных с ХРИ может косвенно свидетельствовать об их повышенной функциональной активности, которая проявляется как в отсутствие какой-либо стимуляции, так и дополнительно усиливается в ответ на активационный стимул.

Таким образом, можно заключить, что по данным обычного иммунного статуса пациенты с хроническими рецидивирующими инфекциями практически не отличаются от здоровых доноров по параметрам В-клеточного, моноцитарно-фагоцитарного и' Т-клеточного звена иммунитета (за исключением повышенного лимфоцитоза и абсолютного кол1Гчества С04Т-лимфоцигов). Тем не менее, дополнительные исследования четко визуализируют количественный дефицит активированных Ж-клеток, сдвиг ТЫ/ТМ баланса в сторону Т-клеток, секретирующих 11,-4, а также повышенную активность Т-клеток, секретирующих 11.-10, что свидетельствует об иммунных нарушениях, которые

развиваются на фоне количественной экспансии регуляторных супрессорных Т-клеток и являются патогенетической основой персистенции и хронизации инфекции.

При сравнительном анализе пациентов с бактериальной и вирусной инфекцией было установлено, что больные с заболеваниями вирусной природы характеризовались более выраженными иммунными нарушениями. Именно в этой подгруппе регистрировалось статистически значимое увеличение общего лимфоцитоза, относительного и абсолютного количества С04Т-лимфоцитов, в том числе С04'С0251,1г" Тгед и С04+РохРЗ Тге0., а также количественный дефицит активированных -клеток. У пациентов с бактериальной инфекцией эти показатели были изменены в меньшей степени, и достоверно было снижено только процентное содержание Ж-клеток. Тем не менее, дисбаланс ТЫ/ТЬ2 цитокинов, а также про- и противовоспалительных цитокинов за счет повышенной продукции ИЛ-4 и ИЛ-10 регистрировался у больных независимо от природы этиопатогена.

Иммунокорригирующая и клиническая эффективность иммунотерапии с использованием р!Ь-2. По разработанному протоколу было пролечено 42 больных. Из них 21 больной получили курсовое лечение в виде подкожных инъекций Ронколейкина в дозе 0,5 мг, №3 через день, оставшиеся 21 пациента с ХРИ - в виде ингаляций препарата в дозе 0,5 мг, №3 через день. Сформированные методом случайного распределения на основании критериев включения/исключения подгруппы были сопоставимы по полу, возрасту, основным нозологическим формам и длительности заболевания, по частоте рецидивов и средней продолжительности межрецидивного периода, а также по параметрам иммунного статуса.

В динамике проводимой терапии у пациентов с ХРИ, получивших курсовое лечение Ронколейкином как в режиме подкожных инъекций, так и в режиме ингаляций, основные параметры Т-, В-клеточного и моноцитарно-фагоцитарного звеньев иммунитета не претерпевали каких-либо выраженных изменений и сохранялись на уровне донорских значений.

Оценка параметров цигокинового статуса в динамике проводимой иммунотерапии также не выявила значимых различий в подгруппах больных, получавших Ронколейкин в режиме подкожных инъекций или ингаляционно (табл.3). Через 4В ч после последнего введения препарата в нестиму лированных культурах пациентов с ХРИ сохранялась повышенная активность Т-клеток, секретирующих 1Ь-4 и 11-10, а индексы соотношения 1РК-уЛЬ4 и ЮТ-аЛЬ-Ю оставались на исходно низком уровне. Тем не менее, следует отметить, что после курсового подкожного введения Ронколейкина. Т-клетки пациентов с ХРИ в ответ на анти-СИЗ-стимуляцию секретировали 1Г'!\'-у на уровне 2-кратно превышающем донорские значения (4356 ± 363 против 2135 + 951 пкг/мл, ри<0,05). Эти данные свидетельствуют об усиление функциональной активности ТЫ-лимфоцитов на фоне проводимой терапии. При этом характер продукции ТОТ-а и 1Ь-10 в анти-СОЗ-стимулированных культурах значимо не менялся. Несколько иная картина отмечалась в подгруппе больных с ингаляционным введением Ронколейкина. В акти-С1)3-стимулированных культурах этих больных не отмечалось дополнительного прироста активности ТЫ-клеток, секретирующих 1Ш-у, и баланс ТЪ1/ТЬ2 цитокинов (индекс соотношения 1Ш-7ЛЬ-4) сохранялся на исходном уровне, который достоверно превышал нормативные значения здоровых доноров. Тем не менее, в данной подгруппе на фоне проводимой иммунотерапии регистрировалось ослабление апти-СОЗ-индуцированной продукции 11,-10, в результате чего различия в уровне секреции 1Ь-10 и в индексе соотношения ТОТ-аЛЬ-Ю становились статистически недостоверными по сравнению с аналогичными показателями здоровых доноров.

