Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Иммунохимический анализ фактора Виллебранда при различных экспериментальных воздействиях и у онкологических больных



На правах рукописи

ДАНИЛОВА Анна Борисовна

ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФАКТОРА ВИЛЛЕБРАНДА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ И У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Специальность -14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена в ордена Трудового Красного знамени Научно-Исследовательском институте онкологии им.проф.Н.Н.Петрова Минздрава РФ.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор В.Б.Окулов

Научный консультант: доктор медицинских наук

профессор, Б.В.Афанасьев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.Д.Иванов

доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Петрищев

Ведущее учреждение: Медицинская Академия

последипломного образования

Защита состоится "_"_ 1997 г. в_часов на заседании

Специализированного совета по защите кандидатских диссертаций К.074.38.01 ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательского института онкологии им.проф.Н.Н.Петрова Минздрава РФ (189646, Санкт-Петербург, Песочный-2, Ленинградская ул., д.68).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан"_"_1997 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Демин Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Активация системы свертывания крови у больных злокачественными новообразованиями известна уже с 1865 года, когда Trousseau впервые описал развитие мигрирующего тромбофлебита у больных раком желудка, матки, яичка, сделав вывод, что "спонтанная коагуляция" является нередким явлением для онкологических больных (Trousseau А., 1865). Эта работа положила начало накоплению клинических и патологоанатомических данных, указывающих на наличие системной активации каскада коагуляции у больных злокачественными опухолями. В настоящее время известно, что тромбозы и тромбоэмболии вызваны состоянием гиперкоагуляции, которое может быть связано с аномалиями пристеночного тока крови, сосудистой стенки и самого состава крови (Patterson W.P., Risengenberg Q.S., 1990). Одним из механизмов развития состояния гиперкоагуляции, которое может привести к возникновению синдрома диссеминирован-ного внутрисосудистого свертывания (ДВС) у онкологических больных, является активация гемостатических свойств эндотелия - основного источника фактора Виллебранда (фВ), гликопротеина, играющего важную роль в плазменно-коагуляционном и сосудисто-тромбоцитарном процессах. Способность фВ образовывать многочисленные связи с клеточными рецепторами, нерастворимыми компонентами субэндотепия и циркулирующим фактором VIII свертывания крови позволяет отнести его к адгезивным белкам, изменение уровня которого может стать определяющим фактором в развитии патологических состояний, проявляющихся как кровотечениями, так и тромбозами.

В самые последние годы пристальное внимание исследователей сосредоточено на взаимосвязи системы свертывания крови с иммунной системой. Такие продукты иммунокомпетентных клеток как фактор некроза опухолей альфа, трансформирующий фактор роста бета, некоторые интерлейкины, факторы ан-гиогенеза и многие другие цитокины активно влияют на гемокоагуляцию. Особенно активны в этом отношении монокины - продукты, вырабатываемые макрофагами (Войтенков Б.О., Окулов В.Б., 1995).

Общепринятая оценка свертывающей системы крови в повседневной клинической практике, как правило, не выявляет каких-либо существенных изменений, которые позволяли бы заподозрить повышенную вероятность тромбообразо-

вания (Luzatto G., Schafer A.L., 1990). В то же время, наличие повышенного содержания фВ в плазме крови больных следует расценивать как неблагоприятный признак вероятности развития тромботических осложнений (Папаян Л.П., 1991), Поскольку фВ наряду с другими поверхностными гликопротеинами тромбоцитов играет важную роль во взаимодействии последних с опухолевыми клетками, можно предположить, что его повышенная концентрация будет способствовать также эмболизации сосудов опухолевыми клетками и развитию метастазов (Karpatkin S. et al., 1988, Nierodzik M. et al., 1995). В связи с вышеизложенным выявление уровня фВ у онкологических больных представляется актуальной научно-практической задачей.

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить содержание фВ в крови онкологических больных и в качестве маркера различных состояний эндотелия при экспериментальном моделировании клинических ситуаций.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать чувствительный и-специфичный метод количественного анализа фВ в физиологических жидкостях. Наиболее соответствующим этой задаче является иммуноферментный анализ (ИФА) на основе моноклонапьных антител, и их получение легло в основу решения данной задачи.

2. Оценить пригодность разработанного метода количественного определения фВ для клинической практики.

3. Изучить влияние различных схем химиотерапии на уровень фВ в крови онкологических больных в связи с другими характеристиками гемокоагуляционного процесса.

4. Изучить фВ как возможный маркер повреждения или активации эндотели-апьных клеток - основного источника изучаемого субстрата при непосредственном воздействии химиопреларатов в культуре.

5. Изучить влияние активированных иммунокомлетентных клеток на эндоте-лиальные клетки в культуре, используя фВ как маркер повреждения эндотелия.

Научная новизна работы.

1. Впервые получены отечественные монокпональные антитела (МКАТ) против фВ человека и на их основе разработана тест-система для иммунофер-ментного количественного. анализа фВ человека в различных биологических жидкостях.

2. Получены новые данные о влиянии химиопрепаратов на уровень ФВ у больных злокачественными опухолями в динамике химиотерапевтического лечения.

Практическая значимость работы. На основе полученных МКАТ создан набор реактивов для количественного иммуноферментного анализа фВ, не уступающий по чувствительности и специфичности известным коммерческим имму-нодиагностическим наборам. В клиническую практику НИИ онкологии им. проф.Н.Н.Петрова, других онкологических учреждений, НИИ гематологии и трансфузиологии, Республиканского центра по лечению больных гемофилией, Санкт-Петербургского Медицинского Университета им.И.П.Павлова внедрен новый метод определения фВ в плазме крови людей. Определение фВ в плазме крови может быть применено для анализа состояния гемокоагуляционной системы у онкологических больных, у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и для прогноза развития тромбозмболических осложнений, а также для диагностики болезни Виллебранда. Установлена пригодность фВ как маркера для диагностики осложнений и мониторинга токсических последствий в процессе химиотерапевтического лечения.

Апробация работы. Результаты исследования обсуждались на научных лабораторных конференциях НИИ онкологии им.проф.Н.Н.Петрова, материалы диссертации были доложены на Всесоюзной конференции по биотехнологии, Тарту, 1989; Всесоюзной конференции "Физиология и патология гемостаза", Полтава, 1991; на съезде Международного общества по тромбозу и гемостазу, Нью-Йорк, 1993; на съезде Британского общества по гемостазу и тромбозу, Лондон, 1996; на I съезде онкологов стран СНГ, Москва, 1996; на заседании Международного симпозиума "СЬегпоЬу1-\М1зес)е VII", 1997.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ и получено 1 авторское свидетельство.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на_страницах

машинописного текста, включая_таблиц и_рисунков. Работа состоит из

введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Список содержит_отечественных и_зарубежных публикаций.

На защиту выносятся следующие положения:

1. На основе полученных моноклонапьных антител к фВ человека разработан набор для ИФА фВ в различных биологических жидкостях человека, по чувствительности и специфичности не уступающий коммерческим образцам.

2. У онкологических больных наблюдается значительно повышенный уровень фВ в плазме крови, а назначение химиотерапевтического лечения независимо от комбинации цитостатиков приводит к дальнейшему увеличению содержания фВ.

3. Одним из механизмов, ответственных за увеличение фВ в кровотоке онкологических больных, является активация эндотелиальных клеток под влиянием различных стимулов, на которые эндотелиальные клетки реагируют однотипно: увеличением секреции фВ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования служила плазма крови 138 больных злокачественными новообразованиями в возрасте от 35 до 65 лет: 11 больных раком поджелудочной железы, 19 больных раком легких, 5 больных раком желудка, 23 больных раком молочной железы, 17 больных лимфогрануломатозом, 26 больных острым миелолейкозом, 8 больных хроническим миелолейкозом, 10 больных миеломной болезнью, 7 больных острым лимфолейкозом, 4 больных хроническим лимфолейкозом, 3 больных лимфобластной лимфомой, 2 больных лимфосарко-мой, 1 больного острым промиелоцитарным лейкозом, 1 больного истинной поли-цитемией, 1 больного хроническим миелофиброзом. Больные лечились в НИИ онкологии им.проф.Н.Н.Петрова и в Центре передовых медицинских технологий на отделении трансплантации костного мозга в течение 1989-92 г.г. Наряду с онкологическими больными исследовали плазму крови 4 больных болезнью

Виллебранда, наблюдавшихся в НИИ.гематологии и трансфузиологии Минздрава РФ.

Для определения нормальных значений содержания фВ в плазме крови были обследованы 27 практически здоровых лиц обоего пола.

Плазму крови от здоровых лиц и больных получали из венозной крови, ста-би лизированной 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9.

Для общей оценки состояния свертывающей системы крови онкологических больных учитывались следующие показатели: время рекальцификации плазмы крови, протромбиновый индекс, концентрация фибриногена, полученные одновременно с данными о содержании фВ в плазме крови этих больных.

Содержание фВ определяли с помощью непрямого метода ИФА в "сэндвич" -варианте (Егоров A.M. и др., 1991, КэттиД., Райкундалиа Ч., 1991).

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (МКАТ) против фВ человека, получали путем слияния клеток селезенки от иммунизированных фВ мышей линии Balb/c с клетками мышиной миеломной линии 6.5.3.А (Климович В.Б. и др., 1986), производимого по методу Galfre (Galfre et al., 1977) с незначительными модификациями. В качестве антигена для иммунизации мышей, при отборе гибридом, продуцирующих МКАТ против фВ человека, использовали частично очищенный препарат фВ, выделенный по методу Zimmerman с модификациями, зарегистрированными как изобретение (Zimmerman T.S. et al., 1971, Глебов A.B. и др., 1988).

Селекцию гибридных клеток производили в культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Выявление положительных клонов -продуцентов МКАТ осуществляли с помощью непрямого метода ИФА. Культивирование гибридомных клеток in vitro осуществляли в 96-, 24- и 6-луночных планшетах (Flow, Англия) при 37°С в атмосфере 7,5% СОг- Для культивирования in vivo суспензию гибридомных клеток вводили внутрибрюшинно мышам Balb/c, получившим за 7 дней до прививки инъекцию 0,3 мл пристана (Sigma, США). Асцитическую жидкость собирали через 10-20 дней после инъекции клеток и МКАТ выделяли последовательно осаждением сульфатом аммония и с помощью аффинной хроматографии на белок А-сефарозе (Pharmacia, Швеция).

Изотип МКАТ определяли с помощью иммуноферментного метода, используя комплект антител против тяжелых цепей иммуноглобулинов мыши (Calbiochem, США).