Табл. 3. Продукция цитокинов в динамике проводимой иммунотерапии

Продукция Доноры (п=5) Режимы иммунотерапии Ронколейкином

цитокинов п/к введение (п=9) Ингаляции (п=9)

(пкг/мл) ДоИТ После ИТ ДоИТ После ИТ

Спонтанная

ШИ-у 27,1 +22,2 41,1 ±33,0 14,3 ± 6,9 8,0 ±2,1 8,5 ±2,1

1Ь4 12,5 + 6,2 107,1 ±21,7 141,2 + 26* 98,0 ±26,5 103,3 ±18,9*

ТЬТ-а 192 + 61,6 288,8 ±124 348 ± 99 124 ±29,8 97,9 + 32,7

1Ь-10 7,4 + 0,7 29,9 ± 7.3 28,5 ±6,0** 21,9 ±6,5 * 17,7 + 5,9*

анти-СИЗ-

индуцированная

1Ш-у 2135 + 951 3960 + 450 4584± 315 * 3884 + 465 3560 ±443

1Ь-4 107 ± 15 120,6 ±17,8 107,4 ± 12,2 117,2 + 78,6 + 11

ТОТ-а 1120 + 98 1155 + 51 1198 + 54 1262 + 35 1099 ±68

1Ь-10 93.6 + 46,7 221 +41 * 236 + 72 * 289 + 67 * 138,5 + 25,5

Примечания: * - рг_ < 0,05- достоверность различий по сравнению с донорами (Ц кртсркл Вилкокссша-Машв-Уигни)

Одной из задач исследования являлась проверка гипотезы, что курсовое лечение с использованием р1Ь-2 (препарата «Ронколешсин) может сопровождаться развитием побочных иммунотропных эффектов, связанных с экспансией регуляторных супрессорных клеток, высоко экспрессирующих рецепторы для 1Ь-2 (С04С 025>и8Ь Тге§).

Табл. 4. Субпопуляции Тге% е динамике проводимой иммунотерапии

Режимы иммунотерапии

Показатель Доноры Ингаляции (п=21)

ДоИТ После ИТ

СБ4+С025+ Тгсё (%) 5,0 ±0,28 5,78 + 0,53 4,93 ± 0,39

С04+С025ЫеЬ Treg (%) 1,31 + 0,12 1,52 ±0,16 1,55 ± 0,27

СТО'РохРЗ Тгео (%) 3,03 ±0,29 5,0 ± 0,86 * 4,23 ± 0,89

С08РохРЗ Тгс3 (%) 6,88+1,8 4,1 ±0,98 3,6 ± 1,035

С04 С025 Тгсз (х 109/Ь) 0,09 + 0,0064 0,13 + 0,015 0,11 ±0,01

С04'С025|,,е'1 Тгсв (х 109/Ь) 0,025 + 0,0025 0,034 ± 0,004 0,039 ± 0,007

С04*РохРЗ Тгев (х 109/Ь) 0,06 + 0,018 0,112 ± 0,018 * 0,098 ± 0,017

СБ8+РохРЗ Тгсг (х 109/Ь) 0.11 ±0,02 0,09 + 0,021 0,075 + 0,015

Режимы иммунотерапии

Показатель Доноры П/к (п=21)

ДоИТ После ИТ

С1)4+С025" Treg (%) 5,0+0,28 5,0 + 0,4 4,31 + 0,41

С04+С0251"8'1 Тге« (%) 1,31 ±0,12 1,74 + 0,17* 1,48 ±0,29

СВ4РохРЗ Тге2 (%) 3,03 ±0,29 5,75 + 0,94 * 6,9 + 0,92 *

СЦ8ТохРЗ Тге8 (%) 6,88+1,8 6,63 + 1,52 5,8+1,18

С04+СВ25+Тгея (х 109/Ь) 0,09 ± 0,0064 0,11 ±0,011 0,09 ±0,014

С04'С1)25Ь"'Ь Тгсё (х 109/1.) 0,025 ± 0,0025 0,04 ± 0,004 * 0,03 + 0,005

С04ТохРЗ Тге2 (х 109/Ь) 0,06 + 0,018 0,125 ±0,019* 0,133 + 0,02*

С08'РохРЗ Treg (х 109/Ь) 0,11 ±0,02 0,145 ±0,035 0,12 ±0,03

Примечания: * - ри <0,05 достоверность различи по сравнению с донорами

Сравнительный анализ компартмента Т-ге§-клеток (табл. 4) у пациентов с ХРИ. получивших лечение в виде подкожных инъекций Ронколейкина, показал снижение относительного и абсолютного количества СВ4+СШ5Ь'8 через 48 ч после завершения курса иммунотерапии, тогда как содержание С04+РохРЗТге§ сохранялось на исходно повышенном уровне. В подгрхппе больных с ХРИ, получавших курсовое лечение Ронколешсином в виде ингаляций, содержание СП4+С0251"8'1 Т-клеток сохранялось стабильным и оставалось в границах нормативных значений. При этом регистрировалось отчетливое снижение относительного и абсолютного количества СЭ4 РохРЗТ-гед до уровня, при котором различия с донорами становились статистически недостоверными.

В соответствии с разработанным протоколом клинических испытаний в качестве основного критерия при оценке клинической эффективности иммунотерапии Ронколейкином использовали продолжительность безрецидивного периода, а также частоту обострений у больных со сроком наблюдения 6 и более месяцев. Данные катамнеза были собраны о 40 из 42 пролеченных больных. Характер ответа пациентов с ХРИ на проведенную иммунотерапию Ронколейкином классифицировали по 3 категориям: 1 - позитивный эффект (уменьшение числа рецидивов; увеличение продолжительности межрецидивного периода; уменьшение площади поражения (у больных герпесом, пиодермией/фурункулезом) и выраженности клинических проявлений; 2 - без эффекта (отсутствие изменений в частоте рецидивов и продолжительности межрецидивного периода до и после лечения); 3 - негативный эффект (увеличение числа рецидивов и сокращение межрецидивного периода, увеличение площади поражения, тяжести обострений).