Исследование специфичности МКАТ проводили с помощью непрямого метода ИФА в "сэндвич'-варианте, метода определения ристомицин-кофакторной активности фВ, иммуногистохимического окрашивания срезов тканей (Папаян Л.П., 1982, Кэтти Д., Райкундалиа Ч., 1991).

Для получения культуры эндотелиапьных клеток использовали пуповины, отделенные от плаценты 50 здоровых рожениц и предоставленные родильным отделением кафедры акушерства и гинекологии Санкт-Петербургского Медицинского Университета им.И. П.Павлова.

Выделение, идентификацию и культивирование эндотелиальных клеток производили по методу Jaffe (Jaffe Е.А. et al„ 1973).

При культивировании эндотелиальных клеток в присутствии хи-миопрепаратов (цисплатин, доксорубицин) последние использовали в концентрациях, рекомендованных Alberts (Alberts D.S. etal., 1980).

Для исследования воздействия монокинов на эндотелиоциты использовали супернатанты активированных перигонеальных макрофагов самцов мышей линии С57В1/6 10-12 недельного возраста (питомник "Рапполово", РАМН), полученных по методу, описанному ранее (Okulov V.B. et al., 1992).

О жизнеспособности эндотелиоцитов судили по активности лактатдегидроге-назы (ЛДГ) (Peterson M.W. et al., 1987), а также по количеству погибших клеток, обнаруживаемых после окрашивания эндотелиоцитов трипановым синим. Надо-садки культур эндотелиальных клеток хранили при -70°С и подвергали исследованию на присутствие фВ с помощью непрямого метода ИФА в "сэндвич'-варианте.

Полученные данные обработаны методами вариационной статистики. Для определения достоверности различий средних значений двух совокупностей применялся критерий Стьюдента-Фишера. Для выявления связи между показателями отдельных опытов использовали корреляционный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение моноклональных антител к фВ человека и разработка метода его количественного определения в биологических жидкостях

В настоящее время наиболее широко используемым методом определения содержания различных маркерных субстанций в растворах является ИФА на

основе поли- или моноклонапьных антител. К моменту начала данной работы получение антител к фВ в нашей стране налажено не было. Однако потребность в таких антителах для диагностики сцепленных с фВ заболеваний и других патологических состояний очевидна. Будучи продуктом моноклона гибрида и доступные к воспроизводству в коммерческих количествах, МКАТ обладают очень высокой специфичностью, как и методы, основанные на их применении.

В результате четырех последовательно проведенных опытов по гибридизации и предварительного отбора клонов гибридных клеток, обладающих наилучшими ростовыми характеристиками и являющихся наиболее активными продуцентами высокоспецифических антител, было получено 6 гибридомных штаммов, синтезирующих МКАТ против фВ человека. Результаты тестирования представлены в таблице 1.

Один из полученных рекпонов, 71РЗ, имеющий наиболее высокие ростовые и продуктивные характеристики, был выбран для депонирования и получил авторское название 380Р2 (авторское свидетельство N 1693046 от 22.07.91).

Таблица 1

Тестирование клонов методом ИФА.

N Название Значения адсорбционной активности, полученной в ИФА

1 76С12 1,32 1,10 1,41 1,28

2 77Н10 1,02 1,05 1,00 1,34

3 71РЗ 1,35 1,44 1,52 1,53

4 15 ЮЮ 1,03 1,57 1,40 1,25

5 16 1Ю7 1,18 1,25 1,16 1,08

6 14 11Я10 0,98 0,94 0,95 1,12

7* Х63-Ад8-6.5.3.А 0,02 0,00 0,00 0,01

8* среда ДМЕМ, 10% СКРС 0,02 0,03 0,01 0,01

* - отрицательный контроль

Клетки штамма 380Р2 продуцируют в среду иммуноглобулины в) класса. Их специфичность к фВ человека была подтверждена с помощью непрямого ИФА в "сэндвич"-варианте с коммерческой сывороткой к фВ человека (ВоеЬгтдег, ФРГ). Результаты тестирования представлены в таблице 2.

При разработке набора для определения фВ человека в различных биологических жидкостях мы остановились на непрямом иммуноферментном методе в "сэндвич'-варианте как наиболее удобном и чувствительном. На первом этапе

фиксацию антигена достигали путем его "вылавливания" из тестируемого или стандартного образца с помощью поликпонапьных антител к фВ, предварительно адсорбированных на пластиковых планшетах. Политональные антитела в качестве "ловушки" для антигена использовать предпочтительнее, так как есть гарантия того, что они свяжут антиген, даже дефектный по одному из зпитопов, что может иметь место при некоторых патологических состояниях (вариантные формы болезни Виллебранда и синдромы, при которых наблюдаются отдельные клинические проявления этой болезни). Первоначально, на этапе скрининга клонов и стандартизации метода использовали коммерческие поликлональные антитела к фВ (Оакораиэ, Дания), в дальнейшем были использованы поликлональные кроличьи антитела собственного производства.

Таблица 2

Результаты определения специфичности МКАТ к фВ человека с помощью непрямого метода ИФА в "сэндвич"-варианте

О/К Последовательность реагентов Оптическая плотность

1 2 3

о Т + Анти-фВ + фВ +МКАТ-71РЗ + вАМ 1,35 1,44 1,53

К-1 Т + Анти-фВ +МКАТ-71 РЗ + вАМ 0,03 0,02 0,02

К-2 Т + Анти-фВ + фВ +МКАТ-М + САМ 0,01 0,02 0,01

Т - твердая фаза (пластик) О - опыт К - контроль

МКАТ-71РЗ - гибридомная среда с МКАТ к фВ без разведения Анти-фВ - антисыворотка к фВ (ВоеМпдег, ФРГ) в разведении 1:2000

МКАТ-М - гибридомная среда, содержащая МКАТ к миоглобину человека, без разведения

САМ - антимышиный периксидазный конъюгат в разведении 1:1000

Специфичность полученных МКАТ была подтверждена также замедлением реакции преципитации тромбоцитов в методе определения ристомицин-кофакторной активности фВ. Результаты реакции выражаются в секундах, в

качестве контроля вместо МКАТ к фВ добавляли МКАТ к миоглобину человека (табл.3).

Таблица 3

Результаты определения ристомицин-кофакторной активности фВ в присутствии МКАТ к фВ человека.

о\к Время агглютинации, с*

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

опыт 68 62 85 66 74 80 81 75 77 73

КОНТРОЛЬ 37 35 42 30 32 41 40 36 33 31

* - В каждой клетке указаны результаты отдельного опыта.

Для определения содержания фВ в плазме крови использовали подход, применяемый в зарубежной клинической практике. Суть его состоит в том, что уровень фВ определяют в процентах от нормы с помощью колибровочной кривой, для построения которой используют ряд последовательных разведений стандартной плазмы - смеси 20-30 образцов плазмы крови практически здоровых людей. За 100% содержания фВ принимали такое его количество, которое содержится в разведении стандарта 1:100. Разведения 1:50, 1:200, .1:400, 1:1000, 1:2000 составляют соответственно 200, 50, 25, 10 и 5%. В табл.4 приведены величины оптической плотности при длине волны 490 нм, соответствующие разведениям плазменного стандарта, на основе которой построена представленная на рис.1 кривая. Для построения стандартной кривой выбрали билогарифми-ческую зависимость. Коэффициенты корреляции для стандартных кривых в разных сериях опытов составляли 0,98-0,99. При разведении исследуемых образцов 1:100 полученные величины оптической плотности откладывали на оси ординат колибровочной кривой, при этом проекция полученной точки на ось X соответствует концентрации фВ в исследуемом образце в процентах от нормы. При использовании разведения исследуемых образцов 1:400 (у больных с гиперпродукцией этого фактора) или 1:50 (у больных с дефицитом этого фактора) определенные по кривой величины концентрации фВ соответственно использовали с

коэффициентом 4 и 1/2. Для определения концентрации фВ в исследуемых образцах по величине адсорбционной активности была создана компьютерная программа на базе вычислительного центра Арктического и Антарктического НИИ.

Таблица 4

Концентрация фВ при последовательных разведениях стандартной плазмы и соответствующие ей значения оптической плотности

Показатель Разведение плазменного стандарта

1:50 1:100 1:200 1:400 1:1000 1:2000

Концентрация фВ, % 200 100 50 25 10 5

Единицы оптической плотности 1,08 0,71 0,38 0,19 0,10 0,05

1,2 1 0,8 Е 0,6 0,4 0,2 0

50

✓0,05

1,08

100 фВ %

150

200

Рис.1 Стандартная кривая, выражающая билогарифми-ческую зависимость между оптической плотностью (Е) и концентрацией фВ (%).

Параллельное исследование содержания фВ в 27 образцах донорской плазмы и плазменного стандарта с применением разработанного набора и с помощью

набора реактивов фирм "Dakopatts" (Дания), "Boehrmger Mannheim" (Германия) показало, что результаты не имеют достоверных различий (р>0,5) (табл.5). Полученные данные свидетельствуют о том, что качество анализа, проводимое с использованием реагентов собственного производства, сравнимо с таковым при использовании наиболее положительно зарекомендовавших себя коммерческих реагентов, выпускаемых известными зарубежными производителями.

Таблица 5

Результаты определения содержания фВ в разных сериях стандартной плазмы с помощью реагентов собственного производства и фирменных реагентов.

Результаты Реагенты X, % S,% n

Реагенты собственного производства 101,3 33,7 6,49 27

Реагенты фирмы "ОакораИв", Дания 101,9 28,56 4,48 27

Реагенты фирмы "ВоеИппдег МаппеЬе^т", ФРГ 101,5 25,1 5,38 27

Содержание фВ в плазме крови онкологических больных и здоровых людей

Исследование пределов нормальных колебаний ( X ± 1,58) содержания фВ в плазме крови практически здоровых лиц (п =27) показало, что они составляют от 50% до 151% ( X = 101,3%).

У всех обследованных больных злокачественными новообразованиями (п=138) имеется достоверное увеличение содержания фВ в плазме крови по сравнению с группой здоровых лиц, причем у больных раком поджелудочной железы этот показатель превышал нормальные значения почти в 5 раз, а у боль-

пых раком молочной железы, раком легкого, раком желудка и лимфогрануломато-зом - в 3 раза (табл.6).

В соответствии с клинико-лабораторными показателями у 36 из 138 (26%) больных имелся риск развития состояния гиперкоагуляции, и среди этих больных было выявлено наиболее высокое содержание фВ ( табл.7). У 97 (70%) больных были выявлены нарушения, которые можно трактовать как проявления хронического синдрома ДВС, и у них показатели уровня фВ значительно варьировали. Наконец, у остальных 5 (4%) больных обнаружили тенденцию к развитию гилокоа-гуляции, и у них был самый низкий уровень фВ в плазме крови.