В целом по группе (п=40) позитивный клинически эффект был зарегистрирован в 65% случаев (у 26 больных), В частности, уменьшение частоты рецидивов выявлено у 12/26 (46,2%) больных. Уменьшение площади поражения и выраженности клинических проявлений у 3/26 (11,5%) больных. Снижение частоты обострений в сочетании с уменьшением выраженности клинических проявлений у 11/26 (42,3%) пациентов. Продолжительность клинического эффекта варьировала от 3 до 7 месяцев, составляя в среднем 4,37±0,24 месяца.

На рисунке 2 представлены результаты сравнительного анализа клинической эффективности иммунотерапии Ронколейкином в зависимости от режима введения препарата. Видно, что позитивный клинический эффект был достигнут у 60% (12/20) пациентов с ХРИ при использовании Ронколейкина в виде подкожных инъекций (в дозе 0.5 мг, №3 через день), и у 70% (14/20) больных - при использовании ингаляций (Ронколейкин в дозе 0,5 мг, разведенный в 7-8 мл раствора для инъекций, №3 через день). Более высокая эффективность ингаляционного режима не была статистически значимой из-за малого числа наблюдений и регистрировалась в виде тенденции.

Рис. 2. Эффективность ил шунотерапии Ронколейкином в лечении пациентов с ХРИ Примечание: Ршф достоверность различия частот (метод Фишера)

Применение Ронколейкина у больных с рецидивирующими вирусными инфекциями сопровождалось развитием положительного клинического эффекта в 71,4% случаев, тогда как при хронических инфекционных заболеваниях бактериальной природы - в 50% елл^чаев.

П/к введение (п=20)

□Улучшение ЕЗБез эффекта

Ингаляции (п=20)

□Улучшение □Без эффекта

Ртмф=0,37

В целом по группе пациентов с ХРИ, ответивших на проведенную иммунотерапию, продолжительность межрецидивного периода до начала лечения составляла в среднем 1,2 ± 0,09 мес. Временной интервал до развития 1-го рецидива после окончания терапии Ронколейкином варьировал от 0,5 до 7 мес. составляя в среднем 2,6) ± 0.36 мес (P\v=0,0004). При этом большинство больных отмечали, что даже в случае раннего рецидивирования заболевания, последующих обострений либо не было вообще, либо их количество значительно уменьшалось, при этом эффект сохранялся в отдельных случаях до 5-7 мес.

В 35% случаев (14/40) иммунотерапия была проведена без значимого эффекта.

Сравнительный анализ демографических, клинических, общелабораторных показателей и «рутинных» параметров иммунного статуса не выявил значимых различий в подгруппах больных, ответивших («респондеры», п=26) и не ответивших («нереспондеры», п=14) на терапию Ронколейкином. Тем не менее, оценка компартмента регуляторных Т-клеток, показала, что пациенты, не ответившие на лечение, отличались от группы «респондеров» повышенным уровнем относительного содержания CD4+T-лимфоцитов, высокоэкспрессирующих CD25 антиген (CD4TD25luehTreg 2,07 + 0.16 против 1,44 ± 0,15%, ри<0,05).

В целом по группе пролеченных больных ХРИ (п=40) между уровнем относительного содержания CD4 CD25highTreg и эффективностью иммунотерапии Ронколейкином была выявлена обратная корреляционная взаимосвязь (rs = -0.44; р=0.005).

Эти результаты послужили основанием для анализа операционных характеристик теста прогнозирования клинического ответа на Ронколейкин. основанного на определении относительного содержания регуляторных CD4'CD25h'8hT-K.<ieTOK. Для этого была построена характеристическая кривая (receiver-operator curve. ROC).

Рис. 3. ROC-крнвш. иллюстрирующая отношение между чувствительностью и специфичностью для различных точек разделения относительного содержания CD4CD25 s Т- reg в раннем прогнозе кпинического ответа на Ронколейкин. Площадь под кривой для данного теста составила 0,79 (95% ДИ 0,66 - 0,93, р=0,002).

Специфичность. %

Из данных таблицы 5 видно, что исходно повышенный уровень регуляторных CD4 С025Ы8ЬТ-клеток (> 2,0%) достоверно чаще встречается в группе больных, где монотерапия Ронколейкином была малоэффективной (в 71,4% случаев против 15,4% в группе больных-респондеров. ртмф=0.0011).

Увеличение относительного количества T-reg более 2,0% характеризовалось высоким диагностическим коэффициентом (ДК=6,7), информативность которого составляла 2,22. Обнаружение у больных ХРИ повышенного содержания CD4"CD25hlEhT-клеток ассоциируется с 13-кратным увеличением относительного риска малоэффективного использования Ронколейкина в режиме монотерапии (RR=13,7).

ROC-curve CD4"CD2SH'st,TreS

Табл. 5 Информативность определения относительного содержания СП4

Тест Частота % Р(Ж/Ак) ДК 8Р % 1(811) РЖ

м 1 А2

С04+СШ51]^ЬТгев > 2,0% 15,4 71,4** 6,7 71,4 84,6 2,22 13,7

Примечание: А, и А2 -----------------, — -

Ронколейкином (п=2б) иА,- больные-нереспондеры (п=М). ДК - диагностический коэффициент; ЯЯ -чувствительность и ЭР - специфичность признака; ^ЙЬ) - информативность по К.Шеннону; И1 -относительный риск. ** - р=0,ООП, достоверность различий частот рассчитана тачным, методом Фишера.

Таким образом, полученные нами результаты четко показывают, что исходная оценка уровня циркулирующих С 04 -ге§ может быть использована врачом,

принимающим решение о проведении иммунотерапии Ронколейкином, для раннего прогноза вероятности достижения значимого клинического эффекта.