Таблица 6

Концентрация фВ в плазме крови здоровых людей и онкологических больных.

Диагноз п фВ, % ( X ± Эх) Средний возраст больных

здоровые люди 27 101,3 ±6,49 37,0 ±5,1

рак поджелудочной железы 11 497,66 ± 24,1 57,4 ± 3,4

рак легких 19 335,6 + 23,4 61,8 + 6,1

рак желудка 5 333,2+ 18,6 58,5 + 3,5

рак молочной железы 23 352,9 ± 25,6 45,3 + 7,3

лимфогрануломатоз 17 305,0 ± 34,7 35,2 + 5,5

острый миелоидный лейкоз 26 197,0 ± 16,3 36,3 + 2,4

хронический миелоидный лейкоз 8 247,0 ±21,3 55,5 + 2,8

миеломная болезнь 10 283,93 ± 54,76 53,8 ±1,7

острый лимфоидный лейкоз 7 288,4 ±17,5 37,2 + 4,5

хронический лимфоидный лейкоз 4 182,9 ±15,2 64,5 ± 3,7

лимфобластная лимфома 3 313,87 ± 25,8 49,3±3,3

лимфосаркома 2 321,35 ± 34,7 35,0

острый примиелоцитарный лейкоз 1 154,2 37

истинная полицитемия 1 181,13 42

хронический миелофиброз 1 269,55 59

Таблица 7

Данные тестов коагулограммы больных злокачественными новообразованиями различных локализаций ( X ± в).

Диагноз п Время ре-кал ьци фикации плазмы крови, с Протромби новый индекс, % Концентра ция фибриногена , г/л

лимфогранулематоз 14 102,14 ± 18,6 95,55 ±5,25 5,92 ± 0,87

рак молочной железы 20 58,9+ 19,3 115,3 + 7,4 4,9 ±0,34

рак легких 19 97,33 + 13,4 88,58 + 7,5 5,7 ±0,42

рак поджелудочной железы 11 58,77 ± 38,9 110,63 + 7,8 4,74 ± 0,9

рак желудка 5 42,6+12,3 117,6 + 5,7 5,82 + 0,34

острый миелолейкоз 26 147,52 + 42,5 82,7 + 8,11 4,2 ±0,92

хронический миелолейкоз 7 133,8 + 23,1 80,0 + 6,0 3,58 ± 0,37

миеломная болезнь 10 123,7 + 25,7 79,25 + 10,6 3,17 ±0,7

острый лимфолейкоз 7 95,75 + 18,2 94,28 + 9,5 4,3 + 0,5

хронический лимфо-лейкоз 4 180,76 ±6,4 84,45 + 2,7 2,2 + 0,12

лимфобластная лимфома 3 100,2 ±16,2 91,7 + 3,6 4,7 ±0,45

лимфосаркома 2 145,0 + 11,2 95,7 + 4,9 4,6 ± 0,1

острый промиелоци-тарный лейкоз 1 165 85 1,8

истинная полиците-мия 1 125 81 2,3

хронический миело-фиброз 1 127 74 4,0

пределы нормальных колебаний показателей тестов коагулограммы 60-120 95-105 2,26-4,0

Существенные отклонения гемостатического равновесия, обнаруживаемые при анализе коагулограмм онкологических больных, отмечаются в литературе примерно у 50% больных без метастазов и более чем в 95% случаев при наличии метастазов (Мапс! Э., 1993). Именно у этих больных гемостазиологический пара-неопластический синдром, клинически проявляющийся развитием тромбоэмболии

и геморрагий, является наиболее распространенной причиной смертности онкологических больных после сопутствующих инфекционных заболеваний.

Содержание фВ в плазме крови онкологических больных в процессе химиотерапии

Многочисленные клинические наблюдения указывают на увеличение частоты развития тромботических осложнений в ходе или по окончании химиотерапии (Гершанович М.Л., 1982, Doll D.C. et al., 1986, Luzzatto G., Schafer A.L., 1990). Механизм возникновения осложнений, связанных с активацией системы свертывания крови при химиотерапевтическом лечении, до настоящего времени не ясен, но предполагается связь с увеличением концентрации факторов свертываемости в кровотоке (Licciardello J.T. etal., 1985, NicolsonG.L., Custead S.E., 1985, Charba D. et al., 1993).

Результаты этого раздела работы показали, что химиотерапевтическое лечение провоцирует дальнейшее увеличение уровня фВ в плазме крови больных злокачественными новообразованиями независимо от класса применяемых цитостатиков. Так, назначение винкристина, цитозара, адриабластина, пред-низолона (VAPA) 16 больным острым миелоидным лейкозом уже после первого курса привело к изменению уровня фВ в плазме крови с 186,0+13,0% до 286,0+22,6% (р<0,01). С увеличением числа курсов химиотерапии у отдельных больных наблюдалась тенденция к еще большему увеличению фВ в плазме крови (рис.2).

Для 16 больных раком молочной железы со множественными метастазами в лимфоузлы, печень, кости, подвергшихся лечению с применением больших доз эпирубицина и циклофосфана, также установлено значительное увеличение уровня фВ после их введения: с 249,95+23,2% до 370,31±57,9% (р<0,001).

У 5 больных лимфогрануломатозом Iii и IV стадии до и после курса ХВПП (хлорбутин, винбластин, прокарбазин, преднизолон) содержание фВ возрасло с 216,05+13,7% до 345,7+35,7% (р<0,001).

У двух больных миеломной болезнью II стадии, имеющей агрессивное течение, и у 1 больного хроническим миелолейкозом в стадии развернутых клинико-

Рис.2 Изменение содержания фВ у больных острым миелолейкозом до (I) и после (II) курса химиотерапии (VAPA):

1 - до I курса химиотерапии, 2 - 1-й день после I курса, 3 - до II курса, 4 - 1-й день после II курса, 5 - через 2 нед. после II курса, 6 - 1-й день III курса, 7 - 3-й день III курса, 8 - 6-й день III курса, 9 - 8-й день III курса, 10 - 1-й день после III

курса.

500 j 450 -400 -350 300 --фВ, % 250

200 -150 100 -•50 -0

-больная В. -больная Г. -больной Я.

-1-1-1-1-1-1

1 2 3 4 5 6

Рис.3 Изменение содержания фВ у больных миеломной болезнью (больная В. и Г.) и больного хроническим миелолейкозом (больной Я.) в ходе химиотерапии 0/ТЮ).

1 - до химиотерапии; 2-1-й день после 1 курса; 3 - 5-й день 2 курса; 4 -1 -й день после 2 курса; 5 - 9-й день 3 курса; 6 - 4-й день после 3 курса.

гематологических проявлений удалось проследить изменения содержания фВ в плазме крови в ходе нескольких курсов химиотерапевтического лечения (винкристин, рубомицин, дексаметазон) (рис.3). Во всех случаях, независимо от применяемых цитостатиков, наблюдалось увеличение уровня фВ в плазме крови после каждого курса химиотерапии. Сходные результаты были получены при определении концентрации фВ у больного раком легкого и у единичных больных с онкогематологическими заболеваниями, получавших различные схемы комбинированной химиотерапии (табл.8).

Таблица 8

Изменение содержания фВ в плазме крови онкологических больных под влиянием химиотерапевтического лечения.

Диагноз Назначенные хи-миопрепараты Концентрация фВ, %

до лечения после лечения*

лимфогрануломатоз ШВ-ст. допан, натулан, винкристин,блеоми-цин, адриабластин, преднизолон 159,27 342,16

лимфогрануломатоз |УА-ст. эмбихин, винкристин, натулан, преднизолон 214,8 324,16

миеломная болезнь, диффузно-узловая форма винкристин, рубо-мици», циклофос-фан, преднизолон 205,6 305,45

острый миелобластный лейкоз рубомицин, цитозар 381,1 428,48

хронический миело-лейкоз винбластин, рубомицин, цитозар, преднизолон 196,2 253,55

мелкоклеточнй рак легкого адриабластин, \/Р-16, циклофосфан 214,03 323,25

диффузная лим-фобластная лимфома в стадии лейкемиезации этамид, (.-аспарагиназа 198,35 230,57

острый проммелоци-тарный лейкоз \/Р-16, цитозар 172,9 286,6

* - измерение уровня фВ производилось на 2-3 день после окончания курса лечения

Влияние продуктов активированных макрофагов и химиопрепа-ратов на первичную культуру эндотелиальных клеток человека

В данном разделе работы было изучено изменение концентрации фВ в кондиционированных средах эндотелиальных клеток, инкубированных с супернатан-тами мышиных макрофагов, предварительно активированных БЦЖ и выделенных на разных стадиях активации. Ответ Мф на самые различные активаторы имеет в целом двухфазный характер (Громов С.А. и др., 1989, 1990, Окулов В.Б., Вой-тенков Б.О., 1990).В первой фазе активации Мф синтезируют преимущественно цитотоксические соединения, а на второй фазе переключаются на продукцию" ростовых факторов, а также серии монокинов, подавляющих собственные цитотоксические реакции (Войтенков Б.О., Окулов В.Б.,1995).

Иммунохимический анализ фВ в культуральной среде эндотелоцитов показал, что продукты активированных макрофагов значительно увеличивают его количество в среде, причем наибольшей активностью обладают монокины, синтезируемые в цитотоксической фазе. Параллельное измерение активности ЛДГ в лизатах эндотелиальных клеток для оценки их жизнеспособности показало отсутствие значимых различий по сравнению с контролем. Окрашивание трипановым синим выявило не более 5% мертвых клеток в поле зрения, что говорит о сохранении эндотелием его целостности.

Кондиционированные среды Мф, обладающие ростстимулирующими свойствами, практически не вызывали заметного увеличения количества фВ по сравнению с контролем. Корреляционный анализ взаимосвязи изменения концентрации фВ, синтезируемого эндотелиальными клетками в ответ на воздействие активированных Мф, со стадиями активации последних, выявленных по способности кондиционированных сред Мф подавлять или стимулировать рост опухолевых клеток, показал, что существует обратная зависимость средней силы. Коэффициент корреляции составил -0,593, обратная зависимость между указанными параметрами была статистически достоверна (р<0,05) (рис.4).

Таким образом, исследование воздействия продуктов активированных Мф на эндотелиальные клетки показало, что Мф, находящиеся в цитотоксической фазе активации, стимулируют выделение фВ эндотелиоцитами в окружающую среду.