Эффективность специфической иммунотерапии с использованием ДК-вакцин и Ронколейкина в качестве адъюванта. На заключительном этапе работы было проведено отдельное клиническое исследование с целью оценки безопасности и эффективности специфической иммунотерапии с использованием ЮТ-ДК в комбинации с Ронколейкином у больных с рецидивирующей герпетической инфекцией. Клинические испытания проводили в дизайне открытого проспективного пилотного исследования с контролем «до-после».

Проведение специфической иммунотерапии по разработанной схеме характеризовалось хорошей переносимостью, не вызывало местных и системных аллергических и/или воспалительных реакций.

При анализе клинической эффективности было показано (рис. 4) достоверное уменьшение числа обострений на фоне лечения (4,0±0,7 против 5,93±0,48 эпизодов до лечения; р„<0,05) и в течение последующих 6 месяцев наблюдения (2,4±0,97;р„<0,05). Соответственно, межрецидивный период на фоне терапии возрос до 81,6±13,8 дней, а в период 6 мес наблюдения после терапии составил 67,1±16,2 дня, что было достоверно выше соответствующего показателя до лечения (18,7±3,2; р„<0,05).

При этом у 3 пациентов в период 6-месячного наблюдения не было зарегистрировано ни одного обострения, а у 4-х имевших рецидивы, обострения протекали в более легкой форме с меньшей площадью высыпаний и степенью выраженности интоксикации.

Рис. 4 Клиническая эффективность специфической иммунотерапии.

* - достоверность различий по сравнению с показателями до лечения. р„<0,05, и-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни

На фэне лечения Через 6 месяцев после лечения

Число обострений —Щ- Межрецидивный период

Исследование антиген-специфического и митоген-индуцированного пролиферативного ответа в культурах МНК больных показало, что исходно пациенты с герпесвирусной инфекцией характеризовались сниженным уровнем Кон-А стимулированной пролиферации (12314±1840 против 49240±3990 имп/мин у здоровых доноров, ри<0,05) и отсутствием реактивности на стимуляцию вирусным антигеном (табл. 6). После первого курса ДК-вакцинаций (через 3 мес от начата лечения) ИВдгвозрастал в среднем в 5 раз, что свидетельствовало о появление антигенной реактивности МНК. Однако интенсивность митогенной реактивности Т-клеток оставалась низкой. По завершению второго курса ДК-вакцинаций (через 12 .мес после начала лечения) интенсивность антигенспецифического ответа сохранялась на достаточно высоком уровне (ИВдг 3,8±1,6 расч. ед.), при этом отмечалось 2-кратное усиление митогенной реактивности Т-клеток (ри<0,05). Через 6 мес после завершения второго курса терапии интенсивность антигенспецифического ответа у больных сохранялась на высоком уровне и соответствовала уровню ответа после первого курса ИТ. Кроме того отмечалось дальнейшее возрастание митоген-стимулированного ответа до среднего уровня митогенной реактивности у здоровых доноров (59240±3990 имп/мин).

Табл. 6 Динамика пролиферативного ответа МНК больных на ДОТ^Д антиген и КонА

Обследование Пролиферативная активность (имп/мин)

МНК МНК+АГ МНК+ КонА

До лечения 198 ± 44 208 ± 44 (1,1 ±0,23) 12314±1840 (58,4 ± 8,9)

После 1 курса ИТ 167 ±45 932 ± 280 * (5,2 ± 2,3) 16444 ±2861 (112 ±24,6)

После 2 курса ИТ 150 ±27 598 ± 222 * (3,8 ± 1,6) 25979 ±4453 * (186 ± 36)

Через 6 мес.после ИТ 208 ± 43 1196 ±552* (5,4 ±2,8) 64450 ± 18050* (306 ± 59)

Примечание: данные представлены в ввде М±БЕ пролиферативного ответа МНК больных герпесвирусной инфекцией в отсутствие и в присутствии АГ или КонА. В скобках - индекс влияния ИВдг и ЙВкон-а-отношепие стимулированного ответа к уровню спонтанной пролиферации, * - достоверность различий по сравнению с показателями до лечения , ри<0,05, и-критерий Видкоксона-Манна-Уитни

Судя по полученным данным, специфическая ИТ на основе ДК-вакцин в сочетании с использованием Ронколейкина в качестве адьюванта, позволяет уменьшить число рецидивов и выраженность их проявлений, а также увеличить продолжительность безреццдивного периода, что сопряжено с активацией специфического и неспецифического иммунного ответа.

ВЫВОДЫ

1. Больные хроническими инфекционными заболеваниями характеризуются количественным дефицитом активированных С056^С016+Ж-клеток, повышенным содержанием регудяторных Т-клеток (С04+СБ25ЫёЬ Тгес, С04'РохРЗ Тге8), сдвигом ТЫ—>ТЬ2 баланса в сторону ТЪ2-клеток, секретирующих 1Ь-4, а также повышенной активностью Т-клеток, секретирующих 1Ь-10, что свидетельствует о выраженных иммунных нарушениях, которые развиваются на фоне количественной экспансии регуляторных супрессорных Т-клеток и являются патогенетической основой персистенции и хронизации инфекции.

2. Дисбаланс Thl/Th2 (INF-y/lL-4) и про-/противовоспалительных (TNF-a/IL-IO) цитокинов регистрируется у пациентов с хроническими рецидивирующими инфекциями независимо от природы этиопатогена.