Рис.4 Графическое сопоставление функциональной активности активированных макрофагов и концентрации фВ, синтезированного зндотелиальными клетками в ответ на их действие.

Гистограмма отражает фазу активности макрофагов, выявленную по способности подавлять или активировать рост клеточной линии КВ (в процентах по отношению к контролю).

Ломаная линия - изменение концентрации фВ (в процентах по отношению к

контролю).

При исследовании воздействия цитостатиков на эндотелиоциты ставилась задача создать ситуацию, приближенную к возникающим при использовании химиотера-певтических препаратов в процессе лечения онкологических больных. Были выбраны цисплатин - препарат преимущественно алкилирующего действия и доксорубицин - противоопухолевый антибиотик. Оба препарата не требуют метаболической активации ферментными системами организма для проявления противоопухолевого действия и способны оказывать прямой противоопухолевый эффект в культуре. При выборе концентрации указанных цитостатиков учитывались фармокинетические параметры для определения эффективности препаратов и их токсичности, одним из которых является пик концентрации в плазме крови. На моделях мышиных опухолей установлено, что антинеопластическая активность алкилирующих агентов и антрациклинов прямо зависит от дозы, и,

следовательно от пика концетрации в плазме (Alberts D.S. et al., 1980). In vitro рекомендуется использовать препараты в концентрации, составляющей 5-10% от пика концентрации лекарства в плазме крови больного и являющейся токсичной для опухолевых клеток. Длительность инкубации с цитостатиками (8 час) была выбрана на основании рекомендаций авторов, специально занимавшихся вопросами действия химиотерапевтических препаратов на культуры клеток (Salmon S.E. etal., 1980). Среди этих рекомендаций основными являются учет фармоки-нетики лекарственного средства, минимального интервала инкубации in vitro и зависимости противоопухолевого эффекта от длительности присутствия его в культуральной среде.

Иммунохимический анализ кондиционированных сред, в которых эндотели-альные клетки культивировались в присутствии цисплатина и доксорубицина, выявил достоверное увеличение содержания фВ по сравнению с контрольными образцами (рис.5а). Уровень фВ при дозах препаратов, соответствующих 10% от пика концентрации их в плазме, был наибольшим и превысил контрольный уровень в 3-4 раза. В то же время определение активности ЛДГ в лизатах эндотели-альных клеток не позволило установить достоверных различий между количеством погибших и живых клеток в опытных образцах и контрольных (рис.5б). Еще один метод определения мертвых клеток - окрашивание трипановым синим после воздействия химиопрепаратоа выявил не более 8-10% их по отношению к живым клеткам.

Полученные результаты свидетельствуют, что при прямом воздействии хи-миопрепаратов на эндотелиоциты увеличение содержания фВ в окружающей среде происходит не в результате разрушения клеток. В основе этого феномена лежит, очевидно, механизм, сходный с таковым при воздействии цитотоксически-ми продуктами активированных макрофагов. Другими словами, на внешние стимулы с преимущественно цитостатическим или цитолитическим потенциалом эндотелиапьные клетки реагируют однотипно - синтезом и выделением в окружающую среду фВ.

Данные о том, что при опухолевом процессе, сопровождающимся повреждением сосудистой стенки и активацией гемосгатических свойств эндотелия, наблюдается усиленная продукция и секреция фВ, расценивается как один из существенных факторов, провоцирующих тромботические осложнения вследствие

0,8 0,6 Е 0,4 - • 0,2 0

Ü1

К1

iZL

К2

0,6 т 0,4 0,2 0

:-П.П.П

-м—н

- Г5! *

Ц—I L±J

К1

К2 3

4

Б

Рис.5 А - определение содержания фВ в супернатантах эндотелиальных клеток при воздействии химиопрепаратов (р<0,001).

Б - определение активности ЛДГ в лизатах эндотелиальных

клеток (р>0,2).

К1, К2 - супернатанты интактных эндотелиоцитов.

1,2- воздействие доксорубицином в концентрациях 0,06 мкг/мл и 0,03 мкг/мл

соответственно.

3, 4 - воздействие цисплатином в концентрациях 0,25 мкг/мл и 0,125 мкг/мл

соответственно.

усиленного связывания фВ с тромбоцитарной мембраной. Это позволяет считать фВ одним из специфических маркеров активации свертывающей системы крови.

Несомненно, что при оценке состояния гемостатической системы онкологических больных.важно учитывать, что патофизиологические процессы, приводящие к ее активации, имеют многофакторную этиологию. Мы попытались рассмотреть однин из возможных механизмов активации системы свертывания крови. Необходимо интерпретировать результаты тестов с большой осторожностью и индивидуально для каждого пациента путем сравнения результатов, полученных в динамике наблюдения, а не единичных измерений (Luzzatto G., Schafer A.L., 1990). Рутинные методы лабораторной оценки состояния системы коагуляции недостаточны для диагностики предтромботических состояний, поэтому целесообразно применять новые тесты, основанные на новейших научных технологиях.

Опираясь на такие данные, в том числе на данные о содержании фВ в кровотоке, целесообразно корректировать состояние системы свертывания крови у онкологических больных, чтобы предотвратить осложнения, благоприятствующие мета-стазированию, и тем самым способствовать увеличению продолжительности жизни больных со злокачественными опухолями.