3. Thl-лимфоциты больных способны в ответ на стимуляцию активно продуцировать INF-y, что указывает на принципиальную возможность коррекции Thl/Th2 баланса, и научно обосновывает клиническое применение pIL-2 (препарата «Ронколейкин») в лечении хронических рецидивирующих инфекций.

4. Трехкратное введение pIL-2 в суммарной дозе 1,5 мг в виде подкожных инъекций или ингаляций сопровождается усилением активности Thl-лимфоцитов и снижением уровня продукции IL-10 in vitro, и при этом не приводит к развитию побочных, иммунотропных эффектов, связанных с количественной экспансией регуляторных супрессорных Т-клеток.

5. Монотерапия препаратом plL-2 позволяет в 65,6% случаев достичь клинически значимого позитивного ответа, который проявляется уменьшением частоты рецидивов, площади поражения и выраженности клинических проявлений, и 4-кратным увеличением длительности безрецидивного периода. При,, этом ингаляционный режим цитокинотерапии не уступает по своей эффективности традиционному, подкожному варианту введения препарата pIL-2 (70 и 60% позитивного ответа, соответственно), и позволяет статистически более значимо увеличить продолжительность ремиссии основного заболевания.

6. Относительное количество в периферической крови больных CD4+CD25hiBhT-reg является высокоинформативным и диагностически значимым предиктором клинического ответа на цитокинотерапию препаратом pIL-2. Исходно повышенное (>2,0%) содержание CD4+CD25hshT-reg позволяет с 84,6% специфичностью и 71,4% чувствительностью прогнозировать неэффективность монотерапии pIL-2 (ДК= 6,7, RR= 13,7).

7. Курсовое лечение больных с рецидивирующей герпетической инфекцией дендритноклеточными вакцинами в сочетании с адьювантной цитокинотерапией pIL-2 сопровождается индукцией антиген-специфического иммунного ответа, что позволяет уменьшить число и выраженность рецидивов без применения противовирусных препаратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Желтова О. И., Старостина Н. М., Тихонова М. А., Леплина О. Ю., Черных Е. Р., Останин А. А. Особенности иммунитета больных с хроническими рецидивирующими инфекциями. // Иммунология. - 2011. № 4. -С. 205-209.

2. Желтова О.И., Старостина Н.М., Тихонова М.А., Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Останин A.A. Эффективность ронколейкина® в лечении хронических рецидивирущих инфекций. // Медицинская иммунология. - 2011. -№ 2-3. - С. 227-236.

3. Желтова О.И., Старостина Н.М., Останин A.A. Клиническая эффективность ронколейкина у пациентов с рецидивирующими инфекциями. // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 2/2 (35). - С. 20-21.

4. Леплина О.Ю., Желтова О.И., Борисова А.Е., Старостина Н.М, Останин A.A. Вакцины на основе дендритных клеток в лечении герпетической инфекции. // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 2/2 (35). -С. 38-39.

5. Желтова О.И., Старостина Н.М., Тихонова М.А., Курганова Е.В., Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Останин A.A. Особенности иммунопатогенеза рецидивирующих инфекций у часто и длительно болеющих пациентов. // Материалы всероссийской научной конференции «Молекудярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии». Цитокины и воспаления. - 2010. - Т. 9,- №3,-С. 64-65

6. О.И. Желтова,^ Н.М. Старостина, М.А. Тихонова, О.Ю. Леплина, Е.Р. Черных, A.A. Останин. Эффективности Ронколейкина при различных режимах введения у часто и длительно болеющих пациентов с бактериальной или вирусной инфекцией. // Материалы юбилейной конференции «Клиническая иммунология и иммуногенетика - междисциплинарные проблемы», Ташкент 2010, С. 45.

7. Желтова О.И., Старостина Н.М., Леплина О.Ю., Тихонова ЕЛ., Черных Е.Р., Останин A.A., Козлов В.А. Ронколейкин в лечении часто и длительно болеющих пациентов: предварительные результаты клинических испытаний (материалы конференции «Дни иммунологии в Сибири» Красноярск 2010, С. 234-236.

8. Желтова О.И., Леплина О.Ю., Старостина Н.М., Борисова А.Е., Останин A.A., Черных Е.Р. Специфическая иммунотерапия с использованием «интерфероновых» дендритных клеток в лечении рецидивирующей герпетической инфекции. // Материалы конференции «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск 2010, С. 236238.

9. Желтова О И., Старостина Н.М., Черных Е.Р., Останин A.A. Иммунные нарушения при хронических рецидивирующих инфекциях и возможности их коррекции. // Материалы конференции «Дни иммунологии в Сибири», Абакан 2011, С. 196-198.

10. Желтова О.И., Старостина Н.М., Черных Е.Р., Останин A.A. Иммунные нарушения и их коррекция рекомбинантным интерлейкином-2 у больных с рецидивирующими инфекциями. // Материалы 8-й отчетной конференции НИИКИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике», Новосибирск 2011, С. 117-118.

Подписано к печати 15.11.2011 формат - 60x84 1/16, Усл. печ. л. 1

Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 467 Типография ООО "ЮГУС-ПРИНТ", ИНН 5402467637, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4

Несмотря на успехи, достигнутые в лечении и профилактике инфекционных заболеваний, вызванных бактериальной, вирусной или грибковой микрофлорой, увеличивается число тяжелых форм, а также форм с торпидным течением воспалительного процесса, частыми рецидивами и малой эффективностью от адекватной этиотропной и патогенетической терапии [81, 56, 166, 84]. Длительная персистенция патогенов находится в тесной причинно-следственной взаимосвязи с развитием вторичного иммунодефицита (ВИД), который проявляется снижением механизмов иммунной защиты [23, 25, 28, 56, 92], что клинически манифестирует в виде хронических упорно-рецидивирующих бактериальных или возвратных вирусных инфекций, резистентных к традиционным методам лечения [57].