ВЫВОДЫ

1. Получена новая отечественная гибридома, продуцирующая мо-ноклонапьные антитела класса IgG (IgGi) к фактору Виллебранда человека (авторское свидетельство N1693046 от 22.07.91). На их основе разработан метод количественного иммуноферментного анализа, позволяющий выявлять фактор Виллебранда в биологических жидкостях в широком диапазоне доз, а также метод иммуногистохимического анализа фактора Виллебранда в тканевых срезах.

2. У больных с солидными злокачественными опухолями основных локализаций (рак молочной железы, рак легких, рак желудка, рак поджелудочной железы) и у больных с наиболее распространенными онкогематологическими заболеваниями до лечения уровень фактора Виллебранда в плазме крови колеблется от 154,2% (острый промиелоцитарный лейкоз) до 497,65+24,10% (рак поджелудочной железы), что достоверно выше, чем у здоровых людей (101,3+6,49%; р<0,001).

3. Моно- и полихимиотерапия онкологического процесса вне зависимости от класса препаратов способствует дальнейшему увеличению содержания фактора Виллебранда в кровотоке онкологических больных, в среднем на 100-150%.

4. Воздействие на культуру эндотелиальных клеток человека цитостатиками (цисплатином и доксорубицином) или продуктами, содержащимися в кондиционированных средах активированных макрофагов, способствует выходу фактора Виллебранда из клеток в окружающую среду, не приводя к их гибели.

Такая однотипная реакция эндотелия на различные воздействия свидетельствует о том, что повышение уровня фактора Виллебранда в плазме крови онкологических больных не является следствием его гибели под действием химиоте-рапевтических препаратов.

5. Поскольку эндотелиальные клетки являются основным местом синтеза фактора Виллебранда в организме, высвобождение его эндотелием в ответ на

различные стимулы (цитостатики, цитокины) следует рассматривать как один из факторов активации свертывающей системы крови при онкологических заболеваниях, в результате чего усиливается вероятность развития как тромбоэмболиче-ских, так и геморрагических осложнений, и метастазирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В.С.Горностаев, А.Б.Олимпиева, А.О.Данилов, Б.Г.Торопова, Д.Ф.Нягулов, А.В.Глебов, З.М.Чистякова, В.Б.Окулов, П.В.Хролова, Л.П.Папаян. Получение монокпональных антител к фактору VIII свертывания крови человека // Всесо-юзн.конф.по биотехнологии. - Тарту, 1989. - Т.2. - С.206-209.

2. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. -продуцент моноклонального антител к фактору Виллебранда системы свертывания человека: A.c. N 1693046 СССР. Заявл. 24.10.89., N 4752832, опубл. 22.07.91, C12N5/20, 12Р21/08 / В.С.Горностаев, А.Б.Олимпиева, А.О.Данилов и ДР-

3. Б.Г.Торопова, В.С.Горностаев, А.О.Данилов, Д.Ф.Нягулов, В.Б.Окулов, А.Б.Олимпиева, Л.П.Папаян, Н.Б.Серебряная, З.М.Чистякова, О.Г.Головина. Иммуноферментный анализ фактора Виллебранда с использованием монокло-нальных антител// Лаб.дело, -1990. - N12.- С.52-55.

4. Л.П.Папаян, А.Б.Олимпиева, О.Г.Головина, О.Э.Залепухина,В.Б.Окулов. Фактор Виллебранда в патологии гемостаза// Всесоюзн.конф. "Физиология и патология гемостаза". - Полтава, 1991. -С.21.

5. Л.П.Папаян, А.Б.Данилова, В.Б.Окулов, О.Г.Головина, Б.В.Афанасьев, С.А.Шавва. Фактор Виллебранда и гиперкоагуляция// Сб."Клинико-лабораторная диагностика предтромбоза и тромботических состояний". - Санкт-Петербург, -1991. - С.64-72.

6. L.P.Papayan, A.B.Danilova, V.B.Okulov, D.F:Niagulov, O.G.Golovina. Von Willebrand factor as a marker of hypercoagulation II Thromb.Haemost. -1993.- Vol.69.-N6.- abstr 1455.

7. L.P.Papayan, V.B.Okulov, O.Golovina, A.Danilova, D.Niagulov, O.Beliaso. Von Willebrand factor (vWF) in oncologic patients // Blood Coagul.Fibrinol. - 1996.- Vol.7. -N3,-abstr 82. '

8. А.Б.Данилова, В.Б.Окулов, Л.П.Папаян. Иммуноферментный анализ уровня фактора Виллебранда в плазме крови у онкологических больных II Мат.1 съезда онкологов стран СНГ. - М., 1996.- Ч.1.- С.228.

9. А.Б.Данилова, Л.П.Папаян, В.Б.Окулов. Изменения уровня фактора Виллебранда в плазме крови онкологических больных и его роль в нарушении системы гемостаза // Вопр.онкол. -1996. - Т.42, N5. - С.26-30.

10. А.Б.Данилова, В.Б.Окулов, А.О.Данилов, С.Г.Зубова, Б.В.Афанасьев. Реакция эндотелия на воздействие химиотерапевтических препаратов и иммуно-модуляторов // Гематология и трансфузиология. -1997. - в печати.

11. Danilova А.В., Danilov А.О., Zubova S.G. Concentration of Willebrand factor in the blood plasma and the role of endothelium in activating the coagulation cascade among oncological patients // Proc.lntern.Scientific Congress "Chemobyl-Wilsede VII". -Gomel, 1997. - P.153-154.