Наиболее типичным представителем рецидивирующих вирусных инфекций является герпетическая инфекция. По данным глобального обзора герпесвирусных исследований, инфицированность/заболеваемость герпесом из года в год нарастает, опережая скорость прироста населения Земли. Многообразие клинических проявлений, особенности возбудителей, возможность их распространения практически всеми известными путями передачи позволили Европейскому региональному бюро ВОЗ отнести герпесвирусные инфекции в группу болезней, которые определяют будущее инфекционной патологии в текущем столетии [89, 21, 95, 217]. Важно отметить, что по данным современных эпидемиологических исследований регистрируется не только увеличение количества пациентов с хронической герпетической инфекцией, но также - более тяжелых форм течения заболевания [37, 73, 96, 113, 133, 134].

Среди бактериальных инфекций наиболее распространены инфекции кожи и подкожно-жировой клетчатки (пиодермия и фурункулез). На сегодняшний день, по данным зарубежной и отечественной литературы, удельный вес пиодермии среди дерматологической патологии варьирует от

17 до 60 % [49, 6]. В экономически развитых странах инфекции кожи и мягких тканей составляют до 1/3 всех инфекционных заболеваний [62]. При этом также отмечается неуклонный рост хронических, часто рецидивирующих форм пиодермии, обусловленных различными нарушениями в системе врожденного и адаптивного иммунитета [78].

Принято считать, что в случаях хронизации инфекционно-воспалительного процесса для индукции эффективного противоинфекционного иммунитета и элиминации патогена необходимо проводить иммуностимулирующую терапию. Однако дефект специфического иммунного ответа может быть следствием активации регуляторных Т-клеток (T-reg), и в этом случае иммуностимуляция может потенцировать их супрессорную активность [176, 177, 10, 170]. Такую вероятность нельзя исключать, поскольку иммунные нарушения при рецидивирующих инфекционных заболеваниях не всегда удается четко верифицировать традиционными методами оценки иммунного статуса [38, 47].

В связи с этим в данной группе пациентов остается открытым вопрос о проведении патогенетически обоснованной иммунотропной терапии. Для ответа на этот вопрос актуальным является проведение углубленных иммунологических исследований с привлечением современных методов, позволяющих оценивать функциональную активность иммунокомпетентных клеток, характер продукции Thl/npo- и ТЬ2/противовоспалительных цитокинов, а также количество различных субпопуляций T-reg. Такой подход позволит получить новые данные об особенностях иммунопатогенеза хронических рецидивирующих инфекций, которые послужат научной основой для разработки более эффективных методов лечения пациентов с хроническими рецидивирующими инфекциями (ХРИ).

На современном фармакологическом рынке постоянно появляются новые иммунотропные препараты. Кроме того, активно идет процесс расширения арсенала методов лабораторной иммунодиагностики и иммуномониторинга, что позволяет клиническим исследователям более точно дифференцировать «точки приложения» не только новых, но и уже хорошо зарекомендовавших себя иммуномодулирующих препаратов. Постоянное обновление наших знаний о механизмах действия иммунотропных препаратов необходимо для последующего целенаправленного их включения в комплексную терапию больных хроническими рецидивирующими инфекциями с целью повышения клинического эффекта от проводимой иммуномодулирующей терапии.

В настоящее время в клинической практике все более широко используются препараты, основой которых являются цитокины. Одним из первых отечественных фармакопейных препаратов, относящихся к этой группе, является Ронколейкин - рекомбинантный интерлейкин-2 (р1Ь-2) человека. Многолетний опыт применения Ронколейкина при лечении сепсиса, острых гнойно-воспалительных заболеваний, некоторых злокачественных опухолей свидетельствует о его эффективности и безопасности [5, 7, 63, 39, 52, 53]. Тем не менее, остаются открытыми ряд вопросов. В частности, в отношении пациентов с хроническими рецидивирующими инфекционными заболеваниями не исследована клиническая и иммунокорригирующая эффективность Ронколейкина при его использовании в режиме монотерапии при различных способах введения препарата: в виде подкожных инъекций и виде ингаляций. Кроме того, представляется важным ответить на вопрос: не происходит ли на фоне курсового лечения Ронколейкином экспансии регуляторных супрессорных Т-клеток, что может быть отнесено к побочным, иммунотропным эффектам препарата, поскольку может усилить клинические проявления иммунной недостаточности.

Исходя из вышесказанного, была сформулирована цель работы:

Изучить особенности иммунопатогенеза и оценить эффективность различных вариантов иммунотерапии хронических рецидивирующих инфекций бактериальной и вирусной природы.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи;

1. Провести сравнительную оценку показателей иммунного статуса, пролиферативной активности Т-клеток, уровня продукции ТЫ /про- и ТЬ2/противовоспалительных цитокинов, а также количества различных субпопуляций T-reg в группах здоровых доноров и пациентов с ХРИ.

2. Оценить особенности иммунитета пациентов с ХРИ в зависимости от нозологической формы основного заболевания и природы этиопатогена (бактериальные уб. вирусные инфекции).

3. Разработать протокол клинических испытаний и провести открытое рандомизированное сравнительное исследование по оценке эффективности р1Ь-2 при подкожном и ингаляционном режимах введения препарата в параллельных группах пациентов с ХРИ.

4. На основе анализа результатов проведенных испытаний оценить безопасность, клиническую эффективность, и иммунокорригирующее действие цитокинотерапии р1Ь-2.

5. Разработать протокол клинических испытаний и провести пилотное клиническое исследование по оценке переносимости, безопасности и эффективности иммунотерапии с использованием дендритных клеток и р1Ь-2 в качестве адъюванта у больных рецидивирующей герпетической инфекцией.

Научная новизна.

Впервые показано, что больные с хроническими рецидивирующими инфекционными заболеваниями характеризуются количественным дефицитом активированных С056+СВ16+МК-клеток, повышенным содержанием регуляторных Т-клеток (СВ4+СВ25Ы8Ь Тге& СБ4+РохРЗ Тгея), сдвигом ТЫ/ТЬ2 баланса в сторону ТЬ2-клеток, секретирующих 1Ь-4, а также повышенной активностью Т-клеток, секретирующих 1Ь-10. Установлено, что больные с вирусными заболеваниями, в отличие от пациентов с бактериальной инфекцией, характеризуются более выраженными иммунными нарушениями, при этом дисбаланс Thl/Th2 (INF-y/IL-4) и про/противовоспалительных (TNF-ot/IL-10) цитокинов регистрируется у пациентов независимо от природы этиопатогена. Полученные результаты впервые аргументируют, что патогенетической основой персистенции и хронизации инфекции являются нарушения механизмов врожденного (дефицит NK-клеток) и приобретенного иммунитета (сдвиг Thl/Th2), которые развиваются на фоне количественной экспансии регуляторных супрессорных Т-клеток.

Впервые показано, что Th 1 -лимфоциты больных с ХРИ сохраняют свой функциональный резерв и способны в ответ на стимуляцию активно продуцировать INF-у, что доказывает принципиальную возможность коррекции баланса Thl/Th2 цитокинов у больных с хроническими рецидивирующими инфекционными заболеваниями

При проведении клинических испытаний впервые установлено, что цитокинотерапия pIL-2 (в курсовой дозе 1,5 мг) сопровождается усилением активности Thl-лимфоцитов и снижением уровня продукции IL-10 in vitro, и при этом не приводит к развитию побочных, иммунотропных эффектов, связанных с количественной экспансией регуляторных супрессорных Т-клеток. Напротив, при подкожном режиме введения препарата отмечается значимое снижение относительного и абсолютного числа CD4+CD25highTreg до уровня нормы. При ингаляционном пути введения препарата содержание CD4+CD25highTreg и CD8 FoxP3Treg сохраняется стабильно нормальным, а относительное и абсолютное количество CD4+FoxP3Treg снижается до уровня, при котором различия с донорами становятся статистически недостоверными.

Практическая значимость

Полученные в работе данные патогенетически обосновывают целесообразность проведения цитокинотерапии с использованием препарата pIL-2 в лечении хронических рецидивирующих инфекций. Результаты рандомизированных клинических исследований показали, что монотерапия pIL-2 позволяет в 65,6% случаев достичь клинически значимого позитивного ответа, который проявляется уменьшением частоты рецидивов, площади поражения и выраженности клинических проявлений, и 4-кратным увеличением длительности безрецидивного периода. Кроме того, впервые показано, что ингаляционный режим цитокинотерапии не уступает по своей эффективности традиционному, подкожному варианту введения препарата pIL-2 (70 и 60% позитивного ответа, соответственно), и позволяет статистически более значимо увеличить продолжительность ремиссии основного заболевания. Показано также, что pIL-2 может использоваться в качестве адъювантной цитокинотерапии в сочетании с дендритноклеточными вакцинами, и что применение такого подхода в лечении больных с рецидивирующей герпетической инфекцией позволяет уменьшить число и выраженность рецидивов без применения противовирусных препаратов.

Практическое значение проведенных исследований заключается также в том, что в качестве лабораторного маркера клинического ответа на монотерапию препаратом pIL-2 предложено использовать оценку относительного содержания CD4+CD25highT -reg в периферической крови больных с ХРИ. Показано, что данный тест является высокоинформативным и диагностически значимым (ДК= 6,7, RR= 13,7), и при исходном (до начала лечения) уровне циркулирующих CD4+CD25hlghT-reg более 2,0% позволяет с 84,6% специфичностью и 71,4% чувствительностью прогнозировать неэффективность цитокинотерапии.

Положения, выносимые на защиту;

1. Рецидивирующий характер течения хронических инфекционных заболеваний ассоциируется с количественным дефицитом СВ56+С016+1Ч1К-клеток, повышенным содержанием регуляторных Т-клеток, сдвигом цитокинового баланса в сторону ТЬ2-клеток, секретирующих 1Ь-4, а также повышенной активностью Т-клеток, секретирующих 1Ь-10.

2. Цитокинотерапия с использованием р1Ь-2 в лечении больных с хроническими рецидивирующими инфекциями является патогенетически обоснованным подходом, который характеризуется иммунокорригирующим и клинически значимым позитивным эффектом.

Объем и структура диссертации:

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 124 страницах машинописного текста, включающего 21 таблицу и 8 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 225 литературных источников, в том числе, 134 иностранных.

Выводы

1. Больные хроническими инфекционными заболеваниями характеризуются количественным дефицитом активированных CD56+CD16+NK-KneTOK, повышенным содержанием регуляторных Т-клеток (CD4+CD25hlgh Treg, CD4+FoxP3 Treg), сдвигом Thl—>Th2 баланса в сторону ТЬ2-клеток, секретирующих IL-4, а также повышенной активностью Т-клеток, секретирующих IL-10, что свидетельствует о выраженных иммунных нарушениях, которые развиваются на фоне количественной экспансии регуляторных супрессорных Т-клеток и являются патогенетической основой персистенции и хронизации инфекции.

2. Дисбаланс Thl/Th2 (INF-y/IL-4) и про-/противовоспалительных (TNF-a/IL-10) цитокинов регистрируется у пациентов с хроническими рецидивирующими инфекциями независимо от природы этиопатогена.

3. Thl-лимфоциты больных способны в ответ на стимуляцию активно продуцировать INF-y, что указывает на принципиальную возможность коррекции Thl/Th2 баланса, и научно обосновывает клиническое применение pIL-2 (препарата «Ронколейкин») в лечении хронических рецидивирующих инфекций.

4. Трехкратное введение pIL-2 в суммарной дозе 1,5 мг в виде подкожных инъекций или ингаляций сопровождается усилением активности Thl-лимфоцитов и снижением уровня продукции IL-10 in vitro, и при этом не приводит к развитию побочных, иммунотропных эффектов, связанных с количественной экспансией регуляторных супрессорных Т-клеток.

5. Монотерапия препаратом pIL-2 позволяет в 65,6% случаев достичь клинически значимого позитивного ответа, который проявляется уменьшением частоты рецидивов, площади поражения и выраженности клинических проявлений, и 4-кратным увеличением длительности безрецидивного периода. При этом ингаляционный режим цитокинотерапии не уступает по своей эффективности традиционному, подкожному варианту введения препарата pIL-2 (70 и 60% позитивного ответа, соответственно), и позволяет статистически более значимо увеличить продолжительность ремиссии основного заболевания.

6. Относительное количество в периферической крови больных СВ4+С025Ь1ёЬТ-ге§ является высокоинформативным и диагностически значимым предиктором клинического ответа на цитокинотерапию препаратом р1Ь-2. Исходно повышенное (>2,0%) содержание С04+С025ь'ё,1Т-гев позволяет с 84,6% специфичностью и 71,4% чувствительностью прогнозировать неэффективность монотерапии р1Ь-2 (ДК= 6,7, КК= 13,7).

7. Курсовое лечение больных с рецидивирующей герпетической инфекцией дендритноклеточными вакцинами в сочетании с адъювантной цитокинотерапией р1Ь-2 сопровождается индукцией антиген-специфического иммунного ответа, что позволяет уменьшить число и выраженность рецидивов без применения противовирусных препаратов.

Практические рекомендации

1. Использование Ронколейкина в режиме монотерапии в виде подкожных инъекций или ингаляций (в дозе 0,5 мг, № 3, через день) позволяет достичь клинически значимого позитивного ответа у 65% больных с ХРИ. Лечебный эффект проявляется в виде уменьшения частоты рецидивов, уменьшения площади поражения и выраженности клинических проявлений, и 4-кратным увеличением длительности безрецидивного периода.

2. Цитокинотерапия Ронколейкином не оказывает негативного эффекта на течение основного заболевания, и характеризуется хорошей переносимостью (возможно развитие «цитокиновых» реакций уже внесенных в официальную инструкцию). В связи с этим монотерапия Ронколейкином (как в виде подкожных инъекций, так и в виде ингаляций в общей дозе 1,5 мг на курс) может осуществляться не только в стационарных, но и в амбулаторных условиях при лечении больных с ХРИ вирусной и бактериальной этиологии.

3. Ингаляционный режим иммунотерапии Ронколейкином пациентов с хроническими рецидивирующими инфекциями не уступает по своей эффективности традиционному, подкожному варианту введения препарата (70 и 60% позитивного ответа, соответственно).

4. При первичном иммунологическом обследовании больных с ХРИ рекомендуется оценивать относительное количество регуляторных С04 СБ25 8 Т -клеток. Выявление исходно повышенного содержания в периферической крови СВ4+С025ь'8,1Т-ге§ (> 2,0%) позволяет с высокой вероятностью прогнозировать низкую эффективность использования Ронколейкина в режиме монотерапии. У таких больных также предпочтительнее назначать комбинированные схемы лечения

Ронколейкин в сочетании с другими этиопатогентическими и иммунотропными средствами).

5. Позитивные клинические эффекты, которые регистрируются у больных ХРИ в результате цитокинотерапии Ронколейкином, имеют транзиторный характер. Поэтому больным, у которых был получен значимый клинический ответ на первый лечебный курс, можно рекомендовать проведение поддерживающих повторных курсов цитокинотерапии (с кратностью до 2-4/год, по начальной схеме) с целью индукции стойкой ремиссии основного заболевания.

6. В качестве одного из альтернативных вариантов иммунотерапии рецидивирующей герпетической инфекции можно рекомендовать проведение курсового лечения с использованием аутологичных дендритноклеточных вакцин в комбинации с Ронколейкином. Возможна следующая схема лечения: первый курс включает 4-6 подкожных инъекций ПчЛ^-ДК, нагруженных рекомбинантными антигенами вируса герпеса (ШУ^О и Н8У2§0) с 2-недельным интервалом; второй курс включает 3-6 вакцинаций с кратностью 1 раз в месяц. Количество ДК на 1 вакцинацию не менее 5 млн. При проведении вакцинаций обязательно использовать адъювантную цитокинотерапию - подкожное введение Ронколейкина в дозе 0,25 мг